JPS63157991A - マクロサイクリツク・ラクタム・ラクトン系抗生物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はミキソコッカス属に属する新規微生物によるマ
クロサイクリック・ラクタム・ラクトン系抗生物質の製
造法に関する。本物質は抗菌活化を有するから医薬、動
物薬に使用できる。

（従来技術） ミキソコッカス・キサンタスを用いるアンチビオチック
ＴＡの製造法（Ｊ　、Ａｎｔｉｂｉｏｔ、、　３５，７
８８．１９８２）。

ミキソコッカス・ビレセンス及びその変異株を用いるミ
ギンビレシンＡ＋ＡＩ　ｒ　Ｂ　Ｔ　Ｃ＋　Ｄ　＊　Ｅ
の製造法（Ｊ、、Ａｎｔｉｂｉｏｔ、、　３５．１４５
４．１９８２　）ミキソコッカス・キサンタスＭ５１６
ＥＲを用いるミキソビレシンＡ並びにＭ−２３ＯＢ　（
ミキンビレシンＢと同一物質と推定されている）製造法
（Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔ、　、　３７，１３．１９８
４　）並びにミキソビレシンＡを化学的に還元してオバ
リシンＡ（本発明者が命名）を製造する方法（Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｅ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　
、　１９８２＋　１３４０．　）が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） 従来知られてｂるマクロサイクリック・ラクタム・ラク
トン群の製造上の間賄点け （１）　　オバリシンＡ：構造式ｆａ）で示めされる物
質でミキソビレシンＡ１を化学的に還元して作られるこ
とが知られているが、実験室規模での化学実験の過程で
の反応であり、その生物活性を測定するにも至らず産業
上本物質を生産利用する点で問題でおった。本発明者ら
によって初めて本物質を作る新規微生物が見いＵ」され
、発酵法による製造法が完成された。

（２）　　ミキソビレシンＡに構造式（ｂ）で示される
物質であるが、ミキソコッカス−ビレセンス及ヒソの変
異株を用いる製造方法は微量の抗生物質を培養液中に生
成せしめそれを回収する方法で、しかも異性体を含むミ
キソビレシンＡとして回収しそこよシＡ、を単離Ｍ製す
る方法でプロセスが煩雑である。しかも本物質Ａ１の生
物活性を測定するにも至っていない。本発明者らは本物
質を培養液中に著量蓄積する新規微生物を見い出し、産
業上本物質を製造する方法を完成した。

（３）　　ミキ、ソビｖシンＢ　（Ｍ−２３０Ｂ　）：
構造式（ｃ）で示される物質であるがミキソコッカス拳
ビレセンス及びその変異株を用いる製造方法、ミキソコ
ッカス、キサンタスを用いる方法が知られているが、生
産１：は微量である。本発明者らは本物質を培養液中に
著量蓄積する微生物を自然界よシ分離することに成功し
本発明を完成した。

（問題点を解決するための手段） 本発明の目的は自然界よシ発明者らが分離した新規微生
物ミキソコッカス拳フラベセンスＡＪ　１２２９８を用
いて行ない、培養液中に効率的にマクロサイクリック・
ラクタム・ラクトン系抗生物質を蓄積し、これを回収し
て新しい抗菌剤を提供するためのマクロサイクリック管
ラクタム・ラクトン系抗生物質の製造方法を完成するこ
とにある。

本発明を概説すれば本発明は新規微生物ミキソコッカス
争フラベセンスＡＪ１２２９８を用いるマクロサイクリ
ック骨うクタム会うクトン系抗生物質の製造法に関する
発明であって、本微生物は以下に記す性質を有する。

本菌は天然界の土壌を採取しフルーティングボディーを
作る条件下で培養してフルーティングボディーを作らせ
た。フルーティングボディ〜はストークを持たｉいもの
であった。このフルーティングボディーよ）糖類、カシ
トン等を含む培地上でコロニーを作る菌を分離してコロ
ニー分離法によシ純化した。

この菌は上記培地上でもフルーティングボディ一様の形
態を示した。このことがら本菌はＭｙｘｏｂ＆ｃｔｅｒ
ｉａｌｅｓのものと判定される。

本菌の栄養細胞はダラム染色法では陰性の桿状の菌で培
養後期になるとミクロシストを形成した栄養細胞の大き
さは幅０．５〜０．９μ、長さ５〜１０μであシ、ミク
ロシストの大きさは２．５μ×２．５μのほぼ球形でお
った。本コロニーの色は淡黄色でフルーティングがディ
一様のものの色は濃いオレンジ色であった。本菌は外大
培地中外らびに液体培地中に淡黄色の菌体外色素を生成
した。

生化学的性質としては本菌はセルロースの分解作用を示
した。

以上の形態的、生化学的知見から本菌はミキソコッカス
属のものと考えられる。（Ｂｓｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａ
ｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ第８版及び５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈａ
　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｏｆ　ｔｈａＭｙｘｏｂａｅｔｅ
ｒｉａｌｅｉ、Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆＭｉｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ　（１５巻１４５３頁〜、
１９６９年）に準拠。） 種としてはミクソコツカス・グイレッセンスＴｈａｘｔ
ｅｒ　１８９２　ｙ又ミクンコツカス会キサンタスＢａ
ｅｋｅ１９４１．に類似点を持つが本分離菌が菌体外色
素を産生ずることからミクソコツカス・キサンタスは除
去される。又本菌は淡黄色の菌体外色素を産生ずるがミ
ジンコツカス＋１グイレツセンスは緑色の色素を産生ず
る。

以上の特徴を考えると本菌はミクソコツカス・グイレッ
センスのものではなくて新規な微生物と判断される。

本菌を以上の知見を総合してミキソコッカス・フラベセ
ンスＦＥＲＭ　Ｐ−８９２６（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓｆ
ｌａｖｅａｃｅｎｇ　ｎｏｖ　ｓｐ、）と命名した。

マクロサイクリック・ラクタム・ラクトン系抗生物質を
製造する方法は本発明の新規ミキソコッカス・フラベセ
ンスＡＪ１２２９８（ＦＥＲＭ　Ｐ−８９２６）等のマ
クロサイクリック・ラクタム中ラクトン系抗生物質を生
産する能力を有する微生物を培養し生成蓄積されたマク
ロサイクリック・ラクタム・ラクトン系抗生物質を培養
液及び菌体よシ採取すれば良い。

これら微生物を用いてマクロサイクリック・ラクタム・
ラクトン系抗生物質を、培養液中に生成蓄積せしめるに
は炭素源、窒素源、無キイオン等を含有する通常の培地
を用い、常法によシ培養すれば良い。炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース。

マルトース、ラフィノース、ラムノース、グリセロール
、キシロース、ラクトース、シュークロース。

スターチ等の糖類エタノール、ソルビトール等のアルコ
ール、酢酸等の有機酸が使用できる。窒素源としてはア
ンモニウムイオンのほか、アミノ酸。

蛋白質、及びこれらを含有する酵母エキス、カゼイン加
水分解物等が使用できる。培地には必要によシカリイオ
ン、リン酸イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイ
オン、銅イオン、亜鉛イオン。

マンガンイオン、鉄イオン等の無機イオンを添加する。

培養は好気的条件下で行うのが良（ｐＨ４から９の範囲
の適当なｐＨに調節しつつ培養すればよシ好ましい結果
が得られる。培養温度は２５℃から３８℃の範囲が好ま
しい。

マクロサイクリック−ラクタム中ラクトン系抗生物質を
単離精製する方法は培養液よシ水に混和しないブタノー
ル、酢酸エチル等の有機溶媒による溶媒抽出法、培養液
よシ遠心分離によシ回収した菌体よジメタツール、エタ
ノール、アセトン等の有機溶媒による抽出法、シリカゲ
ル、ダイヤイオンＨＰ−２０等の吸着クロマトグラフィ
ー、トヨパールＨＷ−４０クロマトグラフィー、マイク
ロポンダパックＣ１８，リクロソルブＲＰ　−８等の逆
相分配クロマトグラフィー等の通常の抗生物質の分離、
精製に使用できる方法が部用できる。

かくして得られたマクロライクリック・ラクタム・ラク
トン系抗生物質は８０チアセトニトリルを展開溶媒とし
てワットマンＫＣｌ８Ｆ逆相分配薄層クロマトグラフィ
ーを行うとＲｆ値０．５６（オバリシンＡ　）　、　０
．５２（ミキンビレシンＡ、）　、　０．５４　（ミキ
ソビレシンＢ）にそれぞれ単−紫外部吸収を有するスポ
ットを与える。

実施例１ マクロサイクリック・ラクタム−ラクトン系抗生物質の
製造例 第１表に示した培地Ａの２００１１を５００ｍ１容肩付
フラスコに入れ殺菌した。ミキソコッカスフラベセンス
ＡＪ　１２２９８を接種し２７℃で５日間培養し、−火
種母液を得た。一方、第１表の培地０．９１を５１容フ
ラスコに入れ殺菌した。これに−火種母液０．１１を接
種し２７℃で５日間培養し二次種母液を得た。次いで第
３表に示した培地の１０１を５０１．容発酵槽に入れ殺
菌した。これに二次種母液１１を接種し２７℃で４８時
間培養し、三次種母液を得た。

第１表 培地Ａ ０．１チ　　　ラフィノース ０．１チ　　　シュークロース ０．１％　　ガラクトース ０．５係　　可溶性澱粉 ０．２５％　　　カシトン（ディフコ社製品カゼイン分
解物）０．１％　　酵母エキス ０．０５チ　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ０，０２５チ　Ｋ２ＨＰＯ４ ｐＨ７，４ 第１表に示した培地Ａ１００１を３００１容発酵槽に入
れ殺菌した。これに三次種母液１０１を接種し、２７℃
、４８時間培養し第四次種母液を得た。次いで培地Ａ　
１　ｋｌを１　ｋＪ容発酵槽に入れ殺菌した。これに四
次種母液１００１を加え２７℃で４８時間培養した。得
られた培養液を遠心分離して２．６　ｋｌ？の菌体を得
た。

得られた菌体のうち２．０　ｋｇに対し、メタノール２
１１を加え攪拌しながら室温で２時間抽出した。

吸引濾過によシ、抽出液と菌体を分離した後菌体にメタ
ノール１６１を加え再び室温で１時間抽出し濾過した得
られたメタノール抽出液を合わせ、これに水１５１を加
えた後、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（カラム体積５
Ａ’）に通し吸着させた。カラムを６７チメタノールＩ
ｏｌ、８０％メタノール１５７で順次洗浄した後、１０
（ｌメタノールで溶出した。メタノール溶出液を１００
−に減圧濃縮した抜水を１！加えジクロロメタン４１で
２回、酢酸エチル２１で２回溶媒抽出した。有機溶媒層
をすべて合せ、約１）に減圧濃縮し、不溶物を遠心分離
にて除去した後無水硫酸ナトリウムによシ乾燥した。こ
れを減圧濃縮乾固後ジクロロメタン：メタノール（１５
：１）を展開溶媒としてシリカダルカラムクロマトグラ
フィー（カラム体積１１）を行った。活性画分を減圧濃
縮乾固後ローパーカラムリクロプレッゾ８１６０　（サ
イズＣ）によるカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；
ジクロロメタン：メタノール（３０：１））を行った。

活性画分を減圧濃縮乾固後逆相シリカゲルＬＲＰ−１を
用いた逆相分配カラムクロマトグラフィー（カラム体積
ｉＩ１．展開溶媒；アセトニトリル・水系）を行った。

展開溶媒中のアセトニトリル濃度を５５％、６０％、で
溶出したところ６０％アセトニトリル区分に、オバリシ
ンＡ、ミキソビレシンＢ、ミキンビレシンＡ、の順に各
々紫外部吸収（２４０ｎｍ）を有する鋭いピークとして
溶出した。

これらの画分を各々トヨパールＨＷ−４０Ｓカラム（カ
ラム体積５０１ｎｌ）によるダル濾過クロマトグラフィ
ー（展開溶媒８０チメタノール）に付した後減圧濃縮乾
固して９．６■のオバリシンＡ、４０■のミキソビレシ
ンＡ１，１４．２１ｎ９のミキソビレシンＢが単離され
た。

これらマクロサイクリック争ラクタム・ラクトンは８０
１アセトニトリルを展開溶媒としてワットマンＫＣｌ８
Ｆ逆相分配薄層クロマトグラフィーを行うとＲｆ値各々
０．５６オバリシンＡ、０．５２ミキソビレシンＡ、、
０．５４ミキソビレシンＢＫ単一（７）紫外部吸収を有
するスポットを与えた。

また、ＦＡＢＭＳ法による分子量の測定、’Ｈ−ＮＭＲ
。

１３Ｃ−ＮＭＲ、紫外部吸収スペクトルから本物質がそ
れぞれオバリシンＡ、ミキソビレシンＡ１．ミキソビレ
シンＢと同定された。又本物質は強い抗菌活性を有して
いた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 マクロサイクリック・ラクタム・ラクトン系抗生物質で
   ある構造式（ａ）で示されるオバリシンＡ、構造式（ｂ
   ）で示されるミキソビレシンＡ＿１又は構造式（ｃ）で
   示されるミキソビレシンＢを生産する能力を有するミキ
   ソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）に属する新規微
   生物を培地中で培養し、培養液中にオバリシンＡ、ミキ
   ソビレシンＡ＿１又はミキソビレシンＢを生成・蓄積せ
   しめ、これらの物質を採取することを特徴とするマクロ
   サイクリック・ラクタム・ラクトン系抗生物質の製造法
   。 ▲数式、化学式、表等があります▼構造式（ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼構造式（ｂ） ▲数式、化学式、表等があります▼構造式（ｃ）