JPS63141996A - 新規活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な活性ペプチドに関するものであり、詳し
くはアンジオテンシン転換酵素阻害活性を有し、高血圧
症の治療もしくは予防に用いて有用性の期待できる新規
なペプチドに関する。

（従来の技術） 高血圧症の発症にレニン−アンジオテンシン系が深いか
かわりを持っていることはよく知られている。このレニ
ン・アンジオテンシン系には血圧調節に与るアンジオテ
ンシン転換酵素が存在し、該酵素は、アンジオテンシン
Ｉを強い血管壁平滑筋収縮作用を有するアンジオテンシ
ンｎに転換せしめることを通じて血圧上昇に関与してい
る。従って、この酵素活性を抑制すること：に：よ１）
て血圧上昇を防ぐこと（降圧）が可能である′。

アンジオテンシン転換酵素の活性阻害物質として、既に
種々の物質が見い出されており、例えば合成物について
はＤ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−し−
プロリン（−船名カブトプリル）がその高い阻害活性か
らして、現に経口降圧剤として実用に供されている。ま
た、天然物あるいは天然物由来の阻害物質としては、蛇
毒ペプチドおよびその類ｌ１体、あるいは牛山来カゼイ
ンをトリプシン分解して得られるペプチド等が知られて
いる。

それらのうち、天然物あるいは天然物由来の阻害物質は
、合成物が毒性や副作用の点でなお問題を残しているの
に対し、より安全性にすぐれた降圧剤となることが期待
でき、なかでもカゼイン由来の阻害ペプチドは、安全性
、存効性に加えて、コスト面でも有利と見込まれるとこ
ろからその降圧剤としての実用化が検討されている。

（発明の目的） 本発明者等は、上記のカゼイン由来の阻害ペプチドの有
用性に鑑み、その類縁ペプチドないしは部分構造物の中
から、有効なアンジオテンシン転換酵素阻害活性を有す
るものを検索し、以て該ペプチド群の降圧網への適用に
際しての選択の巾を拡げ、その実用化可能性をより高め
るべく鋭意研究を行った結果、後述のトリペプチドがか
−る目的を満足することを見い出し、本発明を完成する
に至った。

（発明の構成） 即ち、本発明は、新規な活性ペプチドであるし一プロリ
ルーし一チロシルーし一プロリンおよびその酸付加塩で
ある。

こ〜で酸付加塩としては、製薬上許容される塩、例えば
塩酸塩、硫酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩な
どが好ましいものとして挙げられる。

本発明のペプチドは、牛カゼインの部分構造物であり、
該蛋白の酵素加水分解によっても得ることができるが、
より有利には有機化学的な合成手取下に合成法の一例を
示すが、こ−に於いてアミノ酸はすべてＬ体を意味し、
またアミノ酸の保護基の略号はそれぞれ次の残基を表す
。

Ｂｏｃ：ターシャリーープチルオキシ力ルボニル（ｔｒ
ｅｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）基Ｂｚｌ
：ベンジル（Ｂｅｎｚｙｌ）基 （１）Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ　り−ＯＲとＨ−Ｐｒｏ
−ＯＢｚｌを縮合反応させてＢｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂ２　＋
）−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　Ｉを合成し、その脱係護基反応に
よりＩ（−Ｔｙｒ　（Ｂ２１）−Ｐｒ。

−０Ｂｚｌを得る０次に、この）［−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）
　−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　ＩＪｒｃＩ３ｏｃ−Ｐｒｏ　−Ｏ
Ｈと縮合反応させてＢｏｃ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　　（Ｂｚ
ｌ）−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　Ｉを合成し、同じく脱係護基反
応により目的のＩＩ−Ｐｒｏ−’ｒｙｒ−Ｐｒ。

を得る。

以上の反応に於いて、反応条件等は通常のペプチド合成
の場合と同様のものを採用することができる。

本発明のベプチｒ４．は、アンジオテンシン転換酵素に
対して強い阻害作用を示し、また低毒性であって、血圧
降下を目的として医薬あるいは健康食品等に適用して有
用性が期待できる。

以下に、本発明のペプチドの有用性を示す活性試験の結
果を挙げる。

〔アンジオテンシン転換酵素阻害活性〕（１）供試々料 （イ）後記の実施例で得られた）（−ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ−ＯＨ（本発明ペプチド）（ロ）カプトプリル（
対照） （２）試験方法 （ｉ）アンジオテンシン転換酵素液（ＡＣＥ液）の調製 ５ｇのラビットラングアセトンパウダー（シグマ社製）
を５０ｍ１のＯ，ｌ　Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，３）に
溶解し、４０．０ＯＯｘｇ。

４０分の条件下で遠心処理し、その上清液をさらに、上
記緩衝液で、５倍に希釈し、アンジオテンシン転換酵素
液を得た。

（ｉｉ　）活性の測定 試料を試験管に０．０３ｍ１入れ、上記酵素液を０．１
　ｍ　ｌ添加し、３７℃で１０分間保温後、これに基質
として、２５（ｌｕｌのヒプリルーし一ヒスチジルーし
一ロイシン〔アルドリッヒ　ケミカフ１社（＾１ｄｒｉ
ｃｈ　Ｃｈｅｓ、Ｃｏ、）　５Ｊ、、Ｊｌ終濃度５ｍＭ
、Ｎａ　ｃ　ｌ　３００ｍＭを含む、〕を添加し、３７
℃で３０分間反応させた。その後、ＩＮ塩＃０．２５ｍ
１を添加して反応を停止させた後、１．５ｍｌの酢酸エ
チルを加え、１５秒間激しく撹拌した。その後、３．５
００ｒｐ■で１５分間遠心して、酢酸エチル層１ｍｌを
採取した。その酢酸エチル層を１２０℃で３０分間加熱
し、溶媒を除去した。溶媒除去後、蒸溜水２ｍｌを添加
し、抽出されたヒプリル酸の吸収（２２８ｎｍの吸光度
）を測定し、これを酵素活性とした。なお、この条件で
阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍの吸光度は、ｏ、　
ｓ　ｏ　ｏである。

阻害率は、次式より算、ｐ　ｃ：た。

＝÷　　− 阻害率−Ａ−Ｂ／ＡＸｌ！ｌｏＯ％ Ａ：阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍの吸光度（０，
５００） Ｂ：阻害剤添加の場合の２２８　ｎｍの吸光度そして、
阻害率５０％の時の阻害濃度をＩＤ５０とする。

（ハ）試験結果 試験結果を第１表に示す。

第１表 上記の結果から明らかな通り、本発明のペプチドはアン
ジオテンシン転換酵素に対して阻害作用を有し、生体内
に於いて有効な降圧作用を発揮することが期待できる。

また、本発明のペプチドは、マウス経口投与時の急性毒
性値（ＬＤ５０）が３ｇ　／　ｋｇ以上と極めて低毒性
である。従って、本発が期待できる。

本発明のペプチドを高血圧症の治療あるいは予防のため
の医薬として用いる場合、該ペプチドは、薬学的に許容
される担体（賦形剤、滑沢剤、結合剤、着色剤、矯味剤
、賦香剤等）と共に常法に従って、経口投与用の製剤の
形態、例えば錠剤、カプセル剤、トローチ剤、粉末剤、
細粒剤、顆粒剤等とした上経口投与されるか、もしくは
注射剤の形で静脈内投与される。

一方、健康食品として用いる場合には、上記と同様の経
口投与用製剤の形態とするか、もしくは固型あるいは液
状の食品ないしは嗜好品（例えば菓子類、粉末茶、アル
コール飲料、スポーツ飲料等）の形態とすればよい、　
用量は、一般に成人男子１日当り８０ｍｇ〜４ｇ／にぎ
体重の範囲であり、か＼る範囲から投与（摂食）目的等
に応じて適宜の量が選択される。

次に、実施例によって本発明を説明する。

実施例１ （１）　Ｈ−Ｔｙ　ｒ　（Ｂｚ　ｌ）　−１ｉ’；：Ｆ
’０−ＯＢｚ　ｌの合成 Ｈ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ・ＭＣＩ　　２．４２ｇ（１０１
１１１０１）　　、　ＢＯＣ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）　　−
０Ｈ３，７１ｇ　（１０ｇｍｏｌ）およびｌ−ハイドロ
キシベンゾトリアゾール（ＩＩＯＢ　ｔ）　１．３５　
ｇ（１０ｍ層ｏｆ）をジメチルホルムアミドＣＤＭＰ）
１０ｍｌに溶解し、このＷＩ液に、０℃水冷下、トリエ
チルアミン１．４　ｍ　ｌとジシクロへキシルカーポジ
イミド２．０６　ｇを加え、次いで５℃に保持しつ一一
夜撹拌した。

生成したジシクロへキシルウレアを濾別し、濾液を濃縮
乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液を
、１０％クエン酸水溶液、木、４％炭酸水素ナトリウム
水溶液、次いで水で充分に洗浄し、無水硫酸ナトリウム
で脱水乾燥した。無水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液を
減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルで結晶化した。

この結晶（Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ　１）−Ｐｒ０分間
放置した０次に、反応混合液を減圧濃縮し、残渣をエー
テルで２回洗浄した後、エーテルを留去し、ｔ（−Ｔｙ
ｒ　（Ｂｚ　Ｉ）−Ｐｒｏ−ＯＢｚ；をトリフルオロ酢
酸塩として得た〔収１０．５２ｇ、　　（ｌａｍｏｌ）
、性状：淡黄色粉末〕。

（２）Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ　１）−Ｐｒｏ
−ＯＨの合成 Ｈ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ　Ｉ）−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　Ｉ　・ト
リフルオロ酢酸塩０．５２　ｇ　（ｌａｍｏｌ）　、Ｂ
　。

ｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ０，２２ｇ　（１ｍｓ＋ｏｌ）および
■０ＢｔＯ，１４ｇ　　（ｌａｍｏｌ）　　をＤＭＦ４
ｍｌ　　に２容解し、この溶液に、０℃水冷下、トリエ
チルアミン０．１５ｍ１とジシクロへキシルカーポジイ
ミド０．２１ｇを加え、次いで５℃に保持しつ＼−夜撹
拌した。

生成したジシクロへキシルウレアを濾別し、濾液を濃縮
乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液を
、１０％クエン酸水溶液、水、４％炭酸水素ナトリウム
水溶液１．；次いで水三〜、′パ− で充分に洗浄し、無水硫酸ナトリ、ウムーで脱水乾二；
。

燥した。無水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液を減圧）農
縮し、残渣を得た。

この残渣（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ　１）−Ｐ
ｒｏ−ＯＢｚ　Ｉ）を、メタノール１８ｍ１１ジオキサ
７９ｍ１およびｌＮＮａＯＨ１，５ｍｌの混液に溶解し
、室温に５時間放置した後、水を加えてエーテルで洗浄
し、次いで、陽イオン交換樹脂（ＢＩＯ−ＲＡＤ　　Ａ
Ｇ５０Ｗ−Ｘ８）で中和した。

樹脂を濾過により除き、ａ液を減圧下に１縮乾固してＢ
ｏｃ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ　１）−Ｐｒｏ−ＯＨを
白色粉末として得た〔収１ｔ０．１８　　ｇ　　（０，
３３ｓｎ＋ｏｌ）　　）　　。

（３）Ｈ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＯＨの合成りｏｃ
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ　Ｉ）−Ｐｒ。

−０Ｈ０，０８０ｇ　（０，１５ｍｍｏｌ）を、臭化水
素を飽和した酢酸１ｍｌとアニソール１ｍｌの混液に熔
解し、これを室温に１時間放置した後減圧濃縮し、残渣
を工ｒ＝、’老フルで洗浄した。

；Ｓ３．・、− 次に、この残渣を高速液体クロマトグラフィー（カラム
：ラジアルパック（Ｒａｄｉａｌ　ＰＡｋ）ＣＩ　ｍ　
＋　溶出液ニアセトニトリル１０．１％トリフルオロ酢
酸−６０／４０．溶出速度：２ｍｌ／５ｉｎ）に付し、
活性画分を分取、減圧乾固して、Ｈ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ−Ｏｆｆの精製物０゜００２７　ｇ　（０，００
８ｕｓｏｌ）を無色粉末として得た。

こ＼に得られたペプチドの物性値および分析結果は、以
下の通りであった。

◎比旋光度　〔α〕、露５−９３゜ （Ｃ−０，１，Ｈ＊Ｏ） ◎アミノ酸分析 （６ＮＨＣ１にて２４時間加水分解） Ｔ　ｙ　ｒ　　１．００（１１，Ｐ　ｒ　ｏ　　１．７
　＋２１◎薄層クロマトグライー〔シリカゲルプレート
、展開液；ブタノール：酢酸：水（４；１：５）の上層
、ＵＶ吸収及びニンヒドリン発色〕でＲｒ値０．２９に
単一スボ、トを同　鐘紡株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｌ−プロリル−Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンおよびその
   酸付加塩。