JPS6312286A - フラジエリンをコ−ドするｄｎａおよび該ｄｎａを有するベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星’ＪＥＩ（７１１」立豆 本発明はフラジェリンをフードする遺伝子、およびフラ
ジェリンをコードする遺伝子またはその一部を有する排
出ベクターに関する。

又米り弦恭 近年の遺伝子工学の発展により、目的のペプチドをコー
ドする遺伝子をベクターに組込み、大腸菌などの細菌に
導入して該ペプチドを大量に得ることは容易な技術とな
りつつある。しかし一般に発現したペプチドは細胞内に
蓄積されるため、生成された蛋白質が細胞の成育増殖を
阻害したり、過剰に生成されると負のフィードバックに
よって生産性が抑制されることがある。また、目的の蛋
白質を採集するためには、まず細胞を採集破壊し、該細
胞破壊物から目的の蛋白質を精製しなければならない。

この細胞破壊物中には多くの不純物が含まれ、その一部
は人体に有害であり、そこから純粋な目的の蛋白質を得
ることは必ずしも容易なことではない。

ｍ絶膜を構成する蛋白質や分泌蛋白質などは、その一端
に細胞内外の膜を通過するために必要なアミノ酸配列シ
グナルペプチドを持つ前駆体ポリペプチドとして合成さ
れ、膜通過の際に膜に存在するペプチダーゼによりシグ
ナルペプチド部分は切断され、本来の蛋白質分子となり
その活性および機能を発揮する。

細胞内に蓄積きれた目的のペプチドを精製する困！ｌき
を解決し、目的の蛋白質の生産性を向上させるため、上
記の生体の分泌システムを利用して、目的のペプチドを
細胞外に分泌きせようとする試みがなされてきた０例え
ば、バチルス・ズブチリスのα−アミラーゼプロモータ
ーおよびシグナル配列を有する分泌ベクターによる、大
腸菌β−ラクタマーゼの分泌（ザ・ジャーナル・才ブ・
バイオケミストリー　（Ｊ、Ｂｉｏｃｈａｍ、＞　９５
．８７−９３　（１９８４））、同ベクターシステムに
よるマウスＩＦＮ−βの分泌（ジーン（Ｇｅｎｅ）　３
４．１−８　（１９８５））、大腸菌のアルカリフォス
ファターゼプロモーターおよびシグナル配列を有する分
泌ベクターによるヒトＩＦＮ−αの分泌生産（ザ・ジャ
ーナル・才ブ・バイオケミストリー　（Ｊ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、）　９７．１４２９−１４３６　（１９８５））
、などが挙げられる。

また、細胞内で合成された蛋白質が細胞外に出るメカニ
ズムとしては上記の分泌システムだけでなく排出（ｅｘ
ｃｒｅｔｉｏｎ　）システムが知られている６例えば、
大腸菌の鞭毛を構成するフラジェリンなどがこの排出シ
ステムによって菌体外に排出される。排出システムは、
分泌と異なり、合成されたペプチドはシグナルペプチド
を有さす、ペプチダーゼによって切断きれることなく、
そのまま菌体外に排出されて機能を発揮する（ザ・ジャ
ーナル・才ブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　）臣、　１０５６−１０５９　（１９ｇ４＞
）。大腸菌のフラジェリンをコードする遺伝子はｈａｇ
遺伝子と呼ばれ、既にｐＢＲ３２２やλ−ファージにク
ローニングきれており（日本遺伝子学会第５７回大会プ
ログラム・予行集、ｐ６３　（１９８５）、ザ・ジャー
ナル・才ブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｒｅｉａ
ｌ、）　１３０．７３６−７４５　（１９７７））、そ
のＤＮＡ配列の一部は既に解析きれている（ザ・ジャー
ナル・才プ・バタテリオロジ−（Ｊ。

Ｂａｃｔｒｅｉａｌ、）　１５５．７４−８１　（１９
８３））が未だ全配列は決定きれていない。

明が解決しようとする問題慨 従来の分泌ベクターは、その種類によって分泌されるペ
プチドは制限される。すなわち、一定のプロモーターお
よびシグナル配列に、いかなる目的のペプチドをフード
するＤＮＡを組み込んでも分泌されるというものではな
く、分泌されうるペプチドは一定のものであり、分泌ベ
クターに組み込んでも分泌されないペプチドは数多い。

大腸菌のフラジェリンをコードするｈａｇ遺伝子はクロ
ーニングきれ、その構造の一部は明らかに成っているも
のの、その全構造は未だ不明である。またフラジェリン
の排出機構が目的の蛋白質の菌体外生産に利用可能であ
ることは全く示唆されておらず、ｈａｇ遺伝子を有する
排出ベクターも全く構築されていなかった。　ｈａｇ遺
伝子の全ＤＮＡ配列が解明きれれば、そのような排出ベ
クターの構築もより容易になると考えられる。

また、分泌ベクターによって目的の蛋白質が培地中に分
泌されても、培地からの精製はなお容易ではないが、フ
ラジェリンとの雑種蛋白質として排出し鞭毛を形成浮せ
て不溶性にすれば、培地からの採集はより簡単なものと
なる。

間　点を解決するための手段 本発明者等は、目的のペプチドを菌体外に産生させるシ
ステムに関してフラジェリンの排出機構に着目し、フラ
ジェリンをコードするｈａｇ遺伝子の全塩基配列を決定
し、ベクターに組み込み、該ｈａｇ遺伝子を切断または
一部を欠損させ、その間にリンカ−ＤＮＡを挿入した。

該リンカ−に外来の蛋白質をフードするＤＮＡを挿入し
たところ、該贋白質がフラジェリンとの雑種蛋白質とし
て菌体外に排出きれることを見出した。排出された雑種
蛋白質は一定の条件下では鞭毛を形成し、採集がより容
易になる。また分泌システムによっては菌体外に産生で
きなかった外来のペプチドを排出できる可能性を有する
。

フラジェリンをコードするＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、
ネズミチフス菌、プロテウス属の細菌など鞭毛を有する
全ての細菌から調製し得る０例えば大腸菌のフラジェリ
ンをコードするｈａｇ遺伝子は近藤等の方法（ザ・ジャ
ーナル・才ブ・バクテリオｏ　’、；　−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｒｅｉａｌ、　）　１３０．７３６−７４５　（１９
７７））によって得られるが、既にｐＢＲ３２２やλ−
ファージにクローニングされたｈａｇ遺伝子を用いても
よい。

以下ｈａｇ遺伝子を例に挙げて本発明を説明するが、本
発明においてはフラジェリンをコードするＤＮＡであれ
ばよく、ｈａｇ遺伝子に限定されるものではない。

ｈａｇ遺伝子を有するファージやプラスミドは、ｈａｇ
遺伝子が欠損し鞭毛を形成できない菌株に導入し、その
遊走性によってスクリーニングする。ｈａｇ遺伝子欠損
株は近藤等の方法（ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　）　８４．４０３〜４２１　（１９７６）　）によ
って調製できるし、該方法によって得られたＷ３６２３
Ｈｆｌａ−ａｍ７６株を用いてもよい、また、ｈａｇ遺
伝子内に異種ＤＮＡを挿入した場合には、大腸菌に−１
２Ｃ６００ｒＣ６００ｒ−：　：Ｔａ２Ｏ株または染色
体のｈａｇ遺伝子内にカナマイシン耐性遺伝子が挿入さ
れ鞭毛を形成できない大腸菌に−１２ＪＡＩＩ　（微工
研菌寄第８８５３号）を使用し得る０本発明の実施例に
於てはＫ−１２Ｃ６００ｒ−ｍ−ｈａｇ：　：Ｔａ２Ｏ
株を用いたが、本発明を追試する際には微工研に寄託移
れているに−１２ＪＡＩＩ株を用いるのが便利である。

以下の参考例に示すように本発明のベクターはに−１２
ＪＡＩＩ株に於ても不都合無く使用し得る。

完全なｈａｇ遺伝子が導入きれた株は遊走性を示すよう
になるので、遊走性を示した菌株から再びｈａｇ遺伝子
を有するＤＮＡを調製する。即ち、該菌株を大量に培養
し、通常の遠心操作、除蛋白、エタノール沈澱などによ
って、完全なｈａｇ遺伝子を膚するＤＮＡを精製する。

得られたＤＮＡからｈａｇ遺伝子を有するＤＮＡ断片を
適当な制限酵素で切断し、適当なベクターに挿入ｒる。

用いられる制限酵素はｈａｇ遺伝子を運搬するＤＮＡ配
列によって異なるが、ｈａｇ遺伝子を切断せず、不要な
りＮＡ部分をできるだけ切断するものが好ましい、適当
なベクターとしては、ｐＮＯ１５２３、ｐＳＣｌｏｌ、
ｐＲＫ３５３、ｐＲ）Ｃ６４６、ｐＲＫ２４８、ｐＤＦ
４１、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＶＨ５１、ｐＡｃ１０５、Ｒ５Ｆ
２１２４、ｐｃＲｌ、りＭＢ９、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ
３２２、ｐＢＲ３２４、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、
ｐＢＲ３２８、ｐＫＹ２２８９、ｐＫＹ２７００、ｐＫ
Ｎ８０、ｐＫＣ７、ｐＫＢｌｌｌ、ｐＫＢ１５８、ｐＫ
Ｈ４７、ｐｔｔｓｖ−ｔｏ６、ｐＫＫ２３３−３、ｐＭ
Ｋ２００４、ｐＡｃＹｃｌ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ
８、ｐＵｃ９、ｐＵｃ１２、ｐＵｃ１３、ｐＵｃ１８、
凶Ｃ１９、ｐＡｒｔｓ３、ｐυＲ２２２、ｐＢＴｌ−１
、ｐＪＤＢ２０７、Ｈｏｌ１１ｅｒ１１１、ｐＨ５Ｖ−
１０６、ｐｔａｃ　１２、ｐｔｒｐＬｌ、ｐｓＶ−ｎｅ
ｏ、ｃｌ。

ＤＦ１３、Ｒ６に、　Ｆ、　　ＲＩ、　Ｒ６、Ｅｎｔｐ
３０７、ｐｃ１９４、ｐＥ１９４゜ｐｓＡＯ５０１，ｐ
ＵＢｌｌｏ、ｐＴ１２７などのプラスミドベクターおよ
びＭ１３、λｇｔ、λＣ２入ｇｔ、λＢ、λＷＥＳλＣ
１λＷＥＳ、λ８１　　λｚＪｖｉｒ、λＢ゛、λＡＬ
Ｏ，λＢ１　　λＷＥＳ、　Ｔａ２０５などのファージ
ベクターおよびこれらから構築されるベクターが挙げら
れるが、これらに限定されるものではなく、ｈａｇ遺伝
子を運搬し、宿主に導入できるベクターであれば良い。

また、得られたｈａｇ遺伝子を運搬するベクターはｈａ
ｇ遺伝子を損なうことなくミニ化してもよいし、ｈａｇ
遺伝子部分を他の適当なベクターに移し替えてもよい。

得られた上記ベクターを常法に従って精製しｈａ名遺伝
子の全塩基配列を決定した。塩基配列の決定は従来のマ
キサム・ギルバート法やジデ才キシヌクレオチド鎖終止
法に従えばよい。ｈａｇ遺伝子の全塩基配列は第１図に
示すとおりである。塩基配列から推定されるアミノ酸配
列を第１図中塩基配列の下に示す。

ただし、本発明は第１図の塩基配列に限定きれるもので
はなく、第１図に示されるアミノ酸配列または同等の排
出作用を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列も本
発明の範囲内である。

大腸菌のフラジェリン蛋白質のＮおよびＣ末端のアミノ
酸配列を分析したところ、Ｎ末端はＡｌａ−Ｇｌｎ−で
ありＣ末端はｃｔｙであり、塩基配列から推定されるア
ミノ酸配列と一致する。またアミノ酸組成比の実験値も
塩基配列から推定される理論値と良（一致した。

排出ベクターとしての取扱をより容易にするために、得
られたベクターのｈａｇ遺伝子内に適当なリンカ−を単
数または複数個挿入する。該リンカ−は適当な制限酵素
切断点を与えフラジェリンの分泌機能を損なわないもの
であればよく、好ましくは該ベクター内に少数の制限酵
素切断点を、更に好ましくは唯一の制限酵素切断点を与
えるものがよい１例えば、ｈａｇ遺伝子をｐＢＲ３２２
に組み込んでいる場合には、ＨｉｎｄＩｌ［、Ａｖｒ　
Ｉｆ、Ｂｃｌ　Ｉ　、　ＢｓｔＥ■、Ｂｇｌｌｌ、Ｈｐ
ａ　Ｉ　、Ｋｐｎ　Ｉ　、Ｓａｃ　Ｉ　、　５ａｃｌ［
，５ｅａＩ　、５ｓｔｌ　１ＳｓｔＩ、ＸｂａＩ　、　
ＸｈｏＩ　、Ｘｍａｌなどの切断点を有するリンカ−を
挿入すればよい、このようなリンカ−の挿入によって外
来遺伝子を容易に挿入できるようになる。

ｈａｇ遺伝子は、フラジェリン蛋白質の排出に不要な部
分を欠損部せて、その一部を排出ベクターに利用する事
ができる。　ｈａｇ遺伝子が発現するフラジェリンは中
央部が欠損しても排出されることが判明した。即ち、中
央部分が欠損したｈａｇ遺伝子を有するベクターを、上
記のような鞭毛を形成しない菌株に導入すれば、その菌
株は鞭毛を形成し、遊走する。また、中央部の欠損部位
にリンカ−を挿入し、該リンカ−内に異種ＤＮＡを挿入
しても鞭毛を形成きせることができ、異種タンパク質を
菌体外へ排出させることができる。

ｈａｇ遺伝子中央部は、フラジェリンの抗原性を示すペ
プチド部分をフードしているので、該中央部の欠損は鞭
毛の抗原性が変化することにより確認できる６本発明に
於ては、ｈａｇ遺伝子を有するベクターをランダムに切
断し、該切断点よりＤＮＡを消化した後、リンカ−を加
え結合し再び環化し大腸菌に導入して、抗鞭毛抗体を含
む培地上で遁走できる、即ち鞭毛抗原性が変化した大腸
菌が有するベクターを得た。該ベクターは、ｈａｇ遺伝
子中央部が欠損しリンカ−が挿入されており、かつ大腸
菌に鞭毛形成能を与える。この工程のＤＮＡの切断およ
び消化はランダムであり、同様の性質を有するが異なる
数種のベクターを得る事ができた。同工程を追試すれば
、切断点および該切断点から消化きれる塩基数が異なる
、即ちｈａｇ遺伝子中の欠損部が異なる様々なベクター
が得られることは当業者には容易に類推できる。従って
、本発明は実施例に記載された数種のベクターに限定さ
れるものではなく、上記の工程によって得られるベクタ
ーはもちろんのこと、上記の性質を有するベクターは全
て本発明に含まれる０本発明によれば、第９図に示され
るｈａｇ遺伝子塩基配列の５８３位〜１１４３位（５６
１塩基対）を欠損させ、１８ｍｅ　ｒのリンカ−を挿入
したベクターできえもなお、上記の性質を有した。

また、鞭毛形成を必要とせず、雑種タンパク質の菌体外
への排出のみを要するのであれば、更に該ベクターのｈ
ａｇ遺伝子内の欠損部位を拡大することが可能である。

本発明のベクターに更にｐＨＤ１変異（実施例参照）を
加えれば大腸菌の鞭毛数が増加し有効である。

なお、本明細書中で用いられる略号の意味は以下の通り
である。

ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的ＤＮＡ ｃｃＤＮＡ：閉環状ＤＮＡ ＲＮＡ：リポ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジ＋−ＲＮＡ Ａ：アデニン　　　Ｔ：チミン Ｇニゲアニン　　　Ｃ：シトシン ＡＴＰ　、アデノシン三リン酸 ＴＴＰ：チミジン三リン酸 ＧＴＰニゲアノシン三リン酸 ＣＴＰ　：シチジン三リン酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三すン酸 ｄｄＡＴＰニジデオキシアデノシン三すン酸ｄｄＴＴＰ
ニジデオキシチミジン三すン酸ｄｄＧＴＰニジデオキシ
グアノシン三リン酸ｄ　ｄ　ＣＴＰ　ニジデオキシシチ
ジン三すン酸ＤＴＴニジチオスレイトール ＡｌａまたはＡ：アラニン ＡｒｇまたはＲ：アルギニン ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン ＡｓｐまたはＤ＝アスパラギン酸 ＣｙｓまたはＣニジスティン ＧｌｎまたはＱ：グルタミン ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸 ＧｌｙまたはＧニゲリシン ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン １１ｅまたはＩ：イソロイシン ＬｅｕまたはＬ：ロイシン Ｌｙｓまたはに：リジン Ｍ　ｅ　ｔまたはＭ：メチオニン ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン ＰｒｏまたはＰニブロリン ＳｅｒまたはＳ：セリン ＴｈｒまたはＴ：スレ才二ン ＴｒｐまたはＷニトリブトファン ＴｙｒまたはＹ；チロシン ＶａｌまたはＶ：バリン （以下余白） 実施例 ■　ｈａｇ遺伝子のｐＢＲ３２２への再クローニング（
Ａ）　　ｈａｇ遺伝子の形質導入ラムダファージλｐｆ
ｌａ−Ｈ２ＤＮＡの調製 （ａ）λｐｆｌａ−１２ファージの同定ｈａｇ遺伝子が
変異し鞭毛を形成しない大腸菌に１２株のＷ３６２３Ｈ
ｆｌａ−ａｍ７６株（微工研菌寄第８６１９号（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−８６１９）、寄託日１９８６年１月２５日、
シエネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）８４、４０３−
４２１（１９７６）　）をラムダファージ用トリプトン
培地（バクトドリプトン（ディフコ＜ＤＩＦＣＯ）？ｆ
製）１％、塩化ナトリウム０．２５％、チアミン塩酸塩
０．０００５％から成る、ｐＨ７，０（殺菌前））で−
夜３７℃で振盪培養する。この培養液０．１ｍｌに、大
腸菌に１２株のＫＨ５５２株のｈｇ遺伝子を含む遺伝子
を連撮するλｐｆｌａ−Ｈ２ファージ（ジャーナル・才
ブ・バクテリオニジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　
１３０．７３６−７４５（１９７７））数Ｚｏ。

個を含むと思われる０、１ｍｌの上記トリプトン培地を
加え、寒天を０．６％含む４７℃の上記トリプトン培地
を３．０ｍｌ加え、寒天１．２％を含む上記トリプトン
平板培地に重層する。−夜３７℃で培養すると数１００
個のプラークが形成された。

各プラークを滅菌したツマヨウジで突き、遊走検定用培
地（寒天０．３％を含む上記培地）に突き刺し、３７℃
で７〜８時間培養する＊　ｈａｇ遺伝子を完全に形質導
入できるファージの感染している株は直径３〜４ｃｍの
遊走域を持つコロニーを形成する。このコロニーを生ず
るプラークを形成している培地をひつくり返しフタにク
ロロホルムを数滴滴下し３７９Ｃで１０分間放置して殺
菌した。

（ｂ）λｐｆｌａ−Ｈ２ファージの培養該λｐｆｌａ−
Ｈ２ファージを滅菌したツマヨウジで０．１ｍｌの前記
トリプトン培地に懸濁する。この懸濁液に、前記トリプ
トン培地に終夜培養した大腸菌に１２株の０６００株０
．１ｍｌを加え、４６℃の０．６％寒天を含む前記トリ
プトン培地３ｆｆ１１を加え、１．２％の寒天を含む前
記トリプトン培地に重層する。３７℃で５〜６時間培養
し、Ｃ６００株がλｐｆｌａ−Ｈ２ファージによってほ
とんど溶菌された直後に５ｍｌの前記トリプトン培地を
加え、更に２０〜３０分培養する。数滴のクロロホルム
を加えた後、重層した０、６％軟寒天をくだき、後に加
えた５ｍｌの培地と共に遠心チューブに移し、３０００
回転で１０分間遠心し上清を得る。上清にクロロホルム
数滴を加え３７℃で５分間培養し殺菌し、＾ｐｆｌａ−
８２ファージの種ファージ液を得る。前記トリプトン培
地で種ファージ液を１０１〜１０７倍希釈し、その０．
０５ｍ１を、前記トリプトン培地で終夜培養したｃａｏ
ｏ株０．１ｍｌと混合し、４６℃の０．６％寒天を含む
前記トリプトン培地３ｍｌを加え、１．２％寒天を含む
前記トリプトン培地に重層する。１夜３７℃で培養し出
現したプラーク数から１ｍｌ当りのファージ数を決定す
る＃２Ｘ１０’ファージを含む前記種ファージ液の希釈
液０　、１　ｍｌと、マルトース０，２％を含む前記ト
リプトン培地で終夜培養したＣ６００株培養液０．１ｍ
ｌを混ぜ、３７℃で１０分間放置する。これに４６℃の
０．６％寒天を含む前記トリプトン培地３ｍｌを加え、
１．２％の寒天を含む前記トリプトン培地に重層する。

こうして重層した平板を５０枚作成した。３７℃で５〜
６時間培養し、Ｃ６００株がλｐｆｌａ−Ｈ２７アーシ
によってほとんど溶菌された直後に５＋ｎｌの前記トリ
プトン培地を加え、更に２０〜３０分培養する。数滴の
クロロホルムを加えた後、重１した０、６％軟寒天をく
だき、後に加えた５ｍｌの培地と共に遠心チューブに移
し、３０００回転で１０分間遠心し上清を採集しファー
ジ培養液約３５０ｍ１を得た。

（ｃ）λｐｆｌａ−Ｈ２ファージの精製上記ファージ培
養液を超遠心（２５０００ｐｐｍ。

４℃、９０分間ベックママン８−５５超遠心機、＃３０
ローター）し、上清を捨て、沈澱に少量のＴＭｆｉ衝液
（１０ｍＭｈリス塩＃（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ硫酸マ
グネシウム）を加える。この懸濁液１．３ｍｌ当り塩化
セシウムを４℃で飽和きせた１Ｍ緩衝液１．７ｍｌを加
え、超遠心（２３０００ｒｐｍ、　　１５℃、４０時間
、ベックマンＬ８−５５超遠心機、ＳＷ４１０−ター）
した。遠心チューブのほぼ中央に集まったファージは肉
眼で見える帯状となったので、遠心チューブの外から注
射器で帯状の部分を抜き（約１ｍ１）、ＴＥ緩衝液（１
０ｍＭ　ｈリス塩酸（ｐｎｓ、ｏ）、１ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウム（Ｎａ’＋−ＥＤＴＡ　）に対
して４℃で１夜透析した。

（ｄ）入ｐｆｌａ−）１２ＤＮＡの調製上記入ｐｆｌａ
−Ｈ２ファージ懸濁液１容量に対し０．１容量の１０倍
ＳＳＣ緩衝液（１，５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍク
エン酸ナトリウム）、０．０２容量の０．５Ｍエチレン
ヂアミン四酢酸ナトリウム（Ｎａｇ−ＥＤＴＡ　）、０
．０１容量の２０％ドデシル硫皺ナトリウム（５ＤＳ）
を加え１０分間３７℃に保温する。ＴＥｌ衝液を飽和さ
せたフェノールを等量加え、１分間に６０回転する回転
式抽出機で３０分間ＤＮＡのフェノール抽出を行なう、
その後遠心管に内容物を移し高速冷却遠心機で遠心（８
０００ｒｐｍ、２０℃）し、上清を透析チューブに移し
ＴＥｉ衝液に対して１夜透析する。透析内液をＳＷ４１
ポリマー遠心管（ベックマン社）に移し、０．１容量の
３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、更に２容量の冷エチルアル
コールを加え一２０℃で１夜放置する。ベックマン社製
Ｌ８−５５超遠心機により３万回転６０分４°Ｃで遠心
し沈澱を集める。沈澱はＴＥ緩衝液４００μｍに溶かし
２６０ｎｍの吸光度でＤＮＡの定量を行ない、約３００
ｔ１ｇの精製λｐｆｌａ−Ｈ２ＤＮＡを得た。

（Ｂ）＾ｐｆｌａ−Ｈ２ＤＮＡ上のｈａｇ遺伝子の位置
の推定（ａ）λｐｆｌａ−Ｈ２ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化
λｐｆ　１ａ−Ｈ２ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化する。５
０ｍＭトリス塩＃（ｐＨ７，５）、７ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン、λｐｆ
ｌａ−Ｈ２ＤＮＡ５００　ｎｇを含む反応液２０μｍを
３７℃に予熱し、ＥｃｏＲＩ　（宝酒造）５単位／１μ
ｍを加え３０分間３７°Ｃで反応させる。酵素反応停止
液（５０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．０２％ブロ
ムフェノールブルーの混液）２μｍを添加し反応を停め
た後、その反応液５μｍを電気泳動用０．８％アガロー
ススラブゲルにチャージする。水平式アガロースミニゲ
ル電気泳動装置（マリツル株式会社製）を使用し、トリ
ス塩酸（ｐＨ８，１）４０ｍＭ、酢酸ナトリウム５ｍＭ
、Ｎａ５−ＥＤＴＡ　１　ｍＭを含む電気泳動緩衝液を
用いて、８０Ｖの定電圧で３０〜６０分間泳動する。電
気泳動後、ゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを
含む上記緩衝液に約１０分浸漬し、紫外線ランプ（２８
０ｎμ）を照射しＤＮＡバンドを検出する。その結果λ
ｐｆｌａ−Ｈ２ＤＮＡはＥｃｏＲＩによって２１．３．
１７．０．５．８２．３．５４キロベース（Ｋｂ）の断
片に切断きれることが判明した。同様にバクテリオファ
ージλＣ，８５７Ｓ７のＤＮＡ　（宝酒造）をＥｃｏＲ
Ｉ消化すると、２１．３．５．８２．３．５４ｋｂの断
片は検出されるが、１７、Ｏｋｂ断片は検出きれなかっ
た。よって、ｈａｇ遺伝子を含む大腸菌ＤＮＡ断片は１
７．Ｏｋｂ断片に含まれると推測きれた。

（ｂ）λｐｆｌａ−Ｈ２ＤＮＡの５ａｌＩによる消化λ
ｐｆｌａ−Ｈ２ＤＮＡ　５００　ｎｇを１０ｍＭｌ−リ
ス塩酸（ｐＨ７，５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１７
５ｍＭ塩化ナトリウム、０　、２ｍＭＥＤＩＡ、　　７
ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清ア
ルブミンから成る混液に加え、前項と同様に５ａｌ　Ｉ
で消化し、アガロースゲル電気泳動を行なった。λｐｆ
ｌａ−）＋２ＤＮＡはＳａｌ　Ｉによって３２．７ｋｂ
と１５．３ｋｂの断片に消化された。１５．３ｋｂ断片
はλＣ１８５７１；　７ＤＮＡのＳａｌ　Ｉによる消化
によっても生じるため、ｈａｇ遺伝子を含むＤＮＡ断片
は３２．７ｋｂの断片に存在すると推測された。

＾ｐｆｌａ−Ｈ２における、前項■−Ｂ−ａにおける）
：ｃｏＲＩならびに本項のＳａｌ　Ｉに−よる消化結果
とｈａｇ遺伝子を含む大腸菌染色体由来のＤＮＡ断片の
推定位置を第２図に示す。

（Ｃ）ベクターｐＢＲ３２２へのクローニングλｐｆｌ
ａ−Ｈ２ＤＮＡ　２　、５μｇを■−Ｂ−ａと同様な方
法で、１００μｍの反応混合液中でｌ：ｃｏＲＩで消化
する。続いて７０℃で５分間加熱し反応を停め、３Ｍ酢
酸ナトリウム１０μｍ、冷エタノール２２０μｍを加え
、−２０℃で一夜放置する。遠心（ベックマン社マイク
ロフユージ、１０分間）後上浦を捨て沈殿を７０μｍの
ＴＥＩｔ衝液に溶解する。

得られたλｐｆｌａ−Ｈ２ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物に
、■−Ｂ−ｂと同様に反応混合液とＳａｌ　Ｉを加え（
全量１００μｍ）消化する０反応終了後上記同様にエタ
ノール沈殿を行ない５０μｍのＴＥ緩衝液に溶解する。

他方、ｐＢＲ３２２ｃｃＤＮＡ　（宝酒造）２μｇを含
む、■−Ｂ−ａと同様に調製した反応液１４４μｍにＥ
ｃ。

ＲＩ２４単位／４μｍ、Ｈｉｎｄｎ［１６単位／２μｍ
を加え、３７℃で３０分間反応させる。７０℃で５分間
加熱し反応を止め、エタノール沈殿後、沈殿物を１００
μｍのＴＥ緩衝液に溶解する０次いで同様にＳａｌ　Ｉ
で消化してエタノール沈殿後、沈殿物を４０μｍのＴＥ
！１衝液に溶解する。

２．５μｇのＥｃｏＲＩと５ａｌｒで消化したλｐｆｌ
ａ−Ｈ２ＤＮＡと２５０１１　ｇ（７）ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ａｌ　ＩとＨ４ｎｄ　ｌ［で消化したｐＢＲ３２２を含
むＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液（６６ｍＭトリス塩＃（ｐ
）１７　、６　）、６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０
　ｍＭＤＴＴ、　　１　ｍＭＡｒＰ）　９８μｍにＴ　
、　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造、Ｌｏｔ３０１）０．２Ｉ
ｌＬ位／２μｍを加え、２２〜２３℃で６時間反応きせ
、エタノール沈殿を行ない、沈殿物を２０μｍのＴＥ緩
衝液に溶解する。

コンピテントにしたＷ３６２３Ｈｆｌａ−ａｍ７６株２
１０μｍに、上記ＤＮＡ２５０ｎｇ／　２０　μｌを混
合し感染させる。バタトトリブトン１％（ディフコ社）
、イーストエキストラクト０．５％、塩化ナトリウム０
．５％を含むＬＢ培地（ｐＨ７，０〜７．２）で３７℃
１時間振盪培養を行なった後、その０．１ａｌをアンピ
シリンｏ、ｏｏｓ％と寒天１．５％を含むＬＢ平板培地
に均一に塗抹する。３７℃で一夜培養後、生育したアン
ピシリン耐性株をアンピシリン０．００５％を含む遊走
検定用培地に接種する。１８０コロニーの遊走性を検定
したところ４コロニーが遊走域を形成した。この４コロ
ニーの１つをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒
天培地で２回純化しＷ３６２３Ｈｆｌａ−ａｍ７６　（
ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９　）株を確立した。なお、Ｗ３
６２３Ｈｆｌａ−ａｍ７６　（ｐＢＲ３２２／　ｈａｇ
９　）は１９８６年１月２５日より微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第８６２０号（ＦＥＲＭＰ−８６２０）
として寄託されている。

（Ｄ）組換えプラスミドｐＢＲ３２２／　ｈａｇ９の構
造の検討 （ａ）　ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９　ｃｃ−ＤＮＡの精製
Ｗ３６２３Ｈｆｌａ−ａｍ７６　（ｐＢＲ３２２／　ｈ
ａｇ９　）株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ
培地５ｍｌに接種して３７°Ｃで一晩振盪培養を行なう
、この終夜培養液を、ｉｊ！のアンピシリン５０μｇ／
ｍｌを含むＬＢ培地に植え、−晩３７℃で振盪培養を行
ない、遠心（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）で集菌す
る。

溶液Ｉ（５０ｍＭ０ｍＭグルツースｍＭ）リス塩酸（ｐ
Ｈ８，０）、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）を２０ｍ１加え
懸濁後卵白リゾチーム（シグマ社製）を１００ｍｇ粉末
で加え溶解する。室温で１０分間放置し、時々よく混合
する。４０ｍ１の溶液ｎ（０，２Ｎ水酸化ナトリウム、
１％ドデシル硫酸ナトリウム）をゆっくり加え混合後、
水中に１０分間置く、続いて３０ｍ１の水冷した５Ｍ酢
酸カリウム（ｐＨ４，８）を加え、水中に１０分間置く
、遠心（１０００Ｇｒｐｍ、３０分、４℃）してその上
清を１００ｍ１容メスシリンダーに回収して容量を測定
した後、遠心チューブに移し０．６容量のインプロパツ
ールを加え混合後、室温で１５分間放置する。遠心（１
００００ｒｐｍ、３０分、１５℃）し上清を捨て、沈殿
に７０％エタノール１４０ｍ１を加え遠心（１００００
ｒｐｍ、３０分、４℃）後上清を捨てる。沈殿物を真空
デシケータ−中でほぼ乾かしＴＥｆｉ衝液にとかすｅ５
０ｍｌ容メスシリンダーに移し３０ｍ１に容量をととの
え１０％のラウリルザルコシン酸ナトリウムを０．３ａ
ｌ加え、１０　ｍｇ／　ｍｌの臭化エチジウム２ｍｌを
加え、３３．９１５ｇの塩化セシウムを加え溶解する。

超遠心（３６０００ｒｐｍ、１５℃、４０時間、ベック
マン社Ｌ８−５５超遠心機、ＶＴｉ５０　ｏ　−１−）
ｆｆｌ、紫外線ランプ下螢光バンドを確認し、２本のバ
ンドのうち下方のバンドを遠心管側面より注射器で抜く
。

次いで注射器の内容物を超遠心（３６０００ｒｐｍ１５
℃、２０時間、ベックマンＬ８−５５超遠心機、ＶＴｉ
６５０−ター）する、前回同様紫外線ランプ下で螢光を
発する下方のバンドを注射器で抜き、試験管に移す、塩
化セシウムで飽和させたインプロパツールで臭化エチジ
ウムを抽出しく３回繰り返す）、水層をＴＥＡ１衝液に
対して一晩透析する。

透析後の試料をベックマン社ＳＷ５０．１０−ター用チ
ューブに移し０．１容量の３Ｍ酢酸ソーダ、２容量のエ
タノールを加え、混合後−２０℃Ｋ−装置く（エタノー
ル沈殿）。

超遠心（３００００ｒｐｍ、４℃、３０分間、ベックマ
ンＬ８−５５超遠心機、ＳＷ５０．１０−ター）し、上
清を捨て真空デシケータ−中で軽く乾かし、ＴＥＩＩ衝
液０．６ａｌを加え４℃で一装置＜　＊　ＲＮａｓａ（
シグマ社、９６℃で１０分間加熱する前処理をしておく
）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加え室温で１
時間置く。

次いでＳＷ５０．１０−ター用チューブに１Ｍ塩化ナト
リウム−ＴＥ緩衝液を４ａｌ入れ、上記の試料を重層し
、ＳＷ５０．１０−ターで４０００Ｏｒｐｍ、６時間超
遠心し、上清を捨て沈設物を０．２ｍ１ＴＥ緩衝液に溶
かす、その一部を希釈し、２６０ｍμの吸光度を測定し
ＤＮＡ濃度を算出する。

（ｂ）　ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９　ｃｃ−ＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩならびにＳａｌ　ｌでの消化 ｐＢＲ３２２／　ｈａｇ９　ｃｃ−ＤＮＡを■−Ｂ−ａ
、■−Ｂ−すと同様にしてＥｃｏＲＩ、５ａｌ　Ｉ消化
を行なう、消化物をアガロースゲル電気泳動で分析し、
ｃｃ−ＤＮＡが線状ＤＮＡに変化する事を認め、Ｅｃｏ
ＲＩならびにＳａｌ工の切断個所はそれぞれ１ケ所であ
ると判定した０次いでｐＢＲ３２２／ｈａｇ９ＤＮＡを
、ＥｃｏＲＩ消化後７０℃で反応を停止きせ、続いて５
ａｌ　Ｉで消化した後、７０℃で反応を停止きせる。ア
ガロースゲル電気泳動法で消化物を検討したところ、約
７．５ｋｂ、約３．７ｋｂの断片を認めた（　ＤＮＡの
サイズマーカーＧこはλＣｌ８５７Ｓ７ＤＮＡのＨｉｎ
ｄ■消化物を用いた）、前者はλｐｆｌａ−Ｈ２ＤＮＡ
より由来し、後者はｐＢＲ３２２より由来しているもの
である（第３図）。

（ｃ）　ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９　ｃｃ−ＤＮＡの制限
酵素ＢａｍＨＩによる消化 １０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、７ｍＭ塩化マグネ
シウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン、ｐＢ
Ｒ３２２／ｈａｇ９　ｃｃ−ＤＮＡ　１　μｇを含む反
応液１０μｍに制限酵素ＢａｍＨＩ　１０単位／μｍを
加え、■−Ｂ　−ａ　（７）ＥｃｏＲＩ消化と同様に反
応を行ない消化物をアガロースゲル電気泳動法で検討し
た。　ＤＮＡのサイズマーカーにはλＣ１８５７Ｓ７　
ＤＮＡのＨｉｎｄｍ消化物を用いた。これによりｐＢＲ
３２２／ｈａｇ９　ｃｃ−ＤＮＡは約５．７．３，５．
１．８５Ｋｂの大きさのＤＮＡ断片に切断された。

次にＥｃｏＲＩによって完全分解きれたｐＢＲ３２２／
ｈａｇ９ＤＮＡに対してＢａｍＨＩの不完全分解、なら
びに５ａｌ　Ｉによって完全分解されたｐＢＲ３２２／
ｈａｇ９　ＤＮＡに対して３ａｍＨＩの不完全分解を行
ない、ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９　ｃｃ−ＤＮＡ上でのＢ
ａｍＨＩ切断部の位置を決める。まずｐＢＲ３２２／ｈ
ａｇ９　ｃｃ−ＤＮＡ　１μｇを■−Ｂ−ａならびに■
−Ｂ−ｂと同様にして）：ｃｏＲＩ、ならびにＳａｌ　
Ｉによる消化を別々の試験管で行なう、３７°Ｃで１時
間反応を進め７０℃で５分間過熱して反応を停止する。

次いでＢａｍＨＩ　１単位／μｍを各試験管にくわえ、
２分、５分後に５μｍずつ抜き去り反応停止液（５０％
グリセロール、１％ＳＤ５０　、０２％ブロムフェノー
ルブルー）を加える６反応液残り１１μｍには９分後に
更にＢａｍＨＩを１単位／μｍ加え１０分後、２０分後
にそれぞれ５μｍずつ抜き去り反応停止液０．５μｍを
加える。それぞれの試料を０．８％アガロースゲル電気
泳動法で解析し生じているＤＮＡ断片の太き許を決定す
る。ＤＮＡのサイズマーカーにはλＣ１８５７Ｓ７ＤＮ
Ａの１ｉｎｄｌ［［消化物を用いた。まずＥｃｏＲＩの
完全消化とＢａｍＨＩ消化２０消化２賦 ）、Ｃ（　１　、　９　５ｋｂ）、Ｄ（０．７３ｋｂ）
の断片を生じ、ＥｃｏＲＩの完全消化とＢａｍＨＩ消化
２分（内型５分）の試料では断片の小さい順にＤＳＣ％
Ｂ１Ｂ＋Ｄ，Ａ，Ｂ＋Ｃ，Ｂ＋Ｃ＋Ｄ％Ａ＋Ｃ，Ａ＋Ｂ
＋Ｃ，Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの大きさに相当する断片のバンド
を確認した．一方５ａｌｌの完全消化とＢａｍＨ１消化
２０消化２賦 （３．８ｋｂ）、ｃ（１．９５ｋｂ）、ｄ（１．２６ｋ
ｂ）の断片を生じ、５ａｌｌの完全消化とＢａｍＨＩ消
化２分（内型５分）の試料では、断片の小さい順にｄ，
ｃ，ｃ＋ｄ，ｂ，ａ，ｂ＋ｃ，ｂ＋ｃ＋ｄ。

ａ＋ｂ，ａ＋ｂ＋ｃ，ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄの大ききに相当す
る断片のバンドを確認した．第４図にｐＢＲ３２２／ｈ
ａｇ９　ＤＮＡ上のＢａｍＨＩ切断点の位置を示す。

（Ｅ）組換えプラスミドｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３の作
成まず１ａｌ１ｇ／３０μＩＴＥ緩衝液のｐＢＲ３２２
／ｈａｇ９ｃｃ−ＤＮＡを、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．０）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１０〇−塩化ナト
リウム、２ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０１％
ウシ血清アルブミンを含む反応液５６μｍにＢａｍＨＩ
４　０単位／４μｍを加え、３７℃で２時間反応させる
。

６０μｍのフェノール・クロロホルム（１：１）混液を
加え、混合した後、マイクロフユージで遠心し上清を採
取する．この上清に再度６０μｍのフェノール・クロロ
ホルム混液を加えマイクロフユージで遠心後の上清にク
ロロホルム６０μｍを加えよく混合する．マイクロフユ
ージで遠心し上清を採取する．再度この上清にクロロホ
ルムを加えマイクロフユージで遠心後上涜を採取する．
この上清に３Ｍ酢酸ソーダを１八．量加えエタノールを
２倍量加え一２０℃で一装置く．マイクロフユージで遠
心し、得た沈殿を１１μｍのＴＥ緩衝液に溶解する。

ＤＮＡ連結反応は上記の１１μｍの試料溶液に４μｍの
３３ｍＭ塩化マグネシウムを含む２５０艷トリス塩酸（
ｐＨ７．６）、２μｍの１　０　０ｍＭ　ＡＴＰ、２μ
ｍの１　０　０ｍＭ　ＤＴＴを加え、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ１単位／μｍ（宝酒造：　Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．　２０１
０Ｂ．Ｌｏｔ　Ｎｏ．　３０１）を加え、１３〜１５℃
で６時間反応を進行せしめる。

上記の反応物１０μｍをＷ３６２３Ｈｆｌａ−ａｍ７６
株に形質転換し、アンピシリン５０μｓ／ｍｌ含むＬＢ
寒天培地上に生じたコロニー２００個をアンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含む遊走検定用培地に植え、１４株の遊
走できる株を見出した．１４株のもつプラスミドＤＮＡ
のＢａｍＨＩによる消化をいわゆるラピッドプラスミド
ＤＮＡ解析法１で行ない、その中から第４図中における
りＢＲ３２２／ｈａｇ９のＢ断片を欠損したプラスミド
を見出しｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３と名付けた（第５図
）。

亭１　ラピッドプラスミドＤＮＡ解析法コロニーを５ｍ
ｌのアンピシリン５０μｇ／　ｍｌ　ヲ含むＬＢ培地に
植菌し３７°Ｃで一晩培養する。エツペンドルフチュー
ブに１．５ｍｌ採取しマイクロツユ−・ノで１分間遠心
後上清をできるだけ除き沈殿を１００μｍの溶液１（５
０ｍＭグルコース、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ−２Ｎａ、２
５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、４　ｍｇ／ｍｌ卵白
リゾチーム（シグマ社製）より成る）に懸濁する。周囲
の温度に５分装置いた後、２００μｍの溶液ｎ（０，２
Ｎ＊酸化ナトリウム、１％ＳＤＳより成る）を少しづつ
加え混合し、水中（０℃）に５分間おく０次に１５０μ
ｍの氷冷した３Ｍ酢酸カリウム（氷酢酸でｐ）１４．８
に合わせたもの）を加えよく混ぜる。０°Ｃで５分装置
いた後、４℃でマイクロフユージで遠心し、上清を新し
いエツペンドルフチューブに移ス０等量のフェノール、
クロロホルム（１：１）ｆｉ液を加え、混合後、マイク
ロフユージで２分間遠心し上清を新しいエツベンドルフ
チューブへ移す、２容量のエタノールを加え混合後、２
分間周囲の温度におく、マイクロフユージで５分間遠心
し上清を捨てチューブの内壁に残る溶液をできるだけ紙
でぬぐいとる６次に１ｍｌの７０％エタノールを加えよ
く混合後、５分間マイクロフユージで遠心する。上清を
完全に除き、真空デシケータ−内で乾かしＲＮａｓｅ　
（シグマ社、９５°Ｃ１０分間加熱）を２０μｇ／ｍｌ
含む５０μＩＴＥ緩衝液にとかす、１０μｍを新しいチ
ューブにとり１．２μｍのＢａｍＨＩの１０倍反応ミッ
クス（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、７０ｍＭ
塩化マグネシウム１０００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、０．１％ウシ血清アルブ
ミン）を加え、１単位のＢａｍＨｌを加えて３７℃で１
時間反応を進める。

反応後試料を０．８をアガロースゲル電気泳動法で解析
した。

（Ｆ）　ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３ＤＮＡの構造の検討
（ａ　）ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３ＤＮＡの精製Ｗ３６
２３Ｈｆｌａ−ａｍ７６（ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３）
株から実施例■−Ｄ−ａと同様にしてｐＢＲ３２２／ｈ
ａｇ９３　ｃｃ−ＤＮＡを精製した。

（ｂ）ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３　ｃｃ−ＤＮＡの制限
酵素１ｉｎｅｎによる消化 １０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、７ｍＭ塩化マグネ
ンウム、６０ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３　ｃｃ−ＤＮ
Ａ　１１１　ｇを含む反応液５０μｍに３単位１０　、
５　／７１のＨｉｎｃｌを加え、３７℃で３０分反応さ
せる。実施例■−Ｂ−ａと同様にして、アガロースゲル
電気泳動法により１ｉｎｅ　ＩＩによって切断きれた断
片の大きさを測定した。断片は３．４．１．８５．１．
６８．０．５３．０．４１ｋｂの５種類生じた。これに
よりｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３　ｃｃ−ＤＮＡ上の５ケ
所のＨｉｎｃ　Ｉｔによる切断点は第６図に示す位置に
推定された。

（ｃ）　１．６８ｋｂ　ＨｉｎｃＩ［断片のｐＵＣ９ベ
クタープラスミドへのサブクローニング ｈａｇ遺伝子はＨｉｎｃｌ［切断点（５）とＨｉｎｃｌ
［切断点（４）の間の１．６８ｋｂ断片（実施例■−Ｆ
−ｂ）にコードされていると推定された。この１，６８
ｋｂ断片をｐＵｃ９ベクタープラスミドの１ｉｎａｌｌ
断片点にサブクローンした。

実施例■−Ｂ−ａと同様にしてＩ）ＢＲ３２２／ｈａｇ
９３ｃｃ−ＤＮＡ　１０　ＩＩ　ｇ、　ＥｃｏＲＩ　１
８　ｉ位を含む反応液３０．５μｍ中でｐＢＲ３２２／
ｈａｇ９３　ｃｃ−ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化を行なう、
３７°Ｃで１．５時間反応後、反応液２９．５μｍにＩ
Ｍｈリス−塩酸（ｐＨ８，０）５μｍ、水６３μｍを加
え、大腸菌アルカリ性フォスファターゼ（ＢＡＰ、全酒
造、Ｌｏｔ　１１１２）を０．２３６車位／２μｍ加え
６５℃で３０分反応を進める０等容量のフェノール、ク
ロロホルム（１：１混液）で２回抽出し、更に等容量の
クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈殿を行なう、
沈殿物を２０μＩＴＥ緩衝液にとかす、この２０μｍ（
１０ｌ１ｇＤＮＡ　）の試料にＨｉｎｃＩ　２０単位／
４μｍを加え、反応液全量を４０μｍとして実施例■−
Ｆ−ｂと同様に３７℃で２時間反応を進行滲せ、６５℃
で１０分加熱して反応を停止させエタノール沈殿を行な
い、沈殿を２０μｍのＴＥａ衝液にとかす。

一方、■−Ｂ−ａと同様にｐＵｃ９ベクタープラスミド
（ファルマシア社製）５μｇを、ＨｉｎｃＩ［１５単位
を含む反応液３０μｍ中で消化する。３７℃で１．５時
間反応を進行させ、６０℃で１０分間加熱する事によっ
て反応を停止させる。エタノール沈殿を行ない、沈殿物
を６μｍのＴＥ緩衝液にとかす。

上記のＥｃｏＲＩ、ＢＡＰ、　Ｈｉｎｃ　ＩＩ消化を行
なったｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３５１１　ｇ／　５１１
１とＨｉｎｃ　Ｉ［消化したｐＵｃ９ベクタープラスミ
ド５μｇ／６μｍ、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ０．１単位
／１μｍを含む反応混合液中で■−Ｃと同様にしてＤＮ
Ａの連結反応を行ない、Ｗ３６２３ｆｌａ−ａｍ７６株
に形質転換する。アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ
ＢＢ地上に出現したコロニーをアンピシリン５０μｇ／
ｍｌを含む遊走検定用培地へ接種する事によって１１１
２株の形質転換体の中から１２株の遊走可能なコロニー
を検出した。この２株をラビッドプラスミドＤＮＡ解析
法で解析し、１ｉｎｅｌ［消化により１．６８ｋｂ断片
を生じ、シ＋ｎＨＩ消化で０．４４．４．Ｏｋｂの２断
片を生ずる組換えプラスミドの１つをｐＵｃ９／　ｈａ
ｇ　６と名付けた（第７図）。

ｐＢＲ３２２／　ｈａｇ９３組換えプラスミドは、実施
例■−Ｆ−ｂに示すように１．６８ｋｂのＨｉｎｃπ断
片を持ち、この断片をｐＵｃ９ベクタープラスミドのｌ
ａｃプロモーターの転写方向に沿って正の向き（１，６
８ｋｂ断片でＨｉｎｃｌ［切断（５）＝ＢａｍＨＩ”の
方向）に挿入してやるとＷ３６２３Ｈｆｌａ−ａｍ７６
株に遊走できる性質を与える事がわかった。即ちこの１
．６８ｋｂの断片上にはＩ（ｉｎｃｌ［断片点（５）よ
りＢａｍＨＩ”の向きに流れるｈａｇ遺伝子の構造遺伝
子の部分が完全に含まれている事がわかった。

（ｄ）　ｐＵＣ９／ｈａｇ６組換えプラスミドのＨｉｎ
ｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ断片のｐｕｃｓベクタープラスミ
ドへのサブクローニング Ｗ３６２３Ｈｆｌａ−ａｍ７６（ｐＵＣ９／ｈａｇ６）
株を、実施例■−トａと同様にしてｐＵｃ９７ｈａｇ６
　ｃｃ−ＤＮＡを精製した。

ＥｃｏＲＩ３６単位／６μｍ、Ｈｉｎｄｌ［［３６単位
／３μｍ、ＰｖｕＩ　３０単位／６μｍ、ｐＵｃ９／ｈ
ａｇ６　ｃｃ−ＤＮＡ　１５μｇ１５．１μｍを含む反
応液１６０μｍ中で実施例■−Ｂ−ａと同様にして、ｐ
Ｕｃ９／ｈａｇ６　ｃｃ−ＤＮＡのＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎ
ｄｌ［、Ｐｖｕ　Ｉ［のトリプル消化を３７℃で２時間
行なった。一方ＥｃｏＲＩ　１８単位／３μｍ、）！１
ｎｄｌｌ［１８単位／１．５μｌ、ｐｕｃｓ　（ファル
マシア社製）５μｇ／２０μｍを含む反応液６０μｌ中
で、実施例■−Ｂ−ａと同様にしてｐｕｃｓのＥｃｏＲ
ｌ、　）ＩｉｔＭ１■のダブル消化を３７℃で２時間行
なった。

両反応とも、反応後フェノール・クロロホルム（１：１
混液）で２回抽出、更にクロロホルムで２回抽出し、エ
タノール沈殿を行なった。沈殿物をｐＵＣ９／ｈａｇ６
の反応では３０μＩＴＥＭ衝液に、ｐｕｃｓの方では１
０μｍのＴＥｆｉ衝渣に溶かした。

次に消化したｐＵＣ９／ｈａｇ６ＤＮＡ　４μｇ／８μ
ｍ、消化したｐＵＣ８２μｇ／４μｍ、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ１単位／１μｍを含む反応液２１μｍ中で実施例■
−Ｃと同様にしてＤＮＡ連結反応を行なう１反応終了後
、Ｗ３６２’３Ｈｆｌａ−ａｍ７６株に形質転換し、ア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒点点培地出現し
たコロニーを用いて、ラピッドプラスミドＤＮＡ解析法
でｐｕｃｓ（２，７ｋｂ）＋１．６８ｋｂ＝　４．４ｋ
ｂの組換えプラスミドｃｃ−ＤＮＡを持つか検討し、４
．４ｋｂのｃｃ−ＤＮＡを持つコロニー４０株を選択し
た。この株をアンピシリン５０μｍ／ｍ１を含む遊走検
定用培地上で遊走性を示すか検討した。結果は４０株全
てのコロニーが遊走性を示さなかった。この事はｐｕｃ
ｓでｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターの
流れに反対向きに１．６８ｋｂ断片が挿入されても、ｈ
ａｇ遺伝子の発現は認められない事がわかる。

１．６８ｋｂ断片はｈａｇ遺伝子の構造遺伝子部分は持
つが（実施例■−Ｆ−ｃ）、自前のプロモーター領域は
既に欠損している事を示している。

前記４０株の中から１株を選び、その保有する組換えプ
ラスミドをｐＵＣ８／ｈａｇ６と命名し、ｃｃ−ＤＮＡ
を実施例■−Ｄ−ａと同様にして精製した。

■ｈａｇ遺伝子の塩基配列の決定 （Ａ）　ｈａｇ遺伝子の塩基配列の決定実施例■−Ｆ−
ｃ、■−Ｆ−ｄによる１、６８ｋｂｐのＨｉｎｃ■断片
にｈａｇ遺伝子の構造遺伝子部分はフードきれている事
が明らかになったので、この断片の全領域の塩基配列を
決定した。

１．６８ｋｂ断片のＤＮＡ塩基配列決定には通常のＭ１
３ファージベクターを用いたジデオキシヌクレオチド鎖
終止法を用いた。　ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３、ｐＵｃ
９／ｈａｇ６、ｐＵＣ８／ｈａｇ６のｃｃ−ＤＮＡを）
ｔａｐｌＩ　、　Ｈｉｎｃｌｌ　、１輪１　、５ａｕ３
Ａ、　ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ（７）制限酵素（すヘテ宝
酒造社製）で生ずる特定の断片を（第８図矢印の断片）
をＭ１３ｍｐ８、ｍｐ９、ｍｐ１８ベクター（ファルマ
シア社製）にクローン化した。

ｐＵＣ８／ｈａｇ６、ｐＵｃ９／ｈａｇ６　ＤＮＡ上の
１．６８ｋｂｐ断片の直接のＤＮＡ配列決定には０．１
Ｍ水酸化ナトリウムと０　、１　ｍＭ　ＥＤＩＡ−２Ｎ
ａを含む溶液で、前記ＤＮＡを変性し、１本鎖ＤＮＡに
分離した後、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法によるＤ
ＮＡ配列決定に供試した。

ＤＮＡ配列決定のスケジュールは第８図に示す。

図は５゛→３゛の方向に書かれである。

第９図にＤＮＡシーケンシングの結果得られたｈａｇ遺
伝子の全−次構造を示す、ｈａｇ遺伝子の開始コドンＡ
ＴＧの下流６０塩基までのＤＮＡシーケンスは既知のＤ
ＮＡシーケンス（ジャーナル　才プ　バクテリオロジ−
（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）１５５．７８（１９
８３）　）と一致した。

（Ｂ）フラジェリン蛋白のアミン末端アミノ酸とカルボ
キシ末端アミノ酸の決定 （ａ）フラジェリン蛋白の精製 大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０株をＬＢ寒天培地で純化し、
３７°Ｃで一晩培養しコロニーを形成させる。適当なコ
ロニーを遊走検定用培地に突刺して培養し、３７°Ｃ，
４〜５時間で形成した遊走ゾーンのできるだけ外側に生
育している菌を１００ｍ１のＬＢ培地に植菌し、３７℃
で一晩培養した。翌日、栄研　　　　　゛角１号プレー
ト（８０Ｘ２２５ｍａ＋）に作っておいたＬＢ寒天培地
に、前記の終夜培養液３〜４ｍ１／１枚を広げ、３７℃
で終夜培養を行なった。翌日、培養表面に少量のＰ緩衝
液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸二水素
カリウム−リン酸水素ナトリウム、ｐＨ６，８）を加え
、コンラージ棒にツスイ株式会社製）でかき集めてＰ緩
衝液に懸濁した。

９０枚のプレートから約２５０ｍ１の懸濁液が得られた
。１にの三角フラスコ（栓付き）に移し激しく６００回
振盪後、遠心（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）シ、上
清をグラスウールをしいたロートで濾過し、続いて遠心
（２５０００ｒｐｍ、１時間、４℃ベックマン超遠心機
、ローター＃３０）し、沈殿を約２０ｍ１のＰ緩衝液に
懸濁した。遠心（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を行
ない、上清（鞭毛画分）を回収し、６５°Ｃで５分加熱
後、遠心（２５００Ｏｒｐｍ、９０分、４℃ベックマン
超遠心機ローター＃３０　）　Ｌ、上清（１４，５ｍ１
）を回収し粗製フラジェリン分画とした。

次に０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ’Ｊン酸
二水素カリウムーリン酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ６，
８）で３倍に希釈してＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２
：ホワットマン社）カラムに付す、上記の希釈溶液９８
ｍ１で洗い、０．０５Ｍを含む１０ｍＭリン酸二水素カ
リウム−リン酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ６、８）と０
．７Ｍを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水
素ナトリウム溶液（ｐ）１６．８）の等量の濃度勾配で
溶出する。フラジェリンは塩化ナトリウム濃度０．３Ｍ
で溶出した（　１８　、８ｍ１）、標準蛋白としてウシ
血清アルブミンを用いプロティンアッセイキット（バイ
オラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製）で蛋白質を定量し、
２６．１７ｍｇ／　１８　、８ｍｌの精製フラジェリン
を得た。

（ｂ）アミノ末端アミノ酸、カルボキシ末端アミノ酸、
全アミノ酸含量の決定 分析に先立ち、実施例■−Ｂ−ａで得られた精製フラジ
ェリンを６　、５　ｍｇ／　ｍｌまで遠心濃縮、透析し
各分析法の出発試料を作製した。

アミン末端アミノ酸の決定は通常のエドマン分解で行な
い、Ｎ末端配列はＡｌａ（１位）−Ｇｌｎ（２位）と決
定きれ、第９′５ＡのＤＮＡ配列から推定できるＡｌａ
（１位）　−Ｇｉｎ（２位）のアミノ酸と一致する。

カルボキシ末端アミノ酸の決定は通常のカルボキシペプ
チダーゼＰを用いた方法で分析し、Ｇｌｙと決定され、
第９図から推定できるＧｉｙ（４９７位）と一致する。

全アミノ酸含量の分析は、まず０．１％アンモニア水に
６　、５　ｍｇ／　ｍｌの精製フラジェリンを溶解した
。この１０μｍに、５０μｍの０．２％インドールエチ
ルアミンを含む４Ｍメタンスルホン酸を加え、１１０℃
で２４時間加水分解し、その後４７μｍの４Ｎ水酸化ナ
トリウム及び４０３μｍの０．２Ｎクエン酸ナトリウム
を加え試料とした。

上記、いずれの分析でも日立アミノ酸分析計モデル８３
５型を用いて分析した。全アミノ酸含量と、ＤＮＡ配列
から推定できるアミノ酸含量を比較して表１に示す。

（以下余白） 表１　大腸菌に１２株フラジュリンのアミノ酸組成アミ
ノ酸　　　　分析値ａ　　　理論値Ａｌａ　　　　　　
　５８．１　　　　　５９Ｖａｌ　　　　　　　３２．
８　　　　　３３Ｌｅｕ　　　　　　　３７．５　　　
　　３７ＩＩａ　　　　　　　２７．０　　　　　２８
ｃｘｙ　　　　　　　４５．３　　　　　４４Ｐｒｏ　
　　　　　　　６．０　　　　　　６Ｃｙｓ　　　　　
　　　Ｏ，００ Ｍｅｔ　　　　　　　　２．７　　　　　　３Ｈｉｓ　
　　　　　　　Ｏ，００ Ｐｈａ　　　　　　　　５．０　　　　　　５Ｔｙｒ　
　　　　　　　９．９　　　　　１０Ｔｒｐ　　　　　
　　　Ｏ，００ Ａｓｎ（＋Ａｓｐ）　　　　　　　　　　（８８，７）
　　　　　　　　　　　　　　　　４ｇ（８７）Ｇｉｎ
（＋Ｇ１ｕ）　　　　（４１，５）　　　　　　２７（
４１）Ｓｅｒ　　　　　　　４２．８ｂ　　　　　　４
３Ｔｈｒ　　　　　　　６３．３ｂ　　　　　　６５Ｌ
ｙｓ　　　　　　　２５．４　　　　　２５Ａｒｇ　　
　　　　　１０．２　　　　　１１ａ、　ＰｂｅＢ４基
を５．０として計算したす、加水分解による分解を考慮
した補正■　Ｈ抗原性が変化した変異ｈａｇ遺伝子の試
験管内作成 （Ａ）　ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３　ｃｃ−ＤＮＡのデ
オキシリボヌクレアーゼＩ　（ＤＮａｓｅ　Ｉ　）によ
る消化ＴＥ緩衝液中のｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３　ｃｃ
−ＤＮＡ（１、３５ｍｇ、１ｍ１）をエタノール沈澱し
、５０ＩＩＩＭトリス塩酸（ｐＨ７，３＞に溶かす、こ
のＤＮＡ１２５μｇ％ＤＮａｓｅＩ（宝酒造）６ｎｇ、
１ｍＭ塩化マンガンを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７
，３）より成る反応液３４０μｍを３７℃で１０分間反
応させ、ただちにフェノール・クロロホルム（１：　ｌ
ｆｉ液）ヲ’ＨＬ加え反応を停止させ、実施例■−Ｅと
同様にしてフェノール、クロロホルム抽出を行なった。

エタノール沈澱後、直ちにＴＥ緩衝液２００μｍに溶解
する。

次にアガロースゲル電気泳動で分離し、線状単量体の位
置にくる螢光バンドからＤＮＡを抽出した（線状単量体
のサイズマーカーとして、Ｅｃｏ　ＲＩで切断したｐＢ
Ｒ３２２／ｈａｇ９３　ＤＮＡを用いた）、抽出液をエ
タノール沈澱し、約２μｇの線状ｐＢＲ３２２／ｈａｇ
９３　ＤＮＡを得た。

（Ｂ）エキソヌクレアーゼＢａ１３１による消化実施例
■−ＡのＤＮＡを、１４μｍの水にとかし、２μｍずつ
７本の反応チューブに分注する。

次いで２μｍのＢａ１３１反応液（２４ｍＭ塩化カルシ
ウム、２４ｍＭ塩化マグネシウム、２００ｍＭ塩化ナト
リウム、４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、２ｍＭＥ
ＤＩＡ−２Ｎａより成る。）を加え３０″Ｃで３０分加
温する。

Ｂａ１３１酵素液（ベセスダリサーチラボラトリ（ＢＲ
Ｌ）’）を、１２ｍＭ塩化カルシウム、１２−塩化マグ
ネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２０　ｍＭ　ト
リス塩酸（ｐＨ８，０）、１　ｍＭ　ＥＤＩＡ−２Ｎａ
。

０．１％ウシ血清アルブミンより成る希釈液で６．０２
単位／ｍｌ、３．０１単位／ｍｌ、１．５１単位／ｍｌ
、０．７６単位／ｍｌ、０．３８単位／ｍ１．０．１９
単位／ｍｌ、０．１０単位／ｍｌの７段階に希釈する。

各濃度のＢａ１３１を４μｍ加え、３０°Ｃで１０分間
反応を進行きせ２００ｍＭエチレングリフールビス（β
−アミノエチルエーテル）−Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’、　
Ｎ　−四酢＃（ＥＧＴＡ）１μｍを加え水冷する。７本
の反応チューブの内容を全て集めて実施例■−Ｅと同様
にしてフェノール、クロロホルム抽出を行ない、エタノ
ール沈澱を行なう。

（Ｃ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のラージフラグメン
ト（クレノーフラグメント）による修復と合成Ｈｉｎｄ
ｌ［Ｉ　’Ｊンカー存在下での連続反応実施例■−Ｂの
ＤＮＡを３μｍのＴＥ緩衝液に溶解する。このＤＮＡ　
３μｍ（約２μｇ）を、１０倍ニックトランスレーショ
ンバッファー（０，５Ｍトリス［＃（ｐＨ７、２）、０
．１Ｍ硫酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、
５００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンより成る。）１μｍ
、１μｍ　ｄＮＴＰ’ｓ（宝酒造、ｄＡＴＰ、　ｄＴＴ
Ｐ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ各１ｍＭより成る）、４μ
ｍクレノーフラグメント（宝酒造）３本位／１μｌ、水
１μｍ中で３０℃３０分間反応させる。

続いて上記反応液１０μｍ、５倍ライゲーションバッフ
ァー（０，２５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７゜４）、０．０５
Ｍ塩化マグネシウム、５ｍＭスペルミジン、０　、５　
ｍｇ／　ｍｌ牛血清アルブミン）４μｍ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉリンカ−（５’　−ＣＡＡＧＣＴＴＧ、宝酒造）１μ
ｇ／μｍ、１００ｍＭジチオスレイトール２μｍ、１゜
ｍＭ　ＡＴＰ２　μｍ、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ２単位
／２μｍを１６℃で１６時間反応させる。

（Ｄ）形質転換とＨ−抗原性が変化した菌株の選択 実施例■−Ｃの反応物を、大腸菌に１２株のα００ｒ−
ｍ−ｈａｇ：　：ＴｎｌＯに形質転換する＊　Ｃ６００
ｒＣ６００ｒ−：：Ｉｎ１Ｏ株は０６００株（ｔｈｒ−
１，１ａｕ−６，ｔｈｉ−１，５ｕｐＥ４４、１ａｃＹ
１．ｔｏｎＡ２１．λ−）のｒ−（リストリクジョン・
マイナス）ｍ−（モディフィケーション・マイナス）株
であり、ｈａｇ遺伝子にＩｎ１Ｏが挿入きれ失活した株
である。アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天上
に約８６００ケの形質転換コロニーを得た。このうち約
５０００コロニーから、１万倍に希釈した抗鞭毛ポリマ
ー抗体を含む遊走検定用培地上で３７℃５〜６時間培養
して、抗体を含まない遊走検定用培地上と同程度の遊走
を示す株を１２株（Ａ群）分離した。更に３７℃２０時
間の培養で抗体存在下にもかかわらず明らかに遊走性を
示した菌株を４株（Ｂ群）分離した。

抗鞭毛ポリマー抗体は実施例■−Ｂ−ａの精製フラブエ
リン蛋白１３　、９ｍｇ／　１０ｍｌに硫酸アンモニウ
ムを６０％（Ｗ／Ｖ）になるように加え、４°Ｃで一晩
放置し、遠心（１５０００ｇ、１５分）の沈殿をＰ緩衝
液に懸濁しく１．３ｍ１）、同緩衝液に対して透析をく
り返したものを抗原として用いた。アジュバントにはＤ
Ｉ　ＦＯ社のインコンプリートを用いた。ウサギにュー
ジーランド　ホワイト雌）に初回は３　ｍｇ／羽を両後
肢指掌部並びに大腿部に皮下注射し９日日、１４日日日
同様の注射を行ない、２１日１に頚動脈より全採血した
。採血後通常の方法で粗血清画分を得た。

（Ｅ）　Ｈ抗原性が変化した菌株の持つｈａｇ遺伝子の
解析 （ａ）ラピッドプラスミツドＤＮＡ解析実施例■−りで
採取きれたＡ並びにＢ群について、保有するプラスミツ
ドが制限酵素Ｈｉｎｄｌ［で切断されるかラピッドプラ
スミツドＤＮＡ解析法で検討した。

Ａ群からは４株、Ｂ群からは１株の保有するプラスミド
が１ｉｎｄｌ［［で切断された。これらのプラスミドは
もともとｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３プラスミド由来であ
り、Ｈｉｎｄｌ［［切断点は持っていない事から、この
切断部位は実施例■−Ｃで用いた合成ＨｉｎｄＩＩＩリ
ンカ−のプラスミドへの挿入により生じた事になる。

（ｂ）　Ｈｉｎｄｌ１１切断点のプラスミドＤＮＡ上で
の位置づけ 実施例■−Ｅ−ａのＡ群４株の中から３株を選び、その
保有するプラスミドをｐＦＤｌ　、　ｐＦＤ２．　ｐＦ
Ｄ３と名付けた。Ｂ群の１株についてはｐＨＤ−１と名
付けた。この４種のプラスミドのＨｉｎｄＩ［Ｉ切断点
の位置づけをラピッドプラスミドＤＮＡ解析法により行
なった。

ｐＦＤｌ　、　ｐＦＤ２．　ｐＦＤ３を持つ菌株からラ
ピッドプラスミドＤＮＡ解析法で調製した試料をＥｃｏ
ＲＩ並びにＨｉｎｄｌの二重消化を行ない、アガロース
ゲルを気泳ｅ法で消化物のサイズを検討した。

どの試料からも約５　、３　ｋｂｐと約２．３ｋｂｐの
断片が認められた。従ってＨｉｎｄｌｌ［切断点はＥｃ
ｏＲＩ切断点（実施例■−Ｆ−ｂ）から約２．３ｋｂｐ
離れた距離に位置する。一方、ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９
３　ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化では約５．８ｋｂｐと約１
．９ｋｂｐの断片を生ずる事がわかっているが（■−Ｃ
）　、ＢａｍＨＩ消化後、続いてＨｉｎｄｌ［Ｉで消化
すると、約１．９ｋｂｐの断片の方が二断片にわかれた
。この事からいずれの試料のＨｉｎｄＩ［Ｉ切断点もＥ
ｃｏＲＩ切断点から時計回りで約２　、３　ｋｂｐの距
離に存在し、３ｄｍＨＩ切断時の約１．９ｋｂｐ断片内
に位置する事がわかった。ＥｃｏＲＩ切断点より時計回
りに最初のＢａｍＨＩ切断点までの距離は約０．７ｋｂ
ｐ（■−Ｃ）、更に時計回りをしてＨｉｎｃＩ切断点（
■−Ｆ−ｂ）までは約０゜７ｋｂｐ”である。都合Ｅｃ
ｏＲＩ切断点から１．４ｋｂｐを時計回りするとｈａｇ
遺伝子のコードされているＤＮＡ領域にあたる。Ｅｃｏ
ＲＩ切断点から時計回りで約２．３ｋｂｐの距離に存在
するＨｉｎｄｌｌ切断点はｈａｇ遺伝子がフードされて
いるＤＮＡ領域内に存在する事になる（第１０図）。

村　実施例■−Ｆ−ｂ、図６においてＨｉｎｃｌ［１〜
Ｈｉｎｃ　Ｉ［（５）間の距離は１．８５ｋｂｐであり
、又ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ　”の距離は約０．７３
ｋｂｐである。一方ＨｉｎｃｌＩ　１〜ＥｃｏＲＩの距
離は約０．４５ｋｂｐである（　Ｊ、Ｇ、５ｕｔｃｌｉ
ｆｆａ、　１９７９．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂ。

Ｓｙｍｐｏｓｉａ　４３．ｐ１３３）。従ってＢａｍＨ
Ｃ〜Ｈｉｎｃ　ＩＩ　（５）間の距離は約０．７ｋｂｐ
となる。

上記と同様にしてｐＨＤ−１プラスミド上の）ｉｉｎｄ
　ｍ切断点の位置づけを行なった。　ＥｃｏＲＩ並びに
）Ｂｉｎｄｌの二重消化では約６．４ｋｂｐと約１．４
ｋｂｐの断片に分かれた。従って１ｉｎｄＩ［Ｉ切断点
はＥｃｏＲＩ切断点より約１．４ｋｂの距離に存在する
。一方、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌｌ［の二重消化では約
５　、　Ｂ　ｋｂｐ、１　、２　ｋｂｐ、０　、７　ｋ
ｂｐの断片が得られた。この事からｐＨＤ−１プラスミ
ドにおけるＨｉｎｄｌ［切断点はＥｃｏＲＩ切断点より
時計回りで１．４ｋｂｐの距離、上記の第１０図でＨｉ
ｎｃｌ（５）切断点近辺に位置する事がわかった。これ
はｈａｇ遺伝子の開始コドンＡＴＧの近辺にあたる。

（Ｃ）　ｐＦＤｌ、ｐＦＤ２、ｐＦＤ３プラスミドＤＮ
ＡにおけるＤＮＡ欠損部位の解析 ｐＦＤｌ、ｐＦＤ２、ｐＦＤ３プラスミドの試験管内作
成過程で、ＤＮａｓｅＬによる切断点をＢａ１３１ヌク
レアーゼで少し消化した（実施例■−Ｂ）、この消化に
よるＤＮＡ欠損は、合成Ｈｉｎｄ　ｍ　ＤＮＡリンカ−
の挿入部位に起っている筈である。この挿入部位はプラ
スミド上のＥｃｏＲＩ切断点より時計廻りで約２．３Ｋ
ｂｐの距離に存在し、この位置はＨｉｎｃ　Ｉｆ　（５
）−Ｎｄｅｌ　”　’断片内に存在する。

村　制限酵素Ｎｄｅ　１は５　’　ＣＡ　’　ＴＡＴＧ
を切断し、この塩基の並びは第９図中９５３位のヌクレ
オチド位置に存在する。ＥＣ０ＲＩ切断点より約２　、
４　ｋｂｐ、　ＨｉｎｃＩ［（５）切断点より約１　ｋ
ｂｐの下流に存在する。

上記の４種のプラスミドＤＮＡを含むラピッドプラスミ
ドＤＮＡ解析用の試料を１ｉｎｅ　ＩｆならびにＮｄａ
ｌで二重消化し、生じた断片をアガロースゲル電気泳動
法で検討した。

第９図からｈａｇ遺伝子を含むＨｉｎｃ　Ｉ［断片は約
１．７ｋｂｐの大ききでありＮｄｅｌ切断で約１．０ｋ
ｂｐと０．７ｋｂｐの断片に分かれる事がわかる。実験
ではこの断片はｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３　ＤＮＡの消
化物では約１０２０　ｂｐＳｐＦＤＩ　ＤＮＡからは９
３０　ｂｐ、　ｐＦＤ２　ＤＮＡからは９９０　ｂｐ、
　ｐＦＤ３　ＤＮＡからは９９０ｂｐと測定された。従
ってＨｌｎｄｍを含むＨｉｎｃＩ［（５）−Ｎｄｅｌ　
ＤＭ断片はｐＦＤＩ　ＤＮＡでは約９０　ｂｐ、　ｐＦ
Ｄ２、ｐＦＤ３　ＤＮＡでは約３０　ｂｐ、　ｐＢＲ３
２２／ｈａｇ９３上の断片に比較して、短縮している事
が示された。

（ｄ）　ｐＦＤｌ、ｐＦＤ２．ｐＦＤ３プラスミドでの
ＨｉｎｄＤＩ切断点近辺のＤＮＡシーケンシング ｐＦＤｌ、ｐＦＤ２、ｐＦＤ３のプラスミドを、宿主Ｃ
６００ｒＣ６００ｒ−：　’ＴｎｌＯ株を用い、実施例
■−Ｄ−ａと同様にしてｃｃＤＮＡを精製した。この精
製したプラスミドＤＮＡを用いたＢｉｎｄｌ［切断点付
近（第１１図）のＤＮＡシーケンシングには、通常のＭ
１３ファージベクターを用いるジデオキシヌクレオチド
鎖終止法を用いた０Ｍ１３フアージベクターにはＭ１３
ｍｐ１８（ファルマシア社）を用い、１（ｉｎｄｌ［Ｉ
、ＢａｍＨＩの二重消化を行ない、フェノール、クロロ
ホルム抽出後エタノール沈殿をしてＴＥ緩衝液に溶かし
ておく。プラスミドＤＮＡも同様にしてＴＥ緩衝液に溶
かしておく。この消化したＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結しＪＭ１０５株（ファルマシア社）に感染させプ
ラークを作らせる。常法に従い第１１図のＡまたはＢ断
片を持っＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを調製した。上記の様に
Ｍ１３ｍｐ１８ベクター上にクローン化した後１本鎖Ｄ
ＮＡを調製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法でＤＮ
Ａシーケンシングを行なった。

ｐＦＤＬの運搬するｈａｇ遺伝子は第９図中の７５４位
〜８５４位の塩基配列が欠損し、５　’　ＣＡＡＧＣＴ
　ｒＧ（合成ＨｉｎｄｌｌＩリンカ−〉が挿入されてお
り、その結果、７ミ／酸配列ＮＤＧＴＶＴＭＡＴＧＡＩ
ＡＮＡＴＬＩＴＤＡＮＴＴＫＡＴＴＩＴＳＧＧＴＰの３
４アミノ酸残基が欠損しＱＡＣの３アミノ酸が挿入され
ていた。　ｐＦＤ２の運搬するｈａｇ遺伝子は第９ｒｙ
Ｊ中の７１９位〜７６５位の塩基配列が欠損し、５’Ｃ
ＡＡＧＣＴＩＧ（合成Ｈｉｎｄｌ［リンカ−）が挿入さ
れており、その結果、アミノ酸配列ＤＮＤＧＫＹＹＡＶ
ＴＶＡＮＤＧＴの１６アミノ酸残基が欠損しＡＳＬの３
アミノ酸が挿入されていた。　ｐＦＤ３の運搬するｈａ
ｇ遺伝子は第９図中の７７８位〜８３６位の塩基配列が
欠損し、５’ＣＡＡＧＣＴＴＧ（合成Ｈｉｎｄｌ［リン
カ−〉が挿入されており、その結果、アミノ酸配列ＴＧ
ＡＴＡＮＡｒｖｒＤｆｉ、Ｎ　ｒ　Ｔ　Ｋ　Ａ工Ｔ１の
２０アミノ酸残基が欠損しＱＡＣの３アミノ酸が挿入さ
れていた。

（ｅ　）　ｐｉ（Ｄｉプラスミド上のＨｉｎｄＩ［Ｉ切
断点近辺のＤＮＡシーケンシング Ｃ６００ｒＣ６００ｒ−：　：ｒｎｌＯ（ｐＨＤｌ）株
より実施例■−Ｄ−ａと同様にしてｃｃＤＮＡを精製し
た。精製プラスミドＤＮＡＭＨｉｎｄｌｌｌ切断点近辺
（第１２図）のＤＮＡシーケンシングは、■−Ｅ−ｄで
述べたＭＬ３ファージベクターを用いるジデオキシヌク
レオチド鎖終止法と同様に、第１２図のＡまたはＢ断片
を持つＭ１３ｍｐ１８の１本鎖ＤＮＡを調製して行なっ
た。その結果、ｐＨＤｌの運搬するｈａｇ遺伝子は第９
図中の一２８位〜−２１位の５　’　ＡＡＣＧＡＣＴＴ
の８塩基が欠損し、５’ＣＡＡＧσＴＧ（合成Ｈｉｎｄ
ｌ［［リンカ−）の８塩基が挿入きれていた。この変異
をｐｍ（Ｄｉ変異と名付けた。　ｐｍ（Ｄｉ変異はＤＮ
Ａシーケンシングの結果ｈａｇ遺伝子の蛋白コーディン
グ領域内に起こった変異ではないことが明らかになった
。従ってｐＨＤ１変異が起こっても、ｈａｇ遺伝子の作
るフラジェリンは野生型のものと同じであり、宿主のＨ
抗原性も変化しない。

■　ｐＨＤ１プラスミドを持つ宿主株Ｃ６００ｒＣ６０
０ｒ−：　＋ＴｎｌＯの鞭毛の本数 ｐ）ＩＤＩプラスミドを持つＣ６００ｒＣ６００ｒ−：
　：ｒｎｌＯ株とｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３プラスミド
を持つＣ６００ｒ−Ｃ６００ｒ−：ｒｎｌＯ株の３０℃
で１晩静置培養した菌体の鞭毛を染色し、光学顕微鏡下
で各鞭毛本数を持つ菌体の出現数を数えた（表２）。

（以下余白） 表２　各鞭毛本数を持つ菌体の出現数 宿主：　Ｃ６００ｒＣ６００ｒ−：　：Ｉｎｌ０ｐｕｏ
ｔプラスミドを持ッｃ６００ｒ−ｍ−ｈａｇ：　：ｒｎ
ｌＯ株では菌体の持つ鞭毛の本数が増加している０両画
株を■−Ａ−ａと同様にして遊走検定用培地上で遊走能
を比較すると、３７℃で５時間培養後の遊走ゾーン直径
の平均は、ｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３を持つ場合１６ｍ
ｍ。

ｐＨＤｌを持つ場合３６ｍｍと、ｐＨＤｌを持つ株のほ
うがよく遊走する。　ｐＢＲ３２２のような多コピープ
ラスミド上のｐＨＤ１変異を持つｈａｇ遺伝子は、野生
型のｈａｇ遺伝子がｐＢＲ３２２に運搬きれているより
も宿主大腸菌を多鞭毛にすることがわかった。

■　ｐＦＤ２０２プラスミドの作成 （Ａ　）　ｐＦＤ２　ＤＮＡのヌクレアーゼ３ａ１３１
による消化Ｃ６００ｒＣ６００ｒ−：　：ＴｎｌＯ（ｐ
ＦＤ２）株より実施例■−Ｄ−ａと同様にしてｃｃＤＮ
Ａを精製した。　ｐＦＤ２　ｃｃＤＮＡ２０μｇ／６．
２μｍ、１０倍Ｐｖｕ　Ｍ緩衝液（１００ｍＭ　トリス
塩酸（ｐ）１７．５）、７０ｍＭ塩化マグネシウム、６
００ｍＭ塩化ナトリウム、７０ｍＭ２−メツしカプトエ
タノール）１０μｍ、水７３．８μｍを混合したものに
、制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［１２０本位／１０１を加え、
３７℃で１時間反応させる。実施例■−Ｅと同様にフェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、
０．０５％牛血清アルブミン溶液２０μｍに溶かす、上
記ＤＮＡ溶液４μｍに２倍Ｂａ１３１緩衝液（実施例■
−Ｂ）４μｍを加え３０℃で３分間インキュベートする
。ヌクレアーゼＢａ１３１（４９００本位／ｍ１）をＢ
ａ１３１緩衝液を用いて５２０倍に希釈したものを８μ
ｍ加え、１０分間周囲の温度で反応させた後、２００　
ｍＭＥＧＴＡ（実施例■−Ｂ）を２μｍ加えて氷冷する
。フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿後、
ＴＥ緩衝液１０μｍに溶かす。

（Ｂ）クレノーフラグメントによる修復と合成開Ａリン
カ−（ＨｉｎｄＩ［［−Ｓｍａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｍ　）
存在下の連結反応 実施例■−Ａの試料ＤＮＡ　（約４μｍ／１０μＩＴＥ
緩衝　　　　　液）５μｌに１００倍濃のニックトラン
スレーションバッファー１μｍ、ｄＮＴＰ’ｓ４μｍ（
実施例■−Ｃ）、クレノーフラグメント３車位／１μｍ
を加え周囲の温度で３０分反応きせる０次いで、上記反
応液に５倍濃度のライゲーションバッファー（実施例■
−Ｃ）、合成りＮＡリンカ−（ＨｉｎｄｌｌＩ　−Ｓｍ
ａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ、５’ＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧ
ＧＡＧＡＴＣＴ３°と３　’ＴＴＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣ
ＴＣＴＡＧＡ５゛の２本の１　Ｓｍａ　ｒポリヌクレオ
チド：フォスフオトリエステルを用いる同相合成法で化
学合成＞ｏ、ｓ；ｇ／１μｍ、１０　ｍＭＡＴＰ２１１
１．１００ｍＭＤＴτ２μｍ、水２μｍを混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ２単位／２μｍを加え、１４℃で１８時
間反応させた。

（Ｃ）形質転換体の選択 実施例■−Ｂの反応物を大腸菌Ｋ−１２株のＣ６００ｒ
Ｃ６００ｒ−：　：ＴｎｌＯに形質転換した。アンピシ
リン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天上に約１２００個の
形質転換コロニーを得た。この形質転換コロニーをアン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含む遊走検定用培地に突き刺
し、３７℃で５〜６時間培養したところ、約５０％が遊
走性を示した。このうち９０株について、保有するプラ
スミドがＳｍａ　Ｉで切断きれるかラビッドプラスミド
ＤＮＡ解析法で調べた。その結果、２株の保有するプラ
スミドがＳｍａ　Ｉで切断された。そのうち、１株の持
つプラスミドをｐＦＤ２０２と命名した。　ｐＦＤ２０
２は）ｌｉｎｄ　ｍ、Ｂｇｌ　ＩＩで切断されることが
ラビッドプラスミドＤＮＡ解析で確認された。

（Ｄ　＞　ｐＦＤ２０２プラスミドの合成りＮＡリンカ
−挿入部位近辺のＤＮＡシーケンシング ｐＦＤ２０２は実施例■−Ａの様に、ｐＦＤ２のＨｉｎ
ｄＩＩＩ切断点からヌクレアーゼＢａ１３１によって少
し消化したものである。従って、合成りＮＡリンカ−挿
入部位はｐＦＤ２の）ｌｉｎｄｌＩ切断点近辺というこ
とになり、この部分はプラスミドを１ｉｎｅ　Ｉ［、Ｐ
ｓｔ　Ｉで二重消化した際に生じる約９００ｂｐの断片
の中に含まれる。

（ａ）　ｐＦＤ２０２ＤＮＡのＨ４ｎｃ　Ｉ［−Ｐｓｔ
　Ｉによる二重消化ＣＣ６００ｒｆ−ｈａ：　：Ｔｎｌ
Ｏ（ｐＦＤ２０２）株より、実施例■−Ｄ−ａと同様に
してｃｃＤＮＡを精製した。　ｐＦＤ２０２ｃｃＤＮＡ
２３μｇ７１０μｍ、１００倍濃のｐｖｕ　Ｉ緩衝液１
０μｍ、７０ｍＭ２−メルカプトエタノール１０μｍ、
０．２％牛血清アルブミン、Ｈｉｎｃｌ［６０本位／１
０μｍ、ＰｓｔＩ９６単位／６μｍを加えて全量を１０
０μｍにして３７℃で８０分間反応きせる０反応終了後
、１０μｍの５倍濃度のサンプルバ・ソファ−（ショ糖
２５％、酢酸ナトリウム５ｍＭ、ドデシル硫酸ナトリウ
ム０．１％、ブロムフェノールブルー０．０５％）を加
え、全量を０．８％のアガロースゲルで１００Ｖ４０分
間の電気泳動を行ない、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジ
ウムで染色を行なった後、約９００ｂｐのバンドを含む
ゲルを切り出す、マックス壷イールドを用いて１０Ｖ１
０分間２回の電気的溶出を行ない、エタノール沈殿後２
００μｍのＴＥ緩衝液に溶かした。

（ｂ　）　Ｍ１３ｍｐ８ＤＮＡのＨｉｎｃ　ＩＦ　−Ｐ
ｓｔ　Ｉの二重消化Ｍ１３ｍｐ８ＲＦＤＮＡ　３　μｇ
７３０　μｍ、１００倍濃のＰｖｕ■緩衝液１０μｍ、
７０ｍＭ２−メルカプトエタノール５μｍ、水４０μｌ
を含む反応液に１ｉｎｅｌＩ　１　Ｂ単位／３μｍ、Ｐ
ｓｔＩ　３２単位／２μｍを加え、３７”Ｃで１時間反
応後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を
行ない、２１μｍのＩＥ緩衝液に溶かす。

（ｃ　）　Ｈｉｎｃ　ＩＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片のＭ１３
ｎ＋ｐ８ベクターへのクローニングとＤＮＡシーケンシ
ング 実施例■−叶ａの１ｉｎｅ　ＩＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を
含むＩＥ４１衝液１０μｍ、実施例■−Ｄ−ｂの試料３
μｍ（約４３０ｎｇＤＮＡ　）、５倍濃度のライゲーシ
ョンバッファー４μｍ、１００　ｍＭＤＴＴ２μｍ、１
０　ｍＭＡＴＰ２　ｔｔ　１を含む反応液２１μｍに、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位／１μｍを含む反応液を１４
℃で１８時間反応安せ、全量をＪＭ１０９株（宝酒造）
へ形質転換した。

Ｍ１３＋ｎｐ８ベクターへクローン化した後、１本鎖Ｄ
ＮＡを調製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法でＤＮ
Ａシーケンシングを行なった。その結果、ｐＦＤ２０２
プラスミドが運搬するｈａｇ遺伝子は野生型のｈａｇ遺
伝子に較ベア８塩基対（第９図中７１１位〜７８８位）
が欠損し、１８塩基対が挿入きれており、天然の２６ア
ミノ酸が欠損し、６個の人工アミノ酸配列が挿入きれて
いることがわかった。

■　ｐＦＤ３０１、ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０６、ｐＦ
Ｄ３０７プラスミドの作成 （Ａ　）　ｐＦＤ３　ＤＮＡのヌクレアーゼＢａ１３１
による消化Ｃ６００ｒＣ６００ｒ−：　：ＴｎｌＯ（ｐ
ＦＤ３）株より実施例■−Ｄ−ａと同様にしてｃｃＤＮ
Ａを精製した。　ｐＦＤ３ｃｃＤＮＡ５０μｇ／１２μ
ｍ、１０倍ｐｖｕｌ［ｉ衝液２５μｍ、水１８８μｍを
混合したものに、制限酵素ＨｉｎｄＩ［［３００単位７
２５μｍを加え、３７℃１時間反応させる。

反応後、実施例■−Ｅと同様にして、フェノール・クロ
ロホルム抽出、次いでエタノール沈殿を行ない、水２５
μｍに溶かした。この反応液５μｍ（約２μｇＤＮＡ／
μｍ）に０．０５６％のウシ血清アルブミン溶液を加え
１０倍に希釈する（約２００　ｎｇ／μｍ）。この溶液
２０μｍに２倍Ｂａ１３１緩衝液２０μｍを加え、３０
℃で３０分間インキュベートする。

ヌクレアーゼＢａ１３１（１７００単位７ｍ１）をＢａ
１３１希釈液を用いて１１４０倍に希釈したものを４０
μｍ加え、２０分間周囲の温度で反応させた後、反応液
２０μｍに１００　ｍＭＥＧＴＡ５　Ｉｔ　１を加え氷
冷する。

フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿後１０
μｌの水に溶かした。

（Ｂ）クレノーフラグメントによる修復と合成開Ａリン
カ−（Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　−５ｍｇ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＦ
　）存在下の連結反応 実施例■−Ａの試料ＤＮＡ　（約１μｇ７１０μｍ）に
１００倍濃のニックトランスレーションバッファー１．
５μｍ、ｄＮＴＰ’ｓ２７１１、クレノーフラグメント
３単位／１μｍを加え、周囲の温度で３０分間反応させ
る。続いて上記反応液に合成りＮＡリンカ−（Ｈｉｎｄ
Ｉ［［−５ｍｇ　Ｉ　−Ｂｇｌｌ［）３　　、　７μｇ
１５μｍ、　１００　ｍＭＤＴＴ７μｍ、１０　ｍＭＡ
ＴＰ３７１１．５００ｍＭトリス塩酸（ｐ）１７．３）
１μｍ、水１．５μｍを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２
単位７２μｍを加え１５℃で１８時間反応許せた。

（Ｃ）形質転換体の選択 実施例■−Ｂの反応物をＴＥ緩衝液に対し約４時間透析
後、大腸１ｍＫ１２株のＣ６００ｒＣ６００ｒ−：　：
ＴｎｌＯ株に形質転換した。アンピシリン５０μｇ／ｍ
ｌを含むＬＢ寒天上に形質転換株約５６０コロニーを得
た。このコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
遊走検定用培地に付き刺し、わずかな遊走性を示す株も
遊走するものとみなしてピックアップし２３株を得た。

この２３株について保有するプラスミドが制限酵素Ｓｍ
ａ　Ｉで切断されるか検討し４株を得た。この４株が保
有するプラスミドをｐＦＤ３０１．１Ｄ３０３、ｐＦＤ
３０６、ｐＦＤ３０７と命名した。この４種はＨｉｎｄ
ＩＩＩ、ＢｇｌＩＩでも切断されることがラピッドプラ
スミドＤＮＡ解析で確認きれた。

（Ｄ　）　ｐＦＤ３０１、ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０６
、ｐＦＤ３０７ブラスミドの合成りＮＡリンカ−挿入部
位近辺のＤＮＡシーケンシング ｐＦＤ３０１、ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０６、ｐＦＤ３
０７は実施例■−Ａと同様にしてｐＦＤ３のＨｉｎｄｌ
［［切断点からヌクレアーゼＢａ１３１によって消化を
進めたものであるから、ｐＦＤ３０１．　ｐＦＤ３０３
、ｐＦＤ３０６、ｐＦＤ３０７の合成りＮＡリンカ−挿
入部位はｐＦＤ３のＨｉｎｄｌ［［切断点近辺にある。

従って、合成りＮＡリンカ−挿入部位のＤＮＡシーケン
シングにはＨｉｎｄ　ｍ　−Ｈｌｎｃ　Ｍの２断片Ａ′
、Ｂ’（第１３図）をＨｉｎｄｌ［［切断点からシーケ
ンシングすればよい。

（ａ　）　ｐＦＤ３０１．　ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０
６、ｐＦＤ３０７　ｃｃＤＮＡのＨｉｎｃ　Ｉｆ、１ｉ
ｎｄＩ［［の二重消化ｐＦＤ３０１、ｐＦＤ３０３、ｐ
ＦＤ３０Ｂ、ｐＦＤ３０７を有するＣ６００ｒ−Ｃ６０
０ｒ−：ＴｉＩ４株より、実施例■−Ｄ−ａと同様にし
てｃｃＤＮＡ　ｔ−精製した。　ｐＦＤ３０１のｃｃＤ
ＮＡ５　μｇ、　　１０倍ｐｖｕ　ＩＩ緩衝液５μｍ、
７０ｍＭ２−メルカプトエタノール５μｍ、Ｈｉｎｃｌ
［３０単位１５μｍ、ＨｉｎｄＩ［［５０単位１５μｍ
に水を加え全量を５０μｍにした反応液を３７°Ｃで１
時間インキュベートし、反応終了後フェノール・クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿後、水１０μｍに溶かした
。　ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ　３０６、ｐＦＤ３０７につ
いても同様の処理を行なった。

（ｂ　）　Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＤＮＡのＨｉｎｃ　Ｉ［
、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　（７）　二重消化Ｍ１３ｍｐ１８
　ＲＦＤＮＡ２　、５８ｇ１５　Ｉｔ　１．１０倍Ｐｖ
ｕ　ＩＩ緩衝液５μｍ、７０ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール５μｍ、水２５μｍを含む反応液にＨｉｎｃｌ［３
０単位１５　ｕ　１．　）ＩｉｎｄＩ［［５０単位７５
μｍを加え、３７℃で１時間反応後、フェノール・クロ
ロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、水１０μｍに
溶かした。

（ｃ　）　ＨｉｎｃＩ［−Ｈｌｎｄｌ［［断片のＭ１３
ｍｐ１８ベクターへのクローニングとＤＮＡシーケンシ
ング 実施例■−Ｄ−ａのＨｉｎｃ　Ｉｆ−ＨｉｎｄＩ［［断
片１，５μＶ３μｍ、実施例■−Ｄ−ｂの試料０．５μ
ｇ／２μｍ、５倍濃度のライゲーションバッファー４μ
ｍ、１００　ｍＭＤＴＴ　２μｍ、１０　ｍＭＡＴＰ２
　ａ　１、水５μｍを含む反応液にＴ４ＤＮＡリガーゼ
２単位／２μｍを加え、反応液を１５℃で１８時間イン
キュベートし、全量をＪＭ１０９株（宝酒造）にトラン
スフェクションした。１０個のプラークを採取し、常法
に従い１本鎖ＤＮＡを調製した。２本鎖ＤＮＡをＨｉｎ
ｃ　ＩＩ、Ｈｉｎｄ　ｍで二重消化した反応物を、ｐＦ
Ｄ３ｃｃＤＮＡのＨｉｎｃｌＩ　、　Ｈｉｎｄｌｌｒ二
重消化物をＤＮＡ断片の大きさのコントロールとして、
１．６％のアガロースゲル電気泳動法で検討したところ
、ｐＦＤ３ｃｃＤＮＡ由来のＡ、Ｂ両断片（第１３図）
は何れも消失しており、かわりにＡ５Ｂ５断片より小さ
い２種の断片Ａ′、Ｂｏが認められた。両断片をクロー
ン化している１末鎖ＤＮＡ試料各１個をジデオキンヌク
レオチド鎖終止法で諏Ａシーケンシングを行なった。そ
の結果、ｐＦＤ３０１プラスミドが運搬するｈａｇ遺伝
子は野生型のｈａｇ遺伝子に較べ、５６１個の塩基対（
５８３位〜１１４３位）が欠損し１８個の塩基対が挿入
された結果、天然の１８７個のアミノ酸が欠損し６個の
人工アミノ酸配列が挿入されていることがわかった（第
１４図Ａ）。ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０６、ｐＦＤ３０
７の運搬するｈａｇ遺伝子のシーケンスを第１４図Ｂ、
Ｃ。

Ｄに示す。

■　ｐＦＤ３１１、ｐＦＤ３１３、ｐＦＤ３１５プラス
ミドの作成ヌクレアーゼＢａ１３１の反応時間を５分間
とする以外は、実施例■−Ａ、■−Ｂ、■−〇、■−り
と同様にプラスミドを作成し、ｐＦＤ３１１．　ｐＦＤ
３１３、ｐＦＤ３１５を得た。各プラスミドのＤＮＡシ
ーケンスを第１５図Ａ、Ｂ、Ｃに示す。

■　ｐＦＤ１ベクタープラスミドを用いたポリペプチド
ＨＢｓＡｇ−Ｉをキメラ化したフラジェリンの排出（Ａ
　）　ｃｃ−ｐＦＤｌの制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩによ
る切断とクレノーフラグメントによる修復 ２０μｇのｃｃ−ｐＦＤＬ　ＤＮＡを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７，５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、６０
ｍＭ塩化ナトリウムを含む反応液に制限酵素Ｈ４ｎｄ１
［を１００単位加え、３７℃で３０分間反応させる。フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿後２０μ
ｍのＴＥＩ衝液に溶かしておく。

上記のＤＮＡ２０μｇ／２０μＩＴＥ緩衝液に１０倍ニ
ックトランスレーションバッファー２μ＋、ｄＮＴＰ（
各ＸＴＰは１ｍＭ）２μ１１クレノーフラグメント３単
位／１μｌを加え、室温で３０分間反応させる。５００
ｍＭＥＤＴＡを１μ！加えフエーノル・クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿し、２０μｍのＴＥ犠衝液に溶か
した。

（Ｂ）合成ポリヌクレオチドのアニーリング化学合成ポ
リヌクレオチドＲＴＨ−１６０３（５’ＡＣＡＡＡＡＣ
ＣＴＡＣＧＧＡＴＧＧＡＡＡｒＧＧ３　’　）約２０ａ
ｇ／１００μｌ水とＲＴ　Ｈ−１６０４（５’ＣＣＡＴ
ＴＴＣＣＡＴＣＣＧＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴ３　’　）約
２０μｓ／ｌｏｏμｌ水に１０倍濃度のＴＥ緩衝液２０
μｌを加え、６０℃で３０分間保温した後、６時間かけ
て徐々に２８．５℃まで下げてアニーリングを行なった
。

（Ｃ）　ｐＦＤｌベクターへの化学合成りＮＡの連結実
施例■−Ａの試料ＤＮＡ　１μｇ／ｌμｌ、実施例■−
Ｂの合成りＮＡＩ　８０ａｍｏｌ／　１３　μｌ　、　
　５倍ライゲーションバッファー４μＩ、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ５．６単位／２μｌを加え、１６°Ｃで１６時間
反応させた後、ＴＥ緩衝液に対して２時間透析する。

（Ｄ）形質転換した菌株の選択 実施例■−Ｃの試料ＤＮＡをＣ６００ｒＣ６００ｒ−：
　：ＴｎｌＯ株へ形質転換した。５０μｇ　／　ｍ　ｌ
のアンピシリンを含むＬＢ培地上に、１μ区のｐＦＤＩ
　ＤＮＡあたり３．８Ｘ１０’個のアンピシリン抵抗性
コロニーが出現した。そのうち９０個のコロニーの遊走
性を調べ、８２株が遊走性を示した。そのうち６２株に
ついてラビッドＤＮＡ解析を行ない、保有するプラスミ
ドが制限酵素Ｈｉｎｄｎｌで切断されなくなっている菌
株＃１１、＃１２、＃１４、＃１６、＃１７の計５株を
選び出した。この５株の持つプラスミドをそれぞれｐＦ
Ｄ１／　ＨＢｓＡｇ−１＃　１１、＃１２、＃１４、＃
１６、＃１７と命名した。

（Ｅ　）　ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１プラスミドに挿入
された化学合成りＮＡ部分のシーケンシング ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１プラスミドの化学合成りＮＡ
断片が挿入された部分は、制限酵素Ｈ４ｎｃｌ［とＰｓ
ｔ　Ｉで切断されて生じる断片のうち、分子サイズにし
て大きい方から３番目の断片に含まれる。

（ａ　）　ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−Ｉプラスミドの）ｌ
ｉｎｅｌＩ、Ｐｓｔ　１による二重消化 実施例■−Ｄの＃１１、＃１２、＃１４、＃１６、＃１
７の５株をアンピシリン５０ｔｔｇ／ｍｌを含むＬＢ培
培地１出 ラピッドＤＮＡ解析用の試料を作る．その試料を１５０
μ！のＴＥ＠衝液に溶かす。

上記の試料に、１０倍Ｐｖｕｌ［ｆｆｌ衝液２２ｇ１。

７０ｍＭ２−メルカプトエタノール ０、２％ウシ血清アルブミ’：／１　１μｌ，　Ｈｉｎ
ｃｎ８０単位／１０μ１％ＰｓｔＩ９６単位／１２μｍ
を加え、３７℃で１時間反応を進める。

遠心エバポレーター（佐久間製作所）で１００μｌまで
濃縮し、１０１１１のサンプルバッファーを加え、０．
８％のアガロースゲル電気泳動を行なう．分子サイズに
して大きい方から３番目の螢光バンドを切り取り、電気
溶出を行ない、エタノール沈殿後、１５μｌのＴＥ緩衝
液に溶かす。

（　ｂ　）　Ｍ１３ｍｐＬ８　ＲＦ　ＤＮＡの）Ｉｉｎ
ｃｌ［、ｐｓｔ　Ｉによる二重消化 Ｍ１３ｍｐ８　ＲＦ　ＤＮＡのかわりにＭ１３ｍｐ１８
　ＲＦ　ＤＮＡ　２μ＆／４μｌ、また水６６μｍを加
えること以外は実施例■−Ｄ−ｂと同様にしてＨｉｎＣ
Ｉ［、Ｐｓｔ　Ｉによる二重消化を行なった。

（　９　）　Ｈｉｎｃ　ＩＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片のＭ１
３ｍｐ１８ベクターへのクローニングとＤＮＡシーケン
シング 実施例■−Ｅ−ａの＃１１、＃１２、＃１４、＃１６、
＃１７株のＤＮＡ試料４μｌのそれぞれに、実施例■−
Ｅ−ｂのＤＮＡ試料４μ＋（４００ｎｇ）を加え、５倍
ライゲーションバッファー４μｌ、１００ｍＭＤＴＴ２
μ＋，１０ｍＭＡＴＰ２μｌ、水１μＩ，Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ１単位／１μｌを加えて、１６℃で１６時間反応
させ、全量をＪＭ１０９株へトランスフェクションした
。

Ｍ１３ｍｐ１８ベクターへクローン化した後、１本鎖Ｄ
ＮＡを調製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法でＤＮ
Ａシーケンシングを行なった．その結果、各株プラスミ
ドにおける化学合成りＮＡ部分の構造が以下の通り決定
した。

ｐＦＤｌ／ＨＢｓＡｇ−　Ｉ　＃１１ Ａ１ａＧ１ｕＡ１ａＴｈｒＬｙｓＰｒｏＴｈｒＡｓｐＧ
１ｙＡｓｎＧ１ｙＡ１ａＣｙｓＶａ１５　’　ＧＣＴＣ
ＡＡＧＣ’ｆＡＣＡＡＡＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧにＡＡ
ＡＴＧＧＡＧＣＴＴＧ工ＧＴｒｐＦＤ１／）ｌＢｓＡｇ
−Ｉ　＃１２、＃１４、＃１６、＃１７一部は挿入され
た合成りＮＡ部分 ■　ｐＦＤ１ベクタープラスミドを用いたポリペプチド
ＨＢｓＡｇ−ＩＩをキメラ化したフラジェリンの排出（
Ａ　）　ｃｃ−ｐＦＤｌの制限酵素Ｈｉｎｄｌ［による
切断とクレノーフラグメントによる修復 実施例■−Ａと同様にして、ｃｃ−ｐＦＤｌを制限酵素
）１ｉｎｄｌ［［で切断し、クレノーフラグメントによ
って修復した。

（Ｂ）合成ポリヌクレオチドのアニーリング化学合成ポ
リヌクレオチドとしてＲ３Ｍ−２１０３（５°ＡＣＡＡ
ＡＣＣＩＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＡＩＧＧ３　’　）、Ｒ
５Ｍ−２１０４（５’ＣＣＡＴＩＴＣＣＡＴＣＣＧＡＡ
ＧＧＴＴＴＴＧＩ３’）を用いて、実施例■−Ｂと同様
にアニーリングを行なった。

（Ｃ）ｐＦＤ１ベクターへの化学合成り　Ｎ　Ａの連結
実施例■−Ｃと同様にして、ｐＦＤ　１ベクターへ化学
合成りＮＡを連結した。

（Ｄ）形質転換した菌株の選択 実施例■−Ｃの試料ＤＮＡを、Ｃ６００ｒＣ６００ｒ−
：　：Ｔａ２Ｏ株へ形質転換した。５０ａｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ培地上に、１μｇのｐＦＤＩ　Ｄ
ＮＡあたり２Ｘ１０’個のアンピシリン抵抗性コミニー
が出現した。そのうち６８個のコロニーの遊走性を調べ
、４３株が遊走性を示した。そのうち１６株について、
実施例■−Ｄと同様に、その菌株が持つプラスミドのラ
ビッドプラスミド解析を行ない、＃１、＃２、＃３、＃
６、＃８、＃１３、＃１６の７株が持つプラスミドがＨ
ｉｎｄＩ［Ｉで切断きれなくなっていた。この菌株の持
つプラスミドをそれぞれｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１［＃
　１、＃２、＃３、＃６、＃８、＃１３、＃１６と命名
した。

（Ｅ　）　ｐＦＤｌ／ＨＢｓＡｇ−Ｍプラスミドに挿入
きれた化学合成りＮＡ部分のシーケンシング ＤＮＡシーケンシングは、ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１ｆ
　＃１　、ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１［＃　１３のプラ
スミドについて、実施例■−Ｅと同様にして行なった９
両プラスミドにおける化学合成りＮＡ部分の構造を以下
に示す。

ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１１＃　１、ｐＦＤ１／ＨＢｓ
Ａ’ｇ−Ｉｆ　＃　１３部分は挿入きれた合成り　Ｎ　
Ａ　Ｍ分０ｐＨＤｌ変異による鞭毛数の増加 （Ａ）ｄａｍ−菌からのｐＦＤｌ、ｐＦＤ１／ＨＢｓＡ
ｇ−Ｉ　、　ｐＦＤ１／）ＩＢｓＡｇ−ＩＩプラスミド
ｃｃ−ＤＮＡの調製Ｃ６ＱＯｒ−ｍ−ｂａｇ：　：Ｔａ
１Ｏ株でｐＦＤｌ、　ｐ）ＩＤＩ、ｐＦＤ１／ＨＢｓＡ
ｇ−Ｉ　＃　１１　、ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−ＩＩ　＃
　１をそれぞれ持つ菌株のラピッドＤＮＡ解析用の試料
ＤＮＡを調製する。各ＤＮＡ試料を用いて、ＧＭ３３ｄ
ａｍ−株を形質転換し、ＧＭ３３ｄａｍ−（ｐＦＤｌ　
＞、ＧＭ３３ｄａｍ−（ｐＨＤｌ　）、ＧＭ　３３ｄａ
ｍ−（ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１＃　１１　）、ＧＭ３
３ｄａｍ−（ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−ｎ＃１）株を確立
する。各株から実施例■−Ｄ−ａと同様にして、ｃｃＤ
ＮＡを精製した。

（Ｂ）ｐＨＤ１プラスミドからのＥｃｏＲＩ−Ｂｃｌｌ
　（約１．４Ｋｂｐ）ＤＮＡ断片の調製 実施例０−Ａのｃｃ−ｐＨＤＩ　ＤＮＡ　２９　、７　
μｇ　／　２５μｌに１０倍Ｂｃｌ１４１衝液（５００
ｍＭ　トリス塩＠　（ｐＨ８，０）　、　　１００　ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム）２０
ｔｔｌ、７０ｍＭ２−メルカプトエタノール２０μｍ、
０．２％ウシ血清アルブミン１０μ１％ＥｃｏＲＩ７５
単位／１０μｌ、水１０５μｌを加え、３７°Ｃで１時
間反応を進めた後、Ｂｃ１１５０１Ｌ位１５μｍを加え
、５０℃で１時間反応させる１反応後の１８９μｌと２
０μＩのサンプルバッファーを混合し、０．８デ≦のア
ガロースゲル電気泳動を行なう、１．４Ｋｂｐに相当す
る螢光バンドを切り取り、実施例■−Ｅ−ａと同様にし
て電気溶出を行ない、３０μｌのＴＥ、ＩＩ衝液に溶か
す。

（Ｃ）　　ｐＦＤｌ、　　ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−Ｉ　
　＃　　１　１　　、　ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−■＃１
のＥｃｏＲＩ消化、アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ
）処理、Ｂｃｌｌによる部分消化実施例０−Ａのｃｃ−
ｐＦＤＩ　ＤＮＡ、　ｃｃ−ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−Ｉ
＃１１ＤＮＡあるいはｃｃ−ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１
［＃　Ｉ　　ＤＮＡ４０１Ｉｇ／４０μｍに、１０倍１
：ｃｏＲＩ緩衝液（１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５）　、
７０　ｍＭ塩化マグネシウム、５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム＞１６μｍ、７０ｍＭ２−メルカプトエタノール１６
μ！、０゜２％ウシ血清アルブミン８μｌ　、　Ｅｃｏ
ＲＩ　６０単位／８μｍを加え、３７°Ｃで３０分間反
応を進め、水を加えて１６０μｍとし、更に３７℃で１
時間反応させる０次いで、各試料に１Ｍトリス塩酸（ｐ
Ｈ８，０）　６μｌ、ＢＡＰｌ、２単位／１０μｍ１水
２５μｌを加え、６５℃で３０分間反応きせる。

フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行
ない、１００μｍのＴＥ緩衝液に溶かす。次いで、上記
の各試料８μｇＤＮＡ／２０μｍに１０倍Ｂｃｌｌａ衝
液８μｍ、０．２％ウシ血清アルブミン４μｌ、水４４
μＩ、Ｂｃｌ１２単位／４μｍを加え、５０℃で４０分
間反応を進め、フェノール・クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿後、４０μｌのＴＥ！ＩＩ衝液に溶かす。

（Ｄ）連結反応 実施例（１１）−Ｂの試料ＤＮＡ約９０　ｎ　ｇ　／　
３０μｌ、実施例（ＩＥＩＩ−Ｃの試料ＤＮＡ８００　
ｎ　ｇ／４１１１．１０倍ライゲーションバッファー３
μｍ、１００　ｍＭＤＴＴ３７１１．１０ｍＭＡＴＰ３
μｌ。

水１２μｌにＴ４ＤＮＡリガーゼ２車位／２μｌを加え
、１６゛Ｃで１６時間反応させる。

（Ｅ）形質転換 実施例０−Ｄの試料ＤＮＡをＴＥ緩衝液に対し３時間透
析後、Ｃ６００ｒＣ６００ｒ−：　：工ｎｌＯの形質転
換に用いた。５０ｔｔｇ／ｍ＋のアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地に、操作後のｐＦＤＩ　ＤＮＡ　１μｇ当り２．
６×１０６個、ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−Ｉ　＃１１　Ｄ
ＮＡ　Ｉ　Ｉｔ　ｇ当り３．７５Ｘ１０’個、ｐＦＤ１
／ＨＢｓＡｇ−１［ＩＩ　ＤＮＡ　１μ＆当り２．４Ｘ
１０’個のコロニーを得た。

（Ｆ）形質転換コロニーの遊走性ならびにそれら菌株の
有するプラスミド上のＨｉｎｄｌｌＩｔａ断点の有無実
施例（１）−Ｈの形質転換株について、遊走性の有無を
検討した。操作したｐＦＤｌの形質転換によって得られ
た４５株のうち、１１株が遊走性を示した。　ｐＦＤ１
／ＨＢｓＡｇ−Ｉ　＃１１、ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−Ｉ
Ｆ　＃１からは、それぞれ４５株のうち１２株が遊走性
を有した。これら、１１株、１２株、１２株のラピッド
ＤＮＡ解析用のＤＮＡ試料を作成した。ラピッドＤＮＡ
解析用の試料ＤＮＡ７μｌ、１０倍Ｅｃｏ　ＲＩ緩衝液
１μｍ、７０ｍＭ２−メルカプトエタノール１μ＋、０
．２％ウシ血清アルブミン０．５μｍ　、　ＥｃｏＲＩ
　４単位１０．５μｌ　、　Ｈ４ｎｄｌｌ［５単位１０
．５μｍで３７℃、３０分間反応許せた。０゜８％アガ
ロースゲル電気泳動で生じるＤＮＡ断片を検討した。ｐ
ＦＤｌより得られた１１株から、１゜４　Ｋｂｐと０．
７ｋｂｐを含む３個の断片を生じるプラスミドを見つけ
、ｐＨＦＤｌと命名し、このプラスミドを持つ菌株を純
化してＣ６００ｒＣ６００ｒ−：　：ＴｎｌＯ（ｐＨＦ
ＤＩ）として確立した。　ｐＦＤ１／ＨＢｓＡｇ＃１１
より得られた１２株から１．４Ｋｂｐを含む２個の断片
を生じるプラスミドを見つけｐＨＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−
Ｉ　＃１１と命名し、このプラスミドを持つ菌株を純化
してｃｅｏｏｒ−ｍ−ｈａｇ：：工ｎ１Ｏ（ｐＨＦＤ１
／ＨＢｓＡｇ−Ｉ　＃１１）として確立した。同様に、
操作したｐＦＤｌ／ＨＢｓＡｇ−ＩＩ　＃１より得られ
た１２株から１．４Ｋｂｐを含む２個の断片を生しるプ
ラスミドを見つけ、ｐＨＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−ＴＩ　＃
１と命名し、このプラスミドを持つ菌株を純化してＣ６
００ｒＣ６００ｒ−：　：Ｉｎ１Ｏ（ｐＨＦＤ１／ＨＢ
ｓＡｇ−Ｉ［＃１　）として確立した。

（Ｇ）ｐＨＤ１変異を持つｈａｇ遺伝子を有するプラス
ミドに依存する遊走性 Ｃ６Ｃ６００ｒ−（ｐＢＲ３２２）、Ｃ６００ｒＣ６０
０ｒ−：　：ＴｎｌＯ（ｐＦＤ３）、Ｃ６００ｒＣ６０
０ｒ−：　：ＴｎｌＯ（ｐＨＦＤｌ　）、Ｃ６００ｒＣ
６００ｒ−：　：ＴｎｌＯ（ｐＨＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−
１＃１１　）、Ｃ６００ｒＣ６００ｒ−：　：ＴｎｌＯ
（ｐＨＦＤ１／）ＩＢｓＡｇ−ＩＩ　＃１　）の５株に
ついて遊走性を検討した。

５株を５０μｇのアンピシリンを含むＬＢ培地に純化し
、３７℃で１晩培養し、生じたコロニーを５０μｇのア
ンピシリンを含む遊走検定培地（１％バクトドリプトン
、０．２５％塩化ナトリウム、チアミン５μｓ／ｍｌ、
０．３％寒天、ｐＨ７，０）に接種する。３７℃と３０
℃で培養し、６時間後の遊走ゾーンの直径を検討した（
表３）。

（以下余白） 表３ 菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　遊走ゾーン直
径（Ｍｎ）３７℃　　３０℃ Ｃ６００ｒ−ｍ−（ｐＣ６００ｒ−４３３４Ｃ６００ｒ
−ｍ−ｈａｇ：：ＴｎｌＯ（ｐＦＤ３）　　　　　　　
　　　２４　　　２０Ｃ６００ｒ−ｍ−ｈａｇ：　：Ｔ
ｎｌＯ（ｐＨＦＤｌ）　　　　　　　　　４１　　　３
４Ｃ６００ｒ−ｍ−ｈａｇ：　：ＴｎｌＯ（ｐＨＦＤ１
／ＨＢｓＡｇ−１＃Ｌ１）　　　３８　　　３２Ｃ６０
０ｒ−ｍ−ｈａｇ：：ＴｎｌＯ（ｐＨＦＤ１／ＨＢｓＡ
ｇ−ＩＩ＃１）　　　４３　　　３１ｐＨＦＤ１、ｐＨ
ＦＤ１／ＨＢｓＡｇ−１＃１１、ｐＨＦＤ１／ＨＢｓＡ
ｇ−ＩＩ　＃１を持ツＣ６００ｒＣ６００ｒ−：　：Ｔ
ｎｌＯ株の遊走能はｐＦＤ３を持つ同様より常によく遊
走し、野生株Ｃ６００ｒ−ｍ−（ｐＣ６００ｒ−に近い
。

０　１）ＦＤＩ、ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０６、ｐＦＤ
３０７、ｐＦＤ３１１、ｆＤ３１５ベクタープラスミド
を用いたポリペプチド耶ｓＡｇ−１［［をキメラ化した
フラジェリンの排出（Ａ　）　ｃｃ−ｐＦＤｌ、ｃｃ−
ｐＦＤ３０３、ｃｃ−ｐＦＤ３０６、ｃｃ−ｐＦＤ３０
７、ｃｃ−ｐＦＤ３１１、ｃｃ−ｐＦＤ３１５の制限酵
素ＨｉｎｄｌｌＩによる切断とクレノーフラグメントに
よる修復ｃｃ−ｐＦＤ１、ｃｃ−ｐＦＤ３０３、ｃｃ−
ｐＦＤ３０６、ｃｃ−ｐＦＤ３０７、ｃｃ−ｐＦＤ３１
１、ｃｃ−ｐＦＤ３１５それぞれを実施例■−Ａと同様
にして制限酵素Ｈｉｎｄｌ［により切断し、クレノーフ
ラグメントで修復した。

（Ｂ）合成ポリヌクレオチドの組立て 化学合成ポリヌクレオチドＨＢｓＡｇＡ−１“１、ＨＢ
ｓＡｇＡ−２１、ＨＢｓＡｇＡ−３”　”、ＨＢｓＡｇ
Ａ−４”、）ＩＢｓＡｇＡ−５１６をπＯＮ　ＧＥＮＥ
τＡ−ＩＩ（ゼオン社）を用いて、固相フオスフオロア
ミグイト法で合成した。

申１　５’ＴＴＧＡＣＡＣＧＴＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴ
ＡＣＣＧＣＡＧＴＣ３’−２５’ＡＣＴＡＧＡＣＴＣＧ
ＴＧＧＧＧ　　３’申３　５’ＧＡＧＧＡＴＡＣＧＴＧ
ＴＣＡＡ　　３’本４　５’ＣＴＡＧＴＧＡＣＴＧＣＧ
ＧＴＡＴＴＧＴ　　３’率５　５’ＣＣＣＣＡＣＧＡＧ
Ｔ　　３’ＨＢｓＡｇＡ−２（５００ｐＭ／１２　、２
ａ　Ｉ　）、ＨＢｓＡｇＡ−３（５００ｐＭ／１２．２
μｌ）、ＨＢｓＡｇＡ−４（５００ｐＭ／１５．４μｌ
）を３本のエツペンドルフ１．５ｍｌ容チューブにとり
、それぞれに水１９．８μ＋、１９．８μ＋、１６．６
μｌを加える。続いて、１０倍キナーゼ緩衝液１　（０
、５Ｍトリス塩ｆｉ（ｐＨ７，６）、０．１Ｍ塩化マグ
ネシウム、５０ｍＭｕチオスレイトール、１ｍＭスペル
ミジン、１　ｍＭＥＤＴＡ）１０ｔｔ　Ｌ　７−”ＰＡ
ＴＰ（５０００Ｃｆ／ｍＭ：　１０μＣ／ａ１１アマル
シヤム）１μｌ、１０μＭＡＴＰ５μ＋、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）２μｌを加え３７℃で３０
分間加温する。更に、１ｍＭＡＴＰを２゜５μｍ、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ５単位／２μｌ加え、３７℃
で１時間反応させ、９０℃で５分間加熱後水中で急冷す
る。

上記の反応物ＨＢｓＡｇＡ−２、ＨＢｓＡｇＡ−３、Ｈ
ＢｓＡｇＡ−４全量とＨＢｓＡｇＡ−１（５００ｐＭ／
２３．５μｌ）、皿ｓＡｇＡ−５（５００ｐ　Ｍ／　８
　、１μｍ）を混合し、透析膜（スペクトラ・ボア／分
子量カットオ）１０００、スペクトラムメディカルイン
ダストリ社）に入れ、水中で４°Ｃで１晩透析する。エ
ツペンドルフ１．５ｍｌチューブに移し、遠心エバポレ
ーターで濃縮する。１５μｌのトリス塩酸（ｐＨ７，６
）、１０ｍＭ塩化マグネシウムに溶かし、６０°Ｃで３
０分間加温し、６時間かけて室温までゆっくり戻す、５
倍ライゲーションバッファー１６μｌ、２００ｍＭＤＴ
Ｔ４μｍ、１０ｍＭＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２２．
４単位／８μｍ１水３７μｍを加え、１５℃で１６時間
反応を進める。１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳
動し、オートラジオグラフィーでバンドを検出し、４４
ｂｐの位置のバンドを切り出し、エッベンドル７１．５
ｍｌ容チューブに入れガラス棒で粉砕し、水を１ｍｌ加
え、４℃で１６時間抽出する。

遠心後、上清（約７００μｍ）を遠心エバボレ−ターで
濃縮する。約２００μｌまで濃縮したところで再び遠心
し、ゲルの残渣を除く。

（Ｃ）ｐＦＤｌ、ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０６、ｐＦＤ
３０７、ｐＦＤ３１１、ｐＦｒ）３１５への化学合成り
ＮＡの連結実施例■−Ａの試料ＤＮＡ５００ｎｇ／ｉμ
ｌ、実施例■−Ｂの合成りＮＡ２５０ｐＭ／１００μｍ
、５倍ライゲーションバッファー４μ１１２００ｍＭＤ
ＴＴ２μ＋、１０ｍＭＡＴＰ２　Ｉｌｌ、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ２μ１１水４μ！を加え、１５℃で１６時間反応
を進める。ＴＥｌａ衝液に対して透析後、全量を形質転
換に用いた。

（Ｄ）形質転換した菌株の選択と遊走性の有無実施例＄
−Ｃの試料ＤＮＡを用いてＣ６００ｒＣ６００ｒ−：：
ＴｎｌＯ株へ形質転換した。５０μｌ／ｍｌのアンピン
リンを含むＬＢ培地上に、５Ｘ１０’コロニ一／１μｇ
　ｐＦＤＩＤＮＡ、　　２　Ｘ　１０″コロニ一／１μ
ｇｐＦＤ３０３ＤＮＡ、　　１　、８　Ｘ　１０　’コ
ロニー／１μ、　ｐＦＤ３０６ＤＮＡ、　　２．３Ｘ１
０’コロニ一／１μｇ　ｐＦＤ３０７ＤＮＡ、１．３Ｘ
１０″コロニ一／１μｇ　ｐＦＤ３１１ＤＮＡ。

８Ｘ１０’コロニ一／ｌμｇ　ｐＦＤ３１５ＤＮＡが出
現した。

各グループより１００個のコロニーの遊走性を遊走検定
用培地上で検討し、遊走したコロニーを６株づつアンピ
シリン５０Ｉ１ｇ／ｍｌを含ｔｊＬＢ培地で１晩培養し
、菌株の持つプラスミド上のＨｉｎｄｌ［［切断点の有
無を検討した。ベクター側のＨ１ｍｌ■制限点はＨｉｎ
ｄｌ［［で切断後、クレノーフラグメントで修復されて
いるため、合成りＮＡ　ＨＢｓＡｇ−１１１が順向きに
挿入きれ、合成りＮＡの５゛端からＴが供給された場合
、Ｈ４ｎｄ　ＴＪｉ制限点は復活する。一方挿入されて
いなかったり逆向きに挿入されていると）１ｉｎｄｌ制
限点は存在しない、従ってＨｉｎｄｌｌ［と５ｓｔＩ　
　（Ｓｓｔｎ制限点は挿入点の下流に比較的近い距離に
存在する）で切断した場合、小断片が生じれば合成りＮ
Ａは順向きに挿入されており、小断片が生じなければ合
成りＮＡは挿入されていないか、逆向きに挿入きれてい
る０以上によって、順向きに挿入きれた合成りＮＡの有
無を推定できるので６株の持つプラスミドのラピッドＤ
ＮＡ解析試料を調製し、）Ｉｉｎｄｌｌ［、Ｓｑｔ、Ｉ
Ｉの二重消化を行なった。ＤＮＡ試料８μｍ、１０倍５
ｓｔｌｒ４１衝液（５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０
＞、１００ｍＭ塩化マグネシウム、５００ｍＭ塩化ナト
リウム）２μｍ、７０ｍＭ２−メルカプトエタノール２
　ｉｔ　ｌ，　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　１　０単位／　μｌ　
、Ｓｓｔｌ［　／　１μｍ、水６μｌで二重消化を行な
゛い、５％ポリアクリルアミドゲル亘気気泳動１５０Ｖ
，９５分）後、臭化エチジウムで染色して小断片にあた
る螢光ハンドの有無を検討した．その結果、各グループ
から２株づつ合成りＮＡが順向きに挿入されかつ遊走性
がある菌株を確立できた。これらの菌株はプラスミド上
に挿入された化学合成りＮＡ部分（ＨＢｓＡｇ−ｍ）が
コードするペプチドＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉ　１　
ｅ−　Ｌｅｕ−　Ｔｈｒ−Ｉ　ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１　
ｎ−Ｓｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｙをキメラ化したフラジェリンを鞭毛として排出して
いる。

９　　ｐＦＤｌ、ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０６、ｐＦＤ
３０７、ｐＦＤ３１１、ｐＦＤ３１５ヘクタープラスミ
ドを用いたポリペプチド旧ｓＡｇ−　ＩＶをキメラ化し
たフラジェリンの排出（　Ａ　）　ｃｃ−ｐＦＤｌ、ｃ
ｃ−ｐＦＤ３０３、ｃｃ−ｐＦＤ３０６、ｃｃ−ｐＦＤ
３０７、ｃｃ−ｐＦＤ３１　１、ｃｃ−ｐＦＤ３１５の
制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌによる切断とクレノーフラグメ
ントによる修復実施例■−Ａと同様にして、ｃｃ−ｐＦ
Ｄｌ、ｃｃ−ｐＦＤ３０３、ｃｃ−ｐＦＤ３０６、ｃｃ
−ｐＦＤ３０７、ｃｃ−ｐＦＤ３１１、ｃｃ−ｐＦＤ３
１５を制限酵素Ｈｉｎｄｌ［Ｉで切断し、クレノーフラ
グメントによって修復した。

（Ｂ）合成ポリヌクレオチドの組立て 化学合成ポリヌクレオチドＨＢｓＡｇＢ−１　”　’、
ＨＢｓＡｇＢ−２１、ＨＢｓＡｇＢ−３°、ＨＢｓＡｇ
Ｂ−４１、ＨＢｓＡｇＢ−５”％ＨＢｓＡｇＢ−６”を
実施例■−Ｂと同様にして合成する。

ｍｌ　５’ＴＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＩＴＡＴ　３
’帛２　　５’ＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＡ　　３’申３
　　５’ＣＡＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴ　　３’
本４　５°ＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＡＴＡＡＴＣ　　３
’傘５　　５’ＴＴＧＴＣＣＴＣＴＡＧＧ　　３゛車６
　５°ＣＣＴＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣ　　３′
）ＩＢｓＡｇＢ−２、ＨＢｓＡｇＢ−５をそれぞれ５　
０　０　ｐＭ／９　、　７　１１　１　、ＨＢｓＡｇＢ
−３、ＨＢｓＡｇＢ−４をそれぞれ５００９Ｍ／１３．
８μｌづつ、４本のエッペンドルフ１．５ｍｌ容チュー
ブにとり、それぞれに水を２２．３μ　＋、２２．３　
μ　＋、１８．２μ　！、　　１８．２μｌづつ加える
。実施例■−Ｂと同様にして、合成ポリヌクレオチドの
５゛端をリン酸化する。上記の反応物全量とＨＢｓＡｇ
Ｂ−１、ＨＢｓＡｇＢ−６各１４．６μｌを混合し、実
施例■−Ｂと同様にして連結する０次いで、連結反応後
の試料をポリアクリルアミド電気泳動で分離し、２００
μｌの試料ＤＮＡを得る。

（Ｃ）　ｐＦＤｌ、ｐＦＤ３０３、ｐＦＤ３０６、ｐＦ
Ｄ３０７、ｐＦＤ３１１、ｐＦＤ３１５への化学合成り
ＮＡの連結実施例０−Ｃと同様にして、ベクター分子へ
ＨＢｓＡｇ−ＩＶ　ＤＮＡを連結し、反応物全量を形質
転換に用いる。

（Ｄ）形質転換した菌株の選択と遊走性の有無実施例Ｏ
−Ｃの試料ＤＮＡを用いて、ＣｆｉｏｏＣｆｌｏｏｒ−
：：Ｔａ２Ｏ株へ形質転換した。５０７１　ｇ　／　ｍ
　ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地上には、４．４Ｘ１
０４コロニ一／１μｇ　　ｐＦＤＩ　ＤＮＡ、　　２　
、９Ｘ　１０’コロニ一／１μｇ　ｐＦＤ３０３ＤＮＡ
、　３　、　ａｘ１ｏ’コロニー／１μｇ　ｐＦＤ３０
６　ＤＮＡ、　　３　、２Ｘ　１０’コロニ一／１μｇ
　ｐＦＤ３０７　ＤＮＡ、　　１　、４Ｘ　１０’コロ
ニ一／１μｇ　　ｐＦＤ３１１　ＤＮＡ、　　５　、８
Ｘ　１０’コロニ一／１μｇ　ｐＦＤ３１５　ＤＮＡが
出現した。実施例■−Ｂと同様にして、各グループより
遊走する菌株６株を選び、その菌株について化学合成り
ＮＡ　ＨＢｓＡｇ−ＩＶが順向きに挿入されているプラ
スミドを持つ菌株を各グループより２株確立した。これ
ら菌株はプラスミド上に挿入された化学合成りＮＡ部分
（ＨＢｓＡｇ−ＩＶ　）がコードするペプチドＬｅｕ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｙ−ＭｅＦ、−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙをキメラ化したフラジェリンを鞭
毛として排出している。

参考例　プラスミドｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３　ｃｃ−
ＤＮＡによる大腸菌ＪＡＩＩ株の形質転換 大腸菌ＪＡ１１株（微工研菌寄第８８５３号）をハナハ
ンらの方法（Ｄ、　１ａｎａｈａｎ、ジャーナル・才ブ
・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏｌ、）。

謝、５５７−５８０　（１９８３））により培養してフ
ンピテント化する。ハナハンらの方法（上記）により作
成した一７０℃で凍結したＪＡＩＬ株のコンピテントセ
ル２１０μｌを溶かし、０℃水中でＴＥ緩衝液２０μ＋
に溶かしたプラスミドｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３の■−
ＤＮＡ　２００　ｎ　ｇを加える。３０分間Ｏ℃水中に
置き、４２℃で１００秒加熱後、ＳｏＣ培養液０．８ｍ
ｌを加え、３７℃で１時間振温培養する。培養後、菌液
を１０’希釈し、その０．１ｍｌをアンピシリン５０μ
ｇ　／　ｍ　１を含むＬＢ寒天培地上に拡げる。１晩３
７℃で培養後、５２個のコロニーが出現した。この結果
はＪＡ１１株がｐＢＲ３２２／ｈａｇ９３のｃｃ−ＤＮ
Ａ　Ｉ　ＩＩ　ｇ当り２．６Ｘ１０’１ｔｌ＝−の効率
で形質転換されたことがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は大腸菌のフラジェリンをコードするｈｇ遺伝子
の塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示
す、第２図は＾ｐｆｌａ−Ｈ２のＥｃｏＲＩならびに５
ａｌｌによる消化結果を示し、斜線部はｈａｇ遺伝子を
含む大腸菌染色体由来のＤＮＡ断片の推定位置を示す、
第３図はｐＢＲ３２２／ｈａｇ９のＥｃｏＲＩならびに
Ｓａｌ　Ｉによる消化結果を示す、第４図はｐＢＲ３２
２／ｈａｇ９のＢａｍＨＩ切断点を示す。第５図はｐＢ
Ｒ３２２／ｈａｇ９のＢ断片を欠損したプラスミドｐＢ
Ｒ３２２／ｈａｇ９３を示す、第６図はｐＢＲ３２２／
ｈａｇ９３上の５ケ所のＨｉｎｃｌ［による切断点を示
す、第７図はｐＬＩｃ９／　ｈａｇ　６を示す。第８図
はｈａｇ遺伝子の塩基配列決定のスケジュールを示す、
第９図はＤＮＡシーケンシングの結果得られたｈａｇ遺
伝子の全−次構造を示す、第１０図はｐＦＤｌ　、　ｐ
ＦＤ２．　ｐＦＤ３の簡単な制限酵素マツプを示す、第
１１図はｐＦＤｌ、ｐＦＤ２、ｐＦＤ３のＨｉｎｄ　Ｉ
ｌ［切断点付近のＤＮＡシーケンシングスケジュールを
示す。第１２図はｐＨＤｌのＨｉｎｄｌｌＩ切断点付近
のＤＮＡシーケンシングスケジュールを示す、第１３図
はｐＦＤ３とｐＦＤ３０１を示す、第１４図はｐＦＤ３
０１．ｐＦＤ３０３゜ｐＦＤ３０６およびｐＦＤ３０７
が運搬するｈａｇ遺伝子のシーケンスを示す、第１５図
はｐＦＤ３１１、ｐＦＤ３１３およびｐＦＤ３１５が運
搬するｈａｇ遺伝子のシーケンスを示す。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）大腸菌のフラジェリンをコードするＤＮＡ配列の
   一部または全部を有するＤＮＡ。
2. （２）該大腸菌が大腸菌Ｋ−１２株である特許請求の範
   囲第１項に記載のＤＮＡ。
3. （３）該大腸菌Ｋ−１２株がＨＫ５５２株である特許請
   求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。
4. （４）該フラジェリンが第１図に示されるアミノ酸配列
   を有するペプチドである特許請求の範囲第１項に記載の
   ＤＮＡ。
5. （５）該ＤＮＡ配列が第１図に示されるＤＮＡ配列であ
   る特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。
6. （６）大腸菌のフラジェリンをコードするＤＮＡ配列の
   一部または全部を有するベクター。
7. （７）該ＤＮＡ配列の一部が、フラジェリンをコードす
   るＤＮＡから鞭毛の抗原性に関与する部位をコードする
   ＤＮＡを欠損させたものである特許請求の範囲第６項に
   記載のベクター。
8. （８）該ＤＮＡ内にさらに単数または複数のリンカーＤ
   ＮＡを有する特許請求の範囲第６〜７項に記載のベクタ
   ー。
9. （９）該大腸菌が大腸菌Ｋ−１２株である特許請求の範
   囲第６〜８項に記載のベクター。
10. （１０）該大腸菌Ｋ−１２株がＨＫ５５２株である特許
    請求の範囲第９項に記載のベクタ−。
11. （１１）該フラジェリンが第１図に示されるアミノ酸配
    列を有するペプチドである特許請求の範囲第６項に記載
    のベクター。
12. （１２）該ＤＮＡ配列が第１図に示されるＤＮＡ配列で
    ある特許請求の範囲第６項に記載のベクター。
13. （１３）更にｐＨＤ１変異を有する特許請求の範囲第６
    〜１２項に記載のベクター。