JPH0677018B2 - 補体の測定法 - Google Patents
補体の測定法Info
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- JPH0677018B2 JPH0677018B2 JP15795186A JP15795186A JPH0677018B2 JP H0677018 B2 JPH0677018 B2 JP H0677018B2 JP 15795186 A JP15795186 A JP 15795186A JP 15795186 A JP15795186 A JP 15795186A JP H0677018 B2 JPH0677018 B2 JP H0677018B2
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は血清等の試料中に存在する補体の免疫複合体可
溶化能を利用した補体の均一系分析方法に関する。
溶化能を利用した補体の均一系分析方法に関する。
「従来の技術」 補体系は、新鮮な血清中に含まれる20種類近いタンパク
質によって構成されている反応系で、抗原抗体反応物が
存在すると活性化される古典経路あるいは抗原抗体反応
物以外の物質、例えば酵母から分離した細胞壁であるザ
イモザン、植物性多糖類であるイヌリン、細菌から分離
した毒素などで活性化される二次経路によって、細胞溶
解をはじめ種々の生物活性を現わす。その中の一つに微
生物や感染細胞などの細胞表面を標的とする働きとは異
なる免疫複合体可溶化能がある。この作用で可溶化され
た免疫複合体は、分子量が小さくなるとともにそれ以上
補体系を活性化する能力がなくなり、FCレセプターや補
体レセプターとも反応しなくなることが知られている。
これは生体内では補体系由来の炎症を抑制したり局所に
沈着した不溶性免疫複合体を除去する働きにつながると
考えられる。よって免疫複合体可溶化能を利用して補体
を測定することは臨床検査分野において有用と考えられ
る。
質によって構成されている反応系で、抗原抗体反応物が
存在すると活性化される古典経路あるいは抗原抗体反応
物以外の物質、例えば酵母から分離した細胞壁であるザ
イモザン、植物性多糖類であるイヌリン、細菌から分離
した毒素などで活性化される二次経路によって、細胞溶
解をはじめ種々の生物活性を現わす。その中の一つに微
生物や感染細胞などの細胞表面を標的とする働きとは異
なる免疫複合体可溶化能がある。この作用で可溶化され
た免疫複合体は、分子量が小さくなるとともにそれ以上
補体系を活性化する能力がなくなり、FCレセプターや補
体レセプターとも反応しなくなることが知られている。
これは生体内では補体系由来の炎症を抑制したり局所に
沈着した不溶性免疫複合体を除去する働きにつながると
考えられる。よって免疫複合体可溶化能を利用して補体
を測定することは臨床検査分野において有用と考えられ
る。
血清中の補体について従来調べられているのは補体価で
あり、これは古典経路を介して赤血球膜を破壊する活性
から求められている。この補体価測定法は、メイヤーら
によって開発され感作ヒツジ赤血球と検体血清との反応
後に、溶血により遊離してきたヘモグロビン量を遠心上
清の波長541nmでの吸光度から求める方法であり、50％
溶血を起こした補体の量を一単位としている。高補体価
を示す疾患として悪性リンパ腫、糖尿病、急性肝炎、サ
ルコイドーシス等が知られ又低補体価を示す疾患として
SLE、DIC等が知られている。
あり、これは古典経路を介して赤血球膜を破壊する活性
から求められている。この補体価測定法は、メイヤーら
によって開発され感作ヒツジ赤血球と検体血清との反応
後に、溶血により遊離してきたヘモグロビン量を遠心上
清の波長541nmでの吸光度から求める方法であり、50％
溶血を起こした補体の量を一単位としている。高補体価
を示す疾患として悪性リンパ腫、糖尿病、急性肝炎、サ
ルコイドーシス等が知られ又低補体価を示す疾患として
SLE、DIC等が知られている。
一方、免疫複合体可溶化能を利用した補体の測定は一般
に不溶性免疫複合体を用い、検体血清との反応後、遠心
操作によって不溶性画分を除き上清に遊離してきた抗原
あるいは抗体の量を知ることから成り立っている。可溶
化した抗原あるいは抗体量を知るには以下に挙げる方法
が知られている。１つは、そのどちらか一方に放射性同
位元素を標識しておいて遠心後の上清をシンチレーショ
ンカウンターで測定する方法又は抗原あるいは抗体に酵
素を標識しておいて遠心上清に標識酵素の基質を加え、
酵素活性を測定する方法、あるいは酵素を抗原としてそ
の抗体との不溶性免疫複合体を用い遠心上清の酵素活性
を測定する方法である。
に不溶性免疫複合体を用い、検体血清との反応後、遠心
操作によって不溶性画分を除き上清に遊離してきた抗原
あるいは抗体の量を知ることから成り立っている。可溶
化した抗原あるいは抗体量を知るには以下に挙げる方法
が知られている。１つは、そのどちらか一方に放射性同
位元素を標識しておいて遠心後の上清をシンチレーショ
ンカウンターで測定する方法又は抗原あるいは抗体に酵
素を標識しておいて遠心上清に標識酵素の基質を加え、
酵素活性を測定する方法、あるいは酵素を抗原としてそ
の抗体との不溶性免疫複合体を用い遠心上清の酵素活性
を測定する方法である。
免疫複合体可溶化能に基づく補体量はこの遠心上清中の
放射性同位元素量、あるいは酵素活性量と比例関係にあ
ることから求められている。
放射性同位元素量、あるいは酵素活性量と比例関係にあ
ることから求められている。
従来の技術では補体と免疫複合体との反応後、不溶性画
分を遠心で除くことによって初めて免疫複合体可溶化能
を利用した補体測定が可能である。この遠心の必要性が
測定操作を非常に煩雑にしていた。又同じ理由によって
自動分析機への適用も非常に困難である。
分を遠心で除くことによって初めて免疫複合体可溶化能
を利用した補体測定が可能である。この遠心の必要性が
測定操作を非常に煩雑にしていた。又同じ理由によって
自動分析機への適用も非常に困難である。
「発明が解決しようとする問題点」 本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討の結
果、ペルオキシダーゼの酵素活性が過剰の過酸化水素存
在下では抑制されるが、抗体との会合状態では抑制され
ないことに着目し、遠心操作の必要がない免疫複合体可
溶化能を利用した補体の均一系測定法を目的として本発
明に到達した。
果、ペルオキシダーゼの酵素活性が過剰の過酸化水素存
在下では抑制されるが、抗体との会合状態では抑制され
ないことに着目し、遠心操作の必要がない免疫複合体可
溶化能を利用した補体の均一系測定法を目的として本発
明に到達した。
「問題点を解決するための手段」 すなわち、本発明はペルオキシダーゼとその抗体からな
る免疫複合体が補体により可溶化されることにより生じ
る、過剰過酸化物存在下のペルオキシダーゼ活性の変化
を検知することを特徴とする補体の測定法である。
る免疫複合体が補体により可溶化されることにより生じ
る、過剰過酸化物存在下のペルオキシダーゼ活性の変化
を検知することを特徴とする補体の測定法である。
更に、本発明は対応する抗原と抗体の組合せのいずれか
一方にペルオキシダーゼを標識し、両者の反応により形
成される免疫複合体が補体により可溶化されることによ
り生じる過剰過酸化物存在下のペルオキシダーゼ活性の
変化を検知することを特徴とする補体の測定法にも関す
る。
一方にペルオキシダーゼを標識し、両者の反応により形
成される免疫複合体が補体により可溶化されることによ
り生じる過剰過酸化物存在下のペルオキシダーゼ活性の
変化を検知することを特徴とする補体の測定法にも関す
る。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるペルオキシダーゼは、植物・細菌・
動物等に存在し、過酸化物による物質の酸化反応を触媒
する酵素であり、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、
ラクトペルオキシダーゼ、細菌由来ペルオキシダーゼ等
である。ペルオキシダーゼ抗体とは、上記ペルオキシダ
ーゼを動物に免疫して得られる抗体であり、例えば抗ペ
ルオキシダーゼウサギ抗体、抗ペルオキシダーゼヤギ抗
体等である。
動物等に存在し、過酸化物による物質の酸化反応を触媒
する酵素であり、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、
ラクトペルオキシダーゼ、細菌由来ペルオキシダーゼ等
である。ペルオキシダーゼ抗体とは、上記ペルオキシダ
ーゼを動物に免疫して得られる抗体であり、例えば抗ペ
ルオキシダーゼウサギ抗体、抗ペルオキシダーゼヤギ抗
体等である。
本発明に用いられる免疫複合体は上記のようなペルオキ
シダーゼと抗ペルオキシダーゼ抗体を反応させて調整す
る。この免疫複合体に含まれるペルオキシダーゼは会合
状態にあるため、過酸化物過剰下においても酵素活性を
発現する。この免疫複合体は、補体を含む試料との反応
によって定量的に可溶化される。ところが、この可溶化
によって遊離してきたペルオキシダーゼは、過酸化物過
剰下で活性が抑制されるのでペルオキシダーゼの活性を
測定することにより補体を定量することができる。
シダーゼと抗ペルオキシダーゼ抗体を反応させて調整す
る。この免疫複合体に含まれるペルオキシダーゼは会合
状態にあるため、過酸化物過剰下においても酵素活性を
発現する。この免疫複合体は、補体を含む試料との反応
によって定量的に可溶化される。ところが、この可溶化
によって遊離してきたペルオキシダーゼは、過酸化物過
剰下で活性が抑制されるのでペルオキシダーゼの活性を
測定することにより補体を定量することができる。
本発明に用いられる過酸化物としては、例えば過酸化水
素、過酸化尿素等である。
素、過酸化尿素等である。
又、ペルオキシダーゼと抗ペルオキシダーゼ抗体を用い
て免疫複合体を形成させる代わりに免疫複合体として、
例えばウシ血清アルブミン（BSA）と抗BSAウサギ抗体の
ような、抗原と抗体の組合せで形成させ、そのどちらか
一方にペルオキシダーゼを標識しておいてもよい。例え
ば、BSAにペルオキシダーゼを標識しておくことによっ
て免疫複合体中にはペルオキシダーゼが会合状態で含ま
れることになる。この免疫複合体と補体を含む試料を反
応させてから、ペルオキシダーゼの活性を測定すること
により、ペルオキシダーゼとその抗体からなる免疫複合
体を用いた場合と同様の原理で補体を定量することがで
きる。
て免疫複合体を形成させる代わりに免疫複合体として、
例えばウシ血清アルブミン（BSA）と抗BSAウサギ抗体の
ような、抗原と抗体の組合せで形成させ、そのどちらか
一方にペルオキシダーゼを標識しておいてもよい。例え
ば、BSAにペルオキシダーゼを標識しておくことによっ
て免疫複合体中にはペルオキシダーゼが会合状態で含ま
れることになる。この免疫複合体と補体を含む試料を反
応させてから、ペルオキシダーゼの活性を測定すること
により、ペルオキシダーゼとその抗体からなる免疫複合
体を用いた場合と同様の原理で補体を定量することがで
きる。
ペルオキシダーゼの活性測定用試薬中には、発色剤とし
てフェノール類を含むがこの発色剤は過剰の過酸化物存
在下での会合状態のペルオキシダーゼを遊離状態でのペ
ルオキシダーゼの活性の違いを、検知するのに好ましい
水素供与体であり、フェノール、パルクロロフェノー
ル、2,4−ジクロロフェノール等がある。
てフェノール類を含むがこの発色剤は過剰の過酸化物存
在下での会合状態のペルオキシダーゼを遊離状態でのペ
ルオキシダーゼの活性の違いを、検知するのに好ましい
水素供与体であり、フェノール、パルクロロフェノー
ル、2,4−ジクロロフェノール等がある。
フェノール類による発色に際しては、通常用いられるフ
ェノール類の酸化縮合剤が用いられ、例えば４−アミノ
アンチピリン等が好適に用いられる。
ェノール類の酸化縮合剤が用いられ、例えば４−アミノ
アンチピリン等が好適に用いられる。
「実施例」 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
１）ａ免疫複合体の調整法 西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製、以下HRPと
記す。）を緩衝液Ａ（0.15mM CaCl2,0.5mM MgCl2,0.15M
NaClを含む20mMトリス塩酸緩衝液pH7.5）で６μg/mlに
調整した。又緩衝液Ａで抗HRPウサギ血清を20倍に希釈
し上記のHRP液と等量混合した。４℃において２日間反
応して免疫複合体を形成させた後、緩衝液Ｂ（10％サッ
カロースと４％フィコール400を含む20mMトリス塩酸緩
衝液pH7.5）と等量混合し、2mlずつ分注して凍結乾燥し
た。この凍結乾燥品を緩衝液A6mlで溶解し、免疫複合体
試薬として用いた。
記す。）を緩衝液Ａ（0.15mM CaCl2,0.5mM MgCl2,0.15M
NaClを含む20mMトリス塩酸緩衝液pH7.5）で６μg/mlに
調整した。又緩衝液Ａで抗HRPウサギ血清を20倍に希釈
し上記のHRP液と等量混合した。４℃において２日間反
応して免疫複合体を形成させた後、緩衝液Ｂ（10％サッ
カロースと４％フィコール400を含む20mMトリス塩酸緩
衝液pH7.5）と等量混合し、2mlずつ分注して凍結乾燥し
た。この凍結乾燥品を緩衝液A6mlで溶解し、免疫複合体
試薬として用いた。
ｂ免疫複合体可溶化能に基づく補体量の標準曲線作成法 プール新鮮血清をセントリコン−10（アミコン社製）で
２倍に濃縮し標準補体用血清とした。これを非働化血清
（56℃、30分間熱処理）で希釈し標準物を調整した。こ
の標準物50μｌにａで調整した免疫複合体試薬200μｌ
を加え37℃において20分間反応した。次に基質溶液（0.
75mM4−アミノアンチピリン、25mMフェノール、40mM過
酸化水素を含む緩衝液Ａ）1mlを加え、37℃において10
分間反応した。更に反応停止液（1.8％ホルムアルデヒ
ドを含む20mMリン酸緩衝液pH7.0）2mlを加えた後、波長
500nmにおける吸光度を測定した。横軸に標準補体用血
清濃度をとり、縦軸に波長500nmにおける吸光度をとっ
て標準曲線を作製した。この結果を第１図に示す。
２倍に濃縮し標準補体用血清とした。これを非働化血清
（56℃、30分間熱処理）で希釈し標準物を調整した。こ
の標準物50μｌにａで調整した免疫複合体試薬200μｌ
を加え37℃において20分間反応した。次に基質溶液（0.
75mM4−アミノアンチピリン、25mMフェノール、40mM過
酸化水素を含む緩衝液Ａ）1mlを加え、37℃において10
分間反応した。更に反応停止液（1.8％ホルムアルデヒ
ドを含む20mMリン酸緩衝液pH7.0）2mlを加えた後、波長
500nmにおける吸光度を測定した。横軸に標準補体用血
清濃度をとり、縦軸に波長500nmにおける吸光度をとっ
て標準曲線を作製した。この結果を第１図に示す。
２）調整検体の本法と50％溶血法との相関 種々の正常ヒト血清をセントリコン−10で濃縮あるいは
非働化血清で希釈して補体価の異なる検体を調整した。
次にこの検体の免疫複合体可溶化能に基づく補体量を実
施例１）ｂと同様の実験操作で測定した。更に各検体の
得られた吸光度に対する補体量標準曲線から読みとり％
表示した。
非働化血清で希釈して補体価の異なる検体を調整した。
次にこの検体の免疫複合体可溶化能に基づく補体量を実
施例１）ｂと同様の実験操作で測定した。更に各検体の
得られた吸光度に対する補体量標準曲線から読みとり％
表示した。
一方、調製した検体の補体価をメイヤーらの方法に従っ
て測定した。得られたCH50と可溶化能に基づく補体量の
関係は、第２図に示すごとく相関係数γ＝0.94とよく相
関することがわかった。
て測定した。得られたCH50と可溶化能に基づく補体量の
関係は、第２図に示すごとく相関係数γ＝0.94とよく相
関することがわかった。
「発明の効果」 実施例に示したごとく、本発明によって免疫複合体可溶
化能に基づく補体量が、短時間に遠心操作の必要なく定
量することが可能となった。又、分離操作の不必要な点
から自動分析機への応用も考えられ、多検体測定も困難
なく行なうことができる。更にCH50との相関も良いの
で、煩雑な検体希釈を必要とし、感作ヒツジ赤血球を使
用していることから試薬としての安定性が悪い従来の補
体価測定に代わり、臨床データの蓄積に伴いその測定の
意義が増すことが期待できる。
化能に基づく補体量が、短時間に遠心操作の必要なく定
量することが可能となった。又、分離操作の不必要な点
から自動分析機への応用も考えられ、多検体測定も困難
なく行なうことができる。更にCH50との相関も良いの
で、煩雑な検体希釈を必要とし、感作ヒツジ赤血球を使
用していることから試薬としての安定性が悪い従来の補
体価測定に代わり、臨床データの蓄積に伴いその測定の
意義が増すことが期待できる。
第１図は、本発明の方法により標準補体用血清の希釈列
を測定した場合に得られる結果で、横軸に標準補体濃度
を％表示し縦軸に波長500nmにおける吸光度を示すグラ
フ図であり、第２図は、本発明の測定法で得られた免疫
複合体可溶化能に基づく補体量と、メイヤー等の方法で
得られたCH50との相関を示すグラフ図である。
を測定した場合に得られる結果で、横軸に標準補体濃度
を％表示し縦軸に波長500nmにおける吸光度を示すグラ
フ図であり、第２図は、本発明の測定法で得られた免疫
複合体可溶化能に基づく補体量と、メイヤー等の方法で
得られたCH50との相関を示すグラフ図である。
Claims (4)
- 【請求項１】ペルオキシダーゼとその抗体からなる免疫
複合体が補体により可溶化されることにより生じる、過
剰過酸化物存在下のペルオキシダーゼ活性の変化を検知
することを特徴とする補体の測定法。 - 【請求項２】ペルオキシダーゼの活性測定用試薬として
過剰の過酸化物、フェノール類及びフェノール類に対す
る酸化縮合剤を用いる特許請求の範囲第１項記載の測定
法。 - 【請求項３】対応する抗原と抗体の組合せのいずれか一
方にペルオキシダーゼを標識し、両者の反応により形成
される免疫複合体が補体により可溶化されることにより
生じる過剰過酸化物存在下のペルオキシダーゼ活性の変
化を検知することを特徴とする補体の測定法。 - 【請求項４】ペルオキシダーゼの活性測定用試薬として
過剰の過酸化物、フェノール類及びフェノール類に対す
る酸化縮合剤を用いる特許請求の範囲第３項記載の測定
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15795186A JPH0677018B2 (ja) | 1986-07-07 | 1986-07-07 | 補体の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15795186A JPH0677018B2 (ja) | 1986-07-07 | 1986-07-07 | 補体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6315162A JPS6315162A (ja) | 1988-01-22 |
| JPH0677018B2 true JPH0677018B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=15661026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15795186A Expired - Lifetime JPH0677018B2 (ja) | 1986-07-07 | 1986-07-07 | 補体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0677018B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3811426B2 (ja) | 2002-05-15 | 2006-08-23 | 株式会社日立製作所 | 永久磁石式回転電機 |
| CN110780082B (zh) * | 2019-11-04 | 2023-05-12 | 上海昆涞实业发展有限公司 | 一种总补体活性质控品，试剂，制备方法及应用 |
-
1986
- 1986-07-07 JP JP15795186A patent/JPH0677018B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6315162A (ja) | 1988-01-22 |
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