JPS63160577A - 害虫耐性のトマト植物体 - Google Patents
害虫耐性のトマト植物体Info
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- JPS63160577A JPS63160577A JP62293047A JP29304787A JPS63160577A JP S63160577 A JPS63160577 A JP S63160577A JP 62293047 A JP62293047 A JP 62293047A JP 29304787 A JP29304787 A JP 29304787A JP S63160577 A JPS63160577 A JP S63160577A
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- protein encoded
- plant
- promoter
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
バチルス・チユーリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈ
ｕｒｉｎＱｉＯｎｓｉｓ）は広範囲の鱗翅目の幼虫に毒
性４【パラ胞子結晶性蛋白質を生成できることで知られ
る胞子形成上ｌｎ ＩＩＩ菌である。その結晶は胞子形
成培養物の乾燥ｆＩ！量のおよそ２０−３０％に及び、
胞子形成時のみに生成される主として一つの高分子蛋白
質（〜１３４キロダルトン（ＫＯ＞）より成る。結晶蛋
白はバクデリア中でプロトキシンとして生成され、感受
性幼虫の腸内で活性化されて分子量がおよそ６７ＫＤの
毒素蛋白となる。
ｕｒｉｎＱｉＯｎｓｉｓ）は広範囲の鱗翅目の幼虫に毒
性４【パラ胞子結晶性蛋白質を生成できることで知られ
る胞子形成上ｌｎ ＩＩＩ菌である。その結晶は胞子形
成培養物の乾燥ｆＩ！量のおよそ２０−３０％に及び、
胞子形成時のみに生成される主として一つの高分子蛋白
質（〜１３４キロダルトン（ＫＯ＞）より成る。結晶蛋
白はバクデリア中でプロトキシンとして生成され、感受
性幼虫の腸内で活性化されて分子量がおよそ６７ＫＤの
毒素蛋白となる。
鱗翅目型のバチルス・チユーリンゲンシス細菌の蛋白ｊ
５素の作用に感受性な昆虫は、トマ１〜さ′よう虫（に
ｅｉｆｃｒｉａ １ｙｃｏｐｃｒｓｉｃｅｌｌａ ）
、クバ］すずめが幼虫（Ｈａｎｄｕｃａ ５ｅｘｔａ
） 、トマト寸ずめが幼虫（Ｈａｎｄｕｃａ ｑｕｉｎ
＋＋ｕｅｉａｃｕｌａｔａ ）砂糖大根あわよとう幼虫
（ｓｐｏａｏｔｅｒａ ｅＸｉＱＩＩａ） 、キＡ７ベ
ツ尺とり虫（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ）およ
びトマト果実虫（Ｉｌｃｌｉｏｔｈｉｓ ｚｃａ Ｊ３
よびｌ１ｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｃｓｃｅｎｓ ）な
どがあるが、これらに限定されないバチルス・チユーリ
ンゲンシスの胞子またはこれにより生産される結晶性蛋
白を含有する殺虫性調合剤はＤ Ｉ Ｐ Ｅ Ｌ■Ｊ３
よびＴ Ｉ−Ｉ Ｕ ＲＩ ＣＩ Ｄ Ｅ■などの商品
名で市販されている。
５素の作用に感受性な昆虫は、トマ１〜さ′よう虫（に
ｅｉｆｃｒｉａ １ｙｃｏｐｃｒｓｉｃｅｌｌａ ）
、クバ］すずめが幼虫（Ｈａｎｄｕｃａ ５ｅｘｔａ
） 、トマト寸ずめが幼虫（Ｈａｎｄｕｃａ ｑｕｉｎ
＋＋ｕｅｉａｃｕｌａｔａ ）砂糖大根あわよとう幼虫
（ｓｐｏａｏｔｅｒａ ｅＸｉＱＩＩａ） 、キＡ７ベ
ツ尺とり虫（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ）およ
びトマト果実虫（Ｉｌｃｌｉｏｔｈｉｓ ｚｃａ Ｊ３
よびｌ１ｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｃｓｃｅｎｓ ）な
どがあるが、これらに限定されないバチルス・チユーリ
ンゲンシスの胞子またはこれにより生産される結晶性蛋
白を含有する殺虫性調合剤はＤ Ｉ Ｐ Ｅ Ｌ■Ｊ３
よびＴ Ｉ−Ｉ Ｕ ＲＩ ＣＩ Ｄ Ｅ■などの商品
名で市販されている。
バチルス・チユーリンゲンシスの結晶性蛋白ＦｎｆＡの
市販調合剤を使用づる際の問題魚は殺虫調合剤をくり返
して使用する必要があることである。他の欠点はこの結
晶蛋白質がバチルス・チユーリンゲンシスの生育サイク
ルで胞子形成の段階でのみ生産されることである。この
ような生育段階の制限は、特に工業生産工程で製造に余
分な時間を必要とするために不便である。胞子形成が完
了うＪると細胞は自己消化して胞子Ｊ３よび結晶を培地
中に放出Ｊる。環境問題の叩出から市販殺虫調合剤は胞
子を含有しないことが望ましい。残念なから、胞子およ
び結晶蛋白毒素が大きさおよび比重が類似しているため
に結晶から胞子を分離するのは繁雑で１問がかかり、従
って高くつく。さらに、生育段階の制限或いは他の要因
から結晶を生産する能力を失なったバチルス・チユーリ
ンゲンシスが出現し、そのような菌株は殺虫活性を持た
ない。
市販調合剤を使用づる際の問題魚は殺虫調合剤をくり返
して使用する必要があることである。他の欠点はこの結
晶蛋白質がバチルス・チユーリンゲンシスの生育サイク
ルで胞子形成の段階でのみ生産されることである。この
ような生育段階の制限は、特に工業生産工程で製造に余
分な時間を必要とするために不便である。胞子形成が完
了うＪると細胞は自己消化して胞子Ｊ３よび結晶を培地
中に放出Ｊる。環境問題の叩出から市販殺虫調合剤は胞
子を含有しないことが望ましい。残念なから、胞子およ
び結晶蛋白毒素が大きさおよび比重が類似しているため
に結晶から胞子を分離するのは繁雑で１問がかかり、従
って高くつく。さらに、生育段階の制限或いは他の要因
から結晶を生産する能力を失なったバチルス・チユーリ
ンゲンシスが出現し、そのような菌株は殺虫活性を持た
ない。
結晶蛋白毒素をコードするＤＮＡのバチルス・チユーリ
ンゲンシスからの単離およびこのＤＮＡをバクテリア菌
株の形質転換のため発現ベクターに挿入づることは知ら
れているが、このＤＮＡをトマト稙物の遺伝子内に挿入
し、毒素が感受性鱗翅目幼虫に対して殺虫活性を示Ｊと
いう事は今まで成Ｖノの報告はない。
ンゲンシスからの単離およびこのＤＮＡをバクテリア菌
株の形質転換のため発現ベクターに挿入づることは知ら
れているが、このＤＮＡをトマト稙物の遺伝子内に挿入
し、毒素が感受性鱗翅目幼虫に対して殺虫活性を示Ｊと
いう事は今まで成Ｖノの報告はない。
発明の説明
木兄１！１１はトマト植物体を感受性のｌｌｌ翅ｎ幼虫
に重性に形質転換する方法を提供づる。さらに具体的に
は、本発明はバチルス・チユーリンゲンシスの＋ｉｉ
ｍ蛋白を殺虫レベルで発現１Ｊるトランスジェニックな
トマｌ−ｈ？ｉ物体を提供する。
に重性に形質転換する方法を提供づる。さらに具体的に
は、本発明はバチルス・チユーリンゲンシスの＋ｉｉ
ｍ蛋白を殺虫レベルで発現１Ｊるトランスジェニックな
トマｌ−ｈ？ｉ物体を提供する。
一つの態様として、本発明は１−７１・植物体で機能し
、感受性のｉＩ！！ｌ翅目幼虫に対して１５１ ｔ／Ｉ
を示づトラスジェニックな１−マド稙物体を生成するギ
メラ遺伝子より成る。二重鎖ＤＮＡとして存在Ｊる植物
遺伝子の発現はＩ） Ｎへの一木の鎖からのＲＮΔポリ
メラーゼににる伝ｕＲＮＡ （ｒｒ＋ＲＮ△）の転写お
よび核内でのｍＲＮ八−次転写物のブ［１セシングを伴
なう。このプロセシングは３′の非翻訳領域にし関与し
、ｒｒ＋ＲＮ△の３′末端にポリアデニル酸メクレオヂ
ドを１４加づ゛る。
、感受性のｉＩ！！ｌ翅目幼虫に対して１５１ ｔ／Ｉ
を示づトラスジェニックな１−マド稙物体を生成するギ
メラ遺伝子より成る。二重鎖ＤＮＡとして存在Ｊる植物
遺伝子の発現はＩ） Ｎへの一木の鎖からのＲＮΔポリ
メラーゼににる伝ｕＲＮＡ （ｒｒ＋ＲＮ△）の転写お
よび核内でのｍＲＮ八−次転写物のブ［１セシングを伴
なう。このプロセシングは３′の非翻訳領域にし関与し
、ｒｒ＋ＲＮ△の３′末端にポリアデニル酸メクレオヂ
ドを１４加づ゛る。
１） Ｎ△のｍ［でＮ△への転写は「プロモーター」と
呼ぶＤＮＡ領域により支配されている。プロモーター領
１或はＲＮ△ボリメラーぜがＤＮＡと結合し、プロモー
ターの下流のＤＮＡ鎖を１８型として用いて対応するＲ
ＮＡ鎖を作るｍＲＮＡ転写物の生産の開始を合図りるヌ
クレオチド配列を含む。
呼ぶＤＮＡ領域により支配されている。プロモーター領
１或はＲＮ△ボリメラーぜがＤＮＡと結合し、プロモー
ターの下流のＤＮＡ鎖を１８型として用いて対応するＲ
ＮＡ鎖を作るｍＲＮＡ転写物の生産の開始を合図りるヌ
クレオチド配列を含む。
植物細胞中′Ｃ−活性のある多くのプロモーターが文献
に記載さｒしている。その中にはツバリン合成Ｖｔ木（
ＮＯ８） 、オクトビン合成酵素（ＯＣ８）ｊ′３よび
マノビン合成酵素（ＭＡＳ）のプロモーター（アグロバ
クテリウム・ブユメファシエンスのｎ・ｐ を烏誘導グ
ラスミド上にのっている）、カリフラワー［ザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓブ１］シータ−１
およびリブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼ
の小サブユニット（ｓ ｓ Ｒｔ）１３１ Ｓ ＣＯ１
多ωに存在する植物ポリベブヂド）の光誘導プロモータ
ーなどがある。これらのタイプのプロモーターは植物中
で発現されている各種ＤＮＡ構築物を創成１−るのに使
用されてきた： ＰＣＴ発行ＷＯ８４１０２９１３（Ｒ
ｏｇｅｒｓら、ＨＯｎＳａｎｔＯ）参照。
に記載さｒしている。その中にはツバリン合成Ｖｔ木（
ＮＯ８） 、オクトビン合成酵素（ＯＣ８）ｊ′３よび
マノビン合成酵素（ＭＡＳ）のプロモーター（アグロバ
クテリウム・ブユメファシエンスのｎ・ｐ を烏誘導グ
ラスミド上にのっている）、カリフラワー［ザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓブ１］シータ−１
およびリブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼ
の小サブユニット（ｓ ｓ Ｒｔ）１３１ Ｓ ＣＯ１
多ωに存在する植物ポリベブヂド）の光誘導プロモータ
ーなどがある。これらのタイプのプロモーターは植物中
で発現されている各種ＤＮＡ構築物を創成１−るのに使
用されてきた： ＰＣＴ発行ＷＯ８４１０２９１３（Ｒ
ｏｇｅｒｓら、ＨＯｎＳａｎｔＯ）参照。
植物細胞内でｍＲＮＡ転写物を生産Ｊることか知られて
いる或いは確認されるプロモーターは本発明で使用でき
る。選択するプロモーターは鱗翅目幼虫に７Ｊｆ性を示
す有効な毒素蛋白を生産づるのに十分な発現を誘導でき
なければならない。目的のｉＨ性を誘発するのに必要な
毒ｆＡ蛋白の倒は防除しようとする鱗翅目幼虫により異
なることは′ｔＡ練名には認知するところである。従っ
て、ＣａＭＶ３５３およびＭＡＳプロモーターが々了ま
しいのであるが、これらのプロ〔−ターが本発明の全て
の実施態様で最適でないかも知れないことは理解ずべき
である。
いる或いは確認されるプロモーターは本発明で使用でき
る。選択するプロモーターは鱗翅目幼虫に７Ｊｆ性を示
す有効な毒素蛋白を生産づるのに十分な発現を誘導でき
なければならない。目的のｉＨ性を誘発するのに必要な
毒ｆＡ蛋白の倒は防除しようとする鱗翅目幼虫により異
なることは′ｔＡ練名には認知するところである。従っ
て、ＣａＭＶ３５３およびＭＡＳプロモーターが々了ま
しいのであるが、これらのプロ〔−ターが本発明の全て
の実施態様で最適でないかも知れないことは理解ずべき
である。
キメラ遺伝子により生産されるｍ ＲＮ△はまた５′の
非翻訳リーダー配列を含有する。この配’／１１は例え
ばＣａＭＶ３５ＳまたはＭΔＳプロ［−ターなどのＴｉ
に選ばれたプロモーターに由来することができる。５′
の非翻訳領域はまた他の適当な貞核細胞遺伝子或いは合
成遺伝子配列から１すられる。熟練者は知るように、５
′の非翻訳リーダー配列の必須機能はコードづるボリペ
ブヂドの生産に於いてｍＲＮＡの翻訳を高めるためｍＲ
ＮＡ転写物を植物細胞のりボゾームへの結合を高めるこ
とである。
非翻訳リーダー配列を含有する。この配’／１１は例え
ばＣａＭＶ３５ＳまたはＭΔＳプロ［−ターなどのＴｉ
に選ばれたプロモーターに由来することができる。５′
の非翻訳領域はまた他の適当な貞核細胞遺伝子或いは合
成遺伝子配列から１すられる。熟練者は知るように、５
′の非翻訳リーダー配列の必須機能はコードづるボリペ
ブヂドの生産に於いてｍＲＮＡの翻訳を高めるためｍＲ
ＮＡ転写物を植物細胞のりボゾームへの結合を高めるこ
とである。
キメラ遺伝子はまたバチルス・チユーリンゲンシスの毒
素蛋白またはその殺虫活性断片をコードする構造コード
配列を含有する。鱗翅目タイプのバチルス・チユーリン
ゲンシス細菌は典型的には１−１ ｉ ｎ ｄ ｍによ
る制限断片により分類されている三種の毒素遺伝子を含
有している；にｒｏｎｓｔａｄら（１９８３年）参照。
素蛋白またはその殺虫活性断片をコードする構造コード
配列を含有する。鱗翅目タイプのバチルス・チユーリン
ゲンシス細菌は典型的には１−１ ｉ ｎ ｄ ｍによ
る制限断片により分類されている三種の毒素遺伝子を含
有している；にｒｏｎｓｔａｄら（１９８３年）参照。
これらの遺伝子はｔ９られるＨｉｎｄＩ［［断片の大き
さに基づき、通常４．５．５．３および６．６３１！！
仏子と呼ばれる。さらに完全ｌｌＩｒ素の断片も鱗翅目
幼虫に対して殺虫活性であることがわかっている。そこ
で本発明の目的にはこれら三種の遺伝子のいずれからで
も殺虫活性毒素をコードする配列を１！７ることが出来
、さらにそれらの殺虫活性断片を不必要な実験をするこ
となく得られる。従って本発明の目的では「毒素蛋白」
はバチルス・チユーリンゲンシスにより天然に生産され
る全長毒素或いは前述の１１１１目幼虫に対して殺虫活
性を有する断片（「断片毒素」）を意味りる。断片毒素
をコードする配列の方がより容易に発現され、従って好
ましいことがわかった。さらに、毒素活性には必要でな
い余分なりＮＡの植物遺伝子内への取り込みも低下する
。
さに基づき、通常４．５．５．３および６．６３１！！
仏子と呼ばれる。さらに完全ｌｌＩｒ素の断片も鱗翅目
幼虫に対して殺虫活性であることがわかっている。そこ
で本発明の目的にはこれら三種の遺伝子のいずれからで
も殺虫活性毒素をコードする配列を１！７ることが出来
、さらにそれらの殺虫活性断片を不必要な実験をするこ
となく得られる。従って本発明の目的では「毒素蛋白」
はバチルス・チユーリンゲンシスにより天然に生産され
る全長毒素或いは前述の１１１１目幼虫に対して殺虫活
性を有する断片（「断片毒素」）を意味りる。断片毒素
をコードする配列の方がより容易に発現され、従って好
ましいことがわかった。さらに、毒素活性には必要でな
い余分なりＮＡの植物遺伝子内への取り込みも低下する
。
技術熟練者は知るにうに、具体的実施態様で有用なプロ
モーターは勿論ｍ Ｒ’ Ｎへ転写物の安定性に依存す
る。事実、上述のとＪ３り断片毒素を：１−ドする配列
はより容易に発現されるより安定なｒｒｌＮＡ転写物を
生成するよ・）で好ましい。従って、全長毒素をコード
する配列では有効でない、またはあまり効果のないプロ
ビータ−も断片ｊ■索をコードする配列では右効情のＪ
ｌ累蛋白を生産するのに使用できることも多い。
モーターは勿論ｍ Ｒ’ Ｎへ転写物の安定性に依存す
る。事実、上述のとＪ３り断片毒素を：１−ドする配列
はより容易に発現されるより安定なｒｒｌＮＡ転写物を
生成するよ・）で好ましい。従って、全長毒素をコード
する配列では有効でない、またはあまり効果のないプロ
ビータ−も断片ｊ■索をコードする配列では右効情のＪ
ｌ累蛋白を生産するのに使用できることも多い。
明析かつ簡潔な説明のために以下の例示ではバチルス・
ヂューリンゲンシス亜種りルスタキー分離株１」Ｄ −
１からの「５．３型」毒素遺伝子に出来する構造コード
配列を用いたキメラ遺伝子構築物を記載する。本技術の
熟練者はバチルス・チユーリンゲンシスの他の亜種菌株
ら上述の鱗翅目昆虫に対して毒性を示すことを認識して
いる。そのような亜種としては、Ｂ、ｔ、ｋｕｒｓｔａ
ｋｉ １−ｌＤ−ＩＤｉｐｃｌ （ＰＣＴ公間Ｗ０
８６１０１５３６）、Ｂ、ｔ、５ｏｔｔｏ、 Ｂ、ｔ
、ｂｅｒｌｉｎｅｒ、 Ｂ、ｔ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ。
ヂューリンゲンシス亜種りルスタキー分離株１」Ｄ −
１からの「５．３型」毒素遺伝子に出来する構造コード
配列を用いたキメラ遺伝子構築物を記載する。本技術の
熟練者はバチルス・チユーリンゲンシスの他の亜種菌株
ら上述の鱗翅目昆虫に対して毒性を示すことを認識して
いる。そのような亜種としては、Ｂ、ｔ、ｋｕｒｓｔａ
ｋｉ １−ｌＤ−ＩＤｉｐｃｌ （ＰＣＴ公間Ｗ０
８６１０１５３６）、Ｂ、ｔ、５ｏｔｔｏ、 Ｂ、ｔ
、ｂｅｒｌｉｎｅｒ、 Ｂ、ｔ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ。
Ｂ、ｔ、ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ、 Ｂ、ｔ、ｄｅｎｄｒｏ
ｌｉｎ＋ｕｓ、 Ｂ、ｔ、ａｌｅｓｔｉ。
ｌｉｎ＋ｕｓ、 Ｂ、ｔ、ａｌｅｓｔｉ。
Ｂ、ｔ、ｇａｌｌＱｒｉａｅ、 Ｂ、ｔ、ａｉｚａｗａ
ｉ、およびＢ、 ｔ。
ｉ、およびＢ、 ｔ。
３ｊｌｂｔＯＸｉＣＩＪＳがある。上述の８２℃、亜種
またはその他の菌株からの毒素蛋白をコードする配列を
容易に単離し、或いは合成し、本明細書に記ａ Ｊ“る
ように感受性＆！ｌ翅［１幼虫に毒性となるようにトマ
ト植物体を形質転換することが出来る。従って、そのよ
うな変法も本発明の範囲に含まれるものである。
またはその他の菌株からの毒素蛋白をコードする配列を
容易に単離し、或いは合成し、本明細書に記ａ Ｊ“る
ように感受性＆！ｌ翅［１幼虫に毒性となるようにトマ
ト植物体を形質転換することが出来る。従って、そのよ
うな変法も本発明の範囲に含まれるものである。
さらに、発現レベルは使用する個々の毒素コード配列に
より異なり、また鱗翅目幼虫に対する毒性範囲ら毒素コ
ード配列の由来（叩ち、異なるＢ、ｔ、亜種）により変
化することは理解されるべきである。
より異なり、また鱗翅目幼虫に対する毒性範囲ら毒素コ
ード配列の由来（叩ち、異なるＢ、ｔ、亜種）により変
化することは理解されるべきである。
バチルス・チユーリンゲンシスの毒素蛋白をコードする
ＤＮＡ配列の単離は本技術でよく知られている。上記Ｂ
、ｔ、亜種からのコード配列は特にそのＮ−末端ｆｒｉ
域で大変類似している。この相同性はｄ工素蛋白コード
配列の単離に有効であり、本明細７月に記載するＢ、ｔ
、亜種ｋｕｒｓｔａｋｉ ｌｌ Ｄ −１での［’）
ＮＡ甲離に有用なりＮＡプローブが他の亜種からの毒素
コード配列単離にも有効となる。バチルス・ヂューリン
ゲンシス亜種りルスタギｌ−Ｉ Ｄ −１より単離され
た結晶蛋白毒素遺伝子のアミノ酸配列ｉｊ １ｌｕｎｋ
ａｐｉ ｌ Ｉｅｒら（１９８３年）の方法により部分
決定された。これらの配列はＭｏｎｏら（１９８３年）
により開示された結晶蛋白遺伝子のアミノ末端のＤＮＡ
配列により確認された。結品缶白ポリベブヂドから決定
したアミノ酸配列に基づいた合成オリゴヌクレオブト配
列をＢＯａＬＩＣａＯ（！ら（１９８１年）の方法に従
って調装した。作製したオリゴヌクレＡグドブローブを
次の第１表に示づ。
ＤＮＡ配列の単離は本技術でよく知られている。上記Ｂ
、ｔ、亜種からのコード配列は特にそのＮ−末端ｆｒｉ
域で大変類似している。この相同性はｄ工素蛋白コード
配列の単離に有効であり、本明細７月に記載するＢ、ｔ
、亜種ｋｕｒｓｔａｋｉ ｌｌ Ｄ −１での［’）
ＮＡ甲離に有用なりＮＡプローブが他の亜種からの毒素
コード配列単離にも有効となる。バチルス・ヂューリン
ゲンシス亜種りルスタギｌ−Ｉ Ｄ −１より単離され
た結晶蛋白毒素遺伝子のアミノ酸配列ｉｊ １ｌｕｎｋ
ａｐｉ ｌ Ｉｅｒら（１９８３年）の方法により部分
決定された。これらの配列はＭｏｎｏら（１９８３年）
により開示された結晶蛋白遺伝子のアミノ末端のＤＮＡ
配列により確認された。結品缶白ポリベブヂドから決定
したアミノ酸配列に基づいた合成オリゴヌクレオブト配
列をＢＯａＬＩＣａＯ（！ら（１９８１年）の方法に従
って調装した。作製したオリゴヌクレＡグドブローブを
次の第１表に示づ。
第１表
１４マー ＴＧＧ ＧＧＡ ＣＣＧ Ｇ＾Ｔ ＴＣ１２
００ｂＤ領域１４マー ＧＡ八 ＡＧ八 へ■へ Ｇ
へへ 八ＣＩ２７−３１ア ミ ノ酸領域 バヂルス・ヂューリンゲンシス亜種りルスタキ１−Ｉ
Ｄ −１から１〜２リツトルの培養物を用いてＫｒｏｎ
Ｓｔａｄら＜１９８３年）の方法によりプラスミドＤＮ
Ａを精製した。全てのプラスミド調製物は少なくとも一
回、塩化セシウム／臭化エチジウムグラジェントで分離
した。大きさが３０メガダルトンおよびそれ以上のプラ
スミドを特に単離した。
００ｂＤ領域１４マー ＧＡ八 ＡＧ八 へ■へ Ｇ
へへ 八ＣＩ２７−３１ア ミ ノ酸領域 バヂルス・ヂューリンゲンシス亜種りルスタキ１−Ｉ
Ｄ −１から１〜２リツトルの培養物を用いてＫｒｏｎ
Ｓｔａｄら＜１９８３年）の方法によりプラスミドＤＮ
Ａを精製した。全てのプラスミド調製物は少なくとも一
回、塩化セシウム／臭化エチジウムグラジェントで分離
した。大きさが３０メガダルトンおよびそれ以上のプラ
スミドを特に単離した。
制限酵素ＥＣ０ＲＩ、ＰＳｔＩ、ＨｉｎｄＩ［［、［３
ａ ｍ ）−Ｉ ＩおよびＳｍａＩによる消化は販売元
（ベーリンガー・マンハイム）により推奨される条件で
行なった。形質転換ステップの受容菌としては［５ｃｈ
ｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０１株（Ｈｃ
ｓｓｉｎ（］ら１９８１年および５Ｒ−２００株を使用
した。
ａ ｍ ）−Ｉ ＩおよびＳｍａＩによる消化は販売元
（ベーリンガー・マンハイム）により推奨される条件で
行なった。形質転換ステップの受容菌としては［５ｃｈ
ｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０１株（Ｈｃ
ｓｓｉｎ（］ら１９８１年および５Ｒ−２００株を使用
した。
］ンビーテント細胞は標準法＜ Ｄａ（ＪＯｒｔら９７
９年）に従って調製した。プラスミドｐＵＣ８で形質転
換したコロニーはアンピシリン１００μ！？／ｄおよび
４％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｑａｊ！ ）４０μｆ含
右のＬ−寒天上にプレートした。
９年）に従って調製した。プラスミドｐＵＣ８で形質転
換したコロニーはアンピシリン１００μ！？／ｄおよび
４％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｑａｊ！ ）４０μｆ含
右のＬ−寒天上にプレートした。
５ｏｕｔｈｅｒｎ （１９７５年）の方法に従ってプラ
スミドＤＮＡをニトロセルロースに移した。二１−ロセ
ルロース濾紙をプレハイブリダイピージョン液、１０
ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ （０、２％［３ＳＡ、０．
２％ｒｉｃｏｌｌ、０．２％ポリビニルピロリドン）−
３よび６ｘＳＳＣ（０，９Ｍ ＮａＣ１，０，０９Ｍ
クエン酸ナトリウム）中で３７℃２−４時間、結合した
移転ＤＮＡとインキュベートシてプレハイブリダイゼー
ションを行なった。ハイブリダイゼーションはニド０セ
ルロース濾紙を１０−１１ ｄのプレハイブリダイゼー
ション液および標識プローブと８−１０時間インキュベ
ートして行なった。
スミドＤＮＡをニトロセルロースに移した。二１−ロセ
ルロース濾紙をプレハイブリダイピージョン液、１０
ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ （０、２％［３ＳＡ、０．
２％ｒｉｃｏｌｌ、０．２％ポリビニルピロリドン）−
３よび６ｘＳＳＣ（０，９Ｍ ＮａＣ１，０，０９Ｍ
クエン酸ナトリウム）中で３７℃２−４時間、結合した
移転ＤＮＡとインキュベートシてプレハイブリダイゼー
ションを行なった。ハイブリダイゼーションはニド０セ
ルロース濾紙を１０−１１ ｄのプレハイブリダイゼー
ション液および標識プローブと８−１０時間インキュベ
ートして行なった。
６ＸＳＳＣで加温（３０−４５℃）して何回か洗滌した
後、縞紙をＸ−線フイルムに露出した。
後、縞紙をＸ−線フイルムに露出した。
アルカリフオスファターピ（ベーリンガー・マンハイム
）で処理したＢ ａ ｍ ＨＩ−消化のｐＢＲ３２８（
１００ｎ口）をバヂルス・チューリンゲンシスのプラス
ミドＤＮＡをＢ ａ ｍ ＨＩ消化したちの５００ｎｏ
と混合して結合させた。塩化カルシウムで′ＪＡ製した
Ｅ、ｃｏＪ！ｉ ５Ｒ２００のコンピーテンミル細胞
を形質転換し、アンピシリン耐性で選択してテトラＶイ
クリン感受性で検索した。ミニプラスミド法（Ｈａｎｉ
ａｔｉｓら９８２年）による分析結果で２つのクローン
が正しい１６にｂの挿入を右づ′ることを確認した。第
１表の放Ｑ４１識プローブを用いたサザンハイプリダイ
ゼーションで合成プローブとハイブリダイズする配列を
有するＤＮＡ断片が１ノブクローン化されているこ°と
がわかった。ｐＭＡＰｌおよびｌ）ＭＡＲ２と命名した
２つのプラスミドはベクター中でのＤＮＡｌｆｉ片の方
向のみが異なっていた。これらのプラスミド構築物はウ
ェスタンプロット法（Ｇｃｓｈｏｎｉ ら９７９年）に
よる分析でＢ、ｔ、結晶蛋白毒素抗体と反応性を有する
物質を生産した。挿入されているＢ、ｔ、断片の制限酵
素地図を作成し、４つのＥｃｏＲＩ（Ｅ）部位および３
つのト（ｉｎｄＩ［Ｉ（＋−１）部位がＢａｍＨＩ （
Ｂ）部位の間にｑ在した。これを図示すると次のようで
ある。
）で処理したＢ ａ ｍ ＨＩ−消化のｐＢＲ３２８（
１００ｎ口）をバヂルス・チューリンゲンシスのプラス
ミドＤＮＡをＢ ａ ｍ ＨＩ消化したちの５００ｎｏ
と混合して結合させた。塩化カルシウムで′ＪＡ製した
Ｅ、ｃｏＪ！ｉ ５Ｒ２００のコンピーテンミル細胞
を形質転換し、アンピシリン耐性で選択してテトラＶイ
クリン感受性で検索した。ミニプラスミド法（Ｈａｎｉ
ａｔｉｓら９８２年）による分析結果で２つのクローン
が正しい１６にｂの挿入を右づ′ることを確認した。第
１表の放Ｑ４１識プローブを用いたサザンハイプリダイ
ゼーションで合成プローブとハイブリダイズする配列を
有するＤＮＡ断片が１ノブクローン化されているこ°と
がわかった。ｐＭＡＰｌおよびｌ）ＭＡＲ２と命名した
２つのプラスミドはベクター中でのＤＮＡｌｆｉ片の方
向のみが異なっていた。これらのプラスミド構築物はウ
ェスタンプロット法（Ｇｃｓｈｏｎｉ ら９７９年）に
よる分析でＢ、ｔ、結晶蛋白毒素抗体と反応性を有する
物質を生産した。挿入されているＢ、ｔ、断片の制限酵
素地図を作成し、４つのＥｃｏＲＩ（Ｅ）部位および３
つのト（ｉｎｄＩ［Ｉ（＋−１）部位がＢａｍＨＩ （
Ｂ）部位の間にｑ在した。これを図示すると次のようで
ある。
１３ＥＥＥＥ Ｂ
ｐＭＡＰ２を含有するＥ、ｃｏｆｉ ５Ｒ２００株は
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１℃ｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ、 １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ
ＤｒｉＶＯ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｃ、 ＨＤ ２０
８５２． Ｕ、Ｓ、八。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１℃ｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ、 １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ
ＤｒｉＶＯ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｃ、 ＨＤ ２０
８５２． Ｕ、Ｓ、八。
（以下ＡＴＣＣと略す〉に寄託されＡＴＣｏ ３９８
００と命名されている。
００と命名されている。
ｐＭＡＰ２をＢａｍ）−１１−ＰｓｔＩ消化した後、８
．１にｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を調製用アガロー
スゲルからＤ〔ΔＥ′ａ紙に、製造元の５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ （文献参照）の指示に従
って電気溶出して単離した。プラスミドｐｕｃｓを用い
てＢ、ｔ、３ｆｉ伝子を保有するｌ）ＭＡＲ２のｒ３
ａ ｍ ＨＩ −Ｐ Ｓ ｔ Ｔ断片をサブクローンし
た。
．１にｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を調製用アガロー
スゲルからＤ〔ΔＥ′ａ紙に、製造元の５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ （文献参照）の指示に従
って電気溶出して単離した。プラスミドｐｕｃｓを用い
てＢ、ｔ、３ｆｉ伝子を保有するｌ）ＭＡＲ２のｒ３
ａ ｍ ＨＩ −Ｐ Ｓ ｔ Ｔ断片をサブクローンし
た。
［３ａ ｍ ＨＩおよびｐｓｔＩで消化したｐｌＪｃ８
を精製した８ＫｂのＢａｍ１−ＩＩ−ＰｓｔＩ断片と結
合し、コンピーテントはＥ、ｃｏｌｉＪＭｌｏｌを形質
転換した。アンピシリン耐性およびβ−ガラクトシダー
ピ活性の欠損を基に形質転換株を選択した。目的のプラ
スミドを含有する一つのクローンを単離し、確認した。
を精製した８ＫｂのＢａｍ１−ＩＩ−ＰｓｔＩ断片と結
合し、コンピーテントはＥ、ｃｏｌｉＪＭｌｏｌを形質
転換した。アンピシリン耐性およびβ−ガラクトシダー
ピ活性の欠損を基に形質転換株を選択した。目的のプラ
スミドを含有する一つのクローンを単離し、確認した。
この構築をｐＭＡＰ３ど命名した。ｌ）ＭＡＰ３を保有
するＥ、ＣＯ１＋ ＪＭ１０１株はＡＴＣＣｔ、：寄
託され、ＡＴＣＣ−３９８０１と命名されている。
するＥ、ＣＯ１＋ ＪＭ１０１株はＡＴＣＣｔ、：寄
託され、ＡＴＣＣ−３９８０１と命名されている。
ＤＭＡＰ３のバヂルス・チューリンゲンシスＤＮＡ挿入
部分をＳｍａＩ−ＨｏａＩ欠失により８．１にｂから４
．６Ｋｂに縮めることに成功した。
部分をＳｍａＩ−ＨｏａＩ欠失により８．１にｂから４
．６Ｋｂに縮めることに成功した。
塩化セシウム勾配遠心分離により精製したプラスミドｐ
ＭＡＰ３のＤＮＡをＳｍａＩおよびＨＤａＩで消化して
再結合した。得られたＤＮＡ断片を用いＴＥ、ｃｏＪ！
ｉ ＪＭｌｏｌの＝１ンビーテン１−細胞を形質転換
した。アンピシリン耐性形質転換株をミニプラスミド調
製物のアガロース電気法Ｏ」により検索した。予想され
る［）ＮＡの制限酵素消化パターンを示ずプラスミドを
保有覆る一つのクローンが得られた。これをｌ）ＭＡＰ
４ど命名した。
ＭＡＰ３のＤＮＡをＳｍａＩおよびＨＤａＩで消化して
再結合した。得られたＤＮＡ断片を用いＴＥ、ｃｏＪ！
ｉ ＪＭｌｏｌの＝１ンビーテン１−細胞を形質転換
した。アンピシリン耐性形質転換株をミニプラスミド調
製物のアガロース電気法Ｏ」により検索した。予想され
る［）ＮＡの制限酵素消化パターンを示ずプラスミドを
保有覆る一つのクローンが得られた。これをｌ）ＭＡＰ
４ど命名した。
最後に、キメラ遺伝子は植物中でｍＲＮ△の３′末端に
ボリアデニルメクレオチドを付加するポリアデニル化シ
グナルをコードする３′の非翻訳領域を含有する。適当
な３′領域の例としてはアグロバクテリウムのｆｉ！？
１９１４（Ｔｉ）プラスミドのツバリン合成酵素（ＮＯ
８）遺伝子またはコングリシニン（７Ｓ）貯蔵蛋白遺伝
子のポリアデニル化シグナルを含む３′の転写、非翻訳
領域がある。好ましい３′非翻訳領域の例は以下の例に
記載するＮＯ８遺伝子からのらのである。
ボリアデニルメクレオチドを付加するポリアデニル化シ
グナルをコードする３′の非翻訳領域を含有する。適当
な３′領域の例としてはアグロバクテリウムのｆｉ！？
１９１４（Ｔｉ）プラスミドのツバリン合成酵素（ＮＯ
８）遺伝子またはコングリシニン（７Ｓ）貯蔵蛋白遺伝
子のポリアデニル化シグナルを含む３′の転写、非翻訳
領域がある。好ましい３′非翻訳領域の例は以下の例に
記載するＮＯ８遺伝子からのらのである。
本発明によるキメラ遺伝子は適当な方法によりトマト植
物体の遺伝子内に挿入される。適当な植物形質転換ベク
ターとしては八ＱｒＯｂａＣｔＯｒｉＵｌｔｕ＋ｍｃｒ
ａｃ ｔａｎｓのＴｉプラスミドに由来づるものおよび
例えば１ｌｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、 １９８
３年、Ｂｅｖａｎ ９８３年、Ｋｌｅｅ、 １９８５年
、およびＥＰＯ公聞１２０，５１６．５ｃｈｉ １ｐｅ
ｒｏｏｒｔらにより記載されているものがある。Ａ、ｔ
ｕｌＱｆａＣｉＯｎＳのＴ ｉ ｊ３よび根誘導（Ｒｉ
）プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、本
発明のキメラ遺伝子をトマト細胞に挿入するのに他の方
法も使用できる。伯の方法としては、例えばリポソーム
、エレクトロボーレージ」ンおよび遊ｆｆｉ［）ＮＡの
取り込みを増加する化合物を使用する。形質転換細胞は
次に培養し、全トマト植物体として再生させる。
物体の遺伝子内に挿入される。適当な植物形質転換ベク
ターとしては八ＱｒＯｂａＣｔＯｒｉＵｌｔｕ＋ｍｃｒ
ａｃ ｔａｎｓのＴｉプラスミドに由来づるものおよび
例えば１ｌｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、 １９８
３年、Ｂｅｖａｎ ９８３年、Ｋｌｅｅ、 １９８５年
、およびＥＰＯ公聞１２０，５１６．５ｃｈｉ １ｐｅ
ｒｏｏｒｔらにより記載されているものがある。Ａ、ｔ
ｕｌＱｆａＣｉＯｎＳのＴ ｉ ｊ３よび根誘導（Ｒｉ
）プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、本
発明のキメラ遺伝子をトマト細胞に挿入するのに他の方
法も使用できる。伯の方法としては、例えばリポソーム
、エレクトロボーレージ」ンおよび遊ｆｆｉ［）ＮＡの
取り込みを増加する化合物を使用する。形質転換細胞は
次に培養し、全トマト植物体として再生させる。
以下の実施例は本発明の実施をよりよく説明するもので
あり、請求する発明の範囲を限定するものではない。本
技術の熟練者は本発明の精神および範囲を逸脱すること
なく多くの類似、変異および修飾が存在することを知っ
ており、そのような態様は本発明に含まれるものである
。
あり、請求する発明の範囲を限定するものではない。本
技術の熟練者は本発明の精神および範囲を逸脱すること
なく多くの類似、変異および修飾が存在することを知っ
ており、そのような態様は本発明に含まれるものである
。
実施例１
バヂルス・チューリンゲンシス亜種クルスタキＬＩ Ｄ
−１からの殺虫性ｆｆＪ素遺伝子は既に−ａｔｒｕｄ
ら（１９８５年）により報告されている。Ｂｙ、素遺伝
子はプラスミドｐＭＡＰ４内にＢ、ｔ、ＤＮＡの４．６
にｂ断片上に含有される。全毒素蛋白をコードする配列
を含むＤＭＡＰ４の３７３４ヌクレオチドのＤＮＡ配列
はＳａｎｇｅｒら（１９７７年）（７）ｔａターミネー
ション法により決定した。Ｄ ＮＡ配列およびそれに由
来する毒素蛋白のアミノ酸配列を第１図に示す。以下ヌ
クレオチドの順位は第１図に基づく。
−１からの殺虫性ｆｆＪ素遺伝子は既に−ａｔｒｕｄ
ら（１９８５年）により報告されている。Ｂｙ、素遺伝
子はプラスミドｐＭＡＰ４内にＢ、ｔ、ＤＮＡの４．６
にｂ断片上に含有される。全毒素蛋白をコードする配列
を含むＤＭＡＰ４の３７３４ヌクレオチドのＤＮＡ配列
はＳａｎｇｅｒら（１９７７年）（７）ｔａターミネー
ション法により決定した。Ｄ ＮＡ配列およびそれに由
来する毒素蛋白のアミノ酸配列を第１図に示す。以下ヌ
クレオチドの順位は第１図に基づく。
本配列はｗＡ訳開始コドンの上流に１７１ヌクレオチド
を含み、翻訳終止コドンの下流１８８ヌクレオチドのＫ
ＤｎＩ部位まで続く。蛋白コード配列の最初のヌクレオ
チドを＋１とした。ヌクレオチド−７５からヌクレオチ
ド２２０およびヌクレオチド３２４５から３６５０のＤ
ＮＡ配列もＨａｘａｍおよびＧ１１ｂｃｒｔ （１９
７７年）の化学法により決定した。−１７１から−１６
０のｌ） Ｎ△配列はプラスミドｐＬＪ Ｃ７（Ｖｉｅ
ｉｒａ９８２年）の公知の配列からである。−１５９か
ら−１５３のＤＮＡ配列は化学合成したＰＳｔＩリンカ
−（Ｎｅ１＃Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓでありニ
ー１５２から−１５０の３ヌクレオチドは制限酵素Ｉ−
１ｐ ａ Ｉの公知の切断部位に由来する。ヌクレオチ
ド−１４９から−７６の配列は他の５．ｔ、毒素遺伝子
（５ｃｈｎｅｐｆら９８５年、Ｔｈ０ｒｎＯら９８６年
、＾ｄａｎｇら９８５年および５ｈｉｂａｎｏら９８５
年）の公知の５′−フランキング領域から推定された。
を含み、翻訳終止コドンの下流１８８ヌクレオチドのＫ
ＤｎＩ部位まで続く。蛋白コード配列の最初のヌクレオ
チドを＋１とした。ヌクレオチド−７５からヌクレオチ
ド２２０およびヌクレオチド３２４５から３６５０のＤ
ＮＡ配列もＨａｘａｍおよびＧ１１ｂｃｒｔ （１９
７７年）の化学法により決定した。−１７１から−１６
０のｌ） Ｎ△配列はプラスミドｐＬＪ Ｃ７（Ｖｉｅ
ｉｒａ９８２年）の公知の配列からである。−１５９か
ら−１５３のＤＮＡ配列は化学合成したＰＳｔＩリンカ
−（Ｎｅ１＃Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓでありニ
ー１５２から−１５０の３ヌクレオチドは制限酵素Ｉ−
１ｐ ａ Ｉの公知の切断部位に由来する。ヌクレオチ
ド−１４９から−７６の配列は他の５．ｔ、毒素遺伝子
（５ｃｈｎｅｐｆら９８５年、Ｔｈ０ｒｎＯら９８６年
、＾ｄａｎｇら９８５年および５ｈｉｂａｎｏら９８５
年）の公知の５′−フランキング領域から推定された。
推定された。
実施例２−５
八、仝艮７り素
Ｂ、【、の毒素蛋白をコードするキメラ遺伝子を作成す
るため、Ｂ、ｔ、７ｍ素をコードするＤＮＡの翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞にＮ ＣＯＩ ＲＩＬ位を導入し、△
ＴＧコドンがＮｃｏＩ８識部位（ＣＣＡＴＧＧ）内に含
まれるようにする。毒素遺伝子の開始コドン付近のＤＮ
Ａ配列分析の結果、次の配列がＭ１認された。
るため、Ｂ、ｔ、７ｍ素をコードするＤＮＡの翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞にＮ ＣＯＩ ＲＩＬ位を導入し、△
ＴＧコドンがＮｃｏＩ８識部位（ＣＣＡＴＧＧ）内に含
まれるようにする。毒素遺伝子の開始コドン付近のＤＮ
Ａ配列分析の結果、次の配列がＭ１認された。
５°−ＧＡＧ＾ＴＧＧＡＧＱＴＡ八ＣＴＴ＾ＴＧＧ八■
八へＣ八八ＴＣＣＧへ−へ。
八へＣ八八ＴＣＣＧへ−へ。
ＨへへＡＳｐＡＳｎＡＳｎＰｒＯ
目的のＮＣｏＩ部位を導入するためにはＡ［Ｇ近辺の配
列をＴＴＡＴＧＧからＣＣＡＴＧＧに変える必要があっ
た。第２図のようにして、翻訳開始領域を含む３４０ｂ
ｐのＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＤＭＡＰ４から線状バ
クテリオファージベクターＭ１３ｍｐ８のＳｍａＩとＥ
ｃｏＲＩ部位の間にザブクローンした。このプラスミド
をｐＭＯＮ９７３２と命名した。本構築物からの−・重
鎮ファージＤＮＡは毒素遺伝子配列の非コード鎖を含有
する。
列をＴＴＡＴＧＧからＣＣＡＴＧＧに変える必要があっ
た。第２図のようにして、翻訳開始領域を含む３４０ｂ
ｐのＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＤＭＡＰ４から線状バ
クテリオファージベクターＭ１３ｍｐ８のＳｍａＩとＥ
ｃｏＲＩ部位の間にザブクローンした。このプラスミド
をｐＭＯＮ９７３２と命名した。本構築物からの−・重
鎮ファージＤＮＡは毒素遺伝子配列の非コード鎖を含有
する。
本構築物の一重鎖ＤＮＡに部位特異変異をＺｏｌｌｃｒ
およびＳｇ＋ｉｔｈ （１９８３年）の方法により行
ない、ブライマーとして次の配列の合成オリゴヌクレオ
チドを用いた。
およびＳｇ＋ｉｔｈ （１９８３年）の方法により行
ない、ブライマーとして次の配列の合成オリゴヌクレオ
チドを用いた。
５’−ＧＡＧ＾ＴＧＧＡＧＧＴ＾ＡＣＣＣΔＴＧＧ八ｒ
ＡＡｃＡＡＴｃｃ−３゜変異処理の後へ目的の通り変化
したり１］−ンをＮＣ０Ｉによる消化で同定し、ＮＣｏ
Ｉ部位の存在をＤＮＡ配列分析で確認した。
ＡＡｃＡＡＴｃｃ−３゜変異処理の後へ目的の通り変化
したり１］−ンをＮＣ０Ｉによる消化で同定し、ＮＣｏ
Ｉ部位の存在をＤＮＡ配列分析で確認した。
上）小の部位特異変異によりＮＣｏＩ部位を導入したｉ
ｎ ＊ 遺伝子を構築した。第３図のように、ｐＭＡＰ
３を［３ａｍｌ−ＩＩおよびＣｊ！ａＩで消化し、ＤＵ
Ｃ８ベクターおよび１２８３番目のＣＪａＩ部位から遺
伝子の末端を越えたＰｓｔＩ部位までの毒素遺伝子を含
む断片を単離した。ｍｐ８マルチリンｈ−中の［３ａ
ｍ Ｉ−Ｉ Ｉ部位から１０６番目のＣｌａＩ部位まで
の１８５ｂｐ断片をｐＭＯＮ９７３３より単離した。こ
れらの二つの断片を結合しでｐＭΔＰ１６を創成した。
ｎ ＊ 遺伝子を構築した。第３図のように、ｐＭＡＰ
３を［３ａｍｌ−ＩＩおよびＣｊ！ａＩで消化し、ＤＵ
Ｃ８ベクターおよび１２８３番目のＣＪａＩ部位から遺
伝子の末端を越えたＰｓｔＩ部位までの毒素遺伝子を含
む断片を単離した。ｍｐ８マルチリンｈ−中の［３ａ
ｍ Ｉ−Ｉ Ｉ部位から１０６番目のＣｌａＩ部位まで
の１８５ｂｐ断片をｐＭＯＮ９７３３より単離した。こ
れらの二つの断片を結合しでｐＭΔＰ１６を創成した。
ｐＭＡＰ１６はＡＴＧの位置にＮＣＯＩ部位を含有する
が毒素遺伝子の１０６番目と１２８３７ｆｌ目のＣｌａ
Ｉ部位の間の断片を欠失している。このＣｊ！ａＩ断片
をｐＭΔｐｚから単離してｐＭΔＰ１６のＣｊ！ａＩ演
化物と結合した。ＣｌａＩ断片を正しい方向に挿入し、
機能的毒素遺伝子を回復して含有するプラスミドを同定
し、ｐＭＡＰ１７と命名した。本プラスミドを含有する
Ｅ、ｃｏｔ ｉはおよそ１３４．０００ダルトンの缶白
質を生産し、この缶白質はｐＭＡＰ４を含有するｌ：、
Ｇｏ！＋により生産されるものと同じレベルでバチルス
・ヂューリンゲンシス亜種りルスタキＨＤ −１から得
られた精製結晶毒素蛋白に対して調製した抗体と反応し
た。ＤＭＡＰ１７を含有するＥ、ｃｏｉｒは！ｌ鱗翅目
幼虫ＨａｎｄＬＩＣａ ５（３Ｘｔａに毒性を示した。
が毒素遺伝子の１０６番目と１２８３７ｆｌ目のＣｌａ
Ｉ部位の間の断片を欠失している。このＣｊ！ａＩ断片
をｐＭΔｐｚから単離してｐＭΔＰ１６のＣｊ！ａＩ演
化物と結合した。ＣｌａＩ断片を正しい方向に挿入し、
機能的毒素遺伝子を回復して含有するプラスミドを同定
し、ｐＭＡＰ１７と命名した。本プラスミドを含有する
Ｅ、ｃｏｔ ｉはおよそ１３４．０００ダルトンの缶白
質を生産し、この缶白質はｐＭＡＰ４を含有するｌ：、
Ｇｏ！＋により生産されるものと同じレベルでバチルス
・ヂューリンゲンシス亜種りルスタキＨＤ −１から得
られた精製結晶毒素蛋白に対して調製した抗体と反応し
た。ＤＭＡＰ１７を含有するＥ、ｃｏｉｒは！ｌ鱗翅目
幼虫ＨａｎｄＬＩＣａ ５（３Ｘｔａに毒性を示した。
キメラ毒素遺伝子の植物形質転換ベクターでのＨＡ築を
行なうために、毒素遺伝子のＮＣｏＩ部位の直ぐ上流に
Ｂ ａ ｍ ｌ−Ｉ ＩおよびＢＱＪ！ＩＩ部位を導入
する。第４図を参照に、プラスミドｐＭＯＮ １４６を
以下に示すＢａｍ１−ＩＩ、［３ｇｊ！ＩＩ、ＸｂａＩ
およびＮＣ０Ｉ制限部位を含む合成リンカ−の材料とし
て用いた。
行なうために、毒素遺伝子のＮＣｏＩ部位の直ぐ上流に
Ｂ ａ ｍ ｌ−Ｉ ＩおよびＢＱＪ！ＩＩ部位を導入
する。第４図を参照に、プラスミドｐＭＯＮ １４６を
以下に示すＢａｍ１−ＩＩ、［３ｇｊ！ＩＩ、ＸｂａＩ
およびＮＣ０Ｉ制限部位を含む合成リンカ−の材料とし
て用いた。
５’−ＧＧ＾ＴＣＣＡＧΔＴＣＴＧＴＴＧｒＡＡＧＧ八
ＧＴＣＴＡＧＡ４？−Ｂａａ＋ｌｌ Ｔ、へ Ｂｇ ｌ
ｌ χｂａＩ−ＣＣ＾ＴＧＧ八ＴＣ−３’ ＮＣＯへ 、ｐＭＯＮ１４６をＰｓｔＩで部分消化した後、ＮＣ０
Ｉで完全消化し、３，５にｂのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ断片
を単離した。ｐＭＡＰ１７より毒素全遺伝子を含む４．
５にｂのＮＣｏＩ−ＰｓｔＩ断片を単離し、それを３．
にｂのＤＭＯＮｌ ４６からの断片と結合した。これら
の２つの断片を含むプラスミドをｐＭＯＮ２９４と命名
した。ｐＭＯＮ２９４中で毒素蛋白の開始コドンの直ぐ
上流に３ ａ ｍ ＨＩおよびＢａＩＩｔ部位があり、
１３ ａ ｍ ｆ−ｌ Ｉ部位はｐｓｔ４部位のすぐ下
流にある。
ＧＴＣＴＡＧＡ４？−Ｂａａ＋ｌｌ Ｔ、へ Ｂｇ ｌ
ｌ χｂａＩ−ＣＣ＾ＴＧＧ八ＴＣ−３’ ＮＣＯへ 、ｐＭＯＮ１４６をＰｓｔＩで部分消化した後、ＮＣ０
Ｉで完全消化し、３，５にｂのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ断片
を単離した。ｐＭＡＰ１７より毒素全遺伝子を含む４．
５にｂのＮＣｏＩ−ＰｓｔＩ断片を単離し、それを３．
にｂのＤＭＯＮｌ ４６からの断片と結合した。これら
の２つの断片を含むプラスミドをｐＭＯＮ２９４と命名
した。ｐＭＯＮ２９４中で毒素蛋白の開始コドンの直ぐ
上流に３ ａ ｍ ＨＩおよびＢａＩＩｔ部位があり、
１３ ａ ｍ ｆ−ｌ Ｉ部位はｐｓｔ４部位のすぐ下
流にある。
第１１図に承りように、プラスミドｐＭＯＮ３１６はｐ
ＭＯＮ ２００ （「ｒａｌｅｙら９８５年、ＲＯ（ｌ
ｏｒｓら９８５年）の誘導体でＣａＭＶ３５Ｓプロモー
ターおよびＮ０３ｍ伝了の３′−ポリアデニル化シグナ
ルを含むコインテグレート型の中間ベクターである。ｐ
ＭＯＮ３１６は特有の制限酵素部位ｓｏ、ｃｍ、Ｃ１ａ
Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｘ ｈ ＯＩ オヨＵ Ｅ ＣＯＲＩ
ヲ５ ’ −！Ｊ−ダーシグナルと３’ −ＮＯＳアデ
ニル化シグナルの間に有する。これらの切断部位はＣａ
ＭＶ３５Ｓリーダー配列に隣接する翻訳開始シグナルを
含有するコード配列の挿入を可能とする。プラスミドｐ
ＭＯＮ３１６は［：、ｃｏｌｔおよび＾、 ｔｕｍｃｒ
ａｃ；ｃｎｓでの選択用のストレプトマイシン耐性、植
物組織の形質転換株選択用のカブマイシンノキメラ遺伝
子（ＮＯ３／ＮＰＴＩ［／Ｎ０３）および転換株および
子孫への遺伝性の検出のためのツバリン合成酵素遺伝子
を含むｐＭＯＮ２００の全ての性質を保持している。
ＭＯＮ ２００ （「ｒａｌｅｙら９８５年、ＲＯ（ｌ
ｏｒｓら９８５年）の誘導体でＣａＭＶ３５Ｓプロモー
ターおよびＮ０３ｍ伝了の３′−ポリアデニル化シグナ
ルを含むコインテグレート型の中間ベクターである。ｐ
ＭＯＮ３１６は特有の制限酵素部位ｓｏ、ｃｍ、Ｃ１ａ
Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｘ ｈ ＯＩ オヨＵ Ｅ ＣＯＲＩ
ヲ５ ’ −！Ｊ−ダーシグナルと３’ −ＮＯＳアデ
ニル化シグナルの間に有する。これらの切断部位はＣａ
ＭＶ３５Ｓリーダー配列に隣接する翻訳開始シグナルを
含有するコード配列の挿入を可能とする。プラスミドｐ
ＭＯＮ３１６は［：、ｃｏｌｔおよび＾、 ｔｕｍｃｒ
ａｃ；ｃｎｓでの選択用のストレプトマイシン耐性、植
物組織の形質転換株選択用のカブマイシンノキメラ遺伝
子（ＮＯ３／ＮＰＴＩ［／Ｎ０３）および転換株および
子孫への遺伝性の検出のためのツバリン合成酵素遺伝子
を含むｐＭＯＮ２００の全ての性質を保持している。
第５図に示すように、ｐＭＯＮ２９４からの毒素遺伝子
を含む４．５にｂのＢ ａ ｍ ｌ−Ｉ Ｉ ＩＦ５片
をＢＱｊ！ ＩＩで消化したｐＭＯＮ３１６に結合して
植物中でＢ、ｔ、ｉｉ素遺伝子を発現させるプラスミド
を構築した。毒素遺伝子をその翻訳開始シグナルがＣａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターと隣接するような方向で含むプ
ラスミドをＥＣ０ＲＩ消化で確認し、ｐＭＯＮ８０５３
と命名した。
を含む４．５にｂのＢ ａ ｍ ｌ−Ｉ Ｉ ＩＦ５片
をＢＱｊ！ ＩＩで消化したｐＭＯＮ３１６に結合して
植物中でＢ、ｔ、ｉｉ素遺伝子を発現させるプラスミド
を構築した。毒素遺伝子をその翻訳開始シグナルがＣａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターと隣接するような方向で含むプ
ラスミドをＥＣ０ＲＩ消化で確認し、ｐＭＯＮ８０５３
と命名した。
Ｂ、ｔ、７ｆｉ素の構造コード配列が３４７９の［）ｒ
ａＩ部位で切断された全構築物を含むもう一つの植物キ
メラ遺伝子を調製した。この部位は全長Ｂ、【、毒素の
コード配列の翻訳終止コドンより１０ヌクレオチド下流
である。従って本構築物はバブルス・ヂューリンゲンシ
ス亜種りルスタキ遺伝子の全長コード配列を有するが３
′のフランキング配列はほとんど持たない。これをｐＭ
ＯＮ９７１２と命名した。
ａＩ部位で切断された全構築物を含むもう一つの植物キ
メラ遺伝子を調製した。この部位は全長Ｂ、【、毒素の
コード配列の翻訳終止コドンより１０ヌクレオチド下流
である。従って本構築物はバブルス・ヂューリンゲンシ
ス亜種りルスタキ遺伝子の全長コード配列を有するが３
′のフランキング配列はほとんど持たない。これをｐＭ
ＯＮ９７１２と命名した。
第６図に示すように、ｐＭＯＮ２９４をυ１限酵素Ｄｒ
ａＩで消化してプラスミドｐＭＯＮ９７１２を調製した
。次の配列を有する一対の相補オリゴヌクレオチドを合
成した。
ａＩで消化してプラスミドｐＭＯＮ９７１２を調製した
。次の配列を有する一対の相補オリゴヌクレオチドを合
成した。
５’ −ＴＡＧＴ八ＧＧへＡＧＣＴＡＧＣＣＡ−３’
３′ −へ丁ＣへＴＣＣ＾ＴＣＧ＾ＴＣＧＧｒＣＴＡＧ
−５’相互にアニールさせると、これらのオリゴヌクレ
オチド対 ドする。アニールさせたオリゴヌクレオチド対で一方の
端は平滑末端であるが、他の端は４ヌクレオブトが一本
鎖領域でＢＱｊｌＩ消化ＤＮＡとライゲートすることが
できる。オリゴヌクレオチドをアニールざけた後、予め
ＤｒａＩで消化したｐＭＯＮ２９４ＤＮＡと結合させた
。結合反応物を５ｏｏｎで消化して目的の３４．７ｉ素
コ一ド配列を含むおよそ３．５にｂのＢｇオ■断片を単
離した。
３′ −へ丁ＣへＴＣＣ＾ＴＣＧ＾ＴＣＧＧｒＣＴＡＧ
−５’相互にアニールさせると、これらのオリゴヌクレ
オチド対 ドする。アニールさせたオリゴヌクレオチド対で一方の
端は平滑末端であるが、他の端は４ヌクレオブトが一本
鎖領域でＢＱｊｌＩ消化ＤＮＡとライゲートすることが
できる。オリゴヌクレオチドをアニールざけた後、予め
ＤｒａＩで消化したｐＭＯＮ２９４ＤＮＡと結合させた
。結合反応物を５ｏｏｎで消化して目的の３４．７ｉ素
コ一ド配列を含むおよそ３．５にｂのＢｇオ■断片を単
離した。
本断片は翻訳ｍ１始］トンのすぐ上流のｓｇ、ｅ ｎ部
位からオリゴヌクレオチド対で創成されたＢ！ｌ）Ｊ！
１１部位までを含む。このＢＯＡ ＩＩ断片を１３０
ＡＩ消化のｐＭＯＮ３１６と結合させる。毒素遺伝子の
翻訳開始点が３５８１１コモ−ターと隣接しているクロ
ーン（ｐＭＯＮ９７１２）をＥｃｏＲＩによる開化によ
り確認した。
位からオリゴヌクレオチド対で創成されたＢ！ｌ）Ｊ！
１１部位までを含む。このＢＯＡ ＩＩ断片を１３０
ＡＩ消化のｐＭＯＮ３１６と結合させる。毒素遺伝子の
翻訳開始点が３５８１１コモ−ターと隣接しているクロ
ーン（ｐＭＯＮ９７１２）をＥｃｏＲＩによる開化によ
り確認した。
Ｂ、断片毒素
Ｂ、ｔ、毒素コード配列の翻訳開始点の上流から２１７
０位のＫＤｎ Ｉまでの断片もＥ、ｃｏｌｔ中で発現づ
るとＨ，５ＯＸｔａに毒性の蛋白質を生産することが既
に知られている。以下のようにしてそのような切断Ｂ、
ｔ、毒素コード還伝子を取り込んだ植物発現ベクターを
構築した。毒素遺伝子の２１７０位のＫｐｎＩ部位のＤ
ＮＡ配列を基に以下に示す相補オリゴヌクレオチドを合
成し、アニール後に毒素遺伝子のＫｌｎＩ部位に結合Ｊ
ると毒素コード配列のフレームで二個の翻訳終止コドン
をコードするようにした。
０位のＫＤｎ Ｉまでの断片もＥ、ｃｏｌｔ中で発現づ
るとＨ，５ＯＸｔａに毒性の蛋白質を生産することが既
に知られている。以下のようにしてそのような切断Ｂ、
ｔ、毒素コード還伝子を取り込んだ植物発現ベクターを
構築した。毒素遺伝子の２１７０位のＫｐｎＩ部位のＤ
ＮＡ配列を基に以下に示す相補オリゴヌクレオチドを合
成し、アニール後に毒素遺伝子のＫｌｎＩ部位に結合Ｊ
ると毒素コード配列のフレームで二個の翻訳終止コドン
をコードするようにした。
５’−ＣＴＡＧＴ八八へ−へへ
３’−ＣへＴＧＧ＾ＴＣへＴＴＴＣＴへＧ−５゛アニー
ルしたＡリボヌクレオブードは−・端がＫｐｎＩ消化し
た毒素遺伝子と結合できる４ヌクレＡチドの一木鎖部分
であり、他端はＢ（ＩＩＩ消化ＤＮＡとの結合が可能な
４ヌクレオチドの一本鎖と４Ｔつでいる。第７図に示す
ようにして、オリゴヌクレオチドを相互にアニールし、
予めＫＤｎＩ消化したｐＭＯＮ２９４と結合した。次に
この結合ＤＮＡをＢ（ｌｊ！ ＩＩで消化して２．２に
ｂのＢＧｊ！ Ｉｎ断片を０１１１１した。本断片は毒
素遺伝子の翻訳開始点のすぐ上流にあるＢｇｊ！ Ｉ部
位からオリゴヌクレオチド対により創成されたＢＱＩ
ＩＩ部位までを含む。
ルしたＡリボヌクレオブードは−・端がＫｐｎＩ消化し
た毒素遺伝子と結合できる４ヌクレＡチドの一木鎖部分
であり、他端はＢ（ＩＩＩ消化ＤＮＡとの結合が可能な
４ヌクレオチドの一本鎖と４Ｔつでいる。第７図に示す
ようにして、オリゴヌクレオチドを相互にアニールし、
予めＫＤｎＩ消化したｐＭＯＮ２９４と結合した。次に
この結合ＤＮＡをＢ（ｌｊ！ ＩＩで消化して２．２に
ｂのＢＧｊ！ Ｉｎ断片を０１１１１した。本断片は毒
素遺伝子の翻訳開始点のすぐ上流にあるＢｇｊ！ Ｉ部
位からオリゴヌクレオチド対により創成されたＢＱＩ
ＩＩ部位までを含む。
２．２にｂ ＢＱｊ！ｌｌ１Ｉｉ片を［３ＱＪ！ｌ消
化ｐＭＯＮ３１６と結合してＫｐｎＩで切断されたＢ、
ｔ、 九本遺伝子の植物発現用プラスミドを構築した
。
化ｐＭＯＮ３１６と結合してＫｐｎＩで切断されたＢ、
ｔ、 九本遺伝子の植物発現用プラスミドを構築した
。
ＥｃｏＲＩ消化により毒素遺伝子の翻訳開始点がＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターと隣接しているクローンを同定し
、ｐＭＯＮ９７１１と命名した。第１図の１９３５位の
ＢＣｊ！ Ｉ部位で切断した６４６個のアミノ酸のＢ、
ｔ、毒素断片用のもう一つの植物キメラ遺伝子を［ｆ
した。この遺伝子構築物を植物形質転換用ベクターｐＭ
ＯＮ３１６に挿入し、ＤＭＯＮ９７１３と命名した。
Ｖ３５Ｓプロモーターと隣接しているクローンを同定し
、ｐＭＯＮ９７１１と命名した。第１図の１９３５位の
ＢＣｊ！ Ｉ部位で切断した６４６個のアミノ酸のＢ、
ｔ、毒素断片用のもう一つの植物キメラ遺伝子を［ｆ
した。この遺伝子構築物を植物形質転換用ベクターｐＭ
ＯＮ３１６に挿入し、ＤＭＯＮ９７１３と命名した。
簡単には、ｐＭＯＮ９７１３は以下のようにして［１し
た。第８図に示すように、プラスミドｐＭＯＮ２９４を
３Ｃｊ！Ｉで消化した。ＢＣＩＩ消化の後、一本鎖末端
をＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラ新月および全４デＡ
キシヌクレオチドとの処理により平滑末端とした。次の
配列の相補オリゴヌクレオチド一対を合成した。
た。第８図に示すように、プラスミドｐＭＯＮ２９４を
３Ｃｊ！Ｉで消化した。ＢＣＩＩ消化の後、一本鎖末端
をＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラ新月および全４デＡ
キシヌクレオチドとの処理により平滑末端とした。次の
配列の相補オリゴヌクレオチド一対を合成した。
５°−■へＧＴ＾ＧＧＴ＾ＧＣＴ＾ＧＣＣ＾−３゜３゛
−＾ＴＣ八ＴへＣ＾ＴＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴ＾Ｇ−５゜
相互にアニールさせると、これらのオリゴヌクレオチド
は三種全ての読みワクで翻訳終止点をコードしている。
−＾ＴＣ八ＴへＣ＾ＴＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴ＾Ｇ−５゜
相互にアニールさせると、これらのオリゴヌクレオチド
は三種全ての読みワクで翻訳終止点をコードしている。
アニールしたオリゴヌクレオチド対は一端は平滑末端で
あり、もう一端は［３ｇｊ！ ｎ消化ＤＮＡと結合され
得る４ヌクレＡチドの一本鎖領域を有する。オリゴヌク
レオチドを相互にアニールさせ、上述のように予め３Ｃ
ｊ！ Ｉで消化して処理したｐＭＯＮ２９４ＤＮＡと結
合した。結合したＤＮＡｅＢａｊ！ＩＩで消化し、Ｂ、
ｔ、毒素を〕−ドする配列を含むおよそ１．９にｂのＢ
Ｑｌ ｎ断片をＩＱ離する。本断片は翻訳開始コドンの
すぐ上流のＢＯｊ！Ｉｆ部位からオリゴヌクレオチド対
にＪ：り創成されたｆ３ｇＪ ＩＩ部位までを含む、Ｈ
ｉｎｄｌｌ消化によりＦＤ素遺伝子の翻ｖＲ間始点が３
５Ｓプロ七−ターと隣接するクローン（ｐＭＯＮ９７１
３）を同定した。
あり、もう一端は［３ｇｊ！ ｎ消化ＤＮＡと結合され
得る４ヌクレＡチドの一本鎖領域を有する。オリゴヌク
レオチドを相互にアニールさせ、上述のように予め３Ｃ
ｊ！ Ｉで消化して処理したｐＭＯＮ２９４ＤＮＡと結
合した。結合したＤＮＡｅＢａｊ！ＩＩで消化し、Ｂ、
ｔ、毒素を〕−ドする配列を含むおよそ１．９にｂのＢ
Ｑｌ ｎ断片をＩＱ離する。本断片は翻訳開始コドンの
すぐ上流のＢＯｊ！Ｉｆ部位からオリゴヌクレオチド対
にＪ：り創成されたｆ３ｇＪ ＩＩ部位までを含む、Ｈ
ｉｎｄｌｌ消化によりＦＤ素遺伝子の翻ｖＲ間始点が３
５Ｓプロ七−ターと隣接するクローン（ｐＭＯＮ９７１
３）を同定した。
実施例６−８
八ｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｉ ｔｕｍｅｆａｃｉｃｎｓ
からのオクトビン型プラスミドであるプラスミドｐＴｉ
Ａ６のマノピン合成酢Ａ（ＭＡＳ）プロモーターを既に
記載した構築物ｐＭＯＮ９７１１ 、ｐＭＯＮ９７１２
＋１３よびＣＭＯＮ９７１３に含まれるＢ、 ｔ、毒素
遺伝子と組み合わせて、三種のＢ、ｔ、ｍ素キメラ遺伝
子を構築した。
からのオクトビン型プラスミドであるプラスミドｐＴｉ
Ａ６のマノピン合成酢Ａ（ＭＡＳ）プロモーターを既に
記載した構築物ｐＭＯＮ９７１１ 、ｐＭＯＮ９７１２
＋１３よびＣＭＯＮ９７１３に含まれるＢ、 ｔ、毒素
遺伝子と組み合わせて、三種のＢ、ｔ、ｍ素キメラ遺伝
子を構築した。
ＭＡＳプロし一ターは１）ＴｆＡ６より１．５にｂのＥ
ｃ ｏ ＲＩ −Ｃ１ａ ｎ断片として単離した。こ
（７）ＤＮＡ断片はＢａｒｋｅｒら（１９８３年）の配
列の２０．１３８ヌクレＡチドの位ｄのＣ１ａ■部位か
ら２１．６３１ヌクレオチドの位置のＥＣｏＲＩ部位ま
でを含む。第９図に示すにうに、にｃｏＲＩ−Ｃｊ！ａ
Ｉ断片を予めＥｃｏＲＩと（ｌａＩで消化したバイナリ
−ベクターｐＭ ＯＮ５０５ （ｌ１ｏｒｓｃｈら９８
６年）とライゲートづ。
ｃ ｏ ＲＩ −Ｃ１ａ ｎ断片として単離した。こ
（７）ＤＮＡ断片はＢａｒｋｅｒら（１９８３年）の配
列の２０．１３８ヌクレＡチドの位ｄのＣ１ａ■部位か
ら２１．６３１ヌクレオチドの位置のＥＣｏＲＩ部位ま
でを含む。第９図に示すにうに、にｃｏＲＩ−Ｃｊ！ａ
Ｉ断片を予めＥｃｏＲＩと（ｌａＩで消化したバイナリ
−ベクターｐＭ ＯＮ５０５ （ｌ１ｏｒｓｃｈら９８
６年）とライゲートづ。
る。得られるプラスミドをｐＭＯＮ７０６と命名する。
Ｎ０８３’末端を含む断片をＭＡＳプロ℃−ターの下流
に挿入してＭＡＳ−ＮＯ３３’ 発現用カセットベクタ
ーを得る。Ｎ０８３’ 断片はｐＭＯＮ５３０から３０
０ｂｐの［３（、ｌオ■−Ｂａｍｌ−Ｉｎ断片として切
り出し、ＢＱｊ！Ｉで消化したｐＭＯＮ７０６に挿入し
た。得られるプラスミドをＣＭＯＮ ７０７ど命名した
。
に挿入してＭＡＳ−ＮＯ３３’ 発現用カセットベクタ
ーを得る。Ｎ０８３’ 断片はｐＭＯＮ５３０から３０
０ｂｐの［３（、ｌオ■−Ｂａｍｌ−Ｉｎ断片として切
り出し、ＢＱｊ！Ｉで消化したｐＭＯＮ７０６に挿入し
た。得られるプラスミドをＣＭＯＮ ７０７ど命名した
。
プラスミドｌ）ＭＯＮ５３０はｐＭＯＮ２００をＮｄｅ
Ｉで切断して９００ｂｐのＮｄｅＩ断片を除去してｐＭ
ＯＮ５０３を得て構築した。プラスミドｐＭＯＮ５０３
をＨｉ ｎ ｄ ■おにσＳ ｍ ａ Ｉ ｔ”切断し
、やはりＨｉ ｎ ｄ ■および３ｍａ Ｉで切断した
プラスミドＤ Ｔ Ｊ Ｓ ７５ （Ｓｃｈｍｉｄｈａ
ｕｓｅｒおよび１ｌｅｌｉｎｓｋｉ、 １９８５年）を
混合した。ｐＴＪｓ７５の３，８にｂＨｉ ｎｄｕｌ−
８ｍａＩ断片がＣＭＯＮ５０３の８にｂＨｉ ｎｄ ｍ
−ｓｍａ Ｉ断片ど結合して含有するプラスミドを甲離
し、ｐＭＯＮ５０５と命名した。次にｐＭＯＮ３１６を
５ｔｕＴＪ３よびＨｉｎｄｌｌで切断し、Ｎ０８−ＮＰ
ＴＨ’ −ＮＯ８ｖ−カーおよびＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯ
８３’ カセットを含む２．５Ｋｂの５ｔｕＩ−）−１
ｉ ｎｄＴ［［ｌｌｉ片を単離してこれを５ｔｕＩおよ
びＨｉｎｄｎｌで切断したｐＭＯＮ５０５ＤＮＡに添加
した。ライゲーションおよび形質転換の後、ｏＭＯＮ５
０５にＣａ Ｍ Ｖ ３５ Ｓ −ＮＯ３３’ カセッ
トを保有するプラスミドを甲離し、ＤＭＯＮ５３０と命
名した。
Ｉで切断して９００ｂｐのＮｄｅＩ断片を除去してｐＭ
ＯＮ５０３を得て構築した。プラスミドｐＭＯＮ５０３
をＨｉ ｎ ｄ ■おにσＳ ｍ ａ Ｉ ｔ”切断し
、やはりＨｉ ｎ ｄ ■および３ｍａ Ｉで切断した
プラスミドＤ Ｔ Ｊ Ｓ ７５ （Ｓｃｈｍｉｄｈａ
ｕｓｅｒおよび１ｌｅｌｉｎｓｋｉ、 １９８５年）を
混合した。ｐＴＪｓ７５の３，８にｂＨｉ ｎｄｕｌ−
８ｍａＩ断片がＣＭＯＮ５０３の８にｂＨｉ ｎｄ ｍ
−ｓｍａ Ｉ断片ど結合して含有するプラスミドを甲離
し、ｐＭＯＮ５０５と命名した。次にｐＭＯＮ３１６を
５ｔｕＴＪ３よびＨｉｎｄｌｌで切断し、Ｎ０８−ＮＰ
ＴＨ’ −ＮＯ８ｖ−カーおよびＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯ
８３’ カセットを含む２．５Ｋｂの５ｔｕＩ−）−１
ｉ ｎｄＴ［［ｌｌｉ片を単離してこれを５ｔｕＩおよ
びＨｉｎｄｎｌで切断したｐＭＯＮ５０５ＤＮＡに添加
した。ライゲーションおよび形質転換の後、ｏＭＯＮ５
０５にＣａ Ｍ Ｖ ３５ Ｓ −ＮＯ３３’ カセッ
トを保有するプラスミドを甲離し、ＤＭＯＮ５３０と命
名した。
バイナリ−ベクターの中にはコインテグレイテイングベ
クターと比較してトマト中での形質転換頻度が非常に低
下しているものがあるので、ＨｃＣｏｒｗ＋ｉｃｈら（
１９８６年） 、ＭＡＳ−ＮＯ８３′カセツトをｐＭＯ
Ｎ７０７からコインテグレイテイングベクターｐＭＯＮ
２００、Ｅｒａｌｃｖら（１９８５年）、に移した。プ
ラスミド０Ｍ０Ｎ２００を３ｔｕ 丁およびｔ−１ｉｎ
ｄｌ［Ｉｔ’消化して７．７にｂの断片をアガロースゲ
ル電気泳動で単離した。プラスミドｐＭＯＮ７０７を同
様に３ｔｕＩおよび）−１ｉ ｎ ｄ ｍで消化し、Ｍ
ＡＳ−ＮＯ３３’ カセットを含む３．５にｂの３ｔｕ
Ｉ−１１ｉｎｄｌｌ断片をアガロースゲル電気泳動およ
びＩＭ ＮａＣ１溶出によるＤＥＡＥメンブレンでの
回収により単離した。これらの二つのＤＮＡｆｆ１片を
結合し、得られるプラスミドをｐＭＯＮ９７４１と命名
した。本プラスミドはｐＭＯＮ２００の：」インチグレ
イジョンを前置にＭＡＳ−ＮＯ３３′カセツトを含ｌυ
でいる。ＭＡＳプロモーターにより先導されるＢ、ｔ、
ｉハ素キメラ遺伝子が調製された。第１０図に示Ｊよウ
ニ、ｐＭＯＮ９７１１、ｐＭＯＮ９７１２および０Ｍ０
Ｎ９７１３よりＢ、ｔ、ｆｉｊ素遺伝子挿入物をＢａｆ
ＩＩ断片として切り出した。これらの断片の各々をＢｇ
ｊ！ｌ［消化したｐＭＯＮ９７４１と結合した。各々に
ついてＥｃｏＲＩ（１）ＷＨｆＡＣヨリＢ、ｔ、ｒ６ｆ
ｌ遺伝子（１）５’ 末端がＭＡＳプロモーターと隣接
しているクローンを得る。これらのプラスミドをｐＭＯ
Ｎ９７５５、ρＭＯＮ９７５６およびｐＭＯＮ９７５７
と命名し、それぞれＤＭＯＮ９７１１、ＤＭＯＮ９７１
２およびｐＭＯＮ９７１３からのＢ、ｔ、毒素コード配
列を保有している。
クターと比較してトマト中での形質転換頻度が非常に低
下しているものがあるので、ＨｃＣｏｒｗ＋ｉｃｈら（
１９８６年） 、ＭＡＳ−ＮＯ８３′カセツトをｐＭＯ
Ｎ７０７からコインテグレイテイングベクターｐＭＯＮ
２００、Ｅｒａｌｃｖら（１９８５年）、に移した。プ
ラスミド０Ｍ０Ｎ２００を３ｔｕ 丁およびｔ−１ｉｎ
ｄｌ［Ｉｔ’消化して７．７にｂの断片をアガロースゲ
ル電気泳動で単離した。プラスミドｐＭＯＮ７０７を同
様に３ｔｕＩおよび）−１ｉ ｎ ｄ ｍで消化し、Ｍ
ＡＳ−ＮＯ３３’ カセットを含む３．５にｂの３ｔｕ
Ｉ−１１ｉｎｄｌｌ断片をアガロースゲル電気泳動およ
びＩＭ ＮａＣ１溶出によるＤＥＡＥメンブレンでの
回収により単離した。これらの二つのＤＮＡｆｆ１片を
結合し、得られるプラスミドをｐＭＯＮ９７４１と命名
した。本プラスミドはｐＭＯＮ２００の：」インチグレ
イジョンを前置にＭＡＳ−ＮＯ３３′カセツトを含ｌυ
でいる。ＭＡＳプロモーターにより先導されるＢ、ｔ、
ｉハ素キメラ遺伝子が調製された。第１０図に示Ｊよウ
ニ、ｐＭＯＮ９７１１、ｐＭＯＮ９７１２および０Ｍ０
Ｎ９７１３よりＢ、ｔ、ｆｉｊ素遺伝子挿入物をＢａｆ
ＩＩ断片として切り出した。これらの断片の各々をＢｇ
ｊ！ｌ［消化したｐＭＯＮ９７４１と結合した。各々に
ついてＥｃｏＲＩ（１）ＷＨｆＡＣヨリＢ、ｔ、ｒ６ｆ
ｌ遺伝子（１）５’ 末端がＭＡＳプロモーターと隣接
しているクローンを得る。これらのプラスミドをｐＭＯ
Ｎ９７５５、ρＭＯＮ９７５６およびｐＭＯＮ９７５７
と命名し、それぞれＤＭＯＮ９７１１、ＤＭＯＮ９７１
２およびｐＭＯＮ９７１３からのＢ、ｔ、毒素コード配
列を保有している。
プラスミドｐＭＯＮ９７５５、ｐＭＯＮ９７５６および
ｐＭＯＮ ９７５７は前述のようにしてトマト植物体を
形質転換するのに使用できる。そこから再生されるトマ
ト植物体は感受性のａｍ目幼虫に対して有効な７８性を
示づ。
ｐＭＯＮ ９７５７は前述のようにしてトマト植物体を
形質転換するのに使用できる。そこから再生されるトマ
ト植物体は感受性のａｍ目幼虫に対して有効な７８性を
示づ。
全長または新月痛素道伝子（ｐＭＯＮ２９７．１）ＭＯ
Ｎ８０５３、ｐＭＯＮ９７１１ 、ＣＭＯＮ９７１２お
よびｐＭＯＮ９７１３）を含む中四体ベクターをＩ’ｒ
ａｌｅｙら（１９８５年）により記載される不活性化Ｔ
ｉプラスミドＩ）Ｔ ｉ １３６ＳＥを含む＾ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｃｆａｃｉｅｎｓ Ｇ Ｖ
３１ Ｉ Ｓ Ｅ株に導入した。ｐＴ ｉ Ｂ６ＳＥと
これらの中間体ベクターのコインテグレートを保有する Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｎ＋ ｔｕｍｃｆａｃｉｅｎ
ｓ株を記載のとＪ３つに選択した。
Ｎ８０５３、ｐＭＯＮ９７１１ 、ＣＭＯＮ９７１２お
よびｐＭＯＮ９７１３）を含む中四体ベクターをＩ’ｒ
ａｌｅｙら（１９８５年）により記載される不活性化Ｔ
ｉプラスミドＩ）Ｔ ｉ １３６ＳＥを含む＾ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｃｆａｃｉｅｎｓ Ｇ Ｖ
３１ Ｉ Ｓ Ｅ株に導入した。ｐＴ ｉ Ｂ６ＳＥと
これらの中間体ベクターのコインテグレートを保有する Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｎ＋ ｔｕｍｃｆａｃｉｅｎ
ｓ株を記載のとＪ３つに選択した。
トマトの形質転換および再生
上述の＾ｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ ｔｕｍｃｆａｃｉ
ｅｎｓ株を用いての形質転換および転換細胞の再生はＨ
ＣＣＯｒｌｌｌｉＣｋら（１９８６年）に記載されるよ
うに行なった。
ｅｎｓ株を用いての形質転換および転換細胞の再生はＨ
ＣＣＯｒｌｌｌｉＣｋら（１９８６年）に記載されるよ
うに行なった。
形質転換トマト植物体のし虫飼育アッセイＢ、ｔ、キメ
ラ還伝子を含む形質転換トマトおよびタバコの毒性を試
験昆虫を用いた飼育アッセイにより測定した。ある実験
では葉を植物体からとり、一枚ずつまたは５枚までのグ
ループで、湿めらせた滅菌濾紙を入れた８２Ｍの滅菌ベ
トリ皿に首いた。５〜１０個の幼虫を葉にのせ、３・〜
７０問飼ってその間の幼虫の生死Ｊ３よび相対リイズを
記録した。また別に、４インヂのボットに生資さＵたト
マト植物体の菓に幼虫を１８種してプラスチックの箱で
囲う。熟したトマト果実は昆虫幼虫を直接果実に接種し
てその毒性を調べた。アッセイは全て室温で行なった。
ラ還伝子を含む形質転換トマトおよびタバコの毒性を試
験昆虫を用いた飼育アッセイにより測定した。ある実験
では葉を植物体からとり、一枚ずつまたは５枚までのグ
ループで、湿めらせた滅菌濾紙を入れた８２Ｍの滅菌ベ
トリ皿に首いた。５〜１０個の幼虫を葉にのせ、３・〜
７０問飼ってその間の幼虫の生死Ｊ３よび相対リイズを
記録した。また別に、４インヂのボットに生資さＵたト
マト植物体の菓に幼虫を１８種してプラスチックの箱で
囲う。熟したトマト果実は昆虫幼虫を直接果実に接種し
てその毒性を調べた。アッセイは全て室温で行なった。
１１４ 育アッセイに用いたＨａｎｄｕｃａ ５ｃｘｔ
ａはＣａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏａｉｃａｌ ５ｕｐ
ｐｌｙ Ｃｏ、から卵として冑、仝温で１化して１化後
直ちに菓または植物体に接種した。
ａはＣａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏａｉｃａｌ ５ｕｐ
ｐｌｙ Ｃｏ、から卵として冑、仝温で１化して１化後
直ちに菓または植物体に接種した。
トマト中のｐＭＯＮ９７１１
植物形質転換用ベクターｐＭＯＮ９７１１を用いて形質
転換した２つのトマト植物体を単離し、＃３３７および
＃３４４と命名した。
転換した２つのトマト植物体を単離し、＃３３７および
＃３４４と命名した。
これらの２植物体からの葉でＨａｎｄｕｃａ ５ｅｘｔ
ａの飼育アッセイを３回行なった。その結果を第２表に
まとめである。
ａの飼育アッセイを３回行なった。その結果を第２表に
まとめである。
第２表
３３７ Ｂ、ｔ、（９７１１） ＋ ８７ ４０
６７ １００３／１４ Ｂ、ｔ、（９７１１）
＋ ８７ ８２ １００ １００
Ｔ３０ なし −２２０００ これら２種の植物で飼育すると、非形質転換トマトまた
はＢ、ｔ、ｌ素遺伝子を含まないトランスジェニックな
植物の場合と比較して、Ｈａｎｄｕｃａ ５ｅＸｔａの
有意な死滅が観察された。
６７ １００３／１４ Ｂ、ｔ、（９７１１）
＋ ８７ ８２ １００ １００
Ｔ３０ なし −２２０００ これら２種の植物で飼育すると、非形質転換トマトまた
はＢ、ｔ、ｌ素遺伝子を含まないトランスジェニックな
植物の場合と比較して、Ｈａｎｄｕｃａ ５ｅＸｔａの
有意な死滅が観察された。
＃３３７および＃３４４の植物の菓を用いて１１ｅｌｉ
ｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの飼育アッセイを２回
行なった。アッセイの結果を第３表に示す。
ｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの飼育アッセイを２回
行なった。アッセイの結果を第３表に示す。
第３表
７’／セイ Ｔｅ５ｔ＃ Ｉ Ｔｅ５ｔ＃
２（４日） （４日） ３３７ Ｂ、ｔ、（９７１１） −＋−１００１０
０３４４Ｂ、ｔ、（９７１１） ＋
２． ５ ０１゛３０ なし
００ Ｈｃｌｉｏｔｈｉｓ ＶｉｒＯ３ＣＱｎＳの死滅は植物
＃３３７で飼育した時観察されたが＃３４４で飼育した
場合には見られなかった。ｐＭＯＮ９７１１で形質転換
したトマトカルスよりＲＮＡを［１し、カナマイシン耐
性で選択した。いずれの場合にもオリゴ（ｄＴ）ヒル０
−スフ１コマトゲラフイーによりポリ（Ａ）含有ＲＮＡ
を濃縮した。ＲＮＡをホルムアルデヒド存在下でアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、ジーンスフ＋） −ン（Ｇｅ
ｎｅｓｃｒｅｃｎＲ） メン７ Ｌ／ンにプロットした
。メンブレンをＢ、 ｔ、 ２Ｂ素遺伝子を合む３２Ｐ
−標識ＤＮＡでハイブリダイズした。
２（４日） （４日） ３３７ Ｂ、ｔ、（９７１１） −＋−１００１０
０３４４Ｂ、ｔ、（９７１１） ＋
２． ５ ０１゛３０ なし
００ Ｈｃｌｉｏｔｈｉｓ ＶｉｒＯ３ＣＱｎＳの死滅は植物
＃３３７で飼育した時観察されたが＃３４４で飼育した
場合には見られなかった。ｐＭＯＮ９７１１で形質転換
したトマトカルスよりＲＮＡを［１し、カナマイシン耐
性で選択した。いずれの場合にもオリゴ（ｄＴ）ヒル０
−スフ１コマトゲラフイーによりポリ（Ａ）含有ＲＮＡ
を濃縮した。ＲＮＡをホルムアルデヒド存在下でアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、ジーンスフ＋） −ン（Ｇｅ
ｎｅｓｃｒｅｃｎＲ） メン７ Ｌ／ンにプロットした
。メンブレンをＢ、 ｔ、 ２Ｂ素遺伝子を合む３２Ｐ
−標識ＤＮＡでハイブリダイズした。
Ｂ、ｔ、ｆｉ素遺伝子との特異的ハイブリダイぜ−ショ
ンはＩ）ＭＯＮ９７１１転換トマトカルスおよび植物体
＃３３７および＃３４４から調製したＲＮＡで検出され
た。Ｂ、ｔ、特異ＲＮ△は植物＃３３７では＃３４４よ
りも数倍多かった。この差は植物の遺伝子へのＹＪ累遍
伝子挿入に際しての位欝の影響によるものと考えられる
。
ンはＩ）ＭＯＮ９７１１転換トマトカルスおよび植物体
＃３３７および＃３４４から調製したＲＮＡで検出され
た。Ｂ、ｔ、特異ＲＮ△は植物＃３３７では＃３４４よ
りも数倍多かった。この差は植物の遺伝子へのＹＪ累遍
伝子挿入に際しての位欝の影響によるものと考えられる
。
植物体＃３３７からのトマト果実での１１（！１ｉＯ−
ｔｌｌｉＳ ＶｉｒＯ３ＣＯｎＳの飼育アッセイを非転
換果実を対照に行なった。９匹の幼虫＜Ｖｔ化６日目）
を各果実に接種し、４日間飼育しＩζ。試験期間終了後
、幼虫の体重に２つの処理の闇で有意な差があった。
ｔｌｌｉＳ ＶｉｒＯ３ＣＯｎＳの飼育アッセイを非転
換果実を対照に行なった。９匹の幼虫＜Ｖｔ化６日目）
を各果実に接種し、４日間飼育しＩζ。試験期間終了後
、幼虫の体重に２つの処理の闇で有意な差があった。
＃３３７からの果実で飼育した幼虫は平均０．０９１ｇ
（範囲は０．０６１ｇから０．１４４５９）の重さであ
ったのに対し、対照果実で飼育した幼虫は０．１２５６
！Ｆ（範囲＝０．０９３ｇから０．１９０３）の平均型
（品であった。
（範囲は０．０６１ｇから０．１４４５９）の重さであ
ったのに対し、対照果実で飼育した幼虫は０．１２５６
！Ｆ（範囲＝０．０９３ｇから０．１９０３）の平均型
（品であった。
＃３３７の植物からの菓を用いて１ｌｃｌｉｏｔｈｉｓ
ｅａの飼育アッセイを行なった。５白後の幼虫の死滅率
は対照植物に比較して＃３３７の植物で有意に高かった
。＃３３７の葉に接種した２０匹の幼虫の１４匹が死滅
したのに対して対照の葉では２０匹のうち８匹が死滅し
た。
ｅａの飼育アッセイを行なった。５白後の幼虫の死滅率
は対照植物に比較して＃３３７の植物で有意に高かった
。＃３３７の葉に接種した２０匹の幼虫の１４匹が死滅
したのに対して対照の葉では２０匹のうち８匹が死滅し
た。
植物体＃３３７および＃３４４の自己交配によりＦｌの
植物を碧だ。この子孫につき栽培後４〜６週後にＨａｎ
ｄＬＩＣａ ５（ｉＸｔａの飼育アッセイで毒性をテス
トした。またツバリン生産もテストした。
植物を碧だ。この子孫につき栽培後４〜６週後にＨａｎ
ｄＬＩＣａ ５（ｉＸｔａの飼育アッセイで毒性をテス
トした。またツバリン生産もテストした。
＃ ３３７ Ｊ′３よび＃３４４のいずれしそのＦ１子
孫はノバリ生産おＪ：びｍａｎｄｕｃａ ５ｅｘｔａに
対する高度の毒性をイ１シ１こ。多くの子孫ｔま親の形
質転換植物と同じぐらい幼虫に対して毒性を示した。両
植物の子孫とも高レベルの毒性とツバリン生産とに相関
関係があった。
孫はノバリ生産おＪ：びｍａｎｄｕｃａ ５ｅｘｔａに
対する高度の毒性をイ１シ１こ。多くの子孫ｔま親の形
質転換植物と同じぐらい幼虫に対して毒性を示した。両
植物の子孫とも高レベルの毒性とツバリン生産とに相関
関係があった。
トマト中でのｐＭＯＮ９７１２
植物形質転換用ベクターｐＭＯＮ９７１２を用いて形質
転換したトマト植物体を上述のように単離した。この植
物体の自己交配で１１個のＦ１子孫をＩＪ 、 Ｈａｎ
ｄｕＣａ Ｓ（！Ｘｌａの新生幼虫に対する毒性を２つ
の別のテストでアッセイした。幼虫ｆｆ４ ？’７アツ
セイは全植物体を用いて前）本のとおり実施した。
転換したトマト植物体を上述のように単離した。この植
物体の自己交配で１１個のＦ１子孫をＩＪ 、 Ｈａｎ
ｄｕＣａ Ｓ（！Ｘｌａの新生幼虫に対する毒性を２つ
の別のテストでアッセイした。幼虫ｆｆ４ ？’７アツ
セイは全植物体を用いて前）本のとおり実施した。
１１個の子孫の中で９個がツバリン合成酵素を発現し、
これは転換ＤＮＡが存在づることを示した。
これは転換ＤＮＡが存在づることを示した。
９個のツバリン陽性植物の８個で半数以下の幼虫が生存
した。９個のツバリン陽性ｈｆｔ物の２個で２０％以下
の幼虫しか生存しなかった。非転換植物での幼虫の生存
率はおよそ９０％であった。これらの結果はｐＭＯＮ９
７１２で形質転換したトマト植物体での毒性の程度は非
転換植物と比較して有意であることを示す。
した。９個のツバリン陽性ｈｆｔ物の２個で２０％以下
の幼虫しか生存しなかった。非転換植物での幼虫の生存
率はおよそ９０％であった。これらの結果はｐＭＯＮ９
７１２で形質転換したトマト植物体での毒性の程度は非
転換植物と比較して有意であることを示す。
トマト中でのｐＭＯＮ９７１３
植物形質転換用ベクターｐＭＯＮ９７１３を用いて形質
転換したトマト植物体を上述のように中離した。この植
物につぎ上述のとおりにＨａｎｄｕｃａｓｃｘｔａ新生
幼虫に対りるｄｊ性をアッセイした。飼育アッセイで本
植物に接種した１０匹の全ての幼虫が死亡した。非転換
植物に接種した１０匹の幼虫のうち９匹は生存した。
転換したトマト植物体を上述のように中離した。この植
物につぎ上述のとおりにＨａｎｄｕｃａｓｃｘｔａ新生
幼虫に対りるｄｊ性をアッセイした。飼育アッセイで本
植物に接種した１０匹の全ての幼虫が死亡した。非転換
植物に接種した１０匹の幼虫のうち９匹は生存した。
本結果はｐＭＯＮ９７１３で形質転換したトマト植物の
毒性は非転換植物と比較して有意なレベルであることを
示している。
毒性は非転換植物と比較して有意なレベルであることを
示している。
第１図はバヂルス・チューリンゲンシス亜種クルスタキ
ｌ−Ｉ Ｄ −１の結晶蛋白毒素をコードする配列を承
り構造図である。第２図はプラスミドＤＭＯＮ９７３３
の調製法を、第３図はプラスミドｏＭＯＮ９７１２の調
製法を、第７図はプラスミドｐＭＯＮ９７１１の調製法
を、第８図はプラスミドＩ）ＭＯＮ９７１３のｍ製法を
、第９図はプラスミドｐＭＯＮ９７４１のａｌｌ法をそ
れぞれ示を模式図である。第１０図はプラスミドｐＭＯ
Ｎ９７５５、ｐＭＯＮ９７５６およびｐＭＯＮ９７５７
の調整法を示第１１図はプラスミドｐＭＯＮ３１６の構
成を示す模式図である。
ｌ−Ｉ Ｄ −１の結晶蛋白毒素をコードする配列を承
り構造図である。第２図はプラスミドＤＭＯＮ９７３３
の調製法を、第３図はプラスミドｏＭＯＮ９７１２の調
製法を、第７図はプラスミドｐＭＯＮ９７１１の調製法
を、第８図はプラスミドＩ）ＭＯＮ９７１３のｍ製法を
、第９図はプラスミドｐＭＯＮ９７４１のａｌｌ法をそ
れぞれ示を模式図である。第１０図はプラスミドｐＭＯ
Ｎ９７５５、ｐＭＯＮ９７５６およびｐＭＯＮ９７５７
の調整法を示第１１図はプラスミドｐＭＯＮ３１６の構
成を示す模式図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）以下のステップより成る、鱗翅目の幼虫に毒性を
示す遺伝子組換えのトマト植物体の製造方法： （ａ）（ｉ）植物中でｍＲＮＡ転写物の生成を起させる
プロモーター； （ｉｉ）バチルス・チユーリンゲンシスの毒素蛋白をコ
ードするｍＲＮＡの生成を引き起すコード配列；および （ｉｉｉ）トマト植物体でｍＲＮＡの３′末端にポリア
デニル酸ヌクレオチドの付加を起す３′の非翻訳領域 より成るキメラ遺伝子をトマト細胞中の遺伝子に挿入し
； （ｂ）形質転換したトマト細胞を選択し；そして（ｃ）
形質転換したトマト細胞より鱗翅目の幼虫に対して毒性
を示す遺伝的に形質転換したトマト植物体を再生する。 （２）プロモーターがＣａＭＶ３５ＳおよびＭＡＳプロ
モーターより成るグループから選択される特許請求の範
囲第（１）項記載の方法。 （３）コード配列が第１図の１−３４７１のＤＮＡ配列
によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求の
範囲第（２）項記載の方法。 （４）コード配列が第１図の１−２１７０のＤＮＡ配列
によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求の
範囲第（２）項記載の方法。 （５）コード配列が第１図の１−１９３５のＤＮＡ配列
によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求の
範囲第（２）項記載の方法。 （６）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターであ
る特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （７）コード配列が第１図の１−３４７１のＤＮＡ配列
によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求の
範囲第（６）項記載の方法。 （８）コード配列が第１図の１−２１７０のＤＮＡ配列
によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求の
範囲第（６）項記載の方法。 （９）コード配列が第１図の１−１９３５のＤＮＡ配列
によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求の
範囲第（６）項記載の方法。 （１０）（ａ）植物中でｍＲＮＡ転写物の生成を起させ
るプロモーター； （ｂ）バチルス・チユーリンゲンシスの毒素蛋白をコー
ドするｍＲＮＡの生成を引き起すコード配列；および （Ｃ）トマト植物体でｍＲＮＡの３′末端にポリアデニ
ンヌクレオチドの付加を起す３′の非翻訳領域 より成るキメラ遺伝子を含有し、鱗翅目の幼虫に対して
毒性を示す形質転換したトマト細胞。 （１１）プロモーターがＣａＭＶ３５ＳおよびＭＡＳプ
ロモーターより成るグループから選択される特許請求の
範囲第（１０）項記載の形質転換トマト細胞。 （１２）コード配列が第１図の１−３４７１のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（１１）項記載の細胞。 （１３）コード配列が第１図の１−２１７０のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（１１）項記載の細胞。 （１４）コード配列が第１図の１−１９３５のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（１１）項記載の細胞。 （１５）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
ある特許請求の範囲第（１０）項記載の細胞。 （１６）コード配列が第１図の１−３４７１のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（１５）項記載の細胞。 （１１）コード配列が第１図の１−２１７０のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（１５）項記載の細胞。 （１８）コード配列が第１図の１−１９３５のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（１５）項記載の細胞。 （１９）特許請求の範囲第（１０）項記載の形質転換ト
マト細胞より成り、鱗翅目の幼虫に対して毒性を示す分
化したトマト植物体。 （２０）プロモーターがＣａＭＶ３５ＳおよびＭＡＳプ
ロモーターより成るグループから選択される特許請求の
範囲第（１９）項記載の分化したトマト植物体。 （２１）コード配列が第１図の１−３４７１のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（２０）項記載の分化した植物体。 （２２）コード配列が第１図の１−２１７０のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（２０）項記載の分化した植物体。 （２３）コード配列が第１図の１−１９３５のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（２０）項記載の分化した植物体。 （２４）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
ある特許請求の範囲第（２０）項記載の分化したトマト
植物体。 （２５）コード配列が第１図の１−３４７１のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（２４）項記載の分化した植物体。 （２６）コード配列が第１図の１−２１７０のＤＮＡに
よりコードされる蛋白質をコードしている特許請求の範
囲第（２４）項記載の分化した植物体。 （２７）コード配列が第１図の１−１９３５のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（２４）項記載の分化した植物体。 （２８）（ｉ）植物中でｍＲＮＡ転写物の生成を起すプ
ロモーター； （ｉｉ）バチルス・チユーリンゲンシスの毒素蛋白をコ
ードするｍＲＮＡの生成を起すコード配列；および （ｉｉｉ）植物中でｍＲＮＡの３′末端にポリアデニル
酸ヌクレオチドの付加を起す３′の非翻訳領域 より成る植物キメラ遺伝子。 （２９）プロモーターがＣａＭＶ３５ＳおよびＭＡＳプ
ロモーターより成るグループから選択される特許請求の
範囲第（２８）項記載の植物キメラ遺伝子。 （３０）コード配列が第１図の１−３４７１のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（２９）項記載の植物キメラ遺伝子。 （３１）コード配列が第１図の１−２１７０のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第２９）項記載の植物キメラ遺伝子。 （３２）コード配列が第１図の１−１９３５のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（２９）項記載の植物キメラ遺伝子。 （３３）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
ある特許請求の範囲第（２８）項記載の植物キメラ遺伝
子。 （３４）コード配列が第１図の１−３４７１のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（３３）項記載の植物キメラ遺伝子。 （３５）コード配列が第１図の１−２１７０のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（３３）項記載の植物キメラ遺伝子。 （３６）コード配列が第１図の１−１９３５のＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質をコードしている特許請求
の範囲第（３３）項記載の植物キメラ遺伝子。 （３７）蛋白毒素がバチルス・チユーリンゲンシスの亜
種クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）からのもので、形質
転換植物体がマンジユカ（Ｍａｎｄｕｃａ）およびヘリ
オチス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）属の鱗翅目およびスボド
テラ・エキシグア（Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ
）に対して毒性を示す特許請求の範囲第（６）項記載の
方法。 （３８）蛋白毒素がバチルス・チユーリンゲンシスの亜
種クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）からのもので、形質
転換植物体がマンジユカ（Ｍａｎｄｕｃａ）およびヘリ
オチス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）属の鱗翅目およびスボド
テラ・エキシグア（Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ
）に対して毒性を示す特許請求の範囲（１５）項記載の
細胞。 （３９）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
あり、蛋白毒素がバチルス・チユーリンゲンシスの亜種
クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）からのもので形質転換
植物体がマンジユカ（Ｍａｎｄｕｃａ）およびヘリオチ
ス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）の鱗翅目およびスボドテラ・
エキシグア（Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）に対
して毒性を示す特許請求の範囲第（２０）項記載の分化
したトマト植物体。 （４０）蛋白毒素がバチルス・チユーリンゲンシスの亜
種クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）からである特許請求
の範囲第（３３）項記載の植物キメラ遺伝子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US93281886A | 1986-11-20 | 1986-11-20 | |
| US932818 | 1997-09-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63160577A true JPS63160577A (ja) | 1988-07-04 |
Family
ID=25462994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62293047A Pending JPS63160577A (ja) | 1986-11-20 | 1987-11-19 | 害虫耐性のトマト植物体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0269601B2 (ja) |
| JP (1) | JPS63160577A (ja) |
| AT (1) | ATE94209T1 (ja) |
| DE (1) | DE3787350T2 (ja) |
| ES (1) | ES2003838T3 (ja) |
| IL (1) | IL84536A0 (ja) |
| ZA (1) | ZA878674B (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB8823068D0 (en) * | 1988-09-30 | 1988-11-09 | Ici Plc | Recombinant dna |
| EP1103616A3 (en) | 1989-02-24 | 2001-06-27 | Monsanto Company | Synthetic plant genes and method for preparation |
| US5188960A (en) * | 1989-06-27 | 1993-02-23 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins |
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6803499B1 (en) | 1989-08-09 | 2004-10-12 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6777589B1 (en) | 1990-01-22 | 2004-08-17 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| JP3209744B2 (ja) | 1990-01-22 | 2001-09-17 | デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション | 結実能力のある遺伝子変換コーン |
| US6946587B1 (en) | 1990-01-22 | 2005-09-20 | Dekalb Genetics Corporation | Method for preparing fertile transgenic corn plants |
| US6329574B1 (en) | 1990-01-22 | 2001-12-11 | Dekalb Genetics Corporation | High lysine fertile transgenic corn plants |
| PL295547A1 (ja) * | 1990-04-26 | 1992-10-05 | Plant Genetic Systems Nv | |
| US6395966B1 (en) | 1990-08-09 | 2002-05-28 | Dekalb Genetics Corp. | Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein |
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