JPS6314952B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は微生物を利用してアリルフエニルエー
テル類から相当するエポキシドである２，３−エ
ポキシプロピルフエニルエーテル類を製造する方
法に関する。 ２，３−エポキシプロピルフエニルエーテル類
はアミン類を用いて開環することにより、アリー
ルオキシプロパノールアミン類に誘導し得るので
医薬原料、特にβ−ブロツカー合成中間体として
重要なものである。すなわち、β−ブロツカーに
属するアリールオキシプロパノールアミン類は、
次式で示すように、先づフエノール類にエピクロ
ルヒドリンを作用させ、得られる２，３−エポキ
シプロピルフエニルエーテル類にアルキルアミン
等を作用させて製造される。 従来技術 従来、オレフインから相当するエポキシドを製
造する方法としては、過酸化水素や有機過酸など
の過酸化物を酸化剤として用いて酸化する化学的
方法並びに微生物を用いて酸素酸化する生化学的
方法が知られている。このうち、微生物を用いる
方法ではノカルデイア属、シユードモナス属、ブ
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、マ
イコバクテリウム属、アルスロバクター属、アシ
ネトバクター属、アルカリゲネス属、メチロバク
テリウム属、メチロコツカス属、メチロシナス属
などに属する微生物を直鎖状オレフインあるいは
スチレンやアリルベンゼンなどのアルケニルベン
ゼン類に作用させて相当するエポキシドを生産す
るものであつて、エーテル類のような含酸素不飽
和化合物から微生物を利用してエポキシドを生産
する方法は未だ知られていない。 発明が解決しようとする問題点 本発明者は、種々の属に属する微生物について
エーテル類からエポキシド生産能を有するものを
検索した結果、アルスロバクター属、ブレビバク
テリウム属、コリネバクテリウム属、シユードモ
ナス属、ロドコツカス属に属するエポキシド生産
菌がアリルフエニルエーテル類から相当するエポ
キシドである２，３−エポキシプロピルフエニル
エーテル類を産生することを見出し、本発明をな
すに至つた。 すなわち、本発明の目的は、アリルフエニルエ
ーテル類から、アルスロバクター属、ブレビバク
テリウム属、コリネバクテリウム属、シユードモ
ナス属、またはロドコツカス属に属するエポキシ
ド生産菌を利用して、医薬製造上の中間体として
も有用な２，３−エポキシプロピルフエニルエー
テル類を製造する新規な方法を提供することにあ
る。 以下本発明を詳しく説明する。 問題点を解決するための手段 本発明の構成上の特徴は、アルスロバクター
属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、シユードモナス属およびロドコツカス属に属
する群から選択されるエポキシド生産能を有する
微生物を、アリルフエニルエーテル類に好気的条
件下で作用させて相当する２，３−エポキシプロ
ピルフエニルエーテル類を産生し、得られた該エ
ポキシドを分離、採取することにある。 また、本発明は、上記微生物を水不溶性有機溶
剤の存在下に上記と同様にして作用させることに
より、上記エポキシドを更に有利に産生させるこ
とも特徴とする。 本発明で利用するアルスロバクター属、ブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属、シユー
ドモナス属またはロドコツカス属に属する微生物
としては下記の菌株を例示し得る。なお、これら
の菌株はAmerican Type Culture Collectionに
下記番号で寄託されていて容易にに入手が可能で
ある。 Arthrobacter roseoparaffinus ATCC 15584 Arthrobacter petroleophagus ATCC 21494 Arthrobacter rubellus ATCC 21495 Arthrobacter sp. ATCC 27778 Brevibacterium butanicum ATCC 21196 Corynebacterium fujiokense ATCC 21496 Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 Rhodococcus rhodochrous ATCC 29675 Rhodococcus rhodochrous ATCC 29670 Rhodococcus rhodochrous ATCC 29672 Rhodococcus sp. ATCC 29673 Rhodococcus sp. ATCC 29674 本発明において上記微生物を作用させてエポキ
シドを産生するための原料基質として用いられる
アリルフエニルエーテル類（以下原料エーテル類
と称する）は、アリルフエニルエーテルやナフチ
ルアリルエーテルのような芳香環に置換基を有し
ない芳香族エーテルおよび芳香環にメチル、エチ
ル、イソプロピル、ブチルのようなアルキル基；
アリル基；メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブ
トキシ、ベンジロキシのようなアルコキシ基；塩
素やフツ素のようなハロゲン又はニトリルなどの
置換基を１個又は２個以上有する置換芳香族エー
テルを包含するものであり、具体的には上記アリ
ルフエニルエーテル、α−ナフチルアリルエーテ
ルのほかに、２，５−ジメチルフエニルアリルエ
ーテル、２，３−ジメチルフエニルアリルエーテ
ル、２−アリルフエニルアリルエーテル、２−シ
アノフエニルアリルエーテル、２−シクロペンチ
ルフエニルアリルエーテル、２−アリロキシフエ
ニルアリルエーテル、４−β−メトキシエチルフ
エニルアリルエーテル、４−ブトキシフエニルア
リルエーテル、３−メチルフエニルアリルエーテ
ル、２−クロロ−５−メチルフエニルアリルエー
テルなどを例示し得る。 本発明ではこれらの原料エーテル類を単独また
は２種以上の混合物として原料基質として用いら
れる。 本発明においては、上記原料エーテル類に前記
アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、コ
リネバクテリウム属、シユードモナス属またはロ
ドコツカス属に属する微生物を作用させてエポキ
シドを産生するには、例えば(a)該微生物を予め培
養増殖して得られる菌体に原料エーテル類を好気
的条件下で接触させて反応させる方法、(b)上記微
生物を原料エーテル類を含む培養培地中で好気的
条件下で培養する方法を適用し得る。 上記(a)の増殖菌体に原料エーテル類を接触させ
て反応させる方法では、まず炭素源として糖質例
えばグルコース、シユクロース、糖蜜、澱粉加水
分解物、炭化水素例えばプロパン、ブタン、オク
タン、ドデカン、テトラデカン及びそのほか酢
酸、エタノールの如き菌体増殖作用の高いもの、
或いは炭化水素の酸化酵素系の誘導に有効なもの
を用い、これに塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿
素、アンモニア水、アミノ酸及びその他の資化性
有機窒素化合物のような窒素源、燐酸カリウム、
燐酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガ
ン、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、塩化カルシウム、
塩化マンガンのごとき無機塩類、及びホウ素、
銅、亜鉛などの塩、すなわち、いわゆる微量元
素、更には必要に応じてビタミン類、酵母エキ
ス、コーンステイープリカーのごとき生長促進物
質を添加した培地に、上記微生物の種菌を接種
し、好気的条件下で培養して菌体を増殖させる。
このようにして得られた菌体培養物、又は該培養
物から分離した菌体の懸濁液もしくは菌体を固定
化したものに原料エーテル類及び必要に応じて後
記する有機溶剤を添加し、空気、酸素、酸素富化
ガスのような酸素含有ガスを供給して反応させ
る。 反応はPH５〜９、20〜50℃の範囲で用いる微生
物及び原料エーテル類の種類により適宜定め、半
日〜６日間行う。反応は通常常圧下で行なわれる
が、加圧下で行うことによりエポキシドの生産性
を向上させることも出来る。なお、反応中に菌体
増殖に用いた炭素源、窒素源、更にはその他の成
分を適宜添加することにより、菌体濃度や菌体の
エポキシド生産活性を維持し或いは高めることが
出来る。 反応に用いる原料エーテル類の菌体含有水性液
に対する割合は通常0.1〜50vol／vol％、好まし
くは0.5〜20vol／vol％である。 反応は回分式又は連続式さらには原料エーテル
類或いはその他の成分を反応中に連続的に又は間
歇的に補給する半回分式のいずれでも実施し得
る。 上記反応により生成したエポキシドは相分離、
抽出、蒸留等の公知の手法を適用して分離、採取
する。 つぎに、前記(b)の培養による方法は、上記(a)の
方法における菌体増殖時に原料エーテル類及び必
要に応じて後記する有機溶剤を添加し一段階でエ
ポキシドの生産を図るものである。培養条件
（PH、温度、圧力及び原料エーテル類の添加量
等）、培養方式及び生成したエポキシドの分離、
採取は前記(a)の反応条件、反応方式及び分離、採
取方法が同様に適用し得る。本発明は、前述した
ように、前記微生物による原料エーテル類のエポ
キシ化反応を水不溶性溶剤の存在下で行なう態様
を包含するものであるので、以下この態様につい
て説明する。 本発明において、原料エーテル類に前記微生物
を作用させてエポキシ化を行なうに際して存在さ
せる水不溶性有機溶剤（以下単に有機溶剤と称す
る）は、炭素数９〜17を有するパラフイン、炭素
数10〜18を有するオレフイン、炭素数９〜16を有
するハロゲン化パラフイン、および鎖長が６〜15
の側鎖を有するアルキルベンゼンから成る群から
選択される有機溶剤であつて、これらは単独もし
くは２種以上の混合物としても使用し得る。 これらの有機溶剤について詳しく説明すると、
炭素数９〜17を有するパラフインのうちノルマル
パラフインは石油の灯油および軽油留分中に約20
〜25％含有されているものである。すなわち、沸
点160℃〜350℃の留分を水素化脱硫した後、ゼオ
ライト（もしくはモレキユラーシーブ）等を用い
て分離、回収し得るものであつて、一般にソフト
洗剤の原料として使用されている。 上記パラフインのうちでも炭素数の多いものの
方がエポキシ化の促進作用が高く、特に炭素数12
〜16のものが好ましい。因に、炭素数が９より少
ないとエポキシ化の促進作用がみられず、一方17
より多くなつても該促進作用が低下し、加うるに
室温で固化するようになるので実用的でない。ま
た、上記パラフインのうちイソパラフインは、上
述した留分中にノルマルパラフインと共存してい
るものであつて、精密蒸留によりノルマルパラフ
インと分離し得るが、実際にはノルマルパラフイ
ンとの混合物として用いるのが便利である。な
お、側鎖がメチルやエチルのような短い鎖長のも
のが一般的であるが、炭素数が12〜16を有するイ
ソパラフインがエポキシ化促進上好ましい。 次に、炭素数10〜18を有するオレフインはプロ
ピレンやブチレンの低重合体又はオリゴマーであ
つてもよく、また試薬として市販されているもの
も適用し得る。一般には直鎖状又は低分岐状モノ
オレフインである。 なお、炭素数が10より小さいオレフインではエ
ポキシ化の促進効果はみられず、一方18より多い
ものでは該効果も低く、加うるに粘性が高くなる
ので実用的でない。 有機溶剤としての炭素数９〜16を有するハロゲ
ン化パラフインは、塩素化並びに臭素化パラフイ
ンであつて、塩化デシル、塩化ウンデシル、塩化
ドデシル、塩化トリデシル、塩化テトラデシル、
臭化デシル、臭化ウンデシル、臭化ドデシル、臭
化テトラデシル、臭化ヘキサデシル等を包含す
る。なお、炭素数が９より少くても又16より多く
てもエポキシ化促進効果がみられなくなる。 次に、鎖長が６〜15の側鎖を有するアルキルベ
ンゼンは通常ハード又はソフト洗剤の中間体とし
て利用されているものであつて、炭素数６〜15の
直鎖もしくは分岐アルキル基を側鎖に有するもの
である。 なお、上記鎖長が６〜15の範囲外のものでは、
エポキシ化促進効果はみられないか、又は低くて
実用的でない。 上記有機溶剤の菌体培養液もしくは菌体懸濁液
などの菌体含有水溶液に対する使用割合は、有機
溶剤の種類により異なることもあるが通常１〜
200vol／vol％、好ましくは５〜100vol／vol％で
ある。 なお、有機溶剤を存在させる場合の反応条件、
反応方式および生成エポキシドの分離、採取方法
は前述したと同様に適用することができ、この有
機溶剤の存在下での反応により、目的とするエポ
キシドの生産性を一そう顕著に高めることができ
る。 本発明により得られるエポキシドは光学活性を
有していることから医薬などの生理活性物質の合
成原料として特に有効に利用され得る。 以下に実施例により本発明を更に具体的に説明
する。 実施例 １ 菌懸濁液の調製 後記第２表に記載したPseudomonas以外の８
種の菌株についてはその３白金耳をNBG培地
（オキソイド社製ラブレンコパウダー10ｇ、バク
テリオロジカルペプトン10ｇ、グルコース10ｇ及
び塩化ナトリウム５ｇに水道水を加えて１と
し、1N−苛性ソーダ水溶液でPH7.5調整した後、
オートクレーブ中で120℃15分加熱殺菌した液体
培地）100mlを収容した500ml容の板口フラスコに
接種し、30℃で48時間振盪培養した。 第２表中のPseudomonasについてはニユート
リエントアガースラントから１％グルコースを補
添したニユートリエントアガースラント上に移植
し、30℃で24時間培養した。その培養物の２白金
耳を第１表記載の最小塩培地100mlとオクタン２
mlとを収容した500ml容板口フラスコへ接種して
30℃で16時間振盪培養した。なお培地の殺菌は最
小塩培地はオートクレーブ中で120℃20分間の蒸
気殺菌、オクタンは0.2μｍメンブレンフイルター
を用いての濾過滅菌によつた。 これらの培養により生成した菌体を0.01M−燐
酸緩衝液（PH7.5）で１回洗浄し、ついで下記に
示す反応培地で１回洗浄後、同反応培地中に再懸
濁することにより９種の菌株についてそれぞれ菌
懸濁液を調製した。なお、菌懸濁液中の菌濃度は
乾燥菌体濃度として3.5〜4.0ｇ／の範囲となる
様にした。 反応培地 K₂HPO₄ 1.74ｇ MgSO₄・7H₂O 1.50ｇ FeSO₄・7H₂O 0.05ｇ 脱イオン水 １ PHは2N−H₂SO₄で8.0に調整。 第１表 最小塩培地 （NH₄）₂HPO₄ 10.0ｇ K₂HPO₄ 5.0ｇ NaSO₄ 0.5ｇ CaCl₂（50ｇ／） 1.0ml 塩“Ｂ” 10.0ml MgSO₄・7H₂O 40.0ｇ FeSO₄・7H₂O 2.0ｇ MnSO₄・H₂O 1.6ｇ NaCl 2.0ｇ 蒸留水 １ 微量金属溶液 1.0ml H₃BO₃ 0.50ｇ CuSO₄・5H₂O 0.04ｇ Na₂MoO₄・H₂O 0.20ｇ ZnSO₄・7H₂O 8.00ｇ CuCl₂・6H₂O 0.20ｇ 蒸留水 １ 蒸留水 １ 反応と生成物の分析 前記菌懸濁液20mlとアリルフエニルエーテル１
mlとを500ml容板口フラスコに入れて密栓し、30
℃で24時間振盪培養したのち40mlのエーテルで抽
出して生成した２，３−エポキシプロピルフエニ
ルエーテル量を定量した。定量はジエチレングリ
コールサクシネートをユニポートＢ（ガスクロ工
業社製）80〜100メツシユに担持したカラムとイ
オン化炎検出器とを有するガスクロマトグラフを
用いて行なつた。 結 果 第２表に用いた菌株の種類とそれぞれの場合の
生成した２，３−エポキシプロピルフエニルエー
テル量とを示した。

【表】

【表】 実施例 ２ Brevibacterium butanicum ATCC 21196を
実施例１に記載の方法で培養して菌懸濁液を調製
した。この菌懸濁液20mlに第３表記載の各種原料
エーテル類の各１mlを各えて反応させる方法(A)
法、及び20mlの菌懸濁液に各0.4mlの原料エーテ
ル類と２mlのｎ−ヘキサデカンを加えて反応させ
る方法(B)法の２通りの方法で、実施例１記載と同
様の方法で反応、分析を行なつた。 なお、反応時間は24時間である。原料エーテル
類の種類およよび相当するエポキシドの生成量を
第３表に示す。

【表】 注１） 生成物は２−アリルフエノキシメチ
ルオキシランであつた。
実施例 ３ Brevibacterium butanicum ATCC 21196を
用いて実施例１に記載と同様の方法で７〜８ｇ／
菌体濃度の菌懸濁液を調製した。その菌懸濁液
20ml、原料エーテル類として２−アリルフエニル
アリルエーテル１mlと第４表に記載の各種有機溶
剤１mlとを500ml容坂口フラスコに入れ、実施例
１に記載と同様の方法で反応を行なわせて、24時
間の反応後有機溶剤層を40mlのエーテルで抽出
し、実施例１に記載の方法で生成した２−アリル
フエノキシメチルオキシランを定量した。用いた
有機溶剤の種類と生成したエポキシド量を第４表
に示す。 なお、第４表には比較例として有機溶剤１mlを
添加しないほかは上記と同一の方法で反応、分析
を行なつた結果も示した。

【表】 ％との混合物。
実施例 ４ 後記第５表に記載した６種の菌株の各２白金耳
を合成培地〔（NH₄）₂HPO₄4ｇ、Na₂HPO₄・
12H₂O2.5ｇ、KH₂PO₄2ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5
ｇ、FeSO₄・7H₂O30mg、CaCl₂・2H₂O60mg、
Difco社製酵母エキス200mgにイオン交換水を加
えて１とした後、オートクレーブ中で120℃15
分加熱殺菌した液体培地〕20mlを収容した500ml
容の坂口フラスコに接種し密栓後120mlのプロパ
ンを圧入し、30℃で120時間振盪培養した。培養
により生成した菌体を実施例１記載の方法で洗浄
し、６種の菌株についてそれぞれ菌懸濁液を調製
した。 前記菌懸濁液５mlとアリルフエニルエーテル
250μを外径24mmの試験管に入れて密栓し、30
℃で24時間振盪培養した後20mlのエーテルで抽出
して、実施例１記載の方法で生成した２，３−エ
ポキシプロピルフエニルエーテル量を定量した。 第５表に用いた菌株の種類と反応に用いた菌懸
濁液中の菌濃度および生成した２，３−エポキシ
プロピルフエニルエーテル量を示した。

【表】 実施例 ５ 実施例１に記載したArthrobacter rubellus
ATCC 21495の反応生成物のエーテル溶液よりエ
ーテルを除去し、パイレツクス製20ml容アンプル
に移して、イソプロパノール４ml、イソプロピル
アミン２mlを加え、封管後80℃で４時間加熱し
た。反応終了後関封し、溶媒を除去後残渣を10ml
のベンゼンに溶解し1N−HCl20mlで２回抽出後、
水層に6N−NaOH20mlを加え、ベンゼン20mlで
抽出した。Na₂SO₄でベンゼンを乾燥後、乾固
し、７ml容バイアルに残渣を移した後、100μ
のbis（trimethylsilyl）trifluoro−acetamideを加
え60℃で15分加熱した。冷後、Ｎ−
heptafluorobutyryl−Ｌ−prolylchlorideの1N塩
化メチレン溶液100μを加え15分放置後、2μ
を液相をOV225とする60ｍのガラス製キヤピラ
リーカラムで分析した。 ガスクロマトグラム上のダイアステレオマーの
面積比は保持時間の短いピーク：長いピーク＝
74.5：25.5であり、Arthrobacter ribellus
ATCC 21495の生産する２，３−エポキシプロピ
ルフエニルエーテルの光学純度は49％e.e.であつ
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルスロバクター属、ブレビバクテリウム
   属、コリネバクテリウム属、シユードモナス属、
   およびロドコツカス属に属する群から選択される
   エポキシド生産能を有する微生物を、アリルフエ
   ニルエーテル類に好気的条件下で作用させて相当
   する２，３−エポキシプロピルフエニルエーテル
   類を産生し、得られた該エポキシドを分離、採取
   することを特徴とするアリルフエニルエーテル類
   からエポキシドを製造する方法。 ２ アルスロバクター属、ブレビバクテリウム
   属、コリネバクテリウム属、シユードモナス属お
   よびロドコツカス属に属する群から選択されるエ
   ポキシド生産能を有する微生物を、水不溶性有機
   溶剤の存在下に、アリルフエニルエーテル類に好
   気的条件下で作用させて相当する２，３−エポキ
   シプロピルフエニルエーテルを産生し、得られた
   該エポキシドを分離、採取することを特徴とする
   アリルフエニルエーテル類からエポキシドを製造
   する方法。 ３ 水不溶性有機溶剤が炭素数９乃至17を有する
   パラフイン、炭素数10乃至18を有するオレフイ
   ン、炭素数９乃至16を有するハロゲン化パラフイ
   ンおよび鎖長が６乃至15の側鎖を有するアルキル
   ベンゼンから成る群から選択される１種又は２種
   以上の混合物である特許請求の範囲第２項記載の
   方法。