JPS6315162A - 補体の測定法 - Google Patents
補体の測定法Info
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- JPS6315162A JPS6315162A JP15795186A JP15795186A JPS6315162A JP S6315162 A JPS6315162 A JP S6315162A JP 15795186 A JP15795186 A JP 15795186A JP 15795186 A JP15795186 A JP 15795186A JP S6315162 A JPS6315162 A JP S6315162A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
本発明は血清等の試料中に存在する神体の免疫次合体可
鹸化北金利用した補体の均一系分析方法に関する。
鹸化北金利用した補体の均一系分析方法に関する。
「従来の技術」
補体系は、新鮮な血清中に含まれる２０種類近いタンパ
ク質によって構成されている反応系で。
ク質によって構成されている反応系で。
抗原抗体反応物が存在すると活性化される古典経路ある
いは抗原抗体反応物以外の物質、例えば酵母から分離し
た細胞壁であるディモデン、植物性多糖類であるイヌリ
ン、細菌から分離した４累などで活性化される二次経路
によって、細胞俗解をはじめ徳々の生物活性を現わす。
いは抗原抗体反応物以外の物質、例えば酵母から分離し
た細胞壁であるディモデン、植物性多糖類であるイヌリ
ン、細菌から分離した４累などで活性化される二次経路
によって、細胞俗解をはじめ徳々の生物活性を現わす。
その中の一つに微生物や感染細胞などの細胞表面ヲ標的
とする働きとは異なる免疫複合体可俗化能がある。この
作用で可溶化された免疫複合体は、分子量が小さくなる
とともにそれ以上補体系を活性化する能力がなくなり、
ＦＣレセプターや補体レセプターとも反応しなくなるこ
とが知られている。これは生体内では補体系由来の炎症
を抑制したり局所に沈着した不溶性免疫複合体全除去す
る働きにつながると考えられる。よって免疫複合体可心
化能を利用して補体全測定することは臨床検査分野にお
いて有用と考えられる。
とする働きとは異なる免疫複合体可俗化能がある。この
作用で可溶化された免疫複合体は、分子量が小さくなる
とともにそれ以上補体系を活性化する能力がなくなり、
ＦＣレセプターや補体レセプターとも反応しなくなるこ
とが知られている。これは生体内では補体系由来の炎症
を抑制したり局所に沈着した不溶性免疫複合体全除去す
る働きにつながると考えられる。よって免疫複合体可心
化能を利用して補体全測定することは臨床検査分野にお
いて有用と考えられる。
血清中の補体について従来謂べられているのは補体価で
あり、これは古典経路を介して赤血球膜を破壊する活性
から求められている。この補体価測定法は、メイヤーら
によって開発され感作ヒツジ赤血球と検体血清との反応
後に、浴面により遊離してきたヘモグロビン譬を遠心上
清の波長５４１ａｍでの吸光度から求める方法であり、
５０％―血を起こした補体の量を一単位としている。高
補体価を示す疾患として悪性リン／４腫、糖尿病、急性
肝炎、プルコイド−シス等が知られ又低補体価を示す疾
患としてＳＬＥ 、 ＤＩＣ等が知られている。
あり、これは古典経路を介して赤血球膜を破壊する活性
から求められている。この補体価測定法は、メイヤーら
によって開発され感作ヒツジ赤血球と検体血清との反応
後に、浴面により遊離してきたヘモグロビン譬を遠心上
清の波長５４１ａｍでの吸光度から求める方法であり、
５０％―血を起こした補体の量を一単位としている。高
補体価を示す疾患として悪性リン／４腫、糖尿病、急性
肝炎、プルコイド−シス等が知られ又低補体価を示す疾
患としてＳＬＥ 、 ＤＩＣ等が知られている。
一方、免疫複合体可溶化能全利用した補体の測定に一般
に不溶性免疫複合体金円い、検体血清との反応後、遠心
操作によって不溶性画分を除き上清に遊離してきた抗原
あるいは抗体のｉを知ることから成り立っている。可溶
化した抗原あるいは抗体量を知るには以下に挙げる方法
が知られている。、１つは、そのどちらか一方に放射性
同位元素を標識しておいて遠心後の上溝をシンチレーシ
ョンカウンターで測定する方法又は抗原あるいは抗体だ
酵素を標識しておいて遠心上清に標識酵素の基質を加え
、酵素活性を測定する方法、ちるいはらγＡｆ抗原とし
てその抗体との不后廿免及しシ合体を用い遠心上清の酵
素活性を測定する方法である。
に不溶性免疫複合体金円い、検体血清との反応後、遠心
操作によって不溶性画分を除き上清に遊離してきた抗原
あるいは抗体のｉを知ることから成り立っている。可溶
化した抗原あるいは抗体量を知るには以下に挙げる方法
が知られている。、１つは、そのどちらか一方に放射性
同位元素を標識しておいて遠心後の上溝をシンチレーシ
ョンカウンターで測定する方法又は抗原あるいは抗体だ
酵素を標識しておいて遠心上清に標識酵素の基質を加え
、酵素活性を測定する方法、ちるいはらγＡｆ抗原とし
てその抗体との不后廿免及しシ合体を用い遠心上清の酵
素活性を測定する方法である。
免疫複合体可溶化能に基づく補体針はこの遠心上清中の
放射性同位元素量、あるいは防水活性量と比例関係にあ
ることから求められている。
放射性同位元素量、あるいは防水活性量と比例関係にあ
ることから求められている。
従来の技術では補体と免疫複合体との反応後。
不溶性画分を遠心で除くことによって初めて免疫複合体
可溶化能を利用した補体測定が可能である。
可溶化能を利用した補体測定が可能である。
この遠心の必要性が測定操作を非常に煩雑にしていた。
又同じ理由によって自動分析機への適用も非常に困難で
ちる。
ちる。
「発明が解決しようとする問題点」
本発明者らは、上記間追点を解決すべく俊意検討の結果
、ペルオキシダーゼの酵素活性が連部′（］の過酸化水
木存在下では抑制されるが、抗坏との会合状態では抑制
されないことに’ｊｆｔ目し、遠心操作の必要がない免
疫複合体可溶化能を利用した補体の均一系測定法を目的
として本発明に到達した。
、ペルオキシダーゼの酵素活性が連部′（］の過酸化水
木存在下では抑制されるが、抗坏との会合状態では抑制
されないことに’ｊｆｔ目し、遠心操作の必要がない免
疫複合体可溶化能を利用した補体の均一系測定法を目的
として本発明に到達した。
「問題点を解決するだめの手段」
すなわち、本発明はペルオキシダーゼとその抗体からな
る免役７１合体が補体により可溶化されることにより生
じる、過剰過酸化物存在下のペルオキシダーゼ活性の変
化を検知することを特徴とする補体の測定法である。
る免役７１合体が補体により可溶化されることにより生
じる、過剰過酸化物存在下のペルオキシダーゼ活性の変
化を検知することを特徴とする補体の測定法である。
以下１本発明の詳細な説明する。
本発明に用いられるペルオキシダーゼは、植物・細菌・
動物等に存在し、過酸化物による物質の酸化反応を触媒
する酵素であり、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、
ラクトペルオキシダーゼ、細菌由来ペルオキシダーゼ等
である。ペルオキシダーゼ抗体とは、上記４ルオキシダ
ーゼを動物に免疫して得られる抗体であり、例えば抗ペ
ルオキシダーゼウサギ抗体、抗ペルオキシダーゼヤギ抗
体等である。
動物等に存在し、過酸化物による物質の酸化反応を触媒
する酵素であり、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、
ラクトペルオキシダーゼ、細菌由来ペルオキシダーゼ等
である。ペルオキシダーゼ抗体とは、上記４ルオキシダ
ーゼを動物に免疫して得られる抗体であり、例えば抗ペ
ルオキシダーゼウサギ抗体、抗ペルオキシダーゼヤギ抗
体等である。
本発明に用いられる免疫複合体は上記のようなベルオキ
７ダーゼと抗ペルオキシダーゼ抗体を反応させて調整す
る。この免疫複合体に台筐れるペルオキシダーゼは会合
状態にあるため、過酸化物過剰下においても酵素活性を
発現する。この免疫複合体は、補体を含む試料との反応
によって定量的に可溶化される。ところが、この可溶化
によって遊離してきたペルオキシダーゼは、過酸化物過
剰下で活性が抑制されるのでペルオキシダーゼの活性を
測定することによシ補体を定量することができる。
７ダーゼと抗ペルオキシダーゼ抗体を反応させて調整す
る。この免疫複合体に台筐れるペルオキシダーゼは会合
状態にあるため、過酸化物過剰下においても酵素活性を
発現する。この免疫複合体は、補体を含む試料との反応
によって定量的に可溶化される。ところが、この可溶化
によって遊離してきたペルオキシダーゼは、過酸化物過
剰下で活性が抑制されるのでペルオキシダーゼの活性を
測定することによシ補体を定量することができる。
本発明に用いられる過酸化物としては、例えば過酸化水
素、過酸化尿素等である。
素、過酸化尿素等である。
又、ペルオキシダーゼと抗ペルオキシダーゼ抗体を用い
て免疫複合体を形成させる代わシに免疫複合体として、
例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と抗ＢＳＡウサギ
抗体のような、抗原と抗体の組合せで形成させ、そのど
ちらか一方にペルオキシダーゼを標識しておいてもよい
。例えば、ＢＳＡ Ｉ７ｔ：ペルオキシダーゼを標識し
ておくことによって免疫被合体中にはペルオキシダーゼ
が会合状明で台筐れることになる。この免疫複合体と補
体全台む試料を反応させてから、ペルオキシダーゼの活
性を測定することにより、ペルオキシダーゼとその抗体
からなる免疫複合体を用いた場合と同様の原理で補体を
定量することができる。
て免疫複合体を形成させる代わシに免疫複合体として、
例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と抗ＢＳＡウサギ
抗体のような、抗原と抗体の組合せで形成させ、そのど
ちらか一方にペルオキシダーゼを標識しておいてもよい
。例えば、ＢＳＡ Ｉ７ｔ：ペルオキシダーゼを標識し
ておくことによって免疫被合体中にはペルオキシダーゼ
が会合状明で台筐れることになる。この免疫複合体と補
体全台む試料を反応させてから、ペルオキシダーゼの活
性を測定することにより、ペルオキシダーゼとその抗体
からなる免疫複合体を用いた場合と同様の原理で補体を
定量することができる。
ペルオキシダーゼの活性測定用試薬中には、発色剤とし
てフェノール類を含むがこの発色剤は過剰の過酸化物存
在下での会合状態のペルオキシダーゼを遊離状態でのペ
ルオキシダーゼの活性の違いを、検知するのに好ましい
水素供与体であり、フェノール、ノ！ラクロロフェノー
ル、２．４−ジクロロフェノール等がある。
てフェノール類を含むがこの発色剤は過剰の過酸化物存
在下での会合状態のペルオキシダーゼを遊離状態でのペ
ルオキシダーゼの活性の違いを、検知するのに好ましい
水素供与体であり、フェノール、ノ！ラクロロフェノー
ル、２．４−ジクロロフェノール等がある。
フェノール類による発色に際しては、通常用いられるフ
ェノール類の酸化縮合剤が用いられ、例えば４−アミノ
アンチピリン等が好適に用いられる。
ェノール類の酸化縮合剤が用いられ、例えば４−アミノ
アンチピリン等が好適に用いられる。
「実施例」
以下１本発明を実施例により更に具体的に説明する。
１） ａ 免疫複合体の調整法
西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製、以下ＨＲＰ
と記す。）を緩衝液Ａ （０，１５ｍＭ ＣａＣｌ２゜
０．５ ｍＭ ＮａＣｔ２．０．１５ Ｍ ＮａＣｔ
を含む２０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７，５）で６
μｉ／葱して調整した。又緩衝液Ａで抗ＨＲＰウサゼ血
清を２０倍に苛釈し上記のＨＲＰ液と等址混合した。４
℃において２日間反応して免疫複合体を形成させた後、
緩衝液Ｂ（１０％サッカロースと４％フィコール４００
ｋ含ｔｒ ２０闘トリス塩酸緩衝液−７，５）と等址
混合し、ｚＰｎｔずつ分注して凍結乾燥した。この凍結
乾燥品を緩衝液Ａ６−で浴解し、免疫複合体試薬として
用いた。
と記す。）を緩衝液Ａ （０，１５ｍＭ ＣａＣｌ２゜
０．５ ｍＭ ＮａＣｔ２．０．１５ Ｍ ＮａＣｔ
を含む２０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７，５）で６
μｉ／葱して調整した。又緩衝液Ａで抗ＨＲＰウサゼ血
清を２０倍に苛釈し上記のＨＲＰ液と等址混合した。４
℃において２日間反応して免疫複合体を形成させた後、
緩衝液Ｂ（１０％サッカロースと４％フィコール４００
ｋ含ｔｒ ２０闘トリス塩酸緩衝液−７，５）と等址
混合し、ｚＰｎｔずつ分注して凍結乾燥した。この凍結
乾燥品を緩衝液Ａ６−で浴解し、免疫複合体試薬として
用いた。
ｂ 免疫複合体可溶化能に基づく補体量の標準曲線作成
法 プール新群血清をセントリコン−１０（アミコン社製）
で２倍に濃縮し標準補体用血清と１７だ、これを非動化
血清（５６℃、３０分間熱処理）で希釈し標準物全調整
した。この標準物５０μｌ Ｉｃ ａで調整した免疫被
合体試薬２００μｌを加え３７℃において２０分間反応
した。次に基質ｆ３ Ｋ （０，７５ｍＭ４−アミノア
ンチピリン、２５ ；ｎＭ フェノール、４０ｍＭ過酸
化水素を含む緩袖液Ａ）１４′ｆｆ、加え、３７℃にお
いて１０分間反応した。更に反応停止ｉ（１，８受ホル
ムアルデヒドを含む２０ ｍＭ ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ７
，０）２ｍｔｔ−加えた後、波長５００ｎｍにおける吸
光度を測定した。横軸に標準補体用血清濃度をとり、縦
軸に波長５００ｎｍにおける吸光度をとって標準曲線を
作製した。この結果を第１図に示す。
法 プール新群血清をセントリコン−１０（アミコン社製）
で２倍に濃縮し標準補体用血清と１７だ、これを非動化
血清（５６℃、３０分間熱処理）で希釈し標準物全調整
した。この標準物５０μｌ Ｉｃ ａで調整した免疫被
合体試薬２００μｌを加え３７℃において２０分間反応
した。次に基質ｆ３ Ｋ （０，７５ｍＭ４−アミノア
ンチピリン、２５ ；ｎＭ フェノール、４０ｍＭ過酸
化水素を含む緩袖液Ａ）１４′ｆｆ、加え、３７℃にお
いて１０分間反応した。更に反応停止ｉ（１，８受ホル
ムアルデヒドを含む２０ ｍＭ ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ７
，０）２ｍｔｔ−加えた後、波長５００ｎｍにおける吸
光度を測定した。横軸に標準補体用血清濃度をとり、縦
軸に波長５００ｎｍにおける吸光度をとって標準曲線を
作製した。この結果を第１図に示す。
２）調整検体の拳法と５０％浴血浴面の相関ｈ々の正常
ヒト血清をセントリコン−１０で銭縮あるいは非動化血
清で希釈して補体価の異なる検体音調ケした。次にこの
検体の免疫複合体可溶化能に基づく主１３体量全実施例
１） ｂ と同様の実験操作で測定した。更に各検体
の得られた吸光度に対する補体清樟準曲線から読みとり
係表示した。
ヒト血清をセントリコン−１０で銭縮あるいは非動化血
清で希釈して補体価の異なる検体音調ケした。次にこの
検体の免疫複合体可溶化能に基づく主１３体量全実施例
１） ｂ と同様の実験操作で測定した。更に各検体
の得られた吸光度に対する補体清樟準曲線から読みとり
係表示した。
一方、調製した検体の補体価をメイヤーらの方法に従っ
て測定した。得られたＣＩ（５ｏと可溶化能に基づく補
体量の関係は、第２図に示すごとく相関係数γ−０，９
４とよく相関することがわかった。
て測定した。得られたＣＩ（５ｏと可溶化能に基づく補
体量の関係は、第２図に示すごとく相関係数γ−０，９
４とよく相関することがわかった。
「発明の効来」
実施例に示したごとく１本発明によって免ｋ 複合体町
俗化能に基づく補体量が、短時間に遠心操作の必要なく
定量することが可能となった。又、分離操作の不必要な
点から自動分析機への応用も考えられ、多検体測定も困
難なく行なうことができる。更にＣＨ５ｏとの相関も良
いので、煩雑な検体希釈を必要とし、感作ヒツジ赤血球
を使用していることから試薬としての安定性が悪い従来
の補体価測定に代わり、臨床ｒ−夕の蓄積に伴いその測
定の意義が増すことが期待できる。
俗化能に基づく補体量が、短時間に遠心操作の必要なく
定量することが可能となった。又、分離操作の不必要な
点から自動分析機への応用も考えられ、多検体測定も困
難なく行なうことができる。更にＣＨ５ｏとの相関も良
いので、煩雑な検体希釈を必要とし、感作ヒツジ赤血球
を使用していることから試薬としての安定性が悪い従来
の補体価測定に代わり、臨床ｒ−夕の蓄積に伴いその測
定の意義が増すことが期待できる。
第１図は、本発明の方法により標準補体濃度ｔｈの希釈
列を測定した場合に得られる結果で、横軸に標準補体濃
度を勿表示し縦軸に波長５００ｎｍにおける吸光度を示
すグラフ図であり、第２図は、本発明の測定法で得られ
た免疫複合体可溶化能に基づく補体量と、メイヤー等の
方法で得られたＣＨ５ｏとの相関を示すグラフ図である
。 第１図 梗準糟°拌濃ｆＬ（０ん） 第２図 Ｈ５０
列を測定した場合に得られる結果で、横軸に標準補体濃
度を勿表示し縦軸に波長５００ｎｍにおける吸光度を示
すグラフ図であり、第２図は、本発明の測定法で得られ
た免疫複合体可溶化能に基づく補体量と、メイヤー等の
方法で得られたＣＨ５ｏとの相関を示すグラフ図である
。 第１図 梗準糟°拌濃ｆＬ（０ん） 第２図 Ｈ５０
Claims (3)
- （１）ペルオキシダーゼとその抗体からなる免疫複合体
が補体により可溶化されることにより生じる、過剰過酸
化物存在下のペルオキシダーゼ活性の変化を検知するこ
とを特徴とする補体の測定法。 - （２）対応する抗原と抗体の組合せのいずれか一方にペ
ルオキシダーゼを標識した免疫複合体を用いる特許請求
の範囲第１項記載の測定法。 - （３）ペルオキシダーゼの活性測定用試薬として過剰の
過酸化物、フェノール類及びフェノール類に対する酸化
縮合剤を用いる特許請求の範囲第１項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15795186A JPH0677018B2 (ja) | 1986-07-07 | 1986-07-07 | 補体の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15795186A JPH0677018B2 (ja) | 1986-07-07 | 1986-07-07 | 補体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6315162A true JPS6315162A (ja) | 1988-01-22 |
| JPH0677018B2 JPH0677018B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=15661026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15795186A Expired - Lifetime JPH0677018B2 (ja) | 1986-07-07 | 1986-07-07 | 補体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0677018B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7148597B2 (en) | 2002-05-15 | 2006-12-12 | Hitachi, Ltd. | Permanent magnet rotating electric machine |
| CN110780082A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-02-11 | 上海昆涞实业发展有限公司 | 一种总补体活性质控品，试剂，制备方法及应用 |
-
1986
- 1986-07-07 JP JP15795186A patent/JPH0677018B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7148597B2 (en) | 2002-05-15 | 2006-12-12 | Hitachi, Ltd. | Permanent magnet rotating electric machine |
| US7233089B2 (en) | 2002-05-15 | 2007-06-19 | Hitachi, Ltd. | Permanent magnet rotating electric machine |
| US7417346B2 (en) | 2002-05-15 | 2008-08-26 | Hitachi, Ltd. | Permanent magnet rotating electric machine |
| CN110780082A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-02-11 | 上海昆涞实业发展有限公司 | 一种总补体活性质控品，试剂，制备方法及应用 |
| CN110780082B (zh) * | 2019-11-04 | 2023-05-12 | 上海昆涞实业发展有限公司 | 一种总补体活性质控品，试剂，制备方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0677018B2 (ja) | 1994-09-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |