JPS63111465A - ロイシンエンケフアリンのエンザイムイムノアツセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明はエンザイムアッセイ法（以下ＥＩＡと称する）
によるロイシンエンケファリン（以下Ｌ−Ｅｎｋと称す
る）測定法に関するものである。

Ｌ　　Ｅｎｋは生体内に存在し９モルヒネ様鎮痛作用を
示す５個のアミノ酸からなるペプチドホルモンの一種で
ある。その化学構造はＬ−チロシル−グリシル−グリシ
ル−し−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンであることが
確かめられており、　Ｌ−Ｅｎｋの測定は診断及び治療
などの医療分野に重要な役割を果たす。

ｂ、従来の技術 従来９体液中及び組織中のＬ　−Ｅ　ｎ　ｋを測定する
場合、生体反応の応答を利用したバイオアッセイ法、お
よび抗原抗体反応を応用したラジオイムノアッセイ　（
以下ＲＩＡと称する）とＥＩＡとが行われていた。前者
はその操作が煩雑であり、感度も不十分であることから
、一般には感度が優れている後者のＲＩＡ及びＥＩＡが
Ｌ　−Ｅｎｋの測定に利用されている。ＲＩＡ及びＥＩ
Ａの原理そのものは同じで公知であり、標識抗原として
用いる標識物質の性質が異なるだけである。以下にＥＩ
Ａについて原理を説明する。即ち、まず測定対象となる
物質に対して動物を免疫感作して抗体を調製する。つぎ
に測定対象物質と標識となる酵素とをグルタルアルデヒ
ドなどの化学試薬で共有結合させた標識抗原を調製する
。抗体溶液に標識抗原を加えると、抗原抗体反応が起こ
り、溶液中に標識抗原抗体複合物（以下Ｂと称する）と
遊離のままの標識抗原（以下Ｆと称する）が生じる。こ
のＢをＦと分離して酵素活性を測定すれば抗体に結合し
た抗原の量を知ることが出来る。従って、一定休に対し
て競争的に結合反応が起こり９反応液中の非標識抗原の
量が多いほど抗原抗体複合物中の標識抗原ｆｆｉ　（Ｂ
＋は減少し酵素活性も減少する。そこで。

各種既知濃度の非標識抗原を含む溶液を標準試料溶液と
して調製し、同様な抗原抗体反応を行うと。

名種既知濃度の非標識抗原存在下で抗体と結合した標識
抗原ｍ　（Ｂ）が酵素活性を指標として測定でき。

標準曲線が求められる。この標準曲線をもとに試料中の
測定対象物質濃度を定量することができる。

ＲＩＡでは、標識抗原として酵素のかわりに放射性同位
元素で標識した抗原を用いる。Ｌ−Ｅｎｋを測定する場
合には、ＲＩＡとＥＩＡが利用可能であるが、ＲＩＡで
は標識用物質として放射性同位元素を用いるため、その
使用に関して法律的制約があり、また放射性同位元素の
崩壊現象により放射能が低下して長期間保存できないと
いう欠点を有している。

Ｃ１発明が解決しようとする問題点 Ｌ−ＥｎｋをＥＩＡで測定する場合、ＲＩＡと異なり法
的制約はな（標識抗原も長期間保存が出来るという利点
を有しているが、その測定には標識抗原の調製という煩
雑な操作があり、また９合成された標識抗原調製物は不
均一で標識抗原の抗体に対する結合活性の低下や、標識
酵素の酵素活性の低下により、測定値の精度の低下をき
たす等の問題点があった。

ｄ０発明の構成 従って、Ｌ−ＥｎｋのＥＩＡにおいて測定感度及び再現
性の高い測定を行うためには、（１）標識抗原として用
いた酵素が標識抗原調製中に活性が低下しないこと、（
２）調製された標識抗原の抗体に対する反応性が低下し
ていないこと、（３）抗原が標識用酵素と常に同じ位置
で同じ量結合した均一な標識抗原の調製が必要である。

しかし、従来化学試薬を用いた標識抗原の調製法では酵
素表面の反応部位に抗原が非特異的に結合し、抗原の結
合様式も一様でな（、その標識抗原物質の精製も容易で
はないため上記の問題点の解決は血しかった。本発明者
らは、これらの問題点を改良すべ（鋭意努力した結果、
標識抗原として遺伝子操作により標識用酵素と抗原とが
遺伝的に結合した融合タンパク質の利用を考案しＬ　−
ＥｎｋのＥＩＡに成功した。

本融合タンパク質は枯草菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素
（以下ＤＨＦＲと称する）のカルボキシル末端側にＬ　
−Ｅｎｋのアミノ末端側が結合した一本鎖のポリペプチ
ドからなるタンパク質（以下ＤＨＦＲ−Ｌ　−Ｅｎｋと
称する：特許出願中）である。本融合タンパク質の特徴
的な利点として、＋ＩＩＤＨＦＲ−Ｌ　−Ｅｎｋを暗号
化した遺伝子が遺伝子操作により大腸菌の遺伝子に組み
込まれており、大腸菌を増殖させることにより容易に菌
体内から精製純化でき、その構造は均一でかつ常に一定
である。（２）融合タンパク質の有するＤＨＦＲ酵素活
性は天然の枯草菌由来のＤＨＦＲと同じである。（３）
酵素反応は次式の如（表され。

７．８−Ｈｚ−葉酸＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋−５，６，７，
８Ｈ４−葉酸＋ＮＡＤＰ” 補酵素であるＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドジヌク
レオチドリン酸）の酸化を波長３４０　ｎｍでの吸収変
化を測定することにより、容易に標識酵素であるＤＨＦ
Ｒの酵素活性を知ることが出来る。（４）本融合タンパ
ク質はそのｔ７ｇ造が明確であるため、試験管やマイク
ロプレートに本融合タンパク質を吸着させた固相ＥＩＡ
も行うことが出来る。以上のごとく多くの利点を有する
融合タンパク質を標識抗原として利用することにより、
感度の高い安定したＬ　−ＥｎｋのＥＩＡ法を発明出来
た。

Ｌ−ＥｎｋのＥＩＡはＧ、　Ｚａｍｂｏ　ｎ　ｉ　（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３０
．８３　８７．１９８３）らによって報告されているが
９本発明者のように標識抗原として遺伝子操作により調
製された融合タンパク質を用いてのＥＩＡの報告はない
。本発明は前述のごとく、遺伝子操作により調製された
融合タンパク質を標識抗原として用いることを特徴とし
たＥＩＡ法であり、ＥＩＡ法の実験手技により本発明が
制限されるものではない。

４、実施例 以下に実施例を挙げて本発明方法を具体的に説明する。

実施例　１ （１）試薬の調製 Ｌ　　Ｅｎｋ、　　ウサギ抗Ｌ−Ｅｎｋ抗体及びＢ、　
Ｆの分離に用いたヤギ抗ウサギガンマグロブリン抗体は
すべて市販のものを使用した。

ｆ２）　　ＤＨＦＲＬ　　Ｅｎｋの調製ＤＨＦＲＬ　　
Ｅｎｋを暗号化した遺伝子を有するプラスミド（特許出
願中）を含有する大腸菌を遺伝子操作により調製し、液
体培養を行った。得られた湿重ｆｆ１１３ｇの菌体を、
超音波処理、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍイオン交換ク
ロマトグラフィー及びトヨパールＨＷ５５ゲルクロマト
グラフィーにて分画、精製、純化を行い、約３．７ｍ、
　　４．８ｑ（１，３ｍｇ／ｍＪ）のＳＤＳ電気泳動で
均一なバンドを示すＤ　ＨＦ　ＲＬ　−Ｅ　ｎ　ｋを得
た。

（３）測　定 抗体、ＤＨＦＲ−Ｌ　　Ｅｎｋ及びＬ−Ｅｎｋに対する
希釈用緩衝液としてウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと
称する）を含むリン酸緩衝液（５９６ＢＳＡ、２５ｍＭ
　エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、０．１９６アジ
化ナトリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液　ｐＨ７，５：以
下ＢＥＰＢＳと称する）を用いた。

まず２０００倍希釈のウサギ抗Ｌ−Ｅｎｋ抗体溶液Ｑ、
ｌ−、５０００倍希釈のＤＨＦＲＬ−Ｅｎｋ溶液Ｑ、１
ｍｌ、およびＢＥＰＢＳ　０．１　ｒｍナイＬ　１０　
ｔｉｇ／ｒｎｌから１　ｐｇ／１ｍまで順次希釈したＬ
−Ｅｎｋ溶液０．１ｍｌをプラスチック製ミクロ遠沈管
にいれ４℃で一晩反応させ、つぎに３００倍希釈の正常
ウサギ血清Ｑ、　ｌ　ｍｌ及び１５倍希釈のヤギ抗ウサ
ギガンマグロブリン溶液Ｑ、　ｌ　ｍｌを加えてさらに
４°Ｃで一晩反応させた。反応後、エッペンドル７社の
ミクロ遠心機で５分間遠心して上清を除去し、沈査に２
０μｍの０．００５規定塩酸を加えて溶解し、さらに１
０ｍＭジチオスレイトールを含む０．５Ｍリン酸緩衝液
ΦＨ７，０）２００μｌを加えて酵素活性測定用溶液と
した。酵素活性の測定は以下のように行った。即ち。

酵素活性ｔ、ＩＪ定用溶液２００μｍを１２１ＴＩＩＴ
ＩＸ７５Ｍのガラス試験管に入れ、つぎにＤ　ＨＦ　Ｒ
基質溶液（０，０５ｍＭジヒドロ葉酸、０．０６ｍＭ　
ＮＡＤＰＨ。

１２ｍＭ　　２−メルカプトエタノールを會む５０ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ７，ｏ）ｘｒｎＩ！を加えて反応を開
始した。活性測定は反応開始直後及び３０分後の波長３
４０ｎｍにおける吸収変化を分光光度計（日本分光、Ｕ
ＶＩＤＥＣ−３２０）で測定して求めた。

標準曲線は非標識抗原非存在下における抗体結合ＤＨＦ
Ｒ−Ｅｎｋ（７）酵素活性を１００％とし。

非標識抗原存在下における抗体結合ＤＨＦＲＥｎｋの酵
素活性の百分率を各既知濃度のＬ−Ｅｎｋに対して次式
のごとく求めた。

Ｙ＝　（Ｂ　　Ｎ）／　（Ｂｏ　　Ｎ）ｘｌｏｏＢ　：
非標識抗原存在下における抗体結合ＤＨＦＲ−Ｅｎｋの
酵素活性 Ｂｏ：非標識抗原非存在下における抗体結合ＤＨＦＲ−
Ｅｎｋの酵素活性 Ｎ　：抗Ｌ−Ｅｎｋ抗体非存在下における波長３４０ｎ
ｍでの吸収変化 得られた百分率を用いて作成した標準曲線は第１図の通
りである。

゛（４）結　果 本ＥＩＡ法により得られたＬ−Ｅｎｋに対する標準曲線
を第１図に示した。本法ではＬ−Ｅｎｋｏ、１ｎｇ／ｍ
ｌから１μｇ／ｒｎｌの濃度範囲で容量反応曲線を得た
。

実施例２ （１）試薬の調製 固相ＥＩＡにおいてウサギ抗Ｌ−Ｅｎｋ抗体検出に用い
たペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギがンマグロプリン
抗体は市販のものを用いた。

（２）ＤＨＦＲ−Ｌ　　Ｅｎｋ固定化マイクロプレート
の調製 ９６穴マイクロプートはヌンク社のイムノプレー）ＩＩ
を用いた。ＤＨＦＲ−Ｌ−Ｅｎｋ溶液を０．１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で１０００倍に希釈し、
１穴ごと５０μｌずつ分注し、４°Ｃで２時間静置して
ＤＨＦＲＬ−Ｅｎｋを固定化した。つぎにプレートを水
で洗浄し、ＢＥＰＢＳで各穴を満たし室温で１時間放置
した後、０．０５９６ツイーン２０と０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５：以
下ＴＰＢＳと称する）と水でプレートを洗浄した。

（３）測　定 Ｌ　　Ｅｎｋ及びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギガ
ンマグロブリン抗体に対する希釈用緩衝液として０．０
５９６ツイーン２０を含むＢＥＰＢＳ　（アジ化ナトリ
ウムを含まない二以下ＴＢＥＰＢＳと称する）を用いた
。

ＤＨＦＲ−Ｌ−Ｅｎｋ固定化マイクロプレートの穴に、
５０μｍのＴＢＥＰＢＳないし１０　μｇ／ｍｌから１
０ｐｇ／ｍ＋まで順次希釈したＬ　　Ｅｎｋ溶液、およ
び５０μｍの２０００倍希釈のウサギ抗Ｌ−Ｅｎｋ抗体
溶液を入れて４℃で一晩反応させた。ＴＰＢＳと水でプ
レートを洗浄して遊離状態のウサギ抗ＬＥｎｋ抗体を除
去した後、４００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗ウサギガンマグロブリン抗体溶液５０μｌをくわえ
、室温で１時間反応させた。ついでＴＰＢＳと水でプレ
ートを洗浄し、固定化ＤＨＦＲＬ　　Ｅｎｋと結合した
ウサギ抗Ｌ−Ｅｎｋ抗体を抗原として反応したペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギガンマグロブリン抗体のペル
オキシダーゼ酵素活性を測定するため、基質溶液として
各穴に０．２５ｍｇ／＋＋＋Ａ！の２，２’−７ジノー
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
ト０、００２５％の過酸化水素を含む０．ＩＭのクエン
酸緩衝液（ｐＨ４，２）　　１００μｊを加え１反応開
始１０分後にマイクロプレート光度計（コロナ社ＭＴＰ
−２２形）を用い、波長４０５ｎｍにおける吸収増加を
測定した。

標準曲線は各既知濃度の非標識抗原存在下において、固
定化ＤＨＦ　Ｒ−Ｅｎｋに抗Ｌ−Ｅｎｋを介して結合し
たペルオキシダーゼ標識抗体のペルオキシダーゼ酵素活
性について、波長４０５ｎｍにおける吸収増加を測定し
て求めた。

得られた標準曲線は第２図の通りである。

（４）結　果 本固相ＥＩＡ法により得られたＬ−Ｅｎｋに対する標準
曲線を第２図に示した。本法ではＬ　−ＥｎｋＯ，１ｎ
ｇ／ｍｌから１０　μｇ／ｍｌの濃度範囲で容量反応曲
線を得た。

５、図の簡単な説明 第１図及び第２図は実施例により得られた既知濃度のＬ
−Ｅｎｋと酵素活性との関係を示す標準曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）遺伝子組換え技術を用いて、ジヒドロ葉酸還元酵素
   −ロイシンエンケファリン融合タンパク質（以下ＤＨＦ
   Ｒ−Ｌ−Ｅｎｋと称する）を暗号化した遺伝子を大腸菌
   の遺伝子に組み込み、その大腸菌により合成されたＤＨ
   ＦＲ−Ｌ−Ｅｎｋを、標識抗原として用いることを特徴
   としたロイシンエンケファリンを測定するためのエンザ
   イムイムノアッセイ法 ２）特許請求の範囲の第１項記載のＤＨＦＲ−Ｌ−Ｅｎ
   ｋを固定化抗原として用いることを特徴としたロイシン
   エンケファリンを測定するための固相エンザイムイムノ
   アッセイ法