JPH0736017B2 - マイクロドット免疫検定装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般には試料体液に対する特異的な結合検定を
実施するための固相法に関し、そして更に詳しくはこの
検定を実施するに当ってのクロマトグラフィー技術の使
用に関する。

特異的な結合検定の使用は種々の臨床的用で価値が大き
いことがわかっている。種々の生物学的液体および組織
試料を様々の成分例えば薬物、ホルモン、酵素、蛋白
質、抗体、DNAおよびRANフラグメントおよびその他の生
物学的材料について分析することができる。特異的な結
合検定には、リガンドおよび受容体からなる多数の特異
的な結合対である分析物を測定する検定を包含する。リ
ガンドおよび受容体は、受容体はリガンドに特異的な結
合をし、類似の特性を有する他の試料成分をリガンドと
区別し得る点で関連している。免疫検定は、種々の化合
物および材料の特異的な抗原決定基（抗原）と結合し得
る免疫グロブリン（抗体）との間の反応による。特異的
な結合検定はまたポリヌクレオチド一本鎖が水素結合形
成を経て相補配列を包含するその他のポリヌクレオチド
の鎖と交雑（ハイブリダイゼーション）するDNAおよびR
NA交雑反応をも包含し得る。更に他の特異的な結合検定
例えば免疫反応や交雑を包含していないホルモン受容体
を包括する検定が知られている。

特異的な結合反応の結果は往々にして直接観察し得ない
こともあるので、それらの間接観察のために種々の技術
が案出されている。特異的な結合反応は、放射線同位元
素標識および発色団、螢光団および酵素標識の使用を包
含する周知の技術により特異的な結合対のメンバーの一
つを標識することにより観察し得る。同位元素標識、発
色団、および螢光団は放射線検知器、分光光度計あるい
は裸眼の使用により検知することができる。特異的な結
合対のメンバーが酵素ラベルで標識されている場合、そ
れらの存在は化合物例えば染料が活性化されて検知可能
な信号を生成する反応系の酵素活性化により検知し得
る。

免疫検定には３種の一般的タイプがある。拮抗結合検定
において、標識された試薬および未標識の分析物化合物
は結合物質での結合部位に対して拮抗する。培養または
反応処理（インキュベーション）期間後、未結合物質を
洗い去り、そして部位に結合されている標識試薬の量を
試料溶液中の分析物の濃度の決定のための参照量と対比
する。第二のタイプの免疫検定はサンドイッチ検定とし
て知られていて、そして一般には分析物試料溶液を該分
析物に対して免疫学的に特異的な第一結合物質を有する
表面と接触させることを包括する。第一結合物質と同一
タイプの標識結合物質（抗原または抗体）を有する第二
溶液を検定に加える。標識結合物質は第一結合物質に結
合されている任意の分析物に結合される。次に、検定系
を洗滌工程に付して分析物と結合していない標識結合物
質を除去し、そして標識物質の残量は結合分析物の量に
通常比例する。

第三のタイプの免疫検定技術は凝集反応技術を包むもの
で、そして血液抗原および血清タイプのための周知の検
定により例示される。血清内の抗体と赤血球細胞表面上
に存在する抗原との免疫交差反応性は赤血球細胞および
抗体の三次元の架橋ネットワークの形成により示され
る。血清／赤血球細胞混合物の凝集は裸眼でみることが
できる沈殿（ペレット）を結果として生じる。

これらの種々の検定操作は液相免疫化学技術に従って本
来達成されており、この技術では酵素および同位元素標
識反応は装置例えばマイクロタイタープレート中の液体
溶液中で行われていた。更に近年には、酵素および免疫
反応を湿式多孔性固体基質上で溶液中で実施する「固
体」相検定を実施するための技術および操作が適合され
ていた。

ローゼンフィールド（Rosenfield）等の米国特許第4,32
8,183号には、固相血液型分類操作が開示され、これに
よると溶解赤血球細胞ゴーストの単層がプラスチック・
チューブの壁に共有結合される。次に、単層を血清試料
と接触させ、そして抗体が細胞膜により存在する抗原と
反応性である場合、結合赤血球細胞ゴーストにより試料
中に存在する抗体の免疫吸着が起る。次に赤血球細胞の
抗体感作単層は凝集反応で相補抗原を担有している血液
細胞の第二の層と結合することができる。細胞単層およ
び抗体層双方の免疫学的タイプが知られていると、第二
の細胞層の形成の有無を用いて第二の層を形成している
細胞の免疫学的タイプを指示することができる。逆に、
第一の細胞層の免疫特異性が知られていると、同一細胞
で第二の細胞単層を形成する能力は、第一細胞層の抗原
と特異的に反応性を有する抗体の免疫吸着された層が形
成されたか否かを測定する手段として、依存することが
できる。

グラブ（Grubb）等の米国特許第4,168,146号には、確定
的な「固相」サンドイッチ−タイプ免疫検定を実施する
ための試験ストリップの使用が開示されている。ストリ
ップは抗体が吸着、吸収または共有結合により付着させ
ておいた吸収担体材料から形成されている。好ましい試
験ストリップ材料にはセルロース繊維形成性材料例えば
濾紙、イオン交換紙およびクロマトグラフ紙が包含され
る。材料例えばセルロース薄層クロマトグラフィディス
ク、酢酸セルロースディスク、でんぷんおよび三次元架
橋材料例えばセファデックス（Sephadex）〔ファルマシ
ア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemical
s）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン〕の使用もまた
開示されている。免疫検定は試験ストリップを予測され
る抗原を含む水溶液の一定量で湿らせることによって行
われる。試験溶液内の抗原分子は毛細管作用により試験
ストリップ全体にわたって移動するが、結合抗体が該抗
体が特異性を有する抗原の移動を遅らせるために、定ま
った時間にわたる抗原分子の移動の程度は試験溶液中の
抗原濃度の凾数として関係づけられている。診断装置の
抗原含有領域は標識抗体の添加により示される。

ジーゼル（Giegel）等の米国特許第4,517,288号には、
不活性多孔性材料での固相免疫検定を実施する方法が開
示されている。この特許には、多孔性材料の特定の帯域
内で結合材料を免疫学的に固定化し、そして分析物を固
定化された結合材料を含む帯域に適用することが開示さ
れている。次に、分析物と結合する標識指示薬材料は、
帯域中の分析物の量に相関する量で固定化されるように
なる帯域に適用する。次に、溶媒を帯域の中心に適用し
て帯域から未結合の標識指示薬をクロマトグラフィーで
除去し、その結果帯域に残留する標識指示薬の量を測定
することができる。

ドイチコ（Deutsch）等の米国特許第4,361,537号には、
特異的な結合検定例えば放射性同位元素標識競合検定を
行うための試験装置が開示され、この装置は試料を受容
するための第一帯域、展開液により輸送され得る第一試
薬で含浸された第二帯域、および第三試薬で含浸された
第三帯域を有する毛細管現象により展開液を輸送し得る
ストリップからなる。更に、装置は測定帯域および第二
試薬あるいはストリップの材料であってよい遅延要素を
包含している。第一試薬は、（１）試料、（２）試料お
よび第二試薬、あるいは（３）試料と競合する第二試薬
からなる群の一つと反応して生成物を形成し、その量は
その測定される特性に依存している。試料を第一帯域と
接触させ、そして次にストリップを展開液に浸して試料
と第一試薬との輸送を生ぜしめて反応生成物を形成す
る。遅延要素は生成物または第一試薬（移動試薬）の一
方の輸送を遅延させて両者を空間的に分離させ、そして
次に移動要素の量を測定位置で測定する。

ズク（Zuk）等の米国特許第4,435,504号には、クロマト
グラフィー免疫検定が開示され、この検定ではクロマト
グラフの一端から境界が形成される距離が試料中に存在
する分析物の量を指示している。特定の結合対の一員で
ある分析物を吸収性担体で免疫クロマトグラフを行い、
この担体にはその結合パートナーが非拡散的に結合さ
れ、そして種々のプロトコールが用いられて分析物が結
合している領域と分析物を有していない領域との間の輪
郭を提供している。一つのプロトコールによると、分析
物を、ラベルが酵素１種またはそれ以上を包含する酵素
シグナル生成システムの一員である標識結合共役物の存
在下または不存在下にクロマトグラフを行う。標識共役
物が分析物と共にクロマトグラフされないときは、その
共役物はクロマトグラフに適用され、存在する分析物の
量に比例してそのクロマトグラフに結合せしめられる。
同様に、標識共役物が分析物と共にクロマトグラフされ
るときは、その共役物はその位置で存在している分析物
の量に比例して分析物に結合せしめられる。標識共役物
はシグナル生成システムの酵素メンバーであり得て、こ
のシステムは発色団、りん光体、螢光体、および化学ル
ミネッセンスならびに結合酵素シグナルシステムを包含
し得る。結合酵素システムを用いるときは、第一酵素接
触反応の生成物と反応して検知し得る生成物を形成し得
る第二酵素は分析物溶液と共にクロマトグラフすること
ができるし、または分析物のクロマトグラフィー後に試
験ストリップに加えてもよい。

欧州特許出願第164,194号（1985年12月11日公開）に
は、ズク等の方法の改善が開示され、輸送されたクロマ
トグラフ材料がストリップの本体に沿ったのと実質的に
同一のクロマトグラフストリップの縦のふちに沿った横
断速度を有する点で改良されている。これによってクロ
マトグラフ輸送フロントが凹面よりむしろ実質的に平坦
なままとすることが可能となる。

本願発明にとって関心があるのは本願発明者の２件の公
開されている特許出願である。ゴードン（Gordon）の米
国特許第4,452,901号には蛋白質の固定化のための多孔
性ニトロセルロース支持体の使用が開示されている。こ
のニトロセルロースシートは、ニトロセルロースシート
の残留結合能力が、固定化されるものとは異った、次の
検定で使用される抗体のいずれかと交差反応性でない１
つまたはそれ以上のタイプの蛋白質でのブロック処理に
よって飽和されていると、免疫検定操作に利用すること
ができる。

本発明の背景にとって更に関心があるのは、免疫学的検
定を行うための装置に関する1982年11月３日公開のゴー
ドンの欧州特許出願第63,810号の開示である。この装置
は、抗原、抗体または両者の限定された吸着領域の予め
選定された配列を含有する多孔性固体支持体からなり、
ここで基体上の残留吸着部位が検定で用いられる抗原ま
たは抗体と交差反応しない蛋白質防護剤例えば牛血清ア
ルブミンで飽和されている。多孔性支持体は抗体による
接近および抗原を結合するのに適した表面親和力を可能
とするのに十分な表面多孔度を有していると開示されて
いる。この支持体は種々の天然および合成重合体および
誘導体から選択され得ると開示されているが、好ましく
は厚さ0.1mm、孔サイズ約0.15μｍ〜15μｍを有するニ
トロセルロースシートである。抗原または抗体は直接接
触し次いで防護剤と共に培養することによって多孔性固
体支持体に適用される。未知の抗原または抗体を検出す
るための検定は、抗−免疫グロブリン抗体であってもよ
い標識抗体の使用により実施される。単独または多重検
定の結果を標識抗体の検出により測定される。特定のDN
AおよびRNA配列の検出のための種々の特定の結合検定技
術がよく知られている。この検定は、一本鎖核酸重合体
の相補ポリヌクレオチド配列が相互に認識し、そして相
互作用して安定な二本鎖構造を形成する核酸交雑技術操
作を利用している。サウザーン（Southern）、J.モル．
ビオル（J.Mol.Biol.）、第98巻、第503−517頁（1975
年）には、ゲル電気泳動により分離されたDNA分子はア
ガロース電気泳動ゲルからニトロセルロース濾紙に輸送
され得る操作が開示されている。DNA断片は次に特別な
配列の検出のために放射線同位元素標識RNA断片に対し
て交雑することができる。

ファルコウ（Falkow）等の米国特許第4,358,535号に
は、感染性疾患状態と組合さったDNA配列の検出に有用
な方法が開示され、この方法では感染性微生物と組合さ
ったDNAが単離され、一本鎖変性形態で不活性支持体例
えばニトロセルロースに固定されている。臨床試料に存
在している疑いのある病原生成物の特徴を有するDNA配
列に対して特異的な標識ポリヌクレオチドプローブを交
雑条件下に試料DNAと接触する。次に、支持体を洗滌し
ていずれの未交雑プローブ材料を除去し、そしていずれ
の残留交雑プローブ材料の存在が病原体の存在を指示し
ている。

ダン（Dunn）等はセル（Cell）、第12巻、第23−36頁
（1977年）にサンドイッチ交雑として知られている代替
的交雑操作を開示している。この操作によると、試料RN
Aを、ニトロセルロース濾紙支持体に結合されている定
められたDNA断片に交雑して、その結果RNAの３′または
５′末端が一本鎖テイルとして突び出ていることにな
る。「テイル」配列に対して相補的なDNA配列は次に交
雑条件下で標識DNAの特定の断片で処理することによっ
て決定することができる。

先行技術で知られている種々の特異的な結合検定操作に
加えて、検定試薬の拡散またはクロマトグラフ輸送を包
含する数多くの検定操作が知られている。フォルジオン
（Forgione）の米国特許第3,875,014号には、一組の反
応を利用する血清中の酵素アスパルテート・アミノトラ
ンスフェラーゼ（AST）の濃度を測定するための固相試
験指示薬が開示されている。第一の反応でASTはＬ−ア
スパラギン酸とα−ケトグルタール酸とによってオキザ
ロアセテートを形成する反応を触媒する。第二の反応に
おいて、オキザロアセテートはジアゾニウム塩と反応し
て着色した反応生成物を形成する。フォルジオンの試験
指示薬はオキザロ酢酸を選択的に透過し得る接着剤で相
互に接着された一対の吸収性材料からなっている。第一
の材料を基質Ｌ−アスパラギン酸およびα−ケトグルタ
ール酸で含浸する。第二の材料は乾燥ジアゾニウム塩染
料で含浸する。装置を血清と接触させ、そしてASTが含
有されていると、基質の反応を触媒してオキザロ酢酸を
形成する。次に、オキザロ酢酸が接着バリアーを経由し
て第二ストリップに拡散し、そしてジアゾニウム塩との
発色反応を活性化し、この色を標準物と比較することが
できる。

キャンベル（Cambell）の米国特許第3,893,808号には、
無鉛化自動車ガソリンでの鉛混在を検知するための試験
ストリップが開示されている。試験ストリップは３つの
帯域を有する紙ストリップからなっている。第一の帯域
はヨウ素で含浸され、また第二の帯域はヨウ素とヨウ化
カリウムとの混合物で処理されている。試験すべき自動
車ガソリンの試料をストリップに適用し、そして第一お
よび第二帯域を経て毛細作用により第三帯域に輸送し、
この第三帯域には次のジチゾン指示薬溶液を加える。自
動車ガソリンに存在する任意の有機鉛はストリップの表
面でヨウ化鉛に変換され、そしてこれをジチゾン指示薬
との反応によって特徴のある着色を有する鉛ジチゾネー
ト複合体を形成させることにより検出する。

アルバティ（Alberty）の米国特許第3,895,914号には、
生物学的体液中のバルビツール酸およびバルビツール酸
誘導体検出のための試験ストリップが開示されている。
このストリップ３つの帯域を有する吸収性紙からなる。
第一帯域は適用される試料液体を酸性化するために酸で
含浸されている。第二帯域はバルビツレート−水銀複合
体を形成するよう反応し得るアルカリ性緩衝化酢酸水銀
で含浸されている。第三帯域は水銀指示化学物例えばジ
フェニルカルバゾンで含浸されている。試験すべき液体
の試料を第一帯域に適用し、そしてストリップを溶媒に
浸漬する。試料中に存在するバルビツレートが反応して
バルビツレート−水銀複合体を形成し、このものは第三
帯域に輸送され、水銀指示化合物と反応する。

カリエス（Kallies）の米国特許第4,298,688号には、生
物学的体液中のグルコースレベルを測定するため検定装
置が開示されている。装置は、未処理であってもよい測
定帯域、グルコースオキシダーゼを含む反応帯域および
ペルオキシダーゼおよび指示薬物質例えばｏ−トルイジ
ンおよびオラゾル・イエローを含有する検出帯域に区別
されている紙試験ストリップからなる。検定すべき材料
を測定帯域を経て反応帯域に拡散せしめ、この反応帯域
でいずれのグルコースはグルコースオキシダーゼと反応
し、そして次に検出帯域に拡散せしめ、この帯域で着色
反応が生じ、その程度は反応帯域で実施された反応の程
度に左右される。供試材料の装置中への拡散を助けるの
に水を用いてもよく、そして試験ストリップはまたガラ
ス毛細管内に封入してもよい。

フォグト（Fogt）等の米国特許第4,444,193号には、汗
の中の塩化物のレベルを測定するための定量試験装置が
開示されている。のう胞性線維症をスクリーニングする
のに使用するよう企図されている装置は、対象者の皮膚
にのせたときに一定量の汗を採集する平らなパッチから
なる。パッチは化学的に処理した吸収剤材料の２つの同
心円反応領域からなる。汗試料を内部円反応領域の中心
に導入し、この領域は、塩化物の閾値量を「スクリーン
・アウト」するために予定した濃度以下で汗試料中の全
塩化物と反応し得る化学組成物例えばりん酸銀を含有し
ている。外側の環状反応領域は化学組成物例えばクロム
酸銀を含有し、この組成物は茶色であって、到達する塩
化物のいずれとも反応して白色塩化銀を形成し、そして
予定した閾値を超える塩化物の存在を示す着色シグナル
を生成する。

本発明にとって関心のあるのは、ウィーランド（Wielan
d）およびデターマン（Determann）、J.クロマトグ（Ch
romatog.）、第28巻、第２−11頁（1967年）の開示であ
り、これは薄層クロマトグラフィーフォーマットに用い
られるセファデックスゲルを蛋白質の分離に使用するこ
とに関する。セファデックスは通常の薄層クロマトグラ
フ基体として知られてなく、また通常の薄層クロマトグ
ラフは蛋白質の分離に実際に用いられていないが、高度
に架橋したセファデックスＧ−25の粒子は、上昇型薄層
クロマトグラフフォーマットに使用されていたが、セフ
ァデックスをビーズの形態に製造すると、その粒子は好
都合に接着、結合しないので、上昇型クロマトグラフと
しては役に立たなくなってしまった。下降型薄層クロマ
トグラフフォーマットにおいて大きい孔のセファデック
スタイプＧ−100およびＧ−200を蛋白質の分離に使用す
ることもまた開示されている。

モリス（Morris）、J.クロマトグ、第16巻、第167−175
頁（1964年）には、蛋白質のための下降クロマトグラフ
ィーでのセファデックスタイプＧ−100およびＧ−200プ
レートの使用が開示されている。この開示では、かかる
輸送が遅いことを認めているが、最適の操作条件下では
ヒトCOヘモグロビンは約４−５時間で僅か約70mm移動し
ているのみである旨述べている。

近年の特異的結合検定技術に関して行われてきた多大の
進歩にも拘らず、これらの技術を改善する多くの機会が
なお残されている。現今の検定技術における特に問題と
なる制限は数多くの付加および洗滌工程の必要性であ
る。望ましくない交差反応を防止し、かつ過剰の試薬お
よび介在する物質を除去するのに、必要とされるこれら
の工程は、操作を複雑にし、そして実施し得る分析操作
の複雑化のタイプおよびレベルを非常に制約する。技術
者によって行わなければならない洗滌および付加工程の
数を除去あるいは減少させることは検定を実施しそして
検定結果を解析する時間および費用を減少させるだけで
なく、結果の解析を自動化する困難さを減少させる。こ
れらの理由から、最小の数の添加および洗滌工程ですむ
固相検定装置からなる新しい系が非常に望まれている。
このような装置は好ましくは広い範囲の材料に対する検
定を実施するのに使用可能であり、そして本質的に自動
式で複雑な反応順序を達成し得るものである。

本発明によれば、試料液体に基いて特異的結合検定操作
を実施するための新規な方法および装置が提供される。
これらの方法および装置は最小の洗滌および添加工程で
済み、また種々の分析物（限定するものではないが、抗
体、抗原、DNA配列RNA配列およびその他の化学物質を包
含する）の定量、定性的な特異結合検定を実施するのに
有用である。本発明による試験装置の使用において、反
応剤はクロマトグラフィー材料の部位で選択的に不動化
され、そして多数の反応剤が固定化された試薬と順序接
触し、そして未反応の物質をそれから物理的に除去さ
れ、また処理時間および順序は装置のデザインにより決
定される。

特に、本発明の装置は試料中の分析物の検定のための試
験ストリップからなり、このストリップは選択されたク
ロマトグラフィー溶媒による固定化されていない試薬お
よび反応性試料成分のクロマトグラフィー溶媒輸送のた
めの特定の能力を有する一定の長さのクロマトグラフィ
ー材料からなる。このストリップは、クロマトグラフィ
ー溶媒輸送が開始される第一の末端、クロマトグラフィ
ー溶媒輸送が終る第二の末端および前記第一および第二
の末端の間に位置する複数の帯域からなっている。該帯
域は第一帯域（溶媒中で移動可能であり、かつ分析物と
特異的に結合反応することのできる第一の試薬で含浸さ
れている）、第二帯域（分析物を含有している疑いのあ
る試料を受容するため）および第三帯域（第二帯域の下
流に位置し、そして溶媒輸送に対して固定化され、そし
て分析物と特異的に結合反応することができる第二試薬
で含浸されている）からなる。第一および第二帯域は第
一末端から十分な間隔をおいて配置され、クロマトグラ
フィー溶媒と第一末端（但し、第一および第二帯域では
ない）との接触を可能としている。装置は更に、試料が
第二帯域に受容された後でかつ第一末端がクロマトグラ
フィー溶媒に浸漬されると、分析物および第一試薬分析
物と該第一試薬との相対移動度または第二および第三帯
域の位置関係のいずれかが、第一試薬が第三帯域に到達
する前に分析物が第三帯域にまで輸送せしめられ且つ該
第三帯域に固定化（不動化）されるようなものであり、
これにより試料中の第一試薬と反応性を有する干渉性の
非分析対象物成分を、第一試薬が第三帯域に到達する前
に、クロマトグラフィー溶媒輸送により第三帯域から除
去する。装置は任意に第三および第四（指示薬）試薬で
含浸された第四および第五帯域を有してよく、第三帯域
での第一試薬の検出手段を有している。

装置を用いる検定操作は、（ａ）第二帯域中に試料を付
与し；（ｂ）次に第一末端をクロマトグラフィー溶媒中
に浸漬せしめて、分析物および第一試薬を第三帯域にク
ロマトグラフィーで輸送するのに十分な時間処理し、而
して分析物と第一試薬との相対移動度あるいは第二およ
び第三帯域の位置関係のいずれかが第一試薬が第三帯域
に到達する前に分析物が第三帯域にまで輸送され、且つ
該第三帯域に不動化され、そしてこれにより第一試薬と
反応性を有するところの試薬の干渉性非分析対象物成分
を、第一試薬の到達前に、クロマトグラフィー溶媒によ
り第三帯域から除き；そして（ｃ）第三帯域中の第一試
薬の存在を検知することによって達成される。

本発明の顕著な特徴は、分析物および第一試薬の相対移
動度あるいは第二または第三帯域間の位置関係のいずれ
かが、第一試薬が第三帯域に到達する前に分析物が第三
帯域にまで輸送せしめられ、固定化（不動化）されるよ
うなものであり、そしてその結果第一試薬と反応性を有
する試料の干渉性非分析対象成分が、第一試薬が第三帯
域に到達する前にクロマトグラフィー溶媒輸送により第
三帯域から除去されることを提供するにある。この特徴
により、「洗滌」工程が第一試薬が第三帯域と接触する
前に本来第三帯域で実施され、この特徴によって（第三
帯域の）洗滌工程および（第一試薬の）添加工程が共に
排去れる。手による洗滌工程を避けることが可能となっ
た結果、添加の試薬を試験ストリップに組み入れること
が可能となり、それで添加工程も避けることが可能とな
る。添加試薬の組み入れおよび手による洗滌工程の除去
によって、本発明の装置は２種またはそれ以上の反応を
順次実施することが可能である。更には、複数のクロマ
トグラフィー溶媒輸送経路を用いることが可能となり、
その結果試料、第一試薬および任意の他の材料例えば指
示薬試薬を、部分的に異なったクロマトグラフィー溶媒
輸送経路に沿って分離処理を維持しながらあらかじめ定
められた順番に従って輸送することができる。複数の経
路は液体マイクロ回路を構成するように形成することも
でき、この回路は種々の試薬を特別の位置に順次クロマ
トグラフィー溶媒輸送することにより様々の多工程検定
操作を実施するよう「プログラム」することができる。

本発明の更に他の特徴として、薄層クロマトグラフィー
支持体材料が特に本発明によるクロマトグラフィー輸送
に適していることが見い出された。DNA、およびRNA配
列、蛋白質および大型ポリペプチド（抗体および種々の
抗原を包含する）は通常薄層クロマトグラフィー支持体
上でクロマトグラフィー輸送されていなかったが、この
材料の迅速クロマトグラフィー溶媒輸送が、支持体の非
特異的結合部位を非特異的蛋白質遮断剤、例えば牛血清
アルブミンで処理することによる如く遮断（ブロッキン
グ）を適当に行ったときに、可能であることが見い出さ
れた。蛋白質、大型ポリペプチドおよびその他の材料は
本発明に従って他のクロマトグラフィー材料例えばペー
パークロマトグラフィーに用いられている材料により輸
送し得るが、薄層クロマトグラフィー支持体の使用がこ
の材料の使用によって速度および分解が改善されるので
特に好ましい。

装置の一般的な説明 本発明の装置は、クロマトグラフィー溶媒を用いて第二
帯域で含浸された分析物含有試料材料および第一帯域で
含浸された第一試薬を順次第三帯域に輸送し、そこで第
二試薬が分析物材料と特異的に反応して分析物を固定化
することができる。本発明の多孔性ストリップ装置上に
沈着された分析物および第一試料材料のクロマトグラフ
ィー溶媒輸送に依存することにより、先行技術での検定
システムで必要とされていた多くの添加および洗滌工程
を回避することが可能である。

本発明の著しい特徴は、分析物および第一試薬の相対移
動度あるいは第二または第三帯域間の部位の関係が、第
一試薬が第三帯域に達しそして分析物と接触する前に、
分析物が第三帯域で処理され、そして溶媒輸送に対して
固定化されるようなものであるところに存する。この本
発明の特徴は、第二帯域を第三帯域と一致させるように
することにより、すなわち試料を直接第三帯域に沈着さ
せることにより達成される。あるいはまた、試料および
第一試薬の移動度あるいは装置のデザインが、第一試薬
ならびに分析された干渉性試料成分および第一試薬と反
応性を有する試料の非分析物成分が第三帯域で分析物の
固定化の前に相互に接触するようにしないようにするこ
とであってもよい。

本発明の第二の著しい特徴は、干渉性物質および第一試
薬と反応性を有する試料の非分析物成分が、第一試薬が
第三帯域に達する前に、クロマトグラフィー溶媒輸送に
より第三帯域から除かれてしまうことにある。この特徴
により、洗滌工程が第一試薬の第三帯域への接触の前に
第三帯域で本来実施され、そして試料適用後試料の非分
析物成分および次に第三帯域に適用される試薬類と干渉
するかまたは交差反応し得る材料を除去するための手で
の洗滌工程を除去することができる。この洗滌工程の除
去によって、クロマトグラフィーで移動可能な試薬材料
（例えば第一試薬材料）をストリップ材料に、検定操作
の過程でかかる試薬を適用する必要性に代って、装置の
製造過程の間に予備適用することが可能となる。

本発明の一態様によると、試料材料が適用される第二帯
域および第二試薬が固定化される第三帯域は、第一試薬
が第三帯域に達する前に、第三帯域での溶媒輸送に対し
て固定化されるために、一致していてもよい。しかし、
試料の非分析物成分（クロマトグラフィー溶媒にほとん
どあるいは全く溶解性を有していない）が第三帯域に留
らないようにするために、第二および第三帯域が一致し
ていないのが好ましく、第三帯域ではこれらのものは分
析物、第二試薬あるいは第三帯域の次に適用されるその
他の試薬と干渉するかあるいは交差反応し得る。干渉性
試料成分および第一試薬と反応性を有する非分析物試料
成分の少量がクロマトグラフィー溶媒輸送に対して許容
し得なく、そしてそれ故に第三帯域を超えて輸送される
代りに第一試薬と反応し得る許容性は本発明の範囲内に
あり、この場合この反応は第三帯域で分析物材料の検出
と干渉しない。本発明の実施化に当り使用される試薬の
同一性は試験する分析物の同一性に従って変化する。分
析物（analyte）が抗原または抗体である場合、分析物
と第二試薬との間の免疫学的特異結合反応を用いて第三
帯域で分析物を固定化することができる。分析物が抗体
であるときは、固定化された第二試薬が抗体が特異的に
反応性を有する抗原であり、また第一試薬が分析物抗体
と特異的に反応性を有する標識抗原あるいは分析物抗体
と特異的に反応性を有する標識抗免疫グロブリン抗体で
あり得る。分析物が抗原であるときは、固定化された第
二試薬は抗原と特異的に反応性を有する抗体であり、ま
た第一試薬は標識抗体あるいは抗原とも特異的に反応性
を有する他の特異的結合材料であり得る。

分析物が特定のヌクレオチド配列を有するDNAあるいはR
NA鎖である場合、第二試薬はストリップ材料に対して固
定化された一本鎖DNAまたはRNAプローブであり、このも
のは分析物ヌクレオチド配列の第一部分と交雑して分析
物を固定化し得るヌクレオチド配列を提示している。第
一試薬は標識特異結合材料例えば分析物ヌクレオチド配
列の第二部分と交雑して分析物により固定化され得るヌ
クレオチド配列を有する標識DNAまたRNAプローブであり
得る。

本発明の検定方法および装置は２種または４種もの試薬
のみを用いるものに限られる必要はない。事実、本発明
の方法および装置によって提供される顕著な利点は、多
工程検定操作を手で実施する追加および洗浄工程の最小
限の数で実施する能力にあり、これはかかる洗浄工程を
種々の分析物および反応剤のクロマトグラフィー輸送に
より「自動的に」実施することによりあるいは製造中に
反応剤を装置に予備適用することにより行われる。この
多工程検定操作は本発明の装置に追加の試薬および試薬
帯域を組み入れることによって実施することができる。
この試薬は第一試薬の検知のための手段の一部として反
応のために第三帯域にクロマトグラフィーで輸送するこ
とができる。本発明の一態様によると、第三及び第四試
薬を試験装置に組み入れて酵素標識第一試薬との反応の
ために化学的基質材料および染料化合物を提供すること
もできる。更には、追加の試薬を反応のために他の帯域
にクロマトグラフィー輸送し得ること、またこのような
反応の生成物を固定化するかまたは更に反応もしくは検
定のために他のところに輸送し得ることも企図されてい
る。また、装置を単一試料材料内の複数の分析物の検出
のために用い得ることも企図されている。本発明は検定
の実施において手による洗浄および付加工程の除去のた
めに提供されることが企図されているが、ある種の手に
よる洗浄および付加工程が本発明に従っていずれかの特
別な検定操作の実施に適用していることもまた企図され
ている。

本発明による方法は、試料材料を含む分析物を第三帯域
に輸送するクロマトグラフィー溶媒の流れはこの帯域か
ら（望ましくない）固定されていない材料を除去するの
に役立つところに特徴を有する。このような固定されて
いない材料は、第一試薬と分析物との間の反応に干渉す
る試料成分ならびに第一試薬と反応性を有する非分析物
試料成分を包含する。抗体含有液体での特定の抗体の検
出のための免疫検定の場合、第三帯域で固定化される抗
原材料（第二試薬）と特異的に反応性を有する抗体は抗
原材料と反応し、そして自体でこの帯域で固定化され
る。第二試薬と特異的に反応性を有していない試料中に
存在する非分析物抗体は第二試薬により第三帯域で固定
化されず、試料材料の他の成分と一緒に第三帯域からク
ロマトグラフィー輸送でとり去される。これは、検定が
伝統的な「サンドイッチ」検定であり、そして第一試薬
が標識種特異的抗免疫グロブリン抗体であり、そして第
三帯域から非分析物抗体を除去しないと偽の陽性結果を
生じる場合に、特に有利である。分析物と第一試薬との
反応に干渉する可能性のある試料成分を除去しないと偽
の陰性結果を生じる。一例として、検定が特定のDNAま
たはRNAポリヌクレオチド配列の検出のための交雑検定
である場合、試料核酸材料を、プローブを結合しそして
検定に干渉する非核酸試料材料例えば多糖類、ポリペプ
チドおよび蛋白質から分離するのが望ましい。

本発明による装置は、種々の検定操作を実施するため
に、単一もしくは複数のクロマトグラフィー溶媒輸送経
路を利用している。最も簡単な（単一経路）装置は第一
末端、第一末端の下流の第二末端、標識第一試薬が沈着
されている第一帯域；試料を受容する第二帯域；および
第二試薬で含浸された第三帯域を包含する単一輸送経路
を伴うストリップからなる。三つの帯域は、単一クロマ
トグラフィー溶媒輸送経路に沿って、第三帯域が第一お
よび第二帯域から下流に位置し、そして第二帯域が第一
帯域から下流に位置するように配列されている。

最も簡単な（複数の経路）装置は別々に第三帯域に通じ
ている２個の異なった経路からなる。第一試薬は一つの
経路で第一帯域に適用され、そしてその後試料を他の経
路で第二帯域に適用される。クロマトグラフィー溶媒、
２個のクロマトグラフィー輸送経路のストリップ材料、
第一および第二帯域の配置、および材料自体の組成は、
試料材料が第三帯域と接触し、そして第一試薬と反応性
を有する試料のいずれの非分析物成分およびいずれの干
渉性物質が第一試薬が第三帯域にクロマトグラフィー溶
媒輸送される前に第三帯域から除去されるようなもので
ある。更に複雑な複数の輸送経路の装置を構成すること
ができ、この場合第一、第二および第三帯域が一つの経
路に沿って位置し、また第四および第五帯域（酵素反応
基質および染料化合物で含浸されている）は第三帯域に
通じている第二の部分的に異なった経路に位置してい
る。更に複雑な多成分系を、試薬と試料材料との間の分
離を維持するために、また特別な配列に従って材料を接
触、反応させるために、追加のクロマトグラフィー輸送
経路を利用して構成することができる。

異なったおよび部分的に異なった（不一致）（non−coi
ncident）クロマトグラフィー溶媒輸送経路は種々の手
段により形成させることができる。不透過性バリヤーを
経路の間に形成させて、選択された帯域および領域への
輸送までに溶媒輸送された材料を分離することができ
る。このようなバリヤーは、クロマトグラフィー溶媒輸
送経路を構成する材料の長さの間に不透過性材料を物理
的に中間挿入することによって形成させることができ
る。あるいはまた、クロマトグラフィー溶媒輸送材料、
例えばニトロセルロースをエッチングして経路（pathwa
y）の間にギャップを形成させることができる。これら
のギャップは、ギャップの一方の側から他の側への材料
の潜在クロマトグラフィー溶媒輸送、ひいてはギャップ
の一方の側の物質と他の側の材料との相互作用を防止す
る。

単一、二、三および四経路装置ならびにそれらの機能を
包含する本発明の種々の態様を以下に記載する。

単一経路装置 図面を参照するに、第1a、1bおよび1c図は液体試料中の
分析物の検知のための試験装置（10）を説明する。この
装置は、クロマトグラフィー溶媒輸送が始まる第一末端
（14）およびクロマトグラフィー溶媒輸送が終る第二末
端（18）を伴うクロマトグラフィー材料（11）からな
る。材料（11）は第一帯域（15）、第二帯域（16）およ
び第三帯域（17）からなる。第一帯域（15）はクロマト
グラフィー溶媒中で移動可能であり、分析物が固定化さ
れた形態の場合分析物による溶媒輸送に対して反応、固
定化可能である第一試薬（21）で含浸されている。第二
帯域（16）は第一帯域（15）の下流にあり、そして分析
すべき試料を受容するのに適した部位を備えている。第
三帯域（17）は第二帯域（16）の下流にあり、そして第
二試薬で含浸されている。この試薬は溶媒輸送に対して
固定化され、そして分析物と選択的に反応して分析物に
固定化形態を付与する。装置は更にクロマトグラフィー
材料（11）が付着されている不活性支持体ストリップ
（12）を包含している。装置は更にクロマトグラフィー
材料（11）の上にのせられ、材料の第一末端（14）を露
出したままとするカバープレート（13）を包含してい
る。カバープレート（13）は第二帯域（16）および第三
帯域（17）に相当し、かつ露出したままとする２個の開
口部を定めている。第一および第二除去可能なタブ（1
9）、（20）はそれぞれ第二および第三帯域（16）、（1
7）をカバーしている。この図および他の図にとって、
第三帯域（17）と第二末端（18）との間の破線はこれら
の２個の特徴部の間に延長された距離を示し、これは、
クロマトグラフィー溶媒フロントが第二末端に達し、そ
してクロマトグラフィー溶媒輸送が停止するときに先立
って、第三帯域（17）へあるいはこれを超えて全ての材
料のクロマトグラフィー溶媒輸送のために提供される。

第1a、1bおよび1c図の装置（10）を用いるための操作に
よると、第一タブ（19）を装置（10）から除き、供試材
料の試料を第二帯域（16）に適用し、そして第一タブ
（19）を再びのせる。装置（10）を次にその第一末端
（14）においてクロマトグラフィー溶媒（22）の容器
（21）中に浸漬する。次に、クロマトグラフィー溶媒
（22）をクロマトグラフィー材料（11）中を進めて第一
帯域（15）で含浸された第一試薬および第二帯域（16）
に適用された試料を第三帯域（17）に輸送する。そこ
で、固定化された第二試薬材料が試料中に存在する分析
物と特異的に反応してこれを固定化する。試料の非分析
物成分は第三帯域（17）から運び去られる。次に、第一
試薬を第三帯域（17）に輸送し、ここで分析物が固定化
された形態である場合分析物により溶媒輸送に対して固
定化される。分析物がなくなった試料および第一試薬の
クロマトグラフィー溶媒輸送は、クロマトグラフィー溶
媒（22）が材料の第二末端（18）に達するまで続けられ
る。次に、第二タブ（20）を除去し、そして色素あるい
は他の反応性材料を第三帯域（17）での第一試薬の存在
を検知するために第三帯域（17）に適用することができ
る。

第2a−2f図は第1a図に示した装置の正面図である。これ
らの図は図式的に分析物（Ｂ）および非分析物（Ｃ）を
包含する試料中の分析物（Ｂ）の分析のための試験装置
（30）の操作を表している。これによると、装置はクロ
マトグラフィー溶媒輸送が始まる第一末端（34）および
クロマトグラフィー溶媒輸送が終る第二末端（38）、な
らびに第一帯域（35）、第二帯域（36）および第三帯域
（37）からなる。第一帯域（35）はクロマトグラフィー
溶媒（42）中で移動可能であり、そして分析物（Ｂ）が
固定化された形態である場合分析物（Ｂ）により溶媒輸
送に対して反応、固定化され得る第一試薬（Ａ）で含浸
されている。第三帯域（37）は第二試薬（Ｄ）で含浸さ
れ、この試薬は溶媒輸送に対して固定化され、そして分
析物（Ｂ）と特異的に反応して第三帯域（37）中で分析
物（Ｂ）に固定化された形態を付与する。装置は更にあ
る長さのクロマトグラフィー材料（31）が付着されてい
る不活性支持体ストリップ（32）を包含している。装置
は更に材料（31）の上にのせられて材料の第一末端（1
4）を露出したままにしているカバープレート（33）を
包含している。カバープレート（33）は第二帯域（36）
および第三帯域（37）に相当し、かつ露出したままにし
ている２個の開口部を定めている。第一および第二の除
去可能なタブ（39）、（40）がカバープレート（33）の
上にのせられ、それぞれ第二および第三帯域（36）、
（37）をカバーしている。

使用時、第一タブ（39）をカバープレート（33）から除
去し、そして分析物（Ｂ）および非分析物（Ｃ）を含有
する分析すべき材料の試料を第二帯域（36）に適用す
る。次に、第一タブ（39）をカバープレート（33）の上
に再びのせて、試料材料が乾燥するのを防止するために
第二帯域（36）の部位をカバーする。

第2b図に図示した如く、試験装置の第一末端（34）をク
ロマトグラフィー溶媒（42）の容器（41）中に浸漬し、
この溶媒はクロマトグラフィー材料（31）を経て進行し
て第一帯域（35）と接触し、そして第一試薬（Ａ）をク
ロマトグラフィー溶媒フロント（43）の後に第二末端
（38）の方向へ下流に輸送する。

第2c図に図示した如く、クロマトグラフィー溶媒フロン
ト（43）は第二帯域（36）と接触し、通過する。ここで
分析物（Ｂ）及び非分析物（Ｃ）材料からなる試料液体
は予め沈着されていた。試料が液体であり、かつまた第
二帯域が乾燥されないのが好ましい。第二帯域での乾燥
試料材料は溶媒に迅速に可溶化され得るようなものでは
なくてよく、結果として第一試薬は第三帯域に輸送され
る前に試料成分と接触、反応することができる（以下に
記載の「テトロード」四経路装置はこの制限を要し、そ
して乾燥試料を分析しなければならないような若干の事
例に使用するのに適している）。溶解または懸濁された
分析物（Ｂ）および非分析物（Ｃ）材料を含む試料液体
がクロマトグラフィー溶媒輸送フロント（43）の前に試
料輸送フロント（44）に沿って押し進められ、このフロ
ントの後に第一試薬（Ａ）が輸送される。

第2d図は、試料輸送フロント（44）が第三帯域（37）と
接触し、通過するにつれて、分析物（Ｂ）と特異的に反
応し得る第二試薬（Ｄ）が分析物（Ｂ）と反応して第三
帯域（37）で分析物に固定化された形態を付与する。第
二試薬（Ｄ）は試料液体の非分析物成分（Ｃ）と特異的
に反応性を有してなく、そしてこれらの材料は第三帯域
（37）で固定化されなかった。

第2e図は、試料輸送フロント（44）および非分析物試料
成分（Ｃ）は第三帯域（37）から第二末端（38）の方へ
下流にクロマトグラフィー輸送される。同時に、その後
に第一試薬（Ａ）が輸送されるクロマトグラフィー溶媒
フロント（43）は第三帯域（37）と接触させ、この帯域
の上で分析物（Ｂ）が固定化される。第一試薬（Ａ）
は、分析物（Ｂ）が固定化された形態である場合分析物
（Ｂ）により溶媒輸送に対して反応、固定化され得る。
好ましくは過剰の濃度で存在している第一試薬（Ａ）の
若干は第三帯域（37）で分析物（Ｂ）により固定化され
る。いずれの過剰の第一試薬（Ａ）は第三帯域（37）を
通ってクロマトグラフィー溶媒輸送により引続いて輸送
される。

第2f図に図示した如く、試料輸送フロント（44）および
クロマトグラフィー溶媒フロント（43）は装置の第二末
端（38）に最終的に達し、この点でクロマトグラフィー
溶媒輸送が終る。第二末端（38）に輸送された過剰の第
一試薬材料（Ａ）はそこで拡散によって移動し、分析の
精度に影響を与えることなく非分析物試料材料（Ｃ）と
接触、反応する。

第一試薬材料（Ａ）は直接検知可能な標識物質（例えば
放射性同位元素標識物質）あるいは他の材料との反応に
より検知可能なものであってもよい。第一試薬（Ａ）が
直接検知可能である場合、試料材料中の特定の分析物
（Ｂ）の存在は第三帯域（37）で第一試薬（Ａ）の存在
の検知により、例えば放射線カウンターによる如くして
検出することができる。あるいはまた、第一試薬（Ａ）
が直接検知可能でない場合例えば酵素標識試薬による場
合、付加の試薬を例えば呈色反応を生じさせるために第
三帯域（37）に加えてもよい。従って、第二タブ（40）
をカバープレート（33）から除去し、そして酵素基質お
よび染料物質を加えて固定化された第一試薬（Ａ）の存
在下に呈色反応を生じさせることができる。

二経路装置（ダイオード） 第3aおよび3b図は試料液体中の分析物の検出のための
「ダイオード」（diodo）と称される二経路装置を説明
する。この装置は第一試薬の酵素ベルとの反応による検
知可能な着色シグナルを生成するのに使用し得る追加試
薬を組み入れている。装置は、クロマトグラフィー溶媒
輸送が始まる第一末端（54）およびクロマトグラフィー
溶媒輸送が終る第二末端（60）を伴うクロマトグラフィ
ー材料（51）の長さからなる。材料は中心溶媒バリヤー
手段（62）により分割され、ここで左縁（67）で左手ク
ロマトグラフィー溶媒輸送経路を定め、また右縁（68）
で右手クロマトグラフィー溶媒輸送経路を定めている。
材料は第一帯域（55）、第二帯域（56）、第三帯域（5
7）、第四帯域（58）および第五帯域（59）からなる。
第一帯域（55）は左手クロマトグラフィー溶媒輸送経路
中に位置し、そしてクロマトグラフィー溶媒中で移動可
能であり、そして分析物が固定化された形態である場合
分析物により溶媒輸送に対して反応、固定化し得る第一
試薬で含浸されている。第二帯域（56）は左手クロマト
グラフィー溶媒輸送経路に沿って第一帯域（55）の下流
にあり、そして分析すべき試料を受容するための適当な
部位を備えている。

第四帯域（58）は右手クロマトグラフィー溶媒輸送経路
中に位置し、そしてクロマトグラフィー溶媒中で移動可
能である第三試薬で含浸されている。第五帯域（59）は
右手クロマトグラフィー溶媒輸送経路に沿って第四帯域
（58）の下流にあり、そしてクロマトグラフィー溶媒中
で移動可能である第四試薬で含浸されている。溶媒輸送
に対して固定化されている第二試薬で含浸された第三帯
域（57）は第一（55）、第二（56）、第四（58）および
第五（59）帯域から第二末端（60）の方向に下流に位置
している。

左手および右手クロマトグラフィー溶媒輸送経路を定め
ている中心溶媒バリヤー（62）に加えて、装置は第一溶
媒バフル（63）および第二溶媒バフル（64）を包含し、
これらは上昇溶媒に第一末端（54）と第二末端（60）と
の間の更に回路状のルートを横断させることによって右
手クロマトグラフィー溶媒輸送経路に沿ってクロマトグ
ラフィー溶媒輸送を遅延せしめる。右溶媒バリヤー（6
5）および左溶媒バリヤー（66）も存在し、これらは試
料材料ならびに第一、第三および第四試薬のクロマトグ
ラフィー溶媒輸送を第三帯域（57）の方向に向けさせ
る。

装置は更にクロマトグラフィー材料が付着された不活性
支持体ストリップ（52）および材料（51）上にのせら
れ、材料の第一末端（54）を露出したままにしておくカ
バープレート（53）を包含している。カバープレート
（53）は第二帯域（56）に相当し、かつ露出したままに
しておく孔を定めている。タブ（61）が第二帯域（56）
に試料材料または試薬を適用するのに除去することがで
きる。

第3aおよび3b図の装置（50）を使用するための操作に従
って、タブ（61）をカバープレート（53）上の第二帯域
（56）上のその位置から除去し、そして分析すべき材料
の液体試料を第二帯域（56）に適用する。次に、タブ
（61）を検定操作中試料材料の乾燥を防止するために第
二帯域（56）上に再びのせる。装置（50）をその第一末
端（54）でクロマトグラフィー溶媒中に浸漬し、次にこ
の溶媒は左手および右手溶媒輸送経路に沿って第二末端
（60）の方向に下流へ進行する。右手溶媒輸送経路に沿
ったクロマトグラフィー溶媒輸送は第一（63）および第
二（64）バフルで与えられる回旋状経路の結果として遅
延させられる。左手経路に沿って、クロマトグラフィー
溶媒は第一帯域（55）で含浸された第一試薬および第二
帯域（56）で沈着された液体試料材料を第一試薬が試料
材料に接触することなく第三帯域に輸送する。

第三帯域（57）で、固定化された第二試薬は試料中に存
在する分析物と特異的に反応してこれを固定化する。試
料の非分析物成分は第三帯域（57）からクロマトグラフ
ィーで運び去られる。次に、第一試薬が第三帯域（57）
と接触し、ここで分析物が固定化された形態である場合
分析物により溶媒輸送に対して固定化され得るものとな
る。

同時に、右手輸送経路に沿って進むクロマトグラフィー
溶媒は第四（58）および第五（59）帯域で沈着した第三
および第四試薬を担有、混和する。例示的には酵素触媒
による発色のシグナル手段を包含する第三および第四試
薬は次に右溶媒バリヤー（65）および中心溶媒バリヤー
（62）の間のギャップを経て左手輸送経路中にチャンネ
ル化される。試料材料および第一試薬の大部分はこの時
までに第一試薬と特異的に反応して検知可能なシグナル
を生じる第三および第四試薬との接触を最小限とするた
めに右溶媒バリヤー（65）と左溶媒バリヤー（66）との
間の狭いギャップを通して輸送されてしまう。しかし、
試料および第一試薬を含む若干量の溶媒が右手溶媒輸送
経路中に輸送され、ここでこれらのものは第三および第
四試薬と反応して会合点で検知可能なシグナルを生じ
る。クロマトグラフィー溶媒輸送が続くにつれて、第三
および第四試薬が右溶媒バリヤー（65）と左溶媒バリヤ
ー（66）との間のギャップを経て第三帯域（57）に輸送
される。第三帯域（57）と接触すると、第三および第四
試薬はいずれの固定化第一試薬と反応して分析物の存在
を支持する検知可能なシグナルを生じる。

三経路装置（トリオード） 第4aおよび4b図は試料液体中の分析物の検出のための改
良された三経路〔トリオード（triode）〕装置（70）を
説明する。装置は第３図のダイオード装置に対する改良
をなすものであり、この装置が試料および第一試薬が第
三および第四試薬とのこれらの試薬が第三帯域（77）と
接触する前に接触を防止する助けをなす第三クロマトグ
ラフィー溶媒輸送経路を包含する点に改良がある。装置
は、クロマトグラフィー溶媒輸送が始まる第一末端（7
4）およびクロマトグラフィー溶媒輸送が終る第二末端
（80）を伴うある長さのクロマトグラフィー材料（71）
を有している。材料は溶媒不透過性バリヤー（82−85）
により材料の左縁（88）、第一溶媒バリヤー（82）およ
び第二溶媒バリヤー（83）により定められている左手溶
媒輸送経路、第二溶媒バリヤー（83）および第三溶媒バ
リヤー（84）により定められている中心溶媒輸送経路、
および第三溶媒バリヤー（84）、第四溶媒バリヤー（8
5）および材料の右縁（89）により定められている右手
溶媒輸送経路に分割される。三つの溶媒輸送経路が合し
て中心溶媒輸送経路の延長を形成し、この経路は第一
（82）および第四（85）溶媒バリヤーおよび材料の左
（88）および（89）縁により定められている。

クロマトグラフィー材料で長さのあるものは第一帯域
（75）、第二帯域（76）、第三帯域（77）、第四帯域
（78）および第五帯域（79）からなる。第一帯域（75）
は左手クロマトグラフィー溶媒輸送経路に位置し、そし
てクロマトグラフィー溶媒中で移動可能であり、そして
分析物が固定化された形態である場合分析物により溶媒
輸送に対して反応および固定化し得る第一試薬で含浸さ
れている。第二帯域（76）は第一帯域（75）の下流にあ
り、そして第一（82）および第四（85）溶媒バリヤーに
よって定められる中心溶媒輸送経路の延長に位置する。
第四帯域（78）は右手クロマトグラフィー溶媒輸送経路
に位置し、そしてクロマトグラフィー溶媒中で移動可能
である第三試薬で含浸されている。第五帯域（79）は右
手クロマトグラフィー溶媒輸送経路に沿って装置の第二
末端（80）の方に下流にあり、そしてクロマトグラフィ
ー溶媒中で移動可能である第四試薬で含浸されている。
第三帯域（77）は第一（82）および第四（85）溶媒バリ
ヤーにより定められる中心溶媒輸送経路の延長での第一
（75）、第二（76）、第四（78）および第五（79）帯域
の下流に位置している。

第三（84）および第四（85）溶媒バリヤーおよび材料
（89）の右縁により定められる右手溶媒輸送経路は第一
溶媒バフル（86）および第二溶媒バブル（87）の位置で
あり、これらバフルは、上昇溶媒を第一末端（74）と第
二末端（80）との間の更に回路としたルートを横切るよ
うにさせることによって、右手クロマトグラフィー溶媒
輸送経路に沿ってクロマトグラフィー溶媒輸送を遅延さ
せる。

装置（70）は更にクロマトグラフィー材料（71）が付着
されている不活性支持体ストリップ（72）および材料
（71）の上にのせて材料の第一末端（74）を露出したま
まにしておくカバープレート（73）を含んでいる。カバ
ープレート（73）は第二帯域（76）に相当し、露出した
ままとする開口部を定めている。タブ（81）が第二帯域
（76）をカバーし、そして試料材料または試薬を第二帯
域（76）に適用するために除去することができる。

第4aおよび4b図の改良装置（70）は第3aおよび3b図の装
置（50）と同じ操作に従って使用される。殊に、カバー
タブ（81）はカバープレート（73）上の第二帯域（76）
上のその位置から除去し、そして分析すべき材料の液体
試料を第二帯域（76）に適用する。次に、タブ（81）を
検定操作中試料材料が乾燥するのを防止するために第二
帯域（76）上に再びのせる。装置（70）をその第一末端
（74）においてクロマトグラフィー溶媒中に浸漬し、こ
の溶媒は次に左手、中心および右手溶媒経路に沿って第
二末端の方へ下流へ進行する。右手溶媒輸送経路に沿っ
たクロマトグラフィー溶媒輸送は、第一（86）および第
二（87）バフルによりその上につけられている回旋状経
路の結果として遅延される。左手経路に沿って、クロマ
トグラフィー溶媒は第一帯域（75）で含浸された第一試
薬および第二帯域（76）で沈着された液体試料を第三帯
域（77）に輸送する。クロマトグラフィー溶媒はまた中
心クロマトグラフィー溶媒輸送経路に沿って輸送され、
このものは左手クロマトグラフィー溶媒輸送経路と右手
溶媒輸送経路との接点に達し、そして第一試薬の右手溶
媒輸送経路中への逆流を防止し、この経路において第四
および第五帯域は第一試薬と特異的に反応して着色シグ
ナルを生じる第三および第四試薬で含浸させる。第4aお
よび4b図の装置（80）が第3aおよび3b図の装置（60）に
まさる改良を示しているのは、この逆流の最小限および
次の早期反応の防止にある。この装置（60）において、
第四（58）および（または）第五試薬（59）と特異的に
反応し得る第一試薬材料の一部分はこの装置の右手輸送
経路中に逆流することができ、第一、第三および第四試
薬の量が早期に消費され、そして必らずしも分析物の検
出と組み合されない疑似シグナルが生成される得る効果
がある。

クロマトグラフィー溶媒輸送は第三帯域（77）の方向へ
輸送される試料および第一試薬を伴って続行する。第一
（82）および第四（85）溶媒バリヤーは試薬の流れを第
三帯域に集中するように設計されている。第三帯域（7
7）において、固定化された第二試薬は試料中に存在す
る分析物と選択的に反応して固定化するが、一方試料の
非分析物成分は固定化されず、第三帯域（77）から外に
輸送される。次に、第一試薬は第三帯域（77）と接触
し、ここで試薬は分析物が固定化された形態である場合
分析物により溶媒輸送に対して固定化される。同時に、
右手溶媒輸送経路を進むクロマトグラフィー溶媒は第四
帯域（78）で沈着した第三試薬および第五第四帯域（7
9）で沈着した第四試薬を担有している。第三および第
四試薬は第四溶媒バリヤー（85）により第一試薬が延長
中に輸送された後中心溶媒輸送経路の延長中にチャンネ
ル化される。クロマトグラフィー溶媒輸送が続くにつれ
て、第三および第四試薬が第三帯域（57）に輸送され、
ここでこれらの試薬がいずれの固定化第一試薬と反応し
て検知可能な着色シグナルを生じる 図面を参照するに、第５図は線５−５に沿ってみた第3a
図の試薬装置（50）の横断面図を示す。この図はクロマ
トグラフィー溶媒輸送が生じる毛管現象を有する材料
（51）を具体的に示す。材料は不活性支持体ストリップ
（52）と不活性カバーシート（53）の間のサンドイッチ
とし、これを経て溶媒輸送が起り得ない。別々の溶媒輸
送経路を示す材料の２つの部分（51）は、溶媒輸送に対
して不透過性である中心溶媒バリヤー（62）により分離
されている。溶媒バリヤー（62）は不透過性材料であっ
てもよく、あるいは溶媒クロマトグラフィー輸送はギャ
ップを横切って起らないような十分な巾の材料（51）中
の空気またはガス充填ギャップを示す。

四経路装置（テトロード） 第6aおよび6b図では試料液体中の分析物の検出のための
改善された四経路〔テトロード（tetrode）〕装置（9
0）を説明する。装置は第４図に示したトリオード装置
の改良をなすものであり、４個の溶媒輸送経路の配置が
第一試薬と第三または第四試薬との早期接触を防止する
だけではなく、第一試薬が試料が第三帯域（97）に接触
する前に試料と接触するのを防止する働きをする点で改
良されている。

装置は第一末端（94）を伴う長さのクロマトグラフィー
材料（91）からなり、この末端でクロマトグラフィー溶
媒輸送が始まり、そして第二末端を伴い、この末端でク
ロマトグラフィー溶媒輸送が終る。装置の第一末端（9
4）はその中心でひっこまされていて、装置の左および
右側面間のギャップを定めている。材料は更に溶媒不透
過性バリヤー（103−107）により四つのクロマトグラフ
ィー溶媒輸送経路に分割され、これらの経路は装置に沿
って中途で合併して第三帯域（97）が位置している中心
クロマトグラフィー溶媒輸送経路を形成する。左手のク
ロマトグラフィー溶媒輸送経路は、装置の左縁（108）
および一方の側での第一溶媒バリヤー（103）および装
置の左ギャップ縁（110）および他の側での第二、第三
（104−105）溶媒バリヤーによって定められる。右手の
クロマトグラフィー溶媒輸送経路は装置の右縁（109）
および一方の側の第五溶媒バリヤー（107）および装置
の右ギャップ縁（111）および他の側の第四溶媒バリヤ
ー（106）によって定められる。ギャップの下流および
左手、右手の溶媒輸送経路の間に左中心および右中心溶
媒輸送経路が定められる。左中心経路は一方の側の第二
溶媒バリヤー（104）および第三溶媒バリヤー（105）に
よって定められ、そしてギャップの頂上の第一末端（9
4）から左手溶媒経路に通じている。右中心経路は、一
方の側の第三溶媒バリヤー（105）および他の側の第四
溶媒バリヤー（106）によって定められ、そしてギャッ
プの頂上の第一末端（94）から右手溶媒経路に通じてい
る。

長さのある材料は第一帯域（95）、第二帯域（96）、第
三帯域（97）、第四帯域（98）、第五帯域（99）および
第六帯域（100）を有している。第一帯域（95）は左手
クロマトグラフィー溶媒輸送経路に位置し、そして第一
試薬で含浸されている。第一試薬はクロマトグラフィー
溶媒中で移動可能であり、分析物が固定化された形態で
あるときは分析物による溶媒輸送に対する固定化および
反応が可能である。第二帯域（96）は第一帯域（95）の
下流にある左手溶媒輸送経路でそして左中心溶媒輸送経
路が左手輸送経路と合併している点に位置している。第
四帯域（98）は右手クロマトグラフィー溶媒輸送経路中
に位置し、そしてクロマトグラフィー溶媒中で移動可能
な第三試薬で含浸されている。第五帯域（99）は右手ク
ロマトグラフィー溶媒輸送経路に沿って装置の第二末端
（101）の方を向いた下流に位置し、そしてクロマトグ
ラフィー溶媒中で移動可能である第四試薬で含浸されて
いる。第三帯域（97）は、第１（103）および第五（10
7）溶媒バリヤーにより定められた中心溶媒輸送経路の
延長で、第一（95）、第二（96）、第四（98）、および
第五（99）帯域の下流に位置している。第六帯域（10
0）は第二末端（101）に近い第三帯域（97）の下流に位
置し、そして第二末端で溶媒の存在を指示する第五試薬
で含浸されている。

装置（90）は更にクロマトグラフィー材料（91）が付着
されている不活性支持体ストリップ（92）および材料
（91）上におかれて材料の第一末端（94）を露出したま
まにしているカバープレート（93）を包含している。不
活性支持体ストリップ（92）およびカバープレート（9
3）に溶媒に対して不透過性であり、そしてクロマトグ
ラフィー材料をとりかこみ、その結果その縁に沿って不
透過性であり、カバープレートが第一末端（94）でクロ
マトグラフィー材料を露出している場合にのみ溶媒で湿
潤され得る。カバープレート（93）は更に第二帯域（9
6）に相当し、かつ露出したままにしておく開口部を定
めている。タブ（102）が第二帯域（96）をカバーし、
そして除去されると試料材料または試薬を第二帯域（9
6）に適用することができる。

第6aおよび6b図の改良装置（90）は第3a、3b、4aおよび
4b図の装置（50）および（70）と同じ操作に従って使用
される。殊に、タブ（102）はカバープレート（93）上
の第二帯域（96）上のその位置から除かれ、そして分析
される材料の液体試料を第二帯域（96）に適用する。次
に、タブ（102）を、検定操作中試料材料を乾燥から防
止するために、第二帯域（96）上に再びのせる。装置
（90）をクロマトグラフィー溶媒中に溶媒が四つの溶媒
輸送経路の全てについて第一末端（94）と接触するよう
な深さに浸漬し、ただし、ここではカバープレートが溶
媒輸送が第一及び第四経路よりも第二および第三溶媒経
路で第二末端の方向に下流に開始されるように設計され
ている。次に、溶媒は左手、左中心、右中心および右手
溶媒経路に沿って第二末端の方向に下流に進行する。

左中心溶媒輸送経路に沿ってクロマトグラフィー溶媒輸
送が進行し、その結果溶媒が第一帯域（95）と第二帯域
（96）との間にある左手クロマトグラフィー溶媒輸送経
路上に輸送される。左中心輸送経路は左手溶媒輸送経路
よりも短いので、この溶媒は、左手経路の第一末端（9
4）から進行する溶媒が第一と第二の帯域間の領域に到
達する前に、該帯域に到達する。左中心経路から導入さ
れる溶媒はこのようにして第一帯域（95）で沈着した第
一試薬を第二帯域（96）に沈着した試料材料から分離す
る作用をする。溶媒は第二帯域で試料物質と接触し、こ
れらを可溶化し、そしてこれらを下流に第二末端（10
1）の方に輸送する。同時に、溶媒は第一帯域（95）で
含浸された第一試薬と接触し、そして第一末端（84）か
ら「下流」に進行する溶媒フロントに会合するまで第一
末端（94）の方向にこの「上流」を輸送する。次に、第
一試薬は第三帯域（101）の方向に下流に輸送される
が、左中心溶媒輸送経路により導入される溶媒の塊によ
り試料材料から分離される。左中心溶媒輸送経路から導
入される液体の集団はまた場合によって試料材料が乾燥
している場合に有用である。溶媒の集団は往々にして材
料を可溶化し、そして試料と第一試薬との間の分離を維
持しながら輸送するのに十分な時間を提供する。

右中心溶媒輸送経路に沿ってクロマトグラフィー溶媒輸
送は、溶媒が右中心輸送経路と右手輸送経路との接点に
輸送されるように進行する。右中心経路は右手経路より
も短く、そして右手経路は装置の第四溶媒バリヤー（10
6）と右縁経路よりも短く、そして右手経路は装置の第
四溶媒バリヤー（106）と右縁（109）との間に収縮され
ているので、右中心経路を経て右手経路との接点に輸送
される溶媒は、溶媒が右手経路に沿って「下方に」流れ
る前に、この点に達する。次に、溶媒は、右手輸送経路
を経て下流の流れに会合する前に第四（98）および第五
帯域（99）においてそれぞれ含浸された第三および第四
試薬を混和する右手経路の第一末端（94）の方に「上流
に」流れる。正味の溶媒流「下流」は次に第三および第
四試薬を第三帯域（97）の方に輸送する。一方、右中心
経路を経る溶媒流れは試料および第一試料が第三および
第四試薬に逆流、混和するのを防止するのに役立ってい
た。

クロマトグラフィー溶媒輸送は第三帯域（97）の方に輸
送される試料および第一試薬と共に続行する。第三帯域
（97）で、第二固定化試薬は試料中に存在する分析物と
特異的に反応して固定化するようにする。試料の非分析
物成分は第三帯域（97）から輸送されてしまう。次に、
第一試薬は第三帯域（97）と接触して、ここで分析物が
固定化された形態であるとき分析物による溶媒輸送に対
して固定化される。同時に、右手溶媒輸送経路に沿って
進行するクロマトグラフィー溶媒は、いずれの未結合第
一試薬材料が第三帯域（97）をすぎて輸送された後、第
三および第四試薬を第三帯域に輸送する。第三帯域（9
7）において、第三および第四試薬はいずれの固定化第
一試薬と反応して検知可能なシグナルを生成し得る。染
料化合物例えばジアゾニウム塩を第三または第四試薬と
して使用する場合、着色シグナルは往々にして使用され
たクロマトグラフィー溶媒に不溶である着色された複合
体であり、それにより反応された染料は第三帯域（97）
で固定化される。

装置は、クロマトグラフィー溶媒が第二末端（101）に
達しなく、そして試料、および第一、第三および第四試
薬が第三帯域に接触するまでクロマトグラフィー溶媒輸
送が続くのに十分な長さを有するように設計されてい
る。クロマトグラフィー溶媒が装置の丈を十分に進行し
たかどうかを決定するために、第六帯域（100）を装置
の第二末端（101）の近くにおいてもよい。この帯域
は、溶媒の存在を指示する物質例えば硫酸銅であってよ
い第五試薬で含浸させてもよい。それで、第六帯域が溶
媒が装置の全体の長さを進行したことを示すシグナルを
提供する場合、第三帯域は陽性または陰性反応を検出す
るための観察の用意ができている。

クロマトグラフィーストリップ材料の説明 本発明で有用なクロマトグラフィーストリップ材料は、
選択されたクロマトグラフィー溶媒により固定化されて
いない試薬および反応性試料成分のクロマトグラフィー
溶媒輸送のための毛細管特性および容量特性を有する材
料を包含する。例えばペーパークロマトグラフィーに使
用するような種々のクロマトグラフィー支持体材料が本
発明に使用するのに適しているが、薄層クロマトグラフ
ィー支持体の使用が本発明の使用に好ましい。その理由
はこのような支持体の使用により本発明による検定の速
度および分解が改善されるからである。材料は好ましく
は不活性であり、そして一般には分析物、試薬あるいは
反応生成物のいずれとも物理的または化学的に反応しな
いものである。材料は織布および非織布を包含するペー
パークロマトグラフィー技術で使用するのに適した繊維
状材料を包含していてもよい。更に好ましいのは微孔性
もしくは微粒状構造を有する材料であり、薄層クロマト
グラフィーで使用するのに適した微孔性もしくは微粒状
材料が特に好ましい。

本発明に特に適した薄層クロマトグラフィー材料には粒
状薄層クロマトグラフィー材料例えばシリカまたは微粒
状セルロースを包含する。好ましい非粒状微孔性材料に
は微孔性セルロースエステル例えば脂肪族カルボン酸例
えば１−７個の炭素原子を有するアルカンカルボン酸例
えば酢酸、プロピオン酸、または酪酸もしくは吉草酸の
いずれとセルロースとのエステルが包含される。特に好
ましいのはニトロセルロースから製造した微孔性材料で
あり、この用語はセルロースのいずれの硝酸エステルを
企図している。適当な材料には前記カルボン酸セルロー
スエステルのいずれかと組合さったニトロセルロースが
包含される。それで、純粋なニトロセルロースエステル
は約３個の硝酸基/6個の炭素原子を有するセルロースの
エステルからなるようなものとして使用することができ
る。最も好ましいのは、0.45μｍの気孔サイズを有する
商品名「ミリポア・タイプHAWP」（Millipore Type HAW
P）〔ミリポア・コーポレーション（Millpore Cor
p.）、ベッドフォード．マサチューセッツ〕のもとでの
混合アセテート／ナイトレートセルロースエステル材料
である。

種々のクロマトグラフィー材料はそれ自体適当な形状例
えばフィルム、ストリップまたはシートで使用し得る。
これらの材料は適当な不活性支持体材料例えば紙、ガラ
ス、プラスチック、金属または織布に被覆、貼付または
積層してもよい。（一つの好ましい不活性支持体材料は
ミラー（Mylar）である。）このような支持体材料はク
ロマトグラフィー材料に構造上の支持を与える効果を有
するだけではなく、検出操作中の試薬および溶媒材料の
蒸発を防止する。多孔性固体支持体は好ましくは約0.01
mm乃至約0.5mm、最も好ましくは約0.1mmの範囲の厚さの
ストリップの形態である。ストリップはその他の寸法で
大巾に変り得るが、検定展開時間を短かくしおよび材料
の使用を最小限とするためにかなり小さくするのが好ま
しい。ストリップのサイズが極度に小さいときは、取り
扱いおよび得れた結果の観察を助けるためにストリップ
は適当なハンドルまたはホルダーに付着させることがで
きる。巾約3mm、長さ75mmのストリップが本発明による
単一経路装置を組立てるのに特に適当であることがわか
った。複数経路の装置は複数の経路が形成されているよ
り大きいストリップを用いることができる。孔サイズは
広い限度内で変えることができるが、好ましくは約0.05
−10μｍ、殊に約0.1−1.0μｍ、最も好ましくは約0.45
μｍである。孔サイズと支持体厚さとの組合せは、所望
の速度および分解の特性を得るために使用する特定の試
薬の特徴に従って変えることができる。

本発明の材料の形をつくるに当り、材料中の不均一な流
れを生じ得る材料あるいは材料の先端での不整合さを避
けるのが望ましい。ストリップ材料の好ましい形成手段
は、タングステンカーバイド回転刃を有するペーパーカ
ッターを使用することを包含する。他の適当な手段には
例えば大量生産に用いるのに特に適しているレーザー・
カッターのような方法が包含される。

装置のストリップ材料は化学的に不活性であるのが好ま
しいので、第二試薬が第三帯域で溶媒輸送に対して固定
化されるために、第三帯域で活性化されなければならな
いこともある。ストリップ材料および第二試薬の特別な
化学的性状に従って第二試薬を固定化するのに種々の方
法を必要とする。一般に、ストリップ材料がニトロセル
ロースまたは混合ニトロセルロースエステルである場
合、第二試薬の固定化に特別な化学結合を必要としな
い。他の材料および試薬について種々の技術を使用する
ことができ、これらの技術には例えばカルボニルジイミ
ダゾール、グルタールアルデヒドまたはコハク酸のよう
な材料による官能化あるいは例えば臭化シアンのような
材料による処理を包含する。その他の適当な反応にはア
ルヒデド、カルボニルおよびアミノ基の還元のためのシ
ツフ塩基およびホウ水素化合物による処理が包含され
る。DNA、RNAおよびある種の抗原はストリップ材料に焼
き込むことにより溶媒輸送に対して固定化することがで
きる。焼き込みは約60℃〜約120℃の範囲の温度で約５
分〜約12時間に変る時間実施することができる。好まし
くは約80℃で約２時間である。

抗体の説明 本発明の免疫検定を実施するのに有用な抗体は、生物学
的液体中のその検出が所望されている種々の分析物と特
異的に反応し得るものを包含する。このような抗体は好
ましくはIgGまたはIgM抗体あるいはその混合物であり、
これらは非分析物分子と結合可能な抗体との組合せを本
質的に含有していない。抗体はポリクロナールまたはモ
ノクロナールであってよく、市販されているかあるいは
マウス腹水、組織培養あるいは当該分野で知られている
他の技術により得られる。モノクロナール抗体生産のた
めのハイブリドーマ操作の典型的な説明は次のものにみ
られる。J.R.ワンズ（Wonds）およびV.R.ズラウスキー
（Zurawaki）、ガストロエンテロロジイ（Gastroentero
logy）、第80巻、第225頁（1981年）；マーシャク−ロ
ステステイン（Marohak−Rothstein）、A.等、J.イムノ
ル（J.Immunol.）、第122巻、第2491頁（1979年）；オ
イ（Oi）V.Y.およびL.A.ヘルツエンベルグ（Herzenber
g）、「イムノグロブリン・プロデューシング・ハイブ
リッド」（Immunoglobulin Producing Hybrid）、ミシ
エル（Mishell）、B.B.およびS.M.シイギ（Shiigi）
（編）、「セレクテッド・メソッズ・イン・セルラー・
イムノロジイ」（Selected Methods in Cellular Immun
ology）、サンフランシスコ:W.H.フリーマン（Freema
n）、パブリッシング（Publishing）、1979年；および
クング（Kung）等の米国特許第4,515,893号。異った抗
原特異性のモノクロナール抗体あるいはモノクロナール
抗体とポリクロナール抗体の混合物の使用が望ましいこ
ともある。抗体の特別の源またはタイプとは無関係に、
一般に不純物を含まないのが好ましい。抗体はカラムク
ロマトグラフィーまたは他の通常の手段で精製すること
がでるが、既知の親和精製技術により精製するのが好ま
しい。

抗原の説明 本発明の免疫検定を実施するのに有用な抗原は、本発明
のクロマトグラフィーストリップ材料に存在する場合分
析物抗体が特異的に反応性を有する抗原決定基を提示す
る天然または合成の材料である。合成抗原には通常の化
学合成ならびに組換えDNA技術に従って構成されるもの
が包含される。抗原材料は特定の抗体の検出のためのサ
ンドイッチ検定での反応帯域に結合された反応材料とし
て用いることができる。これらの材料は固定化抗体の検
出のためのシグナル分子と同じ検定で標識し、用いるこ
とができる。

免疫検定のための遮断剤の説明 本発明の免疫検定の装置の製造に有用な遮断剤には、本
発明の試料材料または試薬のクロマトグラフィー溶媒輸
送を阻害し得るクロマトグラフィーストリップ材料での
過剰の結合部位を遮断し得るものが包含される。本発明
の装置の構成において、第二試薬をまず第三帯域で固定
化する。一且第三帯域で第二試薬が固定化されてしまう
と、次にストリップを試薬または試料材料のクロマトグ
ラフィー溶媒輸送を干渉するクロマトグラフィー材料の
過剰の結合部位を遮断するように処理する。非特異的蛋
白質例えばゼラチンまたは総血清中に存在するようなも
のからなる遮断溶液の使用が特に適当である。このよう
な蛋白質は検定の試薬材料と干渉または交差反応しない
ように選択される。部位の遮断は血清溶液例えば生理食
塩水中の３％牛血清アルブミン（BSA）で処理すること
によって実施し得る。次に、ストリップを30℃〜50℃の
範囲、好ましくは40℃の温度で２時間以内の間培養し、
そして生理食塩水で洗う。しかし、免疫検定のための好
ましい遮断材料はゼラチン溶液例えば培養を必要としな
い１％LBゼラチン溶液である。

免疫検定のための溶媒系の説明 本発明による免疫検定のための適当なクロマトグラフィ
ー溶媒系には、分析物、第一試薬ならびにいずれの追加
の試薬および材料を可溶化し、そしてこれらを第三帯域
に輸送し得る溶媒が包含される。このような溶媒は、ス
トリップ材料と輸送された材料との静電相互作用を防止
するのに十分なイオン強度を有していなければならな
い。本発明による免疫検定操作に使用するのに好ましい
溶媒は中性範囲のpHを有する生理食塩水溶液である。蛋
白質ならびに清浄剤例えばドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）、トライトン（Triton）Ｘ−100およびナトリウムオ
キシコレート（DOC）は、ストリップ材料との非特異的
結合を最小限とするが所望の結合および固定化反応を阻
害するような過剰量でないような量でクロマトグラフィ
ー溶媒に混入することができる。その他のクロマトグラ
フィー溶媒例えば高性能液体クロマトグラフィー（HPL
C）溶媒および高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）
溶媒（蛋白質および他の試薬の可溶化に有利に働きかつ
ストリップ材料例えばニトロセルロースへの結合を最小
限とする溶媒）を使用し得る。パレク（Parekh）等、ア
ナル．ビオケム（Anal.Biochem.）第148巻、第87−92頁
（1985年）には種々のクロマトグラフィー溶媒例えば酢
酸アンモニウム緩衝剤（pH 8.9）中の50％ピリジンある
いは40％アセトニトリルの溶液が開示され、これらは本
発明の免疫検定に特に適当である。

DNAおよびRNA交雑材料の説明 本発明によって有用なDNAおよびRNA交雑材料は、一般に
分析物遺伝子材料に相補的である塩基配列を有する標識
および未標識DNAおよびRNAポリヌクレオチドプローブを
包含している。本発明のプローブは一般に約25〜10,000
の塩基、好ましくは約30〜5,000の塩基を有している。
プローブは分析物遺伝子材料の塩基配列に対して完全に
相補的である必要はなく、そして一般に塩基配列間に約
70％あるいはより大きいホモロギイ（homology）が存在
していることを条件として交雑される。DNAおよびRNA交
雑に係る条件はクロサ（Crosa）等、J.バクト（Bac
t.）、第115（３）巻、第904−911頁（1973年）に一般
的に開示されている。ポリヌクレオチドプローブ材料は
当該分野で周知の技術に従って得ることができる。例え
は、コルンベルグ（Kornberg）、DNAレプリケーショ
ン、W.H.フリーマン・アンド・カンパニ、サンフランシ
スコ、670−679頁（1978年）；ダラス（Dallas）等、J.
バクテリオル（J.Bacteriol）、第139巻、第850−858頁
（1979年）およびソウ（So）等、ネイチュア（Natur
e）、第277巻、第453−456頁（1979年）を参照。

本発明の一つの交雑サンドイッチ検定操作によると、検
定装置の第一帯域を第一試薬で含浸させ、この試薬は標
識されていてもよく、分析物核酸の塩基配列の第一部分
に一般的に相補する塩基配列を有するポリヌクレオチド
プローブからなる。第三帯域で、分析物核酸の塩基配列
の第二部分に一般的に相補する露出された塩基配列を有
するポリヌクレオチドからなる第二試薬を固定化する。
検定操作によると、試料を含む分析物を第二帯域に適用
し、そして交雑条件下に第三帯域にクロマトグラフィー
で輸送し、その結果分析物材料は第二試薬の塩基配列に
対するその塩基配列の第二部分の交雑によって固定化さ
れる。第一試薬は次に交雑条件下に第三帯域にクロマト
グラフィーで輸送され、この帯域で分析物分子塩基配列
の第一部分の塩基配列によるその塩基配列の交雑によっ
て固定される。試料成分および第一試薬の相対移動度あ
るいは第二および第三帯域間の部位の関係は、分析物が
処理され、第一試薬が第三帯域に到達する前に第三帯域
で溶媒輸送に対して固定化される。更に、干渉性試料成
分および第一試薬と反応し得る試料の非分析物成分は第
一試薬が第三帯域にクロマトグラフィー輸送される前に
第三帯域から除去される。

交雑検定のための遮断剤の説明 本発明によるポリヌクレオチド交雑検定で使用するのに
適した遮断剤には、本発明の試料材料または試料のクロ
マトグラフィー溶媒輸送を阻害し得るクロマトグラフィ
ーストリップ材料での過剰の結合部位を制限または遮断
し得る遮断剤が包含される。更に、かかる材料は本発明
の試料および試薬ポリヌクレオチド材料の交雑を阻害し
てはならない。交雑検定のための好ましい遮断剤は、SS
PE緩衝剤（それ自体は0.9M NaCl、560mM NaH₂PO₄、およ
び5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（pH 7.4）およ
びデンハルト（Denhardt′ｓ）溶液〔0.1％フィコル（F
icoll）、0.1％ポリビニルピロリドンおよび1mg/ml BSA
からなる〕からなる溶液である。第二試薬が固定化され
たニトロセルロースストリップは、この溶液で２時間65
℃で密封バッグ中で処理することにより遮断される。

交雑検定のための溶媒系の説明 本発明によるポリヌクレオチド交雑検定のための適当な
クロマトグラフィー溶媒系には、分析物、第一試薬およ
びいずれの追加の試薬および材料を可溶化しそしてこれ
らを第三帯域に輸送し得る溶媒が包含される。本発明に
よるポリヌクレオチド交雑検定に使用するための好まし
い溶媒は、SSPE緩衝剤（それ自体は0.9M NaCl、560mM N
aH₂PO₄、およびmM EDTA（pH 7.4）からなる）、デンハ
ルト溶液（0.06％フィコル、0.06％ポリビニルピロリド
ン0.6mg/ml BSA）および50％脱イオン化ホルムアミドか
らなる。好ましい溶媒は随意担体DNA例えば100μg/mlヒ
ト胎盤DNAあるいはサケ精子DNAを包含していてもよい。

経路操作および溶媒バリヤー 本発明により試薬および試料材料の連続輸送を達成する
のに種々の手段が知られている。このような手段は、試
料材料および試薬の配置、試料材料および試薬が輸送さ
れる経路（pathway）の長さの変化およびこの輸送が起
る速度の操作を包含し得る。経路距離を変更するための
手段には、溶媒バリヤーの使用による渦巻形経路の形勢
が包含される。

本発明によるクロマトグラフィー流れを遮断する溶媒バ
リヤーは種々の物理的または化学的エッチング技術によ
り形成することができる。巾0.1mm未満ギャップが液体
の流れを阻害することがわかった。しかし、このような
ギャップを形成するための好ましい手段はレーザーエッ
チング技術の使用を包含する。一つの操作によると、CO
₂レーザーを使用することができ、この場合ミラー裏う
ちしたニトロセルロースを支持取付具にとりつけ、この
取付具は極めて接近した配置許容差の可能なコンピュー
ター制御Ｘ−Ｙテーブルにとりつけられている。あるい
はまた、ビーム移動メカニズムを使用してもよい。適当
な光学レンズおよび慎重なビーム焦点合せの組合せを用
いて、約0.005インチの直径を有するレーザービームス
ポットをニトロセルロース上に焦点合せすることができ
る。レーザー出力を慎重にコントロールすることによ
り、巾約0.005インチのニトロセルロースの狭い経路を
ミラー裏うちから除去するかあるいはこれに溶融するこ
とができる。

CO₂レーザーの使用は、レーザーからの光とニトロセル
ロースとの好ましいカップリング効果のために特に好ま
しい。しかし、レーザービームの波長が溶媒輸送材料に
所望の効果を生じるならば、他のタイプのレーザーも適
当である。移動ビームあるいはＸ−Ｙテーブルの使用に
より、正確な経路そらせチャンネルあるいはその他の複
雑な形状をニトロセルロース上に発生させることができ
る。

溶媒、試薬および試料材料のクロマトグラフィー輸送速
度を変更することにより経路を有効に延長もしくは短縮
させるために、機械的および化学的手段を使用すること
ができる。適当な手段にはクロマトグラフィー支持体の
親水性を様々の程度に変更することが包含される。支持
体の親水性は、種々の物質例えば蛋白質あるいは清浄剤
をストリップ上での材料の表面張力あるいは粘度に影響
を及ぼす媒質あるいはクロマトグラフィー溶媒に加える
ことによって化学的に変化させることができる。このよ
うな材料は、輸送されるレーンを経で輸送されるべき反
応材料と相容性を有していなければならず、また平版印
刷あるいは当該分で既知の他の技術によって適切なレー
ンに選択的に適用することができる。

ストリップ材料が薄層クロマトグラフィー支持体を包含
していないときは、機械的手段を使用して支持体の気孔
度、ひいてはクロマトグラフィー輸送の速度を変更する
こともできる。多孔性クロマトグラフィー材料例えば紙
の圧縮により材料の孔サイズが減少され、これにより一
般に該支持体を通した材料の拡散速度が増大される。あ
るレーンを選択的により大きいかまたは小さい範囲に圧
縮し、そして他の圧縮をしないことにより、反応材料の
第三帯域へのクロマトグラフィー配送をプログラム化す
ることが可能である。材料は当業者に知られている通常
の彫刻技術により圧縮することができる。

検出手段 第三帯域での第一試薬の検出のための種々の手段が利用
可能である。このような手段は一般に検知し得るシグナ
ルを生じ得るシグナル分子で第一試薬を標識することを
包含し、このシグナル分子は放射性同位元素標識、発色
団、螢光団あるいは酵素ラベルであってよい。放射性同
位元素で標識したシグナル分子は検知可能なシグナルを
放出するのに特に有効であるが、これらの検出には特別
な装置を必要とし、また健康および安全上の難点を提示
する。特に好ましいのは、可視ペクトル中の光を包含す
る検知可能なシグナルを生じる標識指示薬分子の使用に
ある。特に適当なのは、酵素レベルの使用にあり、ここ
では第一試薬分子は酵素または補酵素で標識し、次に検
知し得るシグナルを生成するように放射線を吸収あるい
は放出する色素材料を活性化する反応を接触する。

本発明のシグナル生成システムに有用な酵素系にはアル
カリ性ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼお
よびβ−ラクタマーゼを包含する。シグナル生成システ
ムに有用なその他の酵素および補酵素には、米国特許第
4,275,149号（第19−20欄）および米国特許第4,318,980
号（第10−14欄）に開示されたものが包含され、これら
の記載を参考として本文に挿入する。染料前駆体を染料
に酸化する過酸化水素を生産する酵素の使用は当該分野
で周知である。適当な組合せには、サッカリドオキシダ
ーゼ、例えばグルコースオキシダーゼおよびガラクトー
スオキシダーゼならびにヘテロサイクリックオキシダー
ゼ例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ（酵
素例えばペルオキシダーゼおよびチトクロームＣオキシ
ダーゼと組合されて過酸化水素を生成し、そして染料前
駆体を酸化する）が包含される。その他のオキシドレダ
クターゼの使用もまた酵素例えばヒドロラーゼおよびト
ランスフェラーゼの使用の如く適当である。種々の補酵
素例えばNADH、NADPH、ピリドキサルホスフェート、FAD
HおよびFMNHは特にオキシドレダクターゼと組合せて使
用し得る。

実施例1. この実施例では、梅毒抗体の検出のための単一経路の免
疫検定装置を製造し、使用した、厚さ約0.1mmおよび平
均孔サイズ0.45μｍを有する微孔性ニトロセルロース材
料を厚さ約0.1mmの不活性ミラー（Mylar）支持体シート
〔ミクロン・セパレーション・インダストリース（Micr
on Separation Industries）、ウオルサム（Waltha
m）、マサチューセッツ〕に流延した。27mm×31mmの寸
法の片をロータリー・ブレード・ペーパー・カッター
〔アルビン、ウンザー、Ct.（Alvin,Windsor,Ct.）〕で
切断した。装置の組立てを助けるために、グリッドをニ
トロセルロースにグラフィックス・ソフトウエア・パッ
ケージおよびヒコーレット・パッカード（Hewlett Pack
ard）9816コンピコーター〔パロ・アルト・Ca.（Palo A
lto,Ca.）〕を用いてインクジェットプリンター〔ヒコ
ーレット・パッカード、シンクジェット、（Thinkje
t）、パロ・アルト・Ca.〕でプリントした。グリッドは
3mm間隔で５ラインで交叉している巾約3mm、長さ31mmの
番号を付けたレーンの多くのものからなるグリッドであ
り、最初のラインはグリッドの最初の端から9mmであっ
た。第一と第二のラインは第一帯域を定め、第三のライ
ンは第二帯域の中心を定め、そして第四と第五のライン
は第三帯域を定めている。27mm×29mmのミラーカバープ
レートを用いてニトロセルロースに被せて第一端で露出
したニトロセルロースの被覆していない2mmタブを残し
た。更に、第二及び第三帯域に相当するニトロセルロー
スカバーに直径2mmの孔をパンチした。更に、9mm×27mm
のミラーストリップを切断してクロマトグラフィー中孔
を被った。ミラーの両片を一面でラバーセメント〔スタ
ンフォード、ベルウッド、Il（Stanford,Bellwood,I
l）〕で被覆し、そして少くとも１時間乾燥させた。

トレポネマ・パリダム（treponema pallidum）を包含す
る梅毒抗原を兎の睾丸内注射により単離し、そして示差
遠心分離により精製した。抗原を抗原10⁹細胞/mlの濃度
で1mg/mlの濃度の牛血清アルブミンと共に包含するTBS
溶液の0.5μｌアリコート中交互のレーンで第三帯域に
施した。交互のレーンを一つのレーンからの材料が他の
ものを汚染しないように用いた。次に、ニトロセルロー
スを室温で１時間ゆっくりとかくはんしてTBS溶液（0.1
5M NaCl、0.02MトリスーHCl、pH 7.6）中LBゼラチン
〔イノテク、ボーレン（Inotech,Wohlen.）スイス〕の
１％溶液と共に培養することによって防護した。次に、
シートを排水し、風乾した。

ペルオキシダーゼ標識山羊ヒトIgG抗体〔カークガード
−ペリ（Kirkegaard−Perry）、ゲッティスバーグ、メ
リーランド〕を１％LBゼラチンおよび1.0％トライトン
（Triton）Ｘ−100からなる混合物中1:5の比で希釈し
た。抗体混合物を次に0.5μｌアリコートで予め抗原を
適用しておいた同一レーンの第一帯域に適用した。次
に、１％LBゼラチンおよび1.0％トライトンＸ−100から
なる同じ希釈剤混合物を0.5μｌアリコートで装置の第
二（試料受容）帯域の加えた。

ミラー支持体ストリップおよびカバーシートを処理ずみ
ニトロセルロースに貼付し、その結果第二及び第三帯域
および第一の端2mmが露出された。陽性および陰性血清
試料を0.5μｌアリコートで第二帯域に適用し、そして
試料ポートを予め調製したミラーストリップで被った。
次に、シートの第一端をTBSおよび１％ゼラチンを包含
する溶媒に浸漬し、そして液体フロントを約10分間かけ
てシートの頂部に上昇せしめた。カバーシートをはく離
すると露出されたクロマトグラフィー材料が残った。次
に、ストリップの第三の帯域を15分間TBS 10ml、30％過
酸化水素溶液４μｌおよび3mg/mlの濃度でメタノール中
に４−クロロナフトールを包含する溶液0.8mlからなる
ペルオキシダーゼ指示薬溶液中に浸漬した。陽性血清お
よび酵素標識抗体の存在は第三帯域での青黒色スポット
の存在となって生じた。

実施例2. この実施例では、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）に対す
るAIDS患者抗体を検出するための単独エッチ経路装置を
製造した。実施例１の一般操作を用いたが、但しニトロ
セルロースを実施例１の方法論に従ってラバーセメント
を用いて８インチ×11インチミラーシートに手でのり付
けした。バッキングを経て燃焼することなくCO₂レーザ
ーでの調節した処理により、平行ラインをニトロセルロ
ースに3mm間隔でエッチングした。〔レーザー・エイジ
・インコーポレーテッド（Laset Age Inc.）ワウケガン
（Waukegan）、Il〕。この実施例では、すべてのレーン
をチャンネル間の液流がなかったものとして用いた。

適当なHIV抗原〔ガロ（Gallo）、米国特許第4,520,113
号〕を製造からの洗浄剤を除くために30分間30％重量／
容量バイオビーズ（Biobeads）〔バイオラド（Biora
d）、リッチモンド、Ca.〕で処理した。次に、抗原を実
施例１の方法に従ってニトロセルロースに適用した。次
に、実施例１に従ったペルオキシダーゼ標識山羊抗ヒト
IgGを第一帯域に適用し、そして実施例１の残余の操作
に従った。陽性および陰性HIV血清試料による試験で陽
性試料に対して陽性呈色反応が生じ、また陰性試料に対
して呈色反応が生じなかった。

実施例3. この実施例では、特定の抗原を検出するためのに単独経
路免疫検定装置を記載する。この装置は原則的には実施
例１の抗体検出装置と類似しているが、但し検出すべき
抗原と特異的に反応する抗体を装置の第三帯域での溶媒
輸送に対して固定化し、この帯域で抗体は分析物試料に
関連する物質を含む抗原と選択的に結合する。このよう
に固定化された抗原材料は次に関連のある抗原の同一ま
たは他の抗原性エピトープと特異的に反応する標識抗体
で処理することによって検出することができる。

微孔性固体基質材料、好ましくは約0.1mmの厚さのニト
ロセルロースを好ましくは同一の厚さのミラーシートに
流延する。次に、グリッドを、巾約3mmおよび長さ約20
−100mm好ましくは長さ約75mmの数多くのレーンを包含
するインクジェット・プリンターでニトロセルロースに
プリントした。次に、検定すべき抗原の１種またはそれ
以上の抗原決定基と特異的に反応する抗体材料をストリ
ップの一端の近く、好ましくは一端から約10mmの位置で
ストリップの第三帯域に適用する。抗体材料はポリクロ
ナールまたはノモクロナール抗体あるいはこれらの組合
せであってよく、そしてIgG、IgMまたは他の組みの免疫
グロブリンもしくはこれらの組合せであってよい。抗体
は手操作の手段例えば毛細管、ピペットまたは液体噴霧
剤によって多孔性基体に適用することができる。免疫グ
ロブリンをスプレーによって適用する場合、例えばミク
ロエレクトロニクス分野で知られている操作によって小
形化された型板もしくはアプリケーターを既知の平板印
刷技術と組合せて使用することができる。

抗体は第三帯域に任意の適当な幾何学例えばドット、ラ
インまたはスポットを提供するように適用することがで
きる。抗体溶媒は１μｌよりも少い量で適用されるのが
好ましく、約0.5μｌの量が直径約１〜2mmのスポットを
生成するのに特に好ましい。このサイズの帯域が陽性呈
色シグナルの目でみる検査に依存する装置にとって好ま
しい。少い目の量の抗体溶液もまた使用し得るが、この
量では分光光度手段による評価を必要とする小さい目の
帯域を生成し得る。本発明の装置を非可視的手段例えば
反射分光光度計により評価することが企図されている場
合、0.5μｌよりも少い量を、本発明の装置の組立に必
要な抗体材料の量を更に減少させるように適用すること
が好ましい。

溶液で適用される抗体の濃度は好ましくは本発明のニト
ロセルロースシートに適用される場合約100−150μg Ig
M/溶液mlの範囲にある。約120−140μg IgM/溶液mlの範
囲の抗体濃度が最も好ましい。更に高い濃度が適用し得
るが、第三帯域の結合効能を増大させるのに役立つこと
がない。更に低い濃度もまた適用することができ、陽性
結合シグナルの密度が減退する効果がある。更に低い抗
体濃度は陽性シグナル強度を試験結果の可視的評価を阻
害する程度に減少させることが企図されているが、減少
された結合シグナル強度は本発明の装置の自動化された
評価のための分光光度またはその他の技術を不当に阻害
しないことが企図されている。

抗体材料を第三帯域に添加した後、第三帯域およびスト
リップ材料の残部は好ましくは防護剤例えば１％LBゼラ
チン溶液で処理する。この時点で、分析物の１種または
それ以上の抗原決定基と特異的に反応する標識材料を包
含する第一試薬を第三帯域と第一端との間に位置する第
一帯域に適用する。この標識抗体材料はクロマトグラフ
ィー溶媒輸送に対して固定化されてなく、クロマトグラ
フィーで移動性であって、その結果第三帯域に輸送され
得るようになることが企図されている。第一試薬は例え
ば毛細管、ピペットまたは液体噴霧剤のような手段で適
用することができる。抗体材料はポリクローナルまたは
モノクローナルであってよく、分析物で表わされる抗原
に対して特異的に反応し得る限り様々なサブタイプおよ
びエピトープ特異性を有していてよい。抗体材料は標識
され、それにより可視的、分光光度あるいは他の手段に
より検出することができる。検出可能な呈色反応を接触
する酵素結合抗体が特に好ましい。

第三帯域に固定抗体または第一帯域に標識クロマトグラ
フィー移動抗体を適用した後、装置は、第三帯域および
随意第二帯域を除き、一態様ではストリップの端で３−
5mmに対してミラーであってよいカバーで被ってもよ
い。カバーはクロマトグラフィー溶媒の蒸発および装置
のいずれの揮発性試薬の蒸発を防止する。

抗原検定装置を使用するために、血清あるいは他の生物
学的もしくは非生物学的体液であってよい試料を装置の
第二帯域に適用する。試料溶液は0.1μｌ−５μｌの量
特に好ましくは１μｌの量で適用される。抗原濃度と活
性との相違により、これらの量は変化し得るが、適切な
容量を決定するのは当業者に能力内に十分にある。

試料材料の適用後、試験装置のクロマトグラフィー溶媒
溶液に浸漬する。一つの好ましい溶媒は１％LBゼラチン
溶液を包含するが、当業者で知られている他のクロマト
グラフィー溶媒は同等に有用である。溶媒は第三帯域の
方に溶媒フロントの若干後ろに第一試薬の抗体を輸送す
るストリップを経て進行する。溶媒フロントが試験装置
を上に進行するにつれて、これが次に試料材料に出会
い、材料を第三帯域の方に担送し、輸送する。試料材料
は溶媒フロントよりも若干先に輸送され、一方第一試薬
材料は溶媒フロントより若干後に輸送される。結果とし
て、２個の材料は混和しない。分析物材料が第三帯域で
第二試薬により固定化される場合のみ、第一試薬は分析
物に追いつき、そして反応する。試料中に含まれる他の
材料は溶媒によりクロマトグラフィーで輸送され続け、
そして第三帯域から除去される。分析物材料が第三帯域
に結合されていない場合、第一試薬は続いてクロマトグ
ラフィーで輸送され、そして第三帯域から除去され、こ
れによって該帯域でシグナルを生じない。

実施例4. この実施例では、HIVの検出のための２経路「ダイオー
ド」装置を製造した。この実施例によれば、試験装置は
第３図の装置の一般形態でニトロセルロースおよびミラ
ー層双方を切断する高エネルギーレーザーで切断した。
より低いエネルギービームでの第二のパスはニトロセル
ロース層のみを切断して２つのクロマトグラフィー溶媒
輸送経路を創成する。第三帯域は実施例２に記載したの
と同一のHIV製剤で含浸し、そして第一帯域を実施例２
の方法に従って同じペルオキシダーゼ標識山羊抗ヒトIg
G抗体で含浸した。この実施例の装置はまた第四および
第五の帯域を包含し、この場合酵素基質化合物および色
素化合物からなる第三および第四試薬で含浸した。第四
帯域は0.1Mトリス塩基中0.1M 5−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルホスフェートからなる第三試薬で含浸
し、一方第五帯域は水中の0.1Mニトロブル−テトラゾリ
ウム〔シグマ（Sigma）〕の0.5μｌからなる第四試薬で
含浸した。次に、全体の装置を第二（試料）帯域で試料
ポートと共にミラーカバーで被った。陽性および陰性HI
V血清試料を第二帯域に適用し、そして装置を１％LBゼ
ラチンおよびTBSからなる溶媒中に浸漬した。陽性血清
試料は陽性呈色反応を示し、一方陰性血清試料では陰性
呈色反応を示した。

この実施例の装置の変化には第４図および第６図に例示
したとおりの「トリオード」および「テトロード」を包
含する。これらの装置には同じ試薬および材料を導入す
るが、但し追加のチャンネルを装置にエッチングする。
これらのチャンネルは試薬の混和および輸送に時間を合
わせ、そして試薬と試料材料との早期混和を防止するの
に使用し得る。

実施例5. この実施例では、単独経路ポリヌクレオチド交雑検定装
置を製造し、そして使用する。巾約5mm×長さ55mmで厚
さ約0.1mmの微孔性ニトロセルロース材料の片を厚さ約
0.1mmのミラー（Mylar）支持体シート上に流延する。ス
トリップを0.9M NaCl、560mM NaH₂PO₄および5mM EDTA
（pH 7.4）からなるSSPE緩衝液で予備湿潤する。ストリ
ップの第一端から約27mmの第三帯域に、0.9M NaCl、560
mM NaH₂PO₄および5mM EDTA（pH 7.4）からなるSSPE緩衝
剤中の分析物ポリヌクレオチドの塩基配列の第一部分に
一般的に相補する約15ピコモルの直鎖変性DNAを包含す
る第二試薬溶液約1.5μｌを加える。次に、このストリ
ップを風乾し、そして２時間80℃で焼成する。

第二試薬を適用したストリップ材料を次にSSPE緩衝液で
予備湿潤し、そしてSSPE緩衝剤ならびに0.1％フィコル
（Ficoll）、0.1％ポリビニルピロリドンおよび1mg/ml
BSAからなるデンハルト（Denhardt′ｓ）液からなる
防護液で含浸する。ストリップを密封バッグ中で２時間
65℃とし、次に風乾する。

次に、ストリップを第一端から7mmの第一帯域で分析物
がポリヌクレオチドの塩基配列の第二部分に一般に相補
的な塩基配列を有する直鎖でかつ変性した放射性同位元
素標識ポリヌクレオチドを包含する第一試薬材料約100
ピコモルで含浸する。第一試薬はその５′末端で³²Pラ
ジオラベルおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼでの処理
により標識する。次に、第一試薬材料を風乾し、そして
ミラーカバープレート（第一および第三帯域間の第二帯
域にわたるギャップを有する）をニトロセルロースクロ
マトグラフィー材料上にのせる。

検定は試料材料を含む分析物を第二帯域に適用すること
により本発明のポリヌクレオチド交雑検定装置で実施す
る。次にカバータブを第二帯域にのせ、そして検定装置
をSSPE溶液（0.9 NaCl、560mM NaH₂PO₄、5mM EDTA（pH
7.4）、デンハルト液（0.06％フィコル、0.06％ポリビ
ニルピロリドンおよび0.6mg/ml BSA）および50％脱イオ
ン化ホルムアミドからなるクロマトグラフィー溶媒約17
5μｌ中に浸漬する。ストリックを37℃で培養中に溶媒
は装置に沿って上方に進み、そして第一試薬を可溶化し
そしてクロマトグラフィーで第三帯域の方に輸送する。
第一試薬と試料成分との相対移動度は、分析物が第一試
薬が第三帯域に到達する前に第三帯域で処理され、また
溶媒輸送に対して固定化されるようなものである。更
に、任意の介在試料成分および第一試薬と反応し得る試
料の非分析物成分は、第一試薬が第三帯域にクロマトグ
ラフィー輸送される前に第三帯域から除去される。

第三帯域に到達すると、試料内の任意の分析物はその帯
域で固定化された第二試薬で第二塩基配列で交雑するこ
とにより固定化される。任意の未交雑材料は第一試薬の
到達前にクロマトグラフィー溶媒輸送により第三帯域か
ら除去される。第三帯域に到達すると、同位元素標識第
一試薬はそれ自体分析物の第一塩基配列で交雑により固
定化される。ストリップおよびクロマトグラフィー溶媒
を溶媒フロントがストリップの頂部に達するまで37℃で
培養し、この時にストリップを溶媒から除き、そして風
乾する。次に、ストリップをコダック（Kodak）XAR−５
フィルムでオートラジオグラフィーに付する。試料材料
中の分析物の存在は第三帯域で接触したフィルムの露光
により指示される。この実施例の装置の変化には酵素ラ
ベルおよび検出システムを用いる「ダイオード」、「ト
リオード」および「テトラオード」装置が包含されてい
る。

本発明の実施化において数多くの変形および変化が前述
の好ましい態様の説明を考慮して当業者に想起し得るも
のと予想される。従って、本発明は特許請求の範囲によ
ってのみ制限される。

【図面の簡単な説明】

第1a、3a、4aおよび6a図は本発明の試験装置の３種の異
った形態の正面図である。 第1b、3b、4bおよび6b図は第1a、3a、および4a図に示し
た試験装置のそれぞれ線1b−1b、3b−3b、4b−4bおよび
6b−6bに沿った横断面図である。 第1c図は第1a図に示した試験装置のクロマトグラフィー
溶媒と接触している横断面図である。 第2a−2f図は本発明の方法の実施化に従った異った時点
での第1a図に示した装置の正面図である。 第５図は線５−５に沿ってみた第3a図の試験装置の横断
面図である。 図面における符号の意義は次のとおりである。 10……装置、14……第一末端、18……第二末端、11……
クロマトグラフィー材料、15……第一帯域、16……第二
帯域、17……第三帯域、21……第一試薬、12……支持体
ストリップ、13……カバープレート、19、20……タブ、
22……溶媒、Ａ……第一試薬、Ｂ……分析物、Ｃ……非
分析物、30……装置、34……第一末端、38……第二末
端、35……第一帯域、36……第二帯域、37……第三帯
域、31……クロマトグラフィー材料、33……カバープレ
ート、39、40……タブ、43……クロマトグラフィー溶媒
フロント、44……輸送フロント、51……クロマトグラフ
ィー材料、54……第一末端、60……第二末端、62……バ
リヤー手段、67……左縁、68……右縁、55……第一帯
域、56……第二帯域、57……第三帯域、58……第四帯
域、59……第五帯域、63……第一バフル、64……第二バ
フル、65……右バリヤー、66……左バリヤー、52……支
持体ストリップ、61……タブ、53……カバープレート、
70……装置、71……クロマトグラフィー材料、74……第
一末端、80……第二末端、82〜85……バリヤー、88……
左縁、89……右縁、75……第一帯域、76……第二帯域、
77……第三帯域、78……第四帯域、79……第五帯域、8
3、84……バフル、81……タブ、73……カバープレー
ト、90……装置、91……クロマトグラフィー材料、94…
…第一末端、101……第二末端、103〜107……バリヤ
ー、95……第一帯域、96……第二帯域、97……第三帯
域、98……第四帯域、99……第五帯域、100……第六帯
域、104……キャップ縁、92……ストリップ、93……カ
バープレート。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シヤンフアン シング アメリカ合衆国イリノイ州 60061 バー ノンヒルズ ダブリユー モアランド 7841 (56)参考文献 特開 昭61−145459（ＪＰ，Ａ)

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】連続した一連の反応によって試料中の分析
   物の分析をするための試験ストリップにおいて 該試験ストリップは 選択されたクロマトグラフィー溶媒による固定化されて
   いない試薬及び反応性試料成分のクロマトグラフィー溶
   媒輸送のための毛管特性及び容量特性を有し、長さを有
   するクロマトグラフィー材料からなり； 且つ該試験ストリップは クロマトグラフィー溶媒輸送が開始せしめられる第一の
   末端； クロマトグラフィー溶媒輸送が終了せしめられる第二の
   末端；及び 該第一の末端と該第二の末端との間に配置せしめられた
   複数の帯域からなり、 そして該帯域は、 該溶媒中で移動可能であり且つ 該分析物と特異的に結合反応することのできる第一の試
   薬でもって含浸せしめられた第一帯域； 該試料を受容するための第二帯域；及び 溶媒輸送に対して固定化されており且つ該分析物と特異
   的に結合反応することができる第二の試薬でもって含浸
   せしめられ且つ該第二帯域の下流にある第三帯域からな
   り； そして該第二の試薬は該第三帯域に該分析物を不動化で
   き、 該第一帯域及び該第二帯域は該第一の末端からは十分な
   距離を置いて配置せしめられ、該クロマトグラフィー溶
   媒を該第一帯域及び該第二帯域に接触せしめることなく
   該第一の末端に接触させることができ 且つ該試験ストリップは 第三帯域において該分析物の測定手段として該第一の試
   薬を検知するための手段を有しており、 こうして該構成により 試料が該第二帯域に付与され、そして該第一の末端が該
   クロマトグラフィー溶媒中に浸漬されると、分析物と該
   第一の試薬との相対移動度あるいは該第二帯域と該第三
   帯域の位置関係のいずれかが、該第一の試薬が該第三帯
   域に到達する前にその分析物を該第三帯域にまで輸送せ
   しめ且つ該第三帯域に不動化せしめるところのものであ
   り、 且つ該構成により、該第一の試薬と反応するところの試
   料中の非分析対象成分であって干渉性を有する成分を、
   該第一の試薬が該第三帯域に到達する前に、クロマトグ
   ラフィー溶媒輸送により該第三帯域から除くことのでき
   るものであること を特徴とする試験ストリップ。
2. 【請求項２】前記第三帯域で前記第一試薬を検出するた
   めの手段が前記第一試薬に付されたラベルである特許請
   求の範囲第１項記載の試験ストリップ。
3. 【請求項３】前記ラベルが放射性同位元素ラベル、発色
   団、螢光団および酵素ラベルからなる群から選択される
   特許請求の範囲第２項記載の試験ストリップ。
4. 【請求項４】該試験ストリップが該第二帯域と該第三帯
   域の位置関係を制御するための複数のクロマトグラフィ
   ー溶媒輸送経路を有する特許請求の範囲第１項記載の試
   験ストリップ。
5. 【請求項５】前記試料と前記第一の試薬とのクロマトグ
   ラフィー溶媒輸送経路が部分的に異なっている特許請求
   の範囲第４項記載の試験ストリップ。
6. 【請求項６】前記ラベルが酵素ラベルであり、そして前
   記ラベルと反応性を有する第三試薬が第四の帯域に配置
   され、そして該第三試薬は前記クロマトグラフィー溶媒
   中で相対移動度を有し、前記第一試薬が前記第三帯域に
   輸送された後、該第三試薬が、前記溶媒により前記第三
   帯域に輸送される特許請求の範囲第３項記載の試験スト
   リップ。
7. 【請求項７】前記第三試薬が指示薬物質である特許請求
   の範囲第４項記載の試験ストリップ。
8. 【請求項８】前記第一試薬および第三試薬が部分的に一
   致していないクロマトグラフィー溶媒輸送経路を通って
   移送されるものである特許請求の範囲第６項記載の試験
   ストリップ。
9. 【請求項９】前記クロマトグラフィー溶媒輸送経路が溶
   媒不透過性バリヤーにより分離されている特許請求の範
   囲第４項記載の試験ストリップ。
10. 【請求項１０】前記溶媒不透過性バリヤーがレーザーエ
    ッチングにより形成されたものである特許請求の範囲第
    ９項記載の試験ストリップ。
11. 【請求項１１】前記クロマトグラフィー材料が薄層クロ
    マトグラフィー材料である特許請求の範囲第１項記載の
    試験ストリップ。
12. 【請求項１２】前記薄層クロマトグラフィー材料がニト
    ロセルロースである特許請求の範囲第11項記載の試験ス
    トリップ。
13. 【請求項１３】分析物が抗体である特許請求の範囲第１
    項記載の試験ストリップ。
14. 【請求項１４】分析物が抗原である特許請求の範囲第１
    項記載の試験ストリップ。
15. 【請求項１５】分析物がポリヌクレオチドである特許請
    求の範囲第１項記載の試験ストリップ。
16. 【請求項１６】連続した一連の反応によって試料中の分
    析物の分析をするための方法において該方法は試験スト
    リップを使用するものであり、 該試験ストリップは 選択されたクロマトグラフィー溶媒による固定化されて
    いない試薬及び反応性試料成分のクロマトグラフィー溶
    媒輸送のための毛管特性及び容量特性を有し、長さを有
    するクロマトグラフィー材料からなり； 且つ該試験ストリップは クロマトグラフィー溶媒輸送が開始せしめられる第一の
    末端； クロマトグラフィー溶媒輸送が終了せしめられる第二の
    末端；及び 該第一の末端と該第二の末端との間に配置せしめられた
    複数の帯域からなり、 そして該帯域は、 該溶媒中で移動可能であり且つ 該分析物と特異的に結合反応することのできる第一の試
    薬でもって含浸せしめられた第一帯域； 該試料を受容するための第二帯域；及び 溶媒輸送に対して固定化されており且つ該分析物と特異
    的に結合反応することができる第二の試薬でもって含浸
    せしめられ且つ該第二帯域の下流にある第三帯域からな
    り； そして該第二の試薬は該第三帯域に該分析物を不動化で
    き、 該第一帯域及び該第二帯域は該第一の末端からは十分な
    距離を置いて配置せしめられ、該クロマトグラフィー溶
    媒を該第一帯域及び該第二帯域に接触せしめることなく
    該第一の末端に接触させることができ 且つ該試験ストリップは 第三帯域において該分析物の測定手段として該第一の試
    薬を検知するための手段を有しており、 該方法は （１）試料を該第二帯域に付与し、 （２）次に、該第一の末端を該クロマトグラフィー溶媒
    中に浸漬せしめて、分析物と該第一の試薬とを該第三帯
    域までクロマトグラフィー輸送するに充分な時間処理
    し、分析物と該第一の試薬との相対移動度あるいは該第
    二帯域と該第三帯域のま位置関係のいずれかが、該第一
    の試薬が該第三帯域に到達する前にその分析物を該第三
    帯域にまで輸送され且つ該第三帯域に不動化され、且
    つ、該第一の試薬と反応するところの試料中の非分析対
    象成分であって干渉性を有する成分を、該第一の試薬が
    該第三帯域に到達する前に、クロマトグラフィー溶媒輸
    送により該第三帯域から除き、 （３）該第三帯域中の該第一の試薬の存在を検知せしめ
    ることからなることを特徴とする方法。
17. 【請求項１７】前記第三帯域で前記第一試薬を検知する
    手段が前記第一試薬に付されたラベルである特許請求の
    範囲第16項記載の方法。
18. 【請求項１８】前記第三帯域で前記第一試薬を検知する
    手段が前記第一試薬と反応性を有する第四試薬である特
    許請求の範囲第16項記載の方法。
19. 【請求項１９】第四試薬が指示物質である特許請求の範
    囲第18項記載の方法。
20. 【請求項２０】前記第三試薬を第四帯域に配置し、そし
    て前記第一試薬が前記第三帯域に輸送された後該第三試
    薬が第三帯域にクロマトグラフィーで輸送される特許請
    求の範囲第18項記載の方法。
21. 【請求項２１】前記試験ストリップが該第二帯域と該第
    三帯域の位置関係を制御するための複数のクロマトグラ
    フィー溶媒経路を有する特許請求の範囲第16項記載の方
    法。
22. 【請求項２２】該試料と該第一の試薬とが、部分的に異
    なったクロマトグラフィー溶媒輸送経路に沿って輸送さ
    れるものである特許請求の範囲第21項記載の方法。
23. 【請求項２３】前記試料および第三試薬が部分的に異な
    ったクロマトグラフィー溶媒輸送経路に沿って輸送され
    るものである特許請求の範囲第20項記載の方法。
24. 【請求項２４】前記クロマトグラフィー溶媒経路が溶媒
    不透過性バリヤーによって分離されている特許請求の範
    囲第21項記載の方法。
25. 【請求項２５】前記第二帯域が前記第三帯域と同じ経路
    にある特許請求の範囲第16項記載の方法。
26. 【請求項２６】前記クロマトグラフィー材料が薄層クロ
    マトグラフィー材料である特許請求の範囲第16項記載の
    方法。
27. 【請求項２７】前記薄層クロマトグラフィー材料がニト
    ロセルロースである特許請求の範囲第16項記載の方法。
28. 【請求項２８】前記ニトロセルロースが約0.1μ〜約１
    μの範囲の平均孔サイズを有することを特徴とする特許
    請求の範囲第26項記載の方法。
29. 【請求項２９】分析物が抗体である特許請求の範囲第16
    項記載の方法。
30. 【請求項３０】分析物が抗原である特許請求の範囲第16
    項記載の方法。
31. 【請求項３１】前記分析物がポリヌクレオチドである特
    許請求の範囲第16項記載の方法。