JPS6313680B2 - - Google Patents
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- JPS6313680B2 JPS6313680B2 JP56180192A JP18019281A JPS6313680B2 JP S6313680 B2 JPS6313680 B2 JP S6313680B2 JP 56180192 A JP56180192 A JP 56180192A JP 18019281 A JP18019281 A JP 18019281A JP S6313680 B2 JPS6313680 B2 JP S6313680B2
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- JP
- Japan
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- glutathione
- strain
- cells
- resistant
- drug
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
- C12N1/185—Saccharomyces isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
- C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/94—Saccharomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は酵母を用いるグルタチオンの製造法に
関し、詳しくはサツカロミセス属に属し、１，
２，４―トリアゾール又はアジ化ナトリウムに抵
抗性を有する変異株を培地に培養し、菌体内に著
量のグルタチオンを蓄積させ、これを採取する方
法に関する。 グルタチオンは、生体内の酸化還元系に関与す
るトリペプチドで、肝機能の強化，解毒作用等の
医薬として有用である。 グルタチオンの工業的製法としては、合成法，
酵母からの抽出法等が知られているが、合成法は
生理活性のあるＬ体の合成に複雑な工程を要し、
一方、酵母菌体からの抽出はＬ体のみが得られる
が、収率が低い。 改良方法として、グルタチオンの前駆物質であ
るＬ―システイン単独、またはそれにグルタミン
酸，グリシンを添加して菌体内のグルタチオン含
量を高める方法（特開昭48−44488，特開昭48−
92579，特開昭52−156994，特開昭53−94089），
メチオニンないしはＬ―シスチンを添加して菌体
内のグルタチオン含量を高める方法（特開昭48−
22685，特開昭48−44487，特開昭51−139685，特
開昭52−156994）などが報告されている。さらに
改良された酵母を用いる方法として、キヤンデイ
ダ・ウチリスのＬ―またはＤ，Ｌ―エチオニン感
受性株を用いる方法（特開昭52−87296），キヤン
デイダ・ウチルスのエチオニン耐性株を用いる方
法（特開昭52−125687）などが知られている。 酵母を改良した結果、１，２，４―トリアゾー
ル又はアジ化ナトリウムに抵抗性株の菌株はグル
タチオンの生産性が優れていることが見出され
た。 本発明に使用する菌株はサツカロミセス属に属
し、１，２，４―トリアゾール又はアジ化ナトリ
ウムに抵抗性を有するグルタチオン生産菌株であ
ればいずれも用いうるが、さらに他の薬剤抵抗
性，薬剤感受性，栄養要求性などの性質を併せ持
つことによつてより収率の向上が期待される。 本発明で用いられる薬剤抵抗性菌は天然から分
離することもできるが、一般にグルタチオン生産
菌に微生物の変異処理手段、例えば薬剤処理，Ｘ
線，γ線，Co照射あるいは遺伝子組換等の方法
によつて入手できる。 具体的菌株の例は、サツカロミセス・セレビシ
エATCC7754から誘導された１，２，４―トリア
ゾール抵抗性株のサツカロミセス・セレビジエ
TRZ―６（微工研条寄第194号），アジ化ナトリウ
ム抵抗性株のサツカロミセス・セレビジエＮ―33
（微工研条寄第193号），１，２，４―トリアゾー
ルおよびアジ化ナトリウムの両薬剤に対する抵抗
性株のサツカロミセス・セレビジエTRZN―10
（微工研条寄第195号）である。 上記TRZ―６菌株，Ｎ―33菌株、TRZN―10
菌株の取得方法を以下に記す。 薬剤抵抗性株の取得方法 サツカロミセス・セレビジエATCC7754を、グ
ルコース１ｇ／dl，酵母エキス0.3ｇ／dl，麦芽
エキス0.3ｇ／dl，ペプトン0.5ｇ／dlからなるス
ラント培地で、30℃24時間生育させたコロニー
を、生理食塩水で一回洗滌後約108個／mlの菌濃
度で200μｇ／mlのニトロソグアニジンを含む
0.05Mトリス・リンゴ酸緩衝液（PH5.0）に懸濁
し、30℃30分間変異処理する。変異処理後の菌体
を生理食塩水で１回洗滌してから、薬剤を含有す
る下記組成の最小寒天培地に塗りつけ、30℃で３
〜７日間培養する。出現したコロニーを薬剤抵抗
性菌として選択した。
関し、詳しくはサツカロミセス属に属し、１，
２，４―トリアゾール又はアジ化ナトリウムに抵
抗性を有する変異株を培地に培養し、菌体内に著
量のグルタチオンを蓄積させ、これを採取する方
法に関する。 グルタチオンは、生体内の酸化還元系に関与す
るトリペプチドで、肝機能の強化，解毒作用等の
医薬として有用である。 グルタチオンの工業的製法としては、合成法，
酵母からの抽出法等が知られているが、合成法は
生理活性のあるＬ体の合成に複雑な工程を要し、
一方、酵母菌体からの抽出はＬ体のみが得られる
が、収率が低い。 改良方法として、グルタチオンの前駆物質であ
るＬ―システイン単独、またはそれにグルタミン
酸，グリシンを添加して菌体内のグルタチオン含
量を高める方法（特開昭48−44488，特開昭48−
92579，特開昭52−156994，特開昭53−94089），
メチオニンないしはＬ―シスチンを添加して菌体
内のグルタチオン含量を高める方法（特開昭48−
22685，特開昭48−44487，特開昭51−139685，特
開昭52−156994）などが報告されている。さらに
改良された酵母を用いる方法として、キヤンデイ
ダ・ウチリスのＬ―またはＤ，Ｌ―エチオニン感
受性株を用いる方法（特開昭52−87296），キヤン
デイダ・ウチルスのエチオニン耐性株を用いる方
法（特開昭52−125687）などが知られている。 酵母を改良した結果、１，２，４―トリアゾー
ル又はアジ化ナトリウムに抵抗性株の菌株はグル
タチオンの生産性が優れていることが見出され
た。 本発明に使用する菌株はサツカロミセス属に属
し、１，２，４―トリアゾール又はアジ化ナトリ
ウムに抵抗性を有するグルタチオン生産菌株であ
ればいずれも用いうるが、さらに他の薬剤抵抗
性，薬剤感受性，栄養要求性などの性質を併せ持
つことによつてより収率の向上が期待される。 本発明で用いられる薬剤抵抗性菌は天然から分
離することもできるが、一般にグルタチオン生産
菌に微生物の変異処理手段、例えば薬剤処理，Ｘ
線，γ線，Co照射あるいは遺伝子組換等の方法
によつて入手できる。 具体的菌株の例は、サツカロミセス・セレビシ
エATCC7754から誘導された１，２，４―トリア
ゾール抵抗性株のサツカロミセス・セレビジエ
TRZ―６（微工研条寄第194号），アジ化ナトリウ
ム抵抗性株のサツカロミセス・セレビジエＮ―33
（微工研条寄第193号），１，２，４―トリアゾー
ルおよびアジ化ナトリウムの両薬剤に対する抵抗
性株のサツカロミセス・セレビジエTRZN―10
（微工研条寄第195号）である。 上記TRZ―６菌株，Ｎ―33菌株、TRZN―10
菌株の取得方法を以下に記す。 薬剤抵抗性株の取得方法 サツカロミセス・セレビジエATCC7754を、グ
ルコース１ｇ／dl，酵母エキス0.3ｇ／dl，麦芽
エキス0.3ｇ／dl，ペプトン0.5ｇ／dlからなるス
ラント培地で、30℃24時間生育させたコロニー
を、生理食塩水で一回洗滌後約108個／mlの菌濃
度で200μｇ／mlのニトロソグアニジンを含む
0.05Mトリス・リンゴ酸緩衝液（PH5.0）に懸濁
し、30℃30分間変異処理する。変異処理後の菌体
を生理食塩水で１回洗滌してから、薬剤を含有す
る下記組成の最小寒天培地に塗りつけ、30℃で３
〜７日間培養する。出現したコロニーを薬剤抵抗
性菌として選択した。
【表】
第１表 最小寒天培地組成
グルコース 20ｇ／
Ｌ―アスパラギン ２ 〃
（NH4）2SO4 ２ 〃
KH2PO4 1.5 〃
MgSO4・7H2O 0.5 〃
CoCl2.2H2O 0.33 〃
MnSO4・nH2O 0.04 〃
（NH4）6Mo7O24・4H2O 0.02 〃
CuSO4・5H2O 0.04 〃
H3・BO3 0.6 〃
ZnSO4・7H2O 0.31 〃
サイアミン塩酸塩 200μｇ／
パントテン酸カルシウム 200 〃
ニコチン酸 200 〃
ピリドキシン塩酸塩 200 〃
Ｐ―アミノ安息香酸 50 〃
ピオチン ２ 〃
寒 天 20ｇ／
PH5.5
得られた変異株の薬剤抵抗性を確認するため、
以下の実験を行なつた。 薬剤抵抗性株の生育度 親株のサツカロミセス・セレビジエATCC7754
とこれから誘導した薬剤抵抗性株を、当該薬剤を
第２，３表に示す濃度で含有する最小液体培地
（第１表の培地より寒天を除いた培地をいう）に
５×106個／mlの濃度で植菌し、30℃21時間振盪
培養した。この時点の生育度（光学的濁度）を
660mμで測定し、薬剤無添加のときの生育度を
100としたときの相対生育度を第２，３表に示す。
以下の実験を行なつた。 薬剤抵抗性株の生育度 親株のサツカロミセス・セレビジエATCC7754
とこれから誘導した薬剤抵抗性株を、当該薬剤を
第２，３表に示す濃度で含有する最小液体培地
（第１表の培地より寒天を除いた培地をいう）に
５×106個／mlの濃度で植菌し、30℃21時間振盪
培養した。この時点の生育度（光学的濁度）を
660mμで測定し、薬剤無添加のときの生育度を
100としたときの相対生育度を第２，３表に示す。
【表】
【表】
上記第２〜３表の結果より明らかなごとく、薬
剤抵抗性変異株は薬剤存在下での生育阻害度が親
株に比較して軽減されていることが確認される。 培養に用いられる培地の炭素源としては、グル
コース，シユクロース，でんぷん加水分解物，糖
みつなどの糖類，酢酸，クエン酸等の有機酸，エ
タノール，メタノール等のアルコール，その他資
化しうる炭素源であればいずれも使用できる。窒
素源としては、硫酸アンモニウム，塩化アンモニ
ウム，リン酸アンモニウム，硝酸アンモニウム，
尿素などの無機含窒素化合物や、カザミノ酸ペプ
トン，肉エキスなどの有機窒素含有物を用いるこ
とができる。さらに、リン酸塩，硫酸塩，マグネ
シウム塩，カリウム塩，鉄塩，マンガン塩，その
他の無機塩を必要に応じて添加する。生育促進物
質として、酵母エキス，麦芽エキス，コーンステ
イープリカー，大豆かす酸分解物などの有機栄養
源も適宜使用する。 栄養要求株を用いるときは、当該要求物質を添
加する。 培養は、20〜40℃，PH３〜８で好気的に培養す
る。 得られた酵母菌体からのグルタチオンの採取
は、公知の手法によつて行なえばよい。例えば遠
心分離し、回収した菌体より、熱水，硫酸などで
抽出したグルタチオンに、亜酸化銅を添加してグ
ルタチオン銅塩とする。これより銅塩を除去し
て、遊離のグルタチオンを得る。本発明で得られ
たグルタチオンは、各種の展開溶媒によるペーパ
ークロマトグラフイー，赤外線スペクトル分析，
元素分析，アミノ酸分析，核磁気共鳴スペクトル
分析などでグルタチオンであることを確認した。 以下に本発明の態様を示す実施例を示す。 実施例 １ サツカロミセス・セレビジエTRZ―６を糖み
つ（糖換算）2.5ｇ／dl硫酸アンモニウム0.25
ｇ／dlリン酸一カリウム0.25ｇ／dlの前培養培地
に植菌し、30℃で24時間振盪培養する。この前培
養液を下記の発酵培地に10％の植菌量で接種す
る。 発酵培地組成 糖みつ（糖換算） 60ｇ／ （NH4）2SO4 10 〃 NH4H2PO4 ２ 〃 K2SO4 2.5 〃 MgSO4・7H2O 0.5 〃 FeSO4・7H2O ８mg／ MnSO4・nH2O ８ 〃 コーンステイープリカー 2.5ｇ／ 上記発酵培地を250ml容三角フラスコに20ml分
注して殺菌し、冷却後、前培養液を植菌して、30
℃で24時間振盪培養した。培養終了後の発酵液２
から遠心分離により、乾燥菌体として48.5ｇの
酵母を得た。乾燥菌体中のグルタチオン含量は
3.5％であつた。この菌体より硫酸でグルタチオ
ンを抽出し、抽出液に亜酸化銅を加え、グルタチ
オン銅塩を得た。この銅塩を水洗した後に水に懸
濁して、硫化水素を吹きこみ、水溶液中にグルタ
チオンを遊離させ、硫酸イオンの除去の後、減圧
濃縮してグルタチオン1.20ｇを得た。 親株のサツカロミセス・セレビジエATCC7754
を用いる他は上記の方法を繰返し、乾燥菌体とし
て、54.0ｇの酵母を得た。菌体中のグルタチオン
含量は0.9％であつた。これより0.29ｇのグルタ
チオンを得た。 実施例 ２ サツカロミセス・セレビジエＮ―33を用いる他
は実施例１を繰返し、乾燥菌体として50.3ｇの酵
母を得、乾燥菌体中のグルタチオン含量は2.9％
であり、グルタチオン0.99ｇを得た。 実施例 ３ サツカロミセス・セレビジエTRZN―10を用
いる他は実施例１を繰返し、乾燥菌体として46.7
ｇの酵母を得、乾燥菌体中のグルタチオン含量は
3.9％であり、グルタチオン1.32ｇを得た。
剤抵抗性変異株は薬剤存在下での生育阻害度が親
株に比較して軽減されていることが確認される。 培養に用いられる培地の炭素源としては、グル
コース，シユクロース，でんぷん加水分解物，糖
みつなどの糖類，酢酸，クエン酸等の有機酸，エ
タノール，メタノール等のアルコール，その他資
化しうる炭素源であればいずれも使用できる。窒
素源としては、硫酸アンモニウム，塩化アンモニ
ウム，リン酸アンモニウム，硝酸アンモニウム，
尿素などの無機含窒素化合物や、カザミノ酸ペプ
トン，肉エキスなどの有機窒素含有物を用いるこ
とができる。さらに、リン酸塩，硫酸塩，マグネ
シウム塩，カリウム塩，鉄塩，マンガン塩，その
他の無機塩を必要に応じて添加する。生育促進物
質として、酵母エキス，麦芽エキス，コーンステ
イープリカー，大豆かす酸分解物などの有機栄養
源も適宜使用する。 栄養要求株を用いるときは、当該要求物質を添
加する。 培養は、20〜40℃，PH３〜８で好気的に培養す
る。 得られた酵母菌体からのグルタチオンの採取
は、公知の手法によつて行なえばよい。例えば遠
心分離し、回収した菌体より、熱水，硫酸などで
抽出したグルタチオンに、亜酸化銅を添加してグ
ルタチオン銅塩とする。これより銅塩を除去し
て、遊離のグルタチオンを得る。本発明で得られ
たグルタチオンは、各種の展開溶媒によるペーパ
ークロマトグラフイー，赤外線スペクトル分析，
元素分析，アミノ酸分析，核磁気共鳴スペクトル
分析などでグルタチオンであることを確認した。 以下に本発明の態様を示す実施例を示す。 実施例 １ サツカロミセス・セレビジエTRZ―６を糖み
つ（糖換算）2.5ｇ／dl硫酸アンモニウム0.25
ｇ／dlリン酸一カリウム0.25ｇ／dlの前培養培地
に植菌し、30℃で24時間振盪培養する。この前培
養液を下記の発酵培地に10％の植菌量で接種す
る。 発酵培地組成 糖みつ（糖換算） 60ｇ／ （NH4）2SO4 10 〃 NH4H2PO4 ２ 〃 K2SO4 2.5 〃 MgSO4・7H2O 0.5 〃 FeSO4・7H2O ８mg／ MnSO4・nH2O ８ 〃 コーンステイープリカー 2.5ｇ／ 上記発酵培地を250ml容三角フラスコに20ml分
注して殺菌し、冷却後、前培養液を植菌して、30
℃で24時間振盪培養した。培養終了後の発酵液２
から遠心分離により、乾燥菌体として48.5ｇの
酵母を得た。乾燥菌体中のグルタチオン含量は
3.5％であつた。この菌体より硫酸でグルタチオ
ンを抽出し、抽出液に亜酸化銅を加え、グルタチ
オン銅塩を得た。この銅塩を水洗した後に水に懸
濁して、硫化水素を吹きこみ、水溶液中にグルタ
チオンを遊離させ、硫酸イオンの除去の後、減圧
濃縮してグルタチオン1.20ｇを得た。 親株のサツカロミセス・セレビジエATCC7754
を用いる他は上記の方法を繰返し、乾燥菌体とし
て、54.0ｇの酵母を得た。菌体中のグルタチオン
含量は0.9％であつた。これより0.29ｇのグルタ
チオンを得た。 実施例 ２ サツカロミセス・セレビジエＮ―33を用いる他
は実施例１を繰返し、乾燥菌体として50.3ｇの酵
母を得、乾燥菌体中のグルタチオン含量は2.9％
であり、グルタチオン0.99ｇを得た。 実施例 ３ サツカロミセス・セレビジエTRZN―10を用
いる他は実施例１を繰返し、乾燥菌体として46.7
ｇの酵母を得、乾燥菌体中のグルタチオン含量は
3.9％であり、グルタチオン1.32ｇを得た。
Claims (1)
- １ サツカロミセス属に属し、１，２，４―トリ
アゾール又はアジ化ナトリウムに抵抗性を有する
グルタチオン生産性の変異株を培地に培養して、
菌体内にグルタチオンを蓄積させ、これを採取す
ることを特徴とするグルタチオンの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56180192A JPS5881797A (ja) | 1981-11-10 | 1981-11-10 | グルタチオンの製造法 |
| US06/438,930 US4582801A (en) | 1981-11-10 | 1982-11-03 | Process for producing glutathione |
| EP82305967A EP0079241B1 (en) | 1981-11-10 | 1982-11-09 | Process for producing glutathione |
| DE8282305967T DE3278205D1 (en) | 1981-11-10 | 1982-11-09 | Process for producing glutathione |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56180192A JPS5881797A (ja) | 1981-11-10 | 1981-11-10 | グルタチオンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5881797A JPS5881797A (ja) | 1983-05-17 |
| JPS6313680B2 true JPS6313680B2 (ja) | 1988-03-26 |
Family
ID=16078998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56180192A Granted JPS5881797A (ja) | 1981-11-10 | 1981-11-10 | グルタチオンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4582801A (ja) |
| EP (1) | EP0079241B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5881797A (ja) |
| DE (1) | DE3278205D1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03183474A (ja) * | 1989-09-04 | 1991-08-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | アルギニン高含有酵母 |
| US5629023A (en) * | 1991-12-31 | 1997-05-13 | Bland; Jeffrey S. | Medical food composition for metabolic detoxification |
| CA2213266A1 (en) * | 1996-09-04 | 1998-03-04 | Hideki Tsuruoka | Method for isolation and purification of s-(1,2-dicarboxyethyl) glutathione |
| AUPS334602A0 (en) * | 2002-06-28 | 2002-07-25 | Unisearch Limited | Glutathione production |
| DE60225004T2 (de) * | 2002-08-09 | 2009-03-05 | Gnosis S.R.L. | Verfahren zur Herstellung von Glutathion |
| US7371557B2 (en) * | 2006-02-22 | 2008-05-13 | Food Industry Research And Development Institute | Saccharomyces cerevisiae strains for hyper-producing glutathione and γ-glutamylcysteine and processes of use |
| CN101024818B (zh) * | 2006-02-22 | 2011-12-07 | 财团法人食品工业发展研究所 | 用于高产谷胱甘肽与其前体的酿酒酵母菌株及其使用方法 |
| KR102222210B1 (ko) * | 2019-10-29 | 2021-03-05 | 씨제이제일제당 주식회사 | 글루타치온을 생산하는 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법 |
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