JPS6316117B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はグルコキナーゼ含有量の高い菌体の製
造法に関するものであり、さらに詳しくはバチル
ス属に属する好熱性細菌を特定の条件で連続培養
することからなる単位菌体あたりのグルコキナー
ゼ含有量の高い菌体の製造法に関するものであ
る。 近時、酵素は、酵素反応の特徴である反応、基
質、光学の各特異性にすぐれている点などが注目
され、医療分析、食品分析等に広く触媒として利
用されている。なかでも、体液中のグルコースの
含有量の測定は、臨床検査の面で重要であること
はよく知られている。また、食品中のグルコース
の含有量の分析も転化糖工業の分野などで重要な
検査項目となつている。このような成分を分析す
るに際し、近年、グルコキナーゼを用いる方法が
すでに述べたとおり、酵素の非常にすぐれた反
応、基質、光学の各特異性の利点から広く利用さ
れている。この点でグルコキナーゼは重要な酵素
である。 このグルコキナーゼを採取する方法は、グルコ
キナーゼが菌体内酵素であるため菌体を破壊して
得た上澄から抽出する方法が一般であり、そのた
め上澄には菌体由来の種々の物質が混在し目的と
する酵素の分離精製は非常に困難である。例え
ば、菌体破壊後ストレプトマイシンによる除核酸
を行い、得られた上澄を硫酸アンモニウム塩析す
ることにより粗酵素沈澱を得た後、DEAEセルロ
ースカラムクロマトグラフイ、ヒドロキシアパタ
イトカラムクロマトグラフイ、ウルトロゲルカラ
ムクロマトグラフイ、DEAEセフアデツクスカラ
ムクロマトグラフイなどの煩雑な工程を経て精製
が行われている。これらのことから目的とするグ
ルコキナーゼの単位酵素あたりの製造費が高く、
グルコキナーゼの工業的な展開に著しい支障とな
つている。 一方、グルコキナーゼ製造上のもう一つの問題
として菌体の生産性のの低さがあげられる。すな
わち、このグルコキナーゼは菌体内酵素であるた
め、その生産性を上げようとすれば、一般的には
回分法で培養している発酵槽中に逐次栄養源を添
加したり、加圧あるいは酸素通気により酸素移動
容量係数を増加させるなどで菌体量を増す方法が
考えられる。しかしながら、これらの培養方法で
は対数増殖期を継続させることが困難で、静止期
に移行しつつある菌体を得る傾向にあるため、目
的とする菌体内酵素含有量が低下したり、培養に
長時間を要するなどの欠点があつた。また、培地
の消費、酸素の消費が激しいためにコストがかか
り、最終的な菌体量を増加させることはできる
が、単位時間、単位培養コストあたりの目的菌体
量及び酵素の生産性はむしろ低下することが通例
である。事実、グルコキナーゼ生産能を持つ細菌
にこの従来知られている方法をあえて適用してみ
ると、菌体中のグルコキナーゼ含有量は回分法で
培養し、菌体生産性をおさえて、対数増殖中期に
得た菌体に比べると著しく低下している。 つぎに菌体内酵素の単位発酵槽あたりの生産性
を増す方法として、単細胞蛋白（シングル・セ
ル・プロテイン）の生産に代表される連続培養法
が考えられる。しかしながら菌体内酵素の生産
は、菌体の生産性のみを目的とした連続培養法と
異なり、種々の要因、例えば栄養培地中の炭素源
と窒素源との濃度の比、酸素移動速度、PH及び菌
の増殖期などが複雑にからみあつているため、バ
ツチ法の結果をもとに、これを単に連続化するこ
とで酵素の生産を効率良く行う条件を設定するこ
とは困難である。この連続培養法で菌体内酵素等
の生産を行うとすれば、例えば、特開昭53―
52690号に記載されているように、比増殖速度、
溶存酸素濃度、残留基質濃度などの最適条件の組
合せを詳細に検討する必要があり、さらに、この
ようにして条件を設定しても、目的とする酵素等
が違えは全く新しく改めて検討する必要があるこ
とから、連続培養法は工業的にはほとんどかえり
みられていないのが現状である。 一般にエネルギー代謝系に関与するグリセロキ
ナーゼ、酢酸キナーゼ、グルコキナーゼなどの酵
素は、構成酵素と呼ばれ、培養条件に拘わること
なく菌体中に生産されることが知られている。例
えば、ジヤーナル・オブ・アプライド・バクテリ
オロジー、38巻、301〜304頁（1975）には、連続
培養法を用いて菌体内酵素であるロダナーゼ・グ
リセロキナーゼの生産を検討したことが記載され
ている。その中で単位菌体あたりの酵素含有量が
栄養培地中の炭素源の種類によつて左右され、希
釈率には全く影響されないと記載されている。ま
た、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、133
巻、２号、992〜1001頁（1978）には、大腸菌で
単位菌体あたりの酢酸キナーゼ含有量と比増殖速
度との関係を連続培養法によつて検討したことが
記載されている。その中で単位菌体あたりの酢酸
キナーゼ含有量と比増殖速度との間に相関が見ら
れなかつたと記載されている。さらに、ジヤーナ
ル・オブ・アプライド・ケミストリー・アンド・
バイオテクノロジー、26巻、334〜325頁（1976）
には、バチルス・ステアロサーモフイラスでα―
アミラーゼの生産を検討したことが記載されてい
る。その中でα―アミラーゼは菌体外酵素であ
り、なおかつ構成酵素ではなく、二次代謝産物で
あることから、希釈率とα―アミラーゼの生産と
は反比例すると記載されている。 そこで、本発明者らは、このような観点からグ
ルコキナーゼを効率良く得ることは是非とも必要
なことであることから、連続培養法でグルコキナ
ーゼを効率良く得ることを目的として鋭意研究し
た結果、連続培養時の希釈率を特定の範囲に制御
しながら連続培養を行うと、驚くべきことに、単
位菌体あたりのグルコキナーゼ含有量が回分法で
得られた単位菌体あたりのグルコキナーゼ含有量
の最大値よりも高い菌体が得られることと同時に
菌体の生産性も高まることを見い出し、本発明に
到達した。 すなわち、本発明はグルコキナーゼ生産能を持
つバチルス属に属する好熱性細菌を培養するに際
し、希釈率(D)を下記(イ)を満足する条件で連続培養
することを特徴とするグルコキナーゼ含有量の高
い菌体の製造法である。 Ｄ≧0.9μmax (イ) 〔但し、Ｄは希釈率（１／hr）、μmaxは細菌
を連続培養する際のその連続培養条件におけるそ
の細菌の最大比増殖速度（１／hr）を表わす。〕 本発明におけるグルコキナーゼ生産能を持つバ
チルス属に属する好熱性細菌としては、耐熱性グ
ルコキナーゼを生産しうるバチルス属の細菌であ
ればいかなるものでも使用できる。好ましい細菌
としては、例えば、バチルス・ステアロサーモフ
イラス（Bacillus stearothemophilus）があげら
れる。ステアロサーモフイラスとして具体例は
ATCC7953（微工研菌寄第4775号）ATCC8005（微
工研菌寄第4776号）、ATCC10149（微工研菌寄第
4778号）があり、増殖も早くかつ菌体あたりのグ
ルコキナーゼ含有量も高いことから適しており、
中でもATCC7953、ATCC10149、NCA1503が連
続培養時の安定性及びその他の操業性も良く工業
的に有望である。 本発明における細菌を培養するに際して用いら
れる栄養培地において炭素源として、グルコー
ス、シユークロース、フラクトース、澱粉加水分
解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等の糖類、酢酸、
乳酸等の有機酸類、さらには使用する細菌が資化
しうるアルコール類、油脂、脂肪酸およびグリセ
リン等が使用でき、窒素源として硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、ア
ンモニウム、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵
母エキス等の無機または有機物が使用できる。さ
らに、無機塩類としてカリウム、ナトリウム、リ
ン酸、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、
カルシウム、コバルト等の各塩類、必要に応じて
微量金属塩、コーン、ステイープ・リカー、ビタ
ミン類、核酸等を使用してもよく、細菌の一般的
栄養培地が使用できる。 本発明における培養条件は溶存酸素濃度が
0.5ppm以上の好気的培養が好ましい。培養温度
は使用する菌株が好熱性細菌であることから40〜
75℃、好ましくは48〜61℃、PH4.5〜9.0、好まし
くは6.0〜8.0で細菌の生育可能な範囲で培養すれ
ばよい。 本発明における希釈率〔ダイリユウシヨンレイ
ト（dilution rate）、以下Ｄという。〕とは、下記
の式(1) Ｄ＝Ｆ／Ｖ (1) Ｄ；希釈率（１／hr） Ｆ；発酵槽に原料液を供給する速度および同時
に発酵槽より抜出す速度（ｌ／hr） Ｖ；発酵槽中の液量（ｌ） によつて表わされるものである。 本発明におけるμmaxとは、細菌を連続培養す
る際のその連続培養条件における細菌の最大比増
殖速度（１／hr）をいい、物質環境型連続培養
（ケモスタツト；ハルベルト、エルスワース、テ
リング、ジヤーナル・オブ・ジエネラル・ミクロ
バイオロジー、14巻、８号、601〜622頁、1956
年）でＤを高め、菌濃度が定常値を保てなくなつ
た時、すなわち、いわゆるウオツシユ・アウト時
に測定される比増殖速度をいう。本発明における
好熱性細菌を使つてμmaxを求めるには、例えば
２〜30l容発酵槽に栄養培地を1.5〜20l仕込み、40
〜75℃、好ましくは48〜61℃、PH4.5〜9.0、好ま
しくはPH6.0〜8.0に保ちながら、この細菌を接種
し、回分培養を行い、菌の生育が始まり、培養液
中の炭素源が0.01重量％以下になつた時、発酵槽
に仕込んだものと同組成の栄養培地を用いて生育
制限因子が炭素源のみである連続培養を開始す
る。こうすることによつて、物質環境型連続培養
法（ケモスタツト）が設定できる。連続培養が定
常になつた後、Ｄを段階的に順次高めて行き、発
酵液中の菌濃度と、残存炭素源量とを経時的に測
定し、さらにＤを次第に高め、菌の比増殖速度を
超えた時、定常値を保つていた菌濃度が減少しは
じめ、それに反し炭素濃度が上昇しはじめ、もは
やこれ以上のＤでは連続培養の定常性が保てなく
なつた時、これをウオツシユ・アウトといい、こ
の時の比増殖速度がμmaxになる。 このμmaxは使用する栄養培地の種類や培養条
件によつて同一菌株でもさまざまに変化するが、
これらの組合せが変らなければ一定値を示すので
一度測定すれば長期にわたつて信頼できる数値と
なる。 本発明においてはＤを、本発明に使用する細菌
のμmaxの0.9以上に制御して連続培養することが
必要である。すなわち、Ｄを本発明に使用する細
菌のμmaxの0.9以上に保つて連続培養して得た菌
体のグルコキナーゼ含有量は、回分法で得られた
単位菌体あたりのグルコキナーゼの最大値をしの
ぎ、かつ菌体の生産性も高まり、特にＤをμmax
付近に保つた場合、菌体中のグルコキナーゼ含有
量は実に回分法の1.3倍に向上する。一方、Ｄを
0.9μmax未満に保つて連続培養した菌体のグルコ
キナーゼ含有量は回分法よりも低下する。 本発明において、通常の前培養および回分培養
で希望の菌濃度まで培養した後、連続培養に移
し、Ｄの制限を実施することができる。その時期
は培養期間中の何れの時期でもよいが、望ましく
は、バツチ培養時の対数増殖末期に連続培養に移
し、すみやかに所定のＤに固定するのが有利であ
る。 次に、本発明の一実施態様をバチルス・ステア
ロサーモフイラス・NCA1503の例をあげて説明
すると、グルコースを炭素源とした栄養培地を用
い、最適温度（57℃）、最適PH（6.8）、30l容発酵
槽（20l仕込み）で物質環境型連続培養を行つて
μmaxを測定したところ、μmax＝1.1（１／hr）で
あつた。従つてＤ＝μmaxの連続培養を行うに
は、同組成の新しい栄養培地を１時間あたり、発
酵槽仕込み液量の1.1倍、すなわち前記(1)式より
2.2l／hrの速度で連続的に定量ポンプなどを用い
て発酵槽中に供給し、同時に同速度で培養液を抜
出せばよい。 本発明によつて得られた菌体からグルコキナー
ゼを単離するには常法、すなわち菌体を破砕後、
遠心分離して得られた酵素液に有機溶媒または各
種の塩類を加えて分画精製したり、坦体に吸着さ
せて精製するなどの方法が適用できる。これらの
一例として前述した方法に従つて精製を行い、得
られた結晶の物性を元素分析、紫外部の吸光度、
分子量測定等で検討した結果、従来の回分法で製
造された菌体より得たグルコキナーゼと全く一致
していた。 本発明によつて培養収穫した菌体は単位菌体あ
たりのグルコキナーゼ含有量がバツチ法での菌体
と比べて高く、かつ菌体の生産性も高いので、グ
ルコキナーゼを効率良く得ることができ、かつグ
ルコキナーゼ単位重量あたりの抽出精製コストを
大きく低下させることができる。また本発明が連
続培養法であり、Ｄのみによつて培養管理ででき
ることから、培養の制御が容易であり、さらに培
養条件の維持を自動化することができるなどの利
点がある。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。
なお、グルコキナーゼ生産性はグルコキナーゼ含
有量（Ｕ／ｇ乾燥菌体）×菌体生産性（ｇ乾燥菌
体／ｌ／hr）で求めた。 実施例１、２、比較例１、２、３ 使用菌株；バチルス・ステアロサーモフイラ
ス・ATCC7953。 栄養培地組成；グルコースを炭素源として他の
組成を次のごとくのものを使用した。 グルコース2.0g、（NH₄）₂SO₄2.0g、酵母エキス
（オリエンタル酵母社製）1.0g、KH₂PO₄1.0g、
Na₂HPO₄―12H₂O1.0g、MgSO₄―7H₂O0.1g。
以上のものを水道水１に溶解した。 前培養；上記組成の栄養培地を100ml容三角フ
ラスコに20ml、500ml容三角フラスコに100mlずつ
分注し、綿栓後121℃、１Kg／cm²、10分間加圧蒸
気殺菌した。冷却後100ml容三角フラスコにアメ
リカン・タイプ・カルチヤ・コレクシヨンより入
手した凍結乾燥菌体を約５mg無菌的に接種した。
ロータリー・シエイカー（高崎製作所製）を用い
て55℃で一昼夜回転振盪培養（160rpm）したと
ころ、菌体の生育が見られ、濁度が高まり、
660nmの吸光度（日立製作所製101型分光光度計
で測定、以後OD660nmと称す）が0.8〜1.0に達し
たので、これを次に500ml容三角フラスコに約５
ml接種した。同条件で数時間500ml容三角フラス
コを回転振盪培養したところ、OD660nmが1.0程
度に達したので回転振盪培養を中止し、これを前
培養物として本培養への接種に用いた。 本培養；30l容発酵槽（丸菱理化装置製MSJ―
Ｕ型平羽根タービン式）に、上記組成の栄養培地
を20張込み、121℃、11Kg／cm²で15分加圧蒸気
殺菌した。培養条件を57±１℃、PH6.5〜7.0（4N
NaOHで調整）、通気量20／分（空気）、撹拌
数900rpmに設定後、前培養物を約１接種しバ
ツチ培養を開始した。培養に伴い発泡したので消
泡剤（信越化学KM―70）を少量添加した。菌体
の増殖をOD660nmで追跡したところ、対数増殖
が起こり、約2.5時間でOD660nmが1.0に至り、培
養液中のグルコースがほとんど消費されたので
（ソモジネルソン法で測定）、連続培養に移した。
前もつて測定した本菌株のμmaxが1.2（１／hr）
であつたので、前記組成の殺菌済み栄養培地を
24.0／hrの速度で定量ポンプを用いて連続的に
供給し、同速度で発酵槽より培養液を抜出すこと
でＤを1.00μmax（実施例１）に設定し、発酵槽液
量の５倍量の栄養培地を用いて連続培養して菌体
を得た。 次にＤを段階的にμmaxの0.90〔（21.6／hr）
実施例２〕、0.83〔（20.0／hr）比較例１〕、0.06
〔（16.0／hr）比較例２〕に変更し、連続培養し
たがいずれの場合もそれぞれ発酵槽液量の５倍量
の栄養培地を使つて連続培養して菌体を得た。 このようにして得た菌体中のグルコキナーゼ含
有量を測定して、その結果を表―１に示す。な
お、表―１に比較として回分培養で得た値（比較
例３）も併記したが、これは連続培養に移行する
前の回分培養時に得た菌体の値である。

【表】 表―１の結果から明らかなように、Ｄが
0.9μmax以上では単位菌体中のグルコキナーゼ含
有量が回分法で得られるよりも高く、酵素の精製
コスト低減がみこめられ、かつ菌体の生産性も良
いため、それらの相剰効果でグルコキナーゼの生
産性は回分法の4.2倍に向上している。一方、Ｄ
が0.9μmax未満では単位菌体あたりのグルコキナ
ーゼ含有量が回分法よりも低下するため、菌体の
生産性が回分法よりも良いが、抽出精製コストが
大きく、実用的ではない。 実施例３、４、比較例４、５ 使用菌株；バチルス・ステアロサーモフイラ
ス・NCA1503。 栄養培地組成；グルコースを炭素源として他の
組成を次のごとくのものを用いた。 グルコース1.3g、酵母エキス（オリエンタル酵
母社製）1.0g、ペプトン（デイフイコ製）0.5g、
KH₂PO₄0.5g、Na₂HPO₄―12H₂O0.5g、MgSO₄
―7H₂O0.1g、ZnSO₄―7H₂O0.01g、MnSO₄―
7H₂O0.01g、CuSO₄―5H₂O0.01g、COCl₂―
6H₂O0.01g。以上のものを水道水１に溶解し
た。 前培養；上記栄養培地を用い、実施例１と同様
の方法で前培養を行つた。 本培養；30容発酵槽を用い、上記栄養培地を
20張込み殺菌を行つた（121℃、１Kg／cm²、15
分）。 培養条件を55±１℃、PH6.5〜7.0（4N NaOHで
調整）、通気量20／分（空気）、撹拌数900rpm
に設定後、実施例１と同様に回分培養を行つた。 培養開始後約2.5時間でOD660nmが1.2（0.56g乾
燥菌体／ｌ）に至り、培養液中のグルコースがほ
ぼ消費され、0.01重量％以下になつたので、すみ
やかに連続培養を開始した。前もつて測定した本
菌のμmaxが1.4（１／hr）であつたので、前記し
た殺菌済みの栄養培地を28.0／hrの速度で連続
的に供給、同速度で発酵槽より培養液を抜出すこ
とでＤを1.00μmax（実施例３）に設定し、発酵槽
液量の５倍量の栄養培地を用いて連続培養して菌
体を得た。次に実施例１と同様にしてＤを段階的
にμmaxの0.90〔（供給抜出速度25.2／hr）実施
例４〕、0.75〔（21.0l／hr）比較例４〕に変更し、
連続培養を行つて菌体を得た。 このようにして得た菌体中のグルコキナーゼ含
有量を測定して、その結果を表―２に示す。な
お、表―２に比較として回分培養で得た値（比較
例５）も併記したが、これは連続培養に移行する
前の回分培養時に得た菌体の値である。

【表】 表―２に示したごとく、菌株が変つてもＤと単
位菌体あたりのグルコキナーゼ含有量の関係が成
立し、Ｄが0.9μmax以上において生産した菌体は
回分法をしのぐグルコキナーゼ含有量を示した。 実施例５、６、比較例６、７ 使用菌株；バチルス・ステアロサーモフイラ
ス・NCA1503。 栄養培地組成；実施例３の培地組成中、炭素源
をグルコースからグリセリン1.3gに変えたものを
用いた。 前培養；グリセリンを炭素源とした栄養培地を
用いて実施例２と同様の方法で前培養を行つた。 本培養；実施例２と同様にして回分培養を開始
し、約３時間培養を行つたところ、OD660nmが
0.9（0.48g乾燥菌体／）に達したところで培養
液中のグリセリン濃度が0.01重量％以下（島津製
作所製ガスクロマトグラフイーGC−3BT、５％
ポリエチレングリコール20Mカラム、170℃にて
測定）に達したので、連続培養を開始した。グリ
セリンを炭素源とし、前もつて測定した本菌の
μmaxは1.1（ｌ／hr）であつたので、この値をも
とに実施例１と同様にしてＤを段階的に
1.00μmax〔（22.0／hr）実施例５〕、0.90μmax
〔（19.8／hr）実施例６〕、0.075μmax〔（16.5／
hr）比較例６〕に変更し、連続培養を行つて菌体
を得た。 このようにして得た菌体中のグルコキナーゼ含
有量を測定して、その結果を表―３に示す。な
お、表―３に比較として、回分培養で得た値（比
較例７）も併記したが、これは連続培養に移行す
る前の回分培養時に得た菌体の値である。

【表】 表―３に示したごとく、栄養培地中の炭素源を
グルコースからグリセリンに変えても、Ｄと単位
菌体あたりのグルコキナーゼ含有量の関係は変ら
ずＤを0.9μmax以上に制御して得た菌体は、回分
法で得た菌体よりも高いグルコキナーゼ含有量を
示し、本発明の普遍性を確認した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルコキナーゼ生産能を持つパチルス属に属
   する好熱性細菌を培養するに際し、希釈率(D)を下
   記(イ)を満足する条件で連続培養することを特徴と
   するグルコキナーゼ含有量の高い菌体の製造法。 Ｄ≧0.9μmax (イ) 〔但し、Ｄは希釈率（１／hr）、μmaxは細菌
   を連続培養する際のその連続培養条件におけるそ
   の細菌の最大比増殖速度（１／hr）を表わす。〕 ２ グルコキナーゼ生産能を持つバチルス属に属
   する好熱性細菌がバチルス・ステアロサーモフイ
   ラスである特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ バチルス・ステアロサーモフイラスがバチル
   ス・ステアロサーモフイラス・ATCC7953である
   特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ４ バチルス・ステアロサーモフイラスがバチル
   ス・ステアロサーモフイラス・ATCC 8005であ
   る特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ５ バチルス・ステアロサーモフイラスがバチル
   ス・ステアロサーモフイラス・ATCC10149であ
   る特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ６ バチルス・ステアロサーモフイラスがバチル
   ス・ステアロサーモフイラスNCA 1503である特
   許請求の範囲第２項記載の製造法。