JPS6312598B2

JPS6312598B2 -

Info

Publication number: JPS6312598B2
Application number: JP2523180A
Authority: JP
Inventors: Taiji Minoda; Toshio Oomori; Hiroyuki Narishima
Original assignee: Nissan Chemical Corp
Current assignee: Nissan Chemical Corp
Priority date: 1980-03-03
Filing date: 1980-03-03
Publication date: 1988-03-19
Also published as: JPS56124388A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、微生物による２―（４―メチル―３
―シクロヘキセニリデン）―プロピオン酸の製造
法に関するものである。

本発明によつて得られる上記プロピオン酸は化
学構造式を有し、香料または医薬の中間体として有用な公
知化合物である（バイルシユタイン９巻85頁）。

従来、上記プロピオン酸誘導体は化学的合成法
により製造され、微生物による製造法は知られて
いない。

本発明者等は、上記プロピオン酸誘導体の微生
物による製造法について研究した結果、本発明の
方法を完成した。

本発明はシユウドモナス（Pseudomonas）属
に属する菌株をα―ピネンを添加した培地に培養
し、培地中に２―（４―メチル―３―シクロヘキ
セニリデン）―プロピオン酸を生成せしめ、これ
を採取することを特徴とする２―（４―メチル―
３―シクロヘキセニリデン）―プロピオン酸の製
造法である。

本発明の方法においては、菌株としてシユウド
モナス属に属し、α―ピオンを２―（４―メチル
―３―シクロヘキセニリデン）―プロピオン酸に
変換するものが使用され、その例として、シユウ
ドモナス・マルトフイリア（Pseudomonas
maltophilia）S201―１が挙げられる。

この菌は、本発明者等が静岡県伊豆地方の土壤
から新たに分離した菌株であつて、工業技術院微
生物工業技術研究所に微生物受託番号第5420号と
して寄託されており、以下の菌学的性質を有す
る。

１細菌の形態形及び大きさ：桿菌、0.4〜0.8×1.2〜1.4μ 多形性：なし運動性：あり、複数の極鞭毛を有する胞子：なしグラム染色性：陰性抗酸性：なし２生育状態肉汁寒天平板培養円型で表面は滑らかな淡黄色の集落を形成
する。

肉汁寒天斜面培養おだやかに生育する。毛状で淡黄色の光沢
を有する。

肉汁液体培養薄膜を形成し、濁る。

肉汁ゼラチン穿刺培養上部に生育し、層状に液化する。

リトマス・ミルク酸性を示し、ペプトン化する。

３生理学的性質硝酸塩の還元：あり脱窒素反応：なし MRテスト：陰性 VPテスト：陰性インドールの生成：なし硫化水素の生成：なしデンプンの加水分解：陰性クエン酸の利用：コーザーの培地：なしクリステンセンの培地：あり硝酸塩の利用：あり色素の生成：なしウレアーゼ：陰性オキシダーゼ：陰性カタラーゼ：陽性育性PH ：PH４〜10生育可至適PH６〜
８酸素に対する態度：好気性Ｏ―Ｆテスト：酸化型糖類からの酸およびガスの生成：マルトース、Ｄ―マンノース、Ｄ―フラク
ト―ス、シユークロース、ラクトース、ト
レハロース、グリセリンからは酸を生成す
るが、ガスは生成しない。

Ｌ―アラビノース、Ｄ―キシロース、Ｄ―
グルコース、Ｄ―ガラクトース、Ｄ―ソル
ビツト、Ｄ―マンニツト、イノシツト、デ
ンプンからは、酸もガスも生成しない。

３栄養要求性生育因子としてメチオニンを要求する。

以上の菌学的性質を有する菌について、バージ
エイのマニユアル（Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology）第８版に基いて
検索した結果、本菌はシユウドモナス・マルトフ
イリアと同定された。

本発明で使用する培地組成は、使用する菌株が
良好に生育し、かつ前記プロピオン酸誘導体の生
産を順調に行わしめるために適当な炭素源、窒素
源、無機塩及び天然有機栄養物などからなる。

炭素源としては、グルコース、マルトース、マ
ンノース等の種々の炭水化物、酢酸、コハク酸、
クエン酸などの各種有機酸、グルタミン酸、アラ
ニン、アルギニン等の各種アミノ酸も使用可能で
ある。また、培地に添加するμ―ピネンを唯一の
炭素源としてもよい。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム等の各種の無機および有機アンモニ
ウム塩、尿素、ペプトン、NZアミン、肉エキス、
酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加
水分解物等の各種含窒素有機物質、グルタミン
酸、アラニン等の各種アミノ酸等が使用可能であ
る。

無機物としては、各種燐酸塩、硫酸マグネシウ
ム等、さらに微量の重金属塩が使用されるが、天
然物を含む培地では必ずしも添加を必要としな
い。

また、栄養要求を示す株を用いる場合には、当
然、その栄養要求を満足させる物質を培地に添加
しなければならない。

培養は通常振盪または通気撹拌培養などの好気
的条件下に行なうのがよい。水に難溶性の炭素源
等を使用する場合には、ポリオキシエチレンソル
ビタン等の各種界面活性剤あるいは、アセトン、
エタノール等の有機溶媒を培地に添加することも
可能である。培地のPHは、4.5〜9.0、培養温度は
20〜37℃、培養期間は通常18〜120時間である。

本発明の目的物質は、このようにして得られた
培養液に、α―ピネンを添加してさらに培養を数
時間ないしは数日間継続するか、あるいは、培養
菌体を水または適当な緩衝液に懸濁し、α―ピネ
ンを添加して好気的に振盪あるいは通気撹拌する
ことによつても得られる。また、α―ピネンを炭
素源として培養した場合には、目的物質は培養液
中にも蓄積する。

これらの培養液あるいは懸濁液からの目的物質
の採取および精製は、一般の有機化合物の採取お
よび精製の手段に準じて行なうことができる。た
とえば、これらから菌体その他を除去した液を
酸性とし、エチルエーテル等の有機溶媒を用いて
本物質を抽出する。またこれからさらに酸性区分
の分画を行なつてもよい。このようにして得られ
た抽出液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマ
トグラフイー等を用いて目的物質を単離すること
ができる。さらに分離・確認を容易にするため
に、常法に従つて、例えばジアゾメタンにより目
的物質をメチルエステルとすることもできる。ま
た、本発明における培養物中には、目的とする２
―（４―メチル―３―シクロヘキセニリデン）―
プロピオン酸の他に、カンフアー、ボルネオー
ル、リモネンおよび２―（４―メチル―３―ヘキ
セニル）―アクリル酸が副生成物として生成す
る。これらは、もし必要なら、それぞれ公知の手
段、例えば有機溶剤による抽出、カラムクロマト
グラフイまたは薄層クロマトグラフイー等によつ
て培養物中から分離精製される。

以下、実施例により本発明の方法をさらに詳細
に説明するが、本発明は、これらによつて限定さ
れるものではない。

実施例１硝酸アンモニウム５ｇ、リン酸１カリウム1.8
ｇ、リン酸２ナトリウム（12水塩）6.3ｇ、硫酸
マグネシウム（７水塩）0.2ｇ、塩化カルシウム
（２水塩）10mg、硫酸第１鉄（７水塩）10mg、硫
酸マンガン（４水塩）１mg、モリブデン酸アンモ
ニウム（４水塩）１mgおよび精製水１からなる
組成の培地15を水酸化ナトリウムでPH7.2とし
て30容のステンレス製ジヤーフアーメンターに
仕込み、同様の培地にα―ピネンを炭素源として
加えて、30℃で３日間振盪培養を行なつたシユウ
ドモナス・マルトフイリア（Pseudomonas
maltophilia）S201―１（微工研寄託受理番号第
5420号）の培養液１を接種し、α―ピネン75ml
を添加して、温度30℃、通気毎分６、撹拌毎分
250回転の条件で115時間培養を行なつた。培養終
了後、培養液を遠心分離して除菌後、減圧濃縮に
より全量を１とした。次にこれを塩酸を用いて
酸性としてから、等容のエチルエーテルで２回抽
出し、水洗後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
さらにこれを200mlまで減圧濃縮し、半容の炭酸
水素ナトリウム・水酸化ナトリウム緩衝液で２回
抽出した。この抽出物を塩酸を用いて酸性とし、
半容のエチルエーテルで２回抽出し、水洗い、乾
燥後溶媒を留去した。この残渣についてシリカゲ
ルカラムクロマトグラフイーを行ない、ベンゼン
溶出画分を集め、溶媒を減圧留去したところ、２
―（４―メチル―３―シクロヘキセニリデン）―
プロピオン酸の粗結晶約２ｇが得られた。さら
に、これをヘキサンから２度再結晶させ、ジアゾ
メタンでメチル化後、ガスクロマトグラフによる
分取を行なつた。尚、上記ヘキサンの母液を濃縮
し、ジアゾメタンで処理すると２―（４―メチル
―３―ヘキセニル）―アクリル酸のメチルエステ
ルが副生成物として得られた。また、上記培養液
のエチルエーテル抽出液からリモネン、カンフア
およびボルネオールがそれぞれ得られた。

２―（４―メチル―３―シクロヘキセニリデ
ン）―プロピオン酸メチルエステル IRスペクトルν^KBr _naxcm^-1：2900、1720、1650、
1440、1250、1100、720 MS（m/e）：121、180、105、93、137 NMRスペクトルCDCl₃―TMS δppm： ¹H―NMR：7.00（1H、ｔ）、3.73（3H、
ｓ）、2.95（2H、ｓ）、2.33
（4H、ｓ）、1.71（3H、ｓ）、
1.67（3H、ｓ） ¹³C―NMR：167.7、139.3、130.5、125.5、
123.5、51.4、30.1、26.1、
25.5、20.2、19.8 実施例２麦芽糖10ｇ、硝酸アンモニウム５ｇ、リン酸１
カリウム1.8ｇ、リン酸２ナトリウム（12水塩）
6.3ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）0.2ｇ、塩化
カルシウム（２水塩）10mg、硫酸第１鉄（７水
塩）10mg、硫酸マンガン（４水塩）１mg、モリブ
デン酸アンモニウム（４水塩）１mg、DL―メチ
オニン50mgおよび精製水１からなる培地を５規
定水酸化ナトリウムでPH7.2とし、５容三角フ
ラスコに入れて121℃で５分間滅菌した。これに、
同様の培地で30℃で２日間培養したシユウドモナ
ス・マルトフイリアS201―１（微工研寄託受理番
号第5420号）の培養液100mlを接種し、30℃で２
日間振盪培養を行なつた。この培養液を遠心分離
で集菌し、菌体を1/15Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）
で２回洗滌後、同緩衝液500mlに懸濁し、α―ピ
ネン５mlを添加して、30℃で96時間振盪した。次
に、これを除菌後、塩酸で酸性とし、等容のエチ
ルエーテルで２回抽出した。以後、実施例１と同
様の操作で分画を行なつた。得られた目的物質を
ガスクロマトグラフイーで定量したところ、約10
mgであつた。

実施例３酢酸ナトリウム（無水）10ｇ、硝酸アンモニウ
ム５ｇ、リン酸１カリウム1.8ｇ、リン酸２ナト
リウム（12水塩）6.3ｇ、硫酸マグネシウム（７
水塩）0.2ｇ、塩化カルシウム（２水塩）10mg、
硫酸第１鉄（７水塩）10mg、硫酸マンガン（４水
塩）１mg、モリブデン酸アンモニウム（４水塩）
１mg、DL―メチオニン50mgおよび精製水１の
組成からなる培地100mlを、PH6.8とし、500ml容
肩付きフラスコに入れ、121℃で10分間滅菌した。
これに、肉汁寒天スラントに30℃で４時間培養し
たシユウドモナス・マルトフイリアS201―１（微
工研寄託受理番号第542号）を１白金耳接種し、
30℃で48時間培養した。この培養液を1/15Ｍリン
酸緩衝液（PH7.0）で２回洗滌後、同緩衝液50ml
に懸濁し、α―ピネン0.5mlを添加して、120時間
振盪した。次に、これを除菌後、塩酸で酸性と
し、等容のエチルエーテルで２回抽出を行なつ
た。以後、実施例１と同様の操作で分画を行なつ
た。得られた目的物質をガスクロマトグラフイー
で定量したところ、約10mgであつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１シユウドモナス（Pseudomonas）属に属す
る菌株をα―ピネンを添加した培地に培養し、培
地中に２―（４―メチル―３―シクロヘキセニリ
デン）―プロピオン酸を生成せしめ、これを採取
することを特徴とする２―（４―メチル―３―シ
クロヘキセニリデン）―プロピオン酸の製造法。