JPS63101755A - クレアチンキナ−ゼイソ酵素活性の乾式定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は水性液体試料、特に体淑中のクレアチンキナー
ゼのイソ酵素の乾式定量方法に関し、さらに詳細にはＣ
に一聞活性値及びＣに総活性値の両者を乾式測定するこ
とにより結果的にＣに−ＭＢ活性値を乾式定量する方法
に間する。

［従来技術とその問題点コ クレアチンキナーゼ（ＥＣ２，７，３，２；以下、　Ｃ
Ｋと略記することがある）は２つのサブユニッ）ＭとＢ
からなるハイブリッド酵素で９人体中には扇型のＣに−
ＢＢ、筋肉型のＣＫ−間、心筋型のＣに−ＭＢの３種の
イソ酵素（ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ又はｉｓｏｚｉｍｅ）が
存在する。

しかしＣに−８８が血液中に移行することは稀とされて
いるので、実質的に血液中で活性を示すイソ酵素はＣＫ
−間と少量のＣに−Ｍｅの２種であり、特に心筋の疾患
の場合には一過性的にＣに−ＭＢが増加する。

従って血液（血清又は血漿）中のＣにの総活性値とＣＫ
−ＭＢの活性値を知ることは診断上極めて有用である。

血液中のＣＫの総活性値の定量は、クレアチン又はクレ
アチン燐酸を基質とする湿式の化学分析法（北村、仁科
：実践臨床化学（医歯薬出版社、１９８２年発行）、４
２５頁以降）、あるいは乾式分析要素を用いる乾式分析
方法（特開昭４９−１１３９５．特開昭５９−１３５９
００）等がよく知られている。

一方、血液中のＣに−ＭＢ活性値を定量するためには、
まずイソ酵素を分別し９分別されたイソ酵素の活性値を
測定することが必要である。分別法として、電気泳動法
（高木ら：臨床検査、１ｌｔ（３）、３１７（１９８１
））、イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフ法（特開
昭５０−９３９６３．特開昭５４−６５０９６．特開昭
５２−１４６２９８、特開昭５４−１６３８８６等）な
どの物理化学的な方法と並んで、抗体を利用する方法が
知られている。

抗体法はＣに一サブユニットとその抗体との親和性を利
用して、共存する他のサブユニットと分別定量するもの
で、特開昭５２−５７８８７　、特開昭５５−２３９９
２　、特開昭５５−１２０７９７に記載された方法は、
サブユニットＭの活性を阻害する抗体を用いるものであ
り、特開昭５５−１０７９５８及び特開昭６１−６５１
６１に記載の方法は、サブユニッ）Ｂの抗体を固定した
担体を液体試料と接触させて液体試料中のＣＫ　−ＭＢ
だけを捕取した後、担体を取りだし、その結合物のＣＫ
　−ＭＢの活性を測定する方法である。

上記の従来法のうちの物理化学的なＣＫイソ酵素定量法
は特殊な装置と洗浄液と熟練を必要とすることに難点が
ある。また、抗体法は水溶液による反応であるか、ある
いは洗浄液を必要とするもので、簡便法とはいいがたい
、さらに従来技術はすべて水溶液反応を前提としたもの
で、乾式化して簡易化する方向は全く示唆されていない
。

特開昭５５−１０７９５８及び特開昭６１−６５１６１
に記載の方法は、まず、Ｃに−ＭＢのサブユニッ）Ｂと
特異的に結合するＣに一８Ｂ抗体を水不溶性担体に固定
化したものを用意する０次に、Ｃに−ＭＢ及びＣに一間
を含有する一定量の液体試料中に、前記Ｃに−ＢＢ抗体
固定化物を投入してＣＫ　−ＭＢとの選択特異的な結合
反応を行わせる。反応が終った時点で、液体試料中のＣ
に−ＭＢは抗体固定化物に結合・固相化して液体試料か
ら分離され、液体試料の液相中にはＣに一間のみ残留す
ることとなる。固定化物は濾紙又はビーズのような目視
・取り扱いできるサイズの固形物であるので、液体試料
反応液からＣに−ＭＢが結合した固定化物とＣに一間を
含む残留液との２部分に分けることは極めて容易である
。

ここで、従来法はＣに−ＢＢ抗体固定化物に結合して捕
捉されたＣＫ　−ＭＢに着目し、その活性を通常法。

すなわち水溶液中で測定する方法をとっている。

この方法では、結合物に随伴付着しているＣに一間を充
分に洗浄除去する必要があること、また一般的に血清中
に存在するＣＫ−ＭｅはＣＫ　−ＭＭの１／１０以下で
あるとされているにも拘わらず、少ない方をアナライト
（被分析成分）にすること、さらにこの方法は終始水溶
液を取り扱う操作であること等の問題点がある。

生化学検査を乾式化して迅速・簡易化することは時流で
あり、特にＣに−ＭＨの如き一過性の酵素については迅
速・簡易な活性定量法の要望が大きい。

そこで本発明者は上記従来法において、Ｃに一旧とその
抗体との結合物を分析対象にせず、Ｃに一間のみを含む
残留液に着目した分析法に乾式分析要素を組合せること
により、容易な操作で精度の高い活性定量が可能である
ことを見出し本発明に到達した。

［発明の目的］ 本発明の目的はＣに一聞及びＣＫ　−Ｍｅ活性値の簡便
な定量方法を提供することである。すなわち、従来一般
的にイソ酵素活性の定量は大変繁雑な操作を必要とする
ものであるとの観念を破り、Ｃにイソ酵素活性の定量に
当り２分析操作者は実質的に液体試料以外の水は必要と
せず、かつ試薬水溶液の調製、秤量；反応容器や測定セ
ルを必要としない方法を提供することである。

［発明の構成コ 本発明のクレアチンキナーゼイソ酵素活性値の乾式定量
方法は、従来の湿式の免疫法によるＣにイソ酵素活性定
量方法と１種類のクレアチンキナーゼ活性定量用乾式分
析要素を用いる乾式分析方法を結合させることによって
達成された。

本発明のＣにイソ酵素活性値の乾式定量方法は次の如き
器具と操作手順によって構成される。

器具は： ［１］Ｃに総括性測定用乾式分析要素 ［２］水水不溶性担体にＣＫ　−ＢＢの抗体を固定した
抗体固定化物 分析操作手順は： ［１コクレアチンキナーゼのイソ酵素ＭＭ型及びＭＢ型
を含有する水性液体試料を。

クレアチンキナーゼＢＢ型の抗体を水不溶性担体に固定
化した抗体固定化物と接触させて反応させ。

ついで前記反応物の液体部分をクレアチンキナーゼ定量
用乾式分析要素に適用することにより水性液体試料中の
クレアチンキナーゼイソ酵素間型の活性値を乾式定量す
る方法。

及び。

［２］クレアチンキナーゼのイソ酵素間型及びＭＢ型を
含有する水性液体試料及び２個のクレアチンキナーゼ定
量用乾式分析要素を用意し。

■水性液体試料の一定量を、前記クレアチンキナーゼ定
量用乾式分析要素の１個に適用してクレアチンキナーゼ
の総活性値を測定し。

■前記水性液体試料の別の一定量をクレアチンキナーゼ
ＢＢ型の抗体を水不溶性担体に固定化した抗体固定化物
と接触させて反応させ、ついで前記反応物の液体部分の
一定量を前記クレアチンキナーゼ定量用乾式分析要素の
別の１個に適用してクレアチンキナーゼイソ酵素間型の
活性値を測定し。

■クレアチンキナーゼの総活性値からクレアチンキナー
ゼイソ酵素間型の活性値を減じた値をクレアチンキナー
ゼのイソ酵素ＭＢ型の活性値とすることにより、水性液
体試料中のクレアチンキナーゼ及びそのイソ酵素間型及
びＭＢ型それぞれの活性値を乾式定量する方法である。

［発明の構成の詳細な説明コ 実施態様例により本発明の方法を具体的に説明する。

器具［１１ＣＫ総活性測定用乾式分析要素例■：クレア
チン燐酸、ＡＤＰ、　Ｍ８２＋イオン、グルコース、ヘ
キソキナーゼ、グルコース−〇−燐酸デヒドロゲナーゼ
（Ｇ６ＰｄｅＨ）、ＮＡＤＰを含む近紫外光比色測定法
のＣに総括性測定用試薬組成物の１回分を濾紙に代表さ
れるシート状吸収性担体に含浸乾燥させたストリップ型
のＣＫ総活性測定用乾式分析要素。

（例、Ｍｉｌｅｓ社１１Ｓｅｒａｌｙｚｅｒ　Ｃに試験
紙）例■：クレアチン燐酸、ＡＤＰ、Ｍｇ２＋イオン、
グリセリン、グリセリンキナーゼ、グリセロ燐酸オキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、ロイコ色素を含む可視光比
色測定法のＣＫ総活性測定用試薬組成物の１回分を含む
特開昭５９−１３５９００等に記載のＣＫ総活性測定用
一体型多層分析要素を収めた分析スライド。

器具［２］Ｃに−ＢＢの抗体固定化物（乾燥物）例：特
開昭５５−１０７９５８又は特開昭６１−６５１６１に
記載のＣＫ　−ＭＢのサブユニットＢと特異的に結合す
るＣに−ＢＢ抗体を水不溶性担体に固定化したもので。

水性液体試料中にこれを浸漬したとき９分析操作中に抗
体が液中に溶出することがなく、かつ液中のＣに−ＭＢ
と効率よく反応してこれを結合固定する能力をもつもの
。抗体固定化物の好ましい形態は。

試験管の管底内壁に抗体を固定したもの、プラスチック
フィルムを支持台にしたメンブランフィルタ−又はポー
ラス体に抗体を固定して小片に裁断したもの等の乾燥物
で、抗体固定化物が液体試料中に存在する間、その一部
が微小片の形で剥離して２反応中の液中に分散すること
がないようにしたもの。

次に本発明のクレアチンキナーゼイソ酵素活性値の定量
分析方法を具体例により説明する。

■特開昭６１−６５１６１実施例１の記載の方法に従っ
て厚さ１８０ＬＯＴ＋のポリエチレンテレフタレートフ
ィルムで裏打されたメンブランフィルタ−にＣＫ　−Ｂ
Ｂ抗体を固定化し、ついで凍結乾燥した後５ｎ＋ｍ角の
小片に裁断したもの（乾燥物）を調製し４℃で保存する
。

■液体試料として無稀釈の血清又は血清を水又は生理的
塩類水溶液等で２〜３倍に稀釈した水性液体の５０μＬ
を試験管にとり、上記の抗体固定化物の１片を投入し、
３７℃で時々ｔｇ盪しながら１０〜３０分インクベーシ
ョンする。

■特開昭５９−１３５９００実施例１に記載の方法に従
って調製したＣに総括性測定用一体型多層分析要素を収
めた分析スライド２枚を用意し、まずその１枚の展開層
の上に検体として無稀釈血清１０ｕＬを点着し、３７℃
、波長６７０ｎｍの可視光で５分にわたって要素の色光
学濃度を測定して、検体中のＣに総活性値を測定する。

次に、■の操作で調製した液体試料の液体部分の１０ｕ
Ｌを他の１枚の展開層に点着し。

前記と同様にしてＣＫ−間活性値を測定する。Ｃに総活
性値からＣＫ−間活性値を減じた値がＣに一間活性値で
ある。

［発明の効果］ （１）分析器具として２枚のＣに活性定量用乾式分析要
素と１片のＣに−ＢＢ抗体固定化物（乾燥物）の２者の
既製品を用いるだけで９分析操作者は試薬溶液の調製や
秤量の操作なしにＣＫ及びそのイソ酵素活性値の分別定
量が実施できる。

（２）Ｃに−ＢＢ抗体固定化物を液体試料に接触させ反
応させる操作だけで、　ＣＫイソ酵素間とＭＢを分別す
ることができ、しかも反応後の液体部分を次の分析操作
に用いるので、従来法の如き抗体結合物の洗浄操作や遠
心分離操作が不要であり、従って分析誤差に連なる要因
の少ない測定精度の高い定量分析方法である。

（３）Ｃにイソ酵素中に存在量のはるかに多いＣに−Ｍ
Ｍ活性値を測定し、しかもその測定方法がＣに総活性値
測定法と同じ方法であるので９分析学上信頼性の高い測
定方法である。

（４）Ｃに活性定量用乾式分析要素自身が反応容器と測
定セルの役目を兼ねているので９反応容器の準備や排液
処理が不要である。

（５）液体試料の調製、Ｃに活性定量用乾式分析要素へ
の液体試料の適用（点着又は供＊）操作以外には水又は
水溶液を扱う操作がないので９分析操作が極めて簡便で
ある。

（６）１種類のＣＫ活性定量用乾式分析要素だけでＣＫ
総活性値と２種類のイソ酵素活性値を定量測定すること
ができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）クレアチンキナーゼのイソ酵素ＭＭ型及びＭＢ型
   を含有する水性液体試料を、 クレアチンキナーゼＢＢ型の抗体を水不溶性担体に固定
   化した抗体固定化物と接触させて反応させ、ついで前記
   反応物の液体部分をクレアチンキナーゼ定量用乾式分析
   要素に適用することにより水性液体試料中のクレアチン
   キナーゼイソ酵素ＭＭ型の活性値を乾式定量する方法。
2. （２）クレアチンキナーゼのイソ酵素ＭＭ型及びＭＢ型
   を含有する水性液体試料及び２個のクレアチンキナーゼ
   定量用乾式分析要素を用意し、 ［１］水性液体試料の一定量を、前記クレアチンキナー
   ゼ定量用乾式分析要素の１個に適用してクレアチンキナ
   ーゼの総活性値を測定し、 ［２］前記水性液体試料の別の一定量をクレアチンキナ
   ーゼＢＢ型の抗体を水不溶性担体に固定化した抗体固定
   化物と接触させて反応させ、ついで前記反応物の液体部
   分の一定量を前記クレアチンキナーゼ定量用乾式分析要
   素の別の１個に適用してクレアチンキナーゼイソ酵素Ｍ
   Ｍ型の活性値を測定し、［３］クレアチンキナーゼの総
   活性値からクレアチンキナーゼイソ酵素ＭＭ型の活性値
   を減じた値をクレアチンキナーゼのイソ酵素ＭＢ型の活
   性値とすることにより、水性液体試料中のクレアチンキ
   ナーゼ及びそのイソ酵素ＭＭ型及びＭＢ型それぞれの活
   性値を乾式定量する方法。