JPS63164880A - 動物細胞の培養方法及び培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞の増殖に必要な酸素の供給及び装置に係り
、特に機械攪拌式培養槽にて培養するのに好適な動物細
胞の培養方法及び培養装置に関する。

〔従来の技術〕

機械攪拌式培養槽で動物細胞を増殖させるとき培養槽内
上部に気相部に存在する酸素が液面を介して液相部に溶
解することで必要な酸素は供給されているにのときの酸
素の移動速度（気相から液相への溶解速度）は培養液容
量当りの気液界面積及び気液界面の更新に係わる攪拌機
（羽根）の回転数の影響を強く受ける。ところが、回転
数の増加はせん断力の増大に繋がり、細胞が損傷を受け
るに至る為、限界がある。また動物細胞培養用の培養液
に血清を使用する為、通気攪拌を行うと発泡が激しく槽
内容積に対する液量比を小さくせねばならない。更には
、培養液が泡となって溢流して培養の継続が不能になっ
てしまう。その為、微生物培養のように大量通気９強攪
拌によって酸素の移動速度（気相から液相への溶解速度
）を上げることができないことから、改良が試みられて
きた。

改良の試みとして、■酸素含有ガスを培養液に通気して
、気液界面積を増加させようとするもの、■液面を攪拌
しく乱し）、気液界面の更新を促すものとがある。■に
ついては文献１　：　Ａｎｎ、ＮｅｖＹｏｒｋＡｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＶｏＱ４１３Ｐｐ、３６１〜３６４（１９８
３）、■につぃては文献２：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖ　ｏ　
Ｑ　ＸＸＸ■。

Ｐｐ、１２２〜１２５　（１９８５）において述べられ
ている。しかし、未だ満足すべき装置及び方法は開発さ
れていない。

従来技術には上記したような欠点があり、各所でその改
良が試みられているのが現状であるが。

問題点を以下に詳述する。

■通気攪拌方式 培養液に酸素含有ガスを吹き込み（通気）、更に攪拌羽
根にて液を攪拌すると共に吹き込みガスを液内に分散さ
せることを目的としている。この方法は、ガスが液中で
小気泡を形成し、滞留する為気液界面面積が増加し、酸
素移動速度が速くなる効果を有する。しかし、動物細胞
培養に使用する培養液には血清など蛋白質成分が多く、
極めて発泡し易い性質をもっている。また発泡は細胞膜
の分解を引き起す（文献１）といわれており、細胞増殖
を妨げる原因となる。これらの対策として。

消泡剤（界面活性剤）の添加が考えられるが、微生物細
胞と異なり、動作細胞は界面活性剤に対する抵抗性が弱
く、増殖阻害を起す為、使用できない。毒性が弱く、か
つ有効なものは見出されていない。

これに対して発泡による損傷から細胞を保護するために
アルギン酸ソーダなどの半透性のカプセルに細胞を包括
し、該カプセルを培地内に浮遊させ、案内に酸素含有ガ
スを吹き込んで発泡状態で培養する発明がある。しかし
、この方式ではカプセルを無菌的に調製できる装置が必
要であり、培養システムが複雑となる。また、発泡に伴
い排気系に培地が入り込むため、除菌フィルターの目詰
り防止や配管の清掃施策が要求される。

■液面攪拌方式 この方法は攪拌軸に液面を乱す為の羽根を設は液面を攪
乱し、気液接触面積を増加させようとするものである（
文献２）　ａ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｅｒａｔｏｒと呼ば
れる羽根は低速回転ではそれなりの効果を有するが、高
酸素移動速度を得る為に高速回転させると泡立て機と同
様の作用となる。そこで気相部に酸素ガスを注入するこ
とで酸素移動速度を向上させる試みがなされている。

〔発明が解決しようとする問題点３ 以上のように、従来技術では操作条件と培養液の発泡性
との係わりについての配慮が不十分であり、高密度培養
実現に対する大きな制限因子の１つになっている。

本発明の目的は、培養液を発泡させることなく。

効率よく酸素を液中に供給できる動物細胞の培養方法及
び培養装置を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、機械攪拌式の培養槽において液面上部の気
相空間に単一もしくは複数個の気体吹き込みノズルを液
面に向けて設け、該ノズルから酸素含有ガスを連続的に
吐出して液面に逆円錐状の凹みを形成することで達成で
きる。

第１の発明の特徴は、動物細胞を機械攪拌式の培養槽に
て培養するに当り、培養液の攪拌を液面の乱れやボルテ
ックス形成を抑えながら行ない、かつ吹き込みノズルか
ら酸素含有ガスを液面に向けて連続的に吐出し、液面に
凹みを形成させる動物細胞の培養方法にある。この場合
、上記ノズル先端から静止液面までの距離をｈａｍとし
、ガスの吹き込み量Ｑ　（ａｄ／ｓｅｃ　）とノズル先
端でのガス線速度ｖ　（ａＩ／ｓｅｅ　）との積ｆａを
とり、この値を２．５Ｘ１０’Ｘｈ（ｃｍ番／ｓｅｃ”
）以下となるように操作することが望ましい、したがっ
て、ノズル穴径１ｍの場合を考えると、上記ノズルから
吐出する酸素含有ガスの液面に対し垂直方向の液面での
線速度を５　ｍ　／　ｓ以上６５ｍ／ｓ以下とすること
が望ましい。

第２の発明の特徴は、動物細胞を機械攪拌式の培養槽に
て培養する装置において、液面上部の気相空間に酸素含
有ガスを連続的に吐出するための単一もしくは複数個の
気体吹込みノズルを液面に向けて設置したことを特徴と
する動物細胞の培養装置にある。

この場合、培養液を攪拌するための攪拌羽根が、中央部
を抜いた矩形板を１／２回転ひねった構造であることが
望ましい。

第３の発明の特徴は、動物細胞を分散した培養液を攪拌
機で攪拌しながら培養槽にて培養するにあたり、培養液
の液面を実質上平滑に保ちつつ培養液の攪拌を行い、か
つ多数の吹き込み穴を有する吹き込みノズルから酸素含
有ガスを液面に向けて連続的に吐出し、液面に多数の凹
みを形成させ酸素ガスを培養液に溶解する動物細胞の培
養方法にある 第４の発明の特徴は、動物細胞を分散した培養槽の培養
液を機械攪拌しながら培養する方法において、培養液の
発泡及び該動物細胞の破壊を防止しながら培養液の攪拌
をすること、及び吹き込みノズルから酸素含有ガスを液
面に向けて吐出し、液面に凹みを形成させながら酸素ガ
スを培養液に溶解させること、を有する動物細胞の培養
方法にある。

第５の発明の特徴は、動物細胞を機械攪拌式の培養槽に
て培養するにあたり、培養液の攪拌を液面の乱れやボル
テックス形成を抑えながら行い、かつ吹き込みノズルか
ら酸素含有ガスを液面に向けて連続的に吐出し、液面に
凹みを形成し凹みの底部から液面に向かう培養液の流れ
を形成しつつ酸素ガスを培養液に溶解させる動物細胞の
培養方法にある。

第６の発明の特徴は、動物細胞を分散する培養液を収容
する培養槽と、該培養液を攪拌する攪拌機と及び該培養
液の液面に酸素ガスを供給する手段とを有する培養装置
において、液面上部の気相空間に、酸素含有ガスを液面
に向けて連続的に吐出するための気体吹き込みノズルを
設置した動物細胞の培養装置にある。

第７の発明の特徴は、動物細胞を分散する培養液を収容
する培養槽と、該培養液を攪拌する攪拌機と及び該培養
液の液面に酸素ガスを供給する手段とを有する培養装置
において、液面上部の気相空間に、酸素含有ガスを液面
に向けてほぼ垂直に吐出するための気体吹き込みノズル
を設置した動物細胞の培養装置にある。

第８の発明の特徴は、動物細胞を分散する培養液を収容
する培養槽と、該培養液を攪拌する攪拌機と及び該培養
液の液面に酸素ガスを供給する手段とを有する培養装置
において、酸素含有ガスを液面に向けてほぼ垂直に吐出
するための気体吹き込みノズルと、該ノズルからの吐出
圧力を制御し該液面に凹みを形成する制御手段を有する
動物細胞の培養装置にある。

第９の発明の特徴は、培養槽の培養液に分散された動物
細胞を機械攪拌しながら培養する方法において、培養液
の発泡及び該動物細胞の破壊を防止しながら培養液の攪
拌をすること、及び吹き込みノズルからｉ素含有ガスを
液面に向けて垂直方向に５ｍ／秒〜６５ｍ／秒（但しノ
ズルの穴径をＩＩとして計算した場合の液面での線速度
）の速度で吐出し、液面に凹みを形成させがら酸素ガス
を培養液に溶解させること、を有する動物細胞の培養方
法にある。

以下、本発明を図を用いてさらに詳細に説明する。

第１図において、培養槽１は、攪拌羽根３によって培養
液を攪拌する機械攪拌式槽である。攪拌羽根３は、攪拌
モーター４の駆動軸に取り付けられ、該攪拌モーター４
により回転する。なお、攪拌羽根３の回転は、マグネッ
ト方式でも良く、特に限定するものでない、槽内には液
面に酸素含有ガスを吐出するガス吹き込み管２．ＰＨセ
ンサー６、溶存酸素センサー７及び温度センサー８が設
置されている。また、恒温水槽５は、培養槽１を加温す
るものである。給気口１１及び排気口１２に取り付けた
除菌フィルター１３は０．２〜０．４５μｍの孔径であ
り、酸素含有ガス中の雑菌を除くと同時に排気口１２か
らの雑菌進入を防ぐものである。なお、排気に伴う培養
液の水の蒸散を抑えるため、培養温度の飽和蒸気圧に近
い値で蒸気圧を調整した酸素含有ガスを培養槽１に供給
する。

このため、フィルター材質は結露になる目づまりの少な
いテフロンなどの疎水性のものを使用する。

第２図は、ガス吹き込み管２の一例である。ガス吹き込
み管２は、緩衝管２ａ、吹き込みノズル２ｂ及び送気管
２ｃにより構成される。酸素含有ガスは、送気管２ｃを
通して緩衝管２ａに入り、緩衝管２ａの下部に取り付け
られた各々の吹き込みノズル２ｂから均圧にて連続的に
吐出される。

吹き込みノズル２ｂのガス吐出面は、液面に向けられる
が、好適には静止液面に平行とすると良い。

また、吹き込みノズル２ｂの穴径及びガス吐出間の液面
までの距離は、吐出したる酸素含有ガスにより液面に逆
円錐状の凹みを形成できる条件にあれば良い。ノズル穴
径１ｍの場合には吐出したる酸素含有ガスの液面での垂
直方向に対する線速度を５ｍ／ｓ以上となるようにすれ
ば、液面に逆円錐状の凹みを形成できる。吹き込みノズ
ル２ｂの数は、特に限定するものではなく、最大の酸素
移動速度の得られる数に設定すると良い、複数個の吹き
込みノズル２ｂを設置する場合、液面の凹みが重ならな
いように平面的に位置を決める。と良い。

ところで、液表面の乱れが多い場合、吹き込みノズル２
ｂから吐出した酸素含有ガスにより、液内にガスを巻き
込んで発泡を引き起こす。

また、液表面に深いボルテックスが形成される場合、吹
き込みノズル２ｂの液面までの距離が遠くなり液面に凹
みが形成されない、したがって、好適な液面は、乱れの
少ない平らなものが良い。

液面の乱れやボルテックスの形成は、主に攪拌羽根３の
形状に左右されるので、適切なものを選定する必要があ
る。第１図に示した中央部の抜けた矩形の攪拌羽根３は
、液面の乱れやボルテックスの形成を抑えることのでき
る一例である。

以下、装置に係わる動物細胞の培養操作について第１図
を用いて述べる。

動物細胞は、固体表面に付着生育するものと、浮遊状態
で増殖できるものに大別できる。前者の場合、マイクロ
キャリアー法、即ち、デキストランなどのマイクロビー
ズに細胞を付着させて、該ビーズを浮遊させることで、
浮遊状態で培養できる。したがって、浮遊培養に係わる
本発明は、上記両種の動物細胞に対して使用できる。

培地は、培地供給口９から培養槽１に無菌的に仕込まれ
る。培地は、ガス吹き込み管２を設置するのに必要な最
少限の空間（液面からノズル吐出面までの距離も含める
）を残して仕込むことができるが、好適な仕込み率は４
０〜７０％である。

培養は、培地供給口９から種細胞が接種されて開始され
る。培養液の温度は、温度センサー８の信号により温度
制御計が働き恒温水槽５に送られる温水の温度及び流量
が調節されて、所要範囲に制御される。培養初期では５
％程度の炭酸ガスを含む酸素含有ガスが、液面に凹みを
形成しない流量でガス吹き込み管２から培養槽１の気相
部に送られる。増殖に必要な酸素は、該気相部から液面
を介して供給される。細胞濃度が低密度では、溶存酸素
濃度は、増殖の制限因子となるレベルにない。

この時の攪拌羽根３の回転数は、細胞を充分に均一分散
できる値があれば良い、そして細胞の増殖に伴い酸素消
費量が増加し溶存酸素濃度が増殖の制限因子となるレベ
ルにまで低下した時から酸素吹き込みガスにより液面で
の凹み形成を開始する。

即ち、酸素センサー７からの信号を受けた溶存酸素制御
計により酸素含有ガスの吹き込み量の調整弁を開き、液
表面での垂直方向での線速度が５ｍ／ｓ以上となるよう
に吹き込み量を増加させる。

増加のタイミングは、１０〜３０分間毎に溶存酸素濃度
のレベルを判定して該制限因子となるレベル以下である
時とする。また、高レベルの溶存酸素濃度は却って増殖
を阻害する。したがって、溶存酸素濃度を、増殖の制限
因子となる値及び増殖阻害を起こす値の間にあるように
、吹き込み量を制御することになる。上記範囲内で溶存
酸素濃度を上記操作で制御すると、細胞濃度の増加と共
に酸素含有ガスの吹き込み量は徐々に増加する。ところ
が、ガス吹き込み管に吹き込んだガス量とノズル先端に
おけるガス線速度との積であるｆａが２　、５　Ｘ　１
０　’Ｘ　ｈ　（ａｍ’／ｓｅｃ”）より大きくなると
。

ノズル径ＩＩＩＩｌの場合にはガス吹込み管２の吹き込
みノズル２ｂから吐出された酸素含有ガスの液面におけ
る垂直方向の線速度が、６５ｍ／ｓｅｃより大きくなり
、液内に気泡が入り込み、培養液の発泡を引き起こす、
即ち、吹き込みガス量には限界がある。したがって酸素
含有ガスの吹き込み量が。

限界値より大きくなる場合は、酸素含有ガスの酸素分圧
を高くすると良い。

ところで、細胞濃度がＩ　Ｘ　１０Ｂ個／　ｍ　Ｑ　以
上の高密度では、老廃物が蓄積し、また栄養源が不足す
る。このため、培養液取り出し口１０から培養液を取り
出し、細胞を無菌的に分離する。そして該細胞を新しい
培地とともに培地供給口９から培養槽１に戻す、この操
作は間けつ的あるいは連続でも良い、なお、細胞の分離
方法については特に限定するものでない、ところが、こ
の操作だけでは、ＰＨ値が最適値以下となる。これは、
細胞濃度の増加に伴い炭酸ガスの発生量及び発生速度が
増加し、溶存炭酸ガス濃度が増加するためである０本発
明では、炭酸ガスの液相と気相との交換が良好に行なわ
れる。したがって、ｐＨセンサー６の信号を受けたｐＨ
計により、酸素含有ガスと炭酸ガスの混合比を変える、
即ち、ｐＨ値が最適値以下となった時に炭酸ガスの混合
比を下げた酸素含有ガスを吹き込むことで、液相の炭酸
ガスを気相に排出してＰＨ値を上昇させることができる
。

この時、炭酸ガスの混合比の低下割合は、０．１〜０．
５％　として徐々に行うと良い、また、乳酸の蓄積量の
多い場合、重炭酸ソーダなどのアルカリ剤の添加を併用
すると効果的である。

〔作用〕

前記ノズルから液面に向かって酸素含有ガスを連続的吐
出せしめ、液面に逆円錐状の凹みを形成させることは、
凹みによる気液界面積を増加させること、及び吐出ガス
が逆円錐状の凹みの底部から液面に向かう流れを強制的
に作ることとなり気液界面の更新率が高められることの
作用によって酸素移動速度を向上させることができる。

このとき、ノズルから吐出したる酸素含有ガスの被表面
での運動エネルギーを被表面を押し下げる程度とすれば
、被表面の張力を破って液相への酸素含有ガスの入り込
みがない、即ち、培養液の発泡を抑えることができる。

以上の作用により、培養液の発泡を抑えて、酸素移動速
度を向上させることができる。

〔実施例〕

実施例１ 本発明による酸素含有ガス吹き込み機構を有する培養槽
における溶存酸素計を用いたガスアウト法により水系で
の酸素移動容量係数を求めた。

使用した培養槽の構造は、第１図に示すもので、内容積
は５Ｑである。槽本体は、パイレックスガス製で外径１
６０ｍｍ、高さ２７０ｍｍである。ガス吹き込み管は、
１４φの管を外径７８ｍ＋＋ａの円型ドーナツ型の融衝
管下部にノズル穴径１ｍの吹き込みノズル６個を６０°
間かくでノズル穴部が水平に取り付けた構造である。ま
た、攪拌羽根は、第３図に示す２種を供試した。攪拌羽
根Ａは、幅８０■、高さ１１００ａ＋の板で幅５０＋ｍ
、高さ６０閤で中央部を抜いた矩形板を１７２回転ひね
った構造である。攪拌羽根Ｂは、幅８０ｍ＋、高さ１０
０Ｉの矩形板を１７２回転でひねった構造である。

両羽根とも槽底部から２０ｍの位置に底部がくるように
攪拌軸に取り付けた。なお、ガス吹込み管や攪拌羽根の
材質は５ＵＳ３１６を使用した。

上記構造の培養槽に蒸留水２．５２　を仕込み。

ガス吹き込み管は、ノズル穴部が水面から２０ｍｍとな
るように取り付けた。まず、窒素ガスを液中に通気して
、溶存酸素濃度をゼロに付近まで下げ、次いで、槽の気
相部を空気で置換後、所定の条件で攪拌及びノズルから
の空気の吐出を開始した。

溶存酸素計にて溶存酸素濃度の増加の経時変化を求めて
、同データから酸素移動容量係数を求めた。

なお、測定温度は、３７±１℃とし、また、吹き込む空
気は予め上記温度の飽和蒸気圧に調整したものを使用し
た。

第６図は、各吹き込み量におけるノズルから吐出したる
空気の液面での垂直方向の線速度と酸素移動容量係数を
示したものである。攪拌羽根は、Ａを使用し、回転数は
８０ｒｐｍと一定とした。また、空気の通気量は０〜２
２　Ｑ　／ｗｉｎとした。ノズルから吐出したる空気の
液面での垂直方向の線速度は、水を抜いた槽にて熱線流
量計にてノズル吐出面から２０ｍでの流速を測定した値
を用いた。

液面での凹みは、該線速度が５　ｍ　／　ｓ以上で形成
され、それと同時に酸素移動容量係数が増加した。

なお、該線速度が５　ｍ　／　ｓ以下での酸素移動容量
係数は、従来法、即ち、槽上部の気相部から液面を通し
て酸素が移動する場合の値であった。また。

ノズル穴径が１ｍのものは、該線速度６５ｍ／ｓ以上で
は酸素移動容量係数が、急激に増加した。

これは、気泡の液内へ巻込が原因であった。そこで、血
清を１０％混合して、発泡テストを行ったところ、該線
速度が６５ｍ／ｓ以上では、著しい発泡を引き起こすこ
とがわかった。

次に、攪拌羽根の違いによる効果を検討するため、第３
図に示す攪拌羽根ＡとＢにて酸素移動速度係数を測定し
た。第７図は、攪拌羽根Ａ、第８図は攪拌羽根Ｂの場合
である。前者は、酸素移動速度が攪拌羽根の回転数に比
例して増加したのに対して、後者では、８０ｒｐ園で最
大となり、それ以降減少した。この違いは、前者では攪
拌数の回転数が増加しても液面の乱れも少なく平である
のに対して、後者ではボルテックスを形成するためであ
ることがわかった。即ち、ノズル吹き出し面から、液面
までの距離がボルテックスにより遠くなる液面での空気
の線速度が遅くなるためである。

この結果から、攪拌羽根は、回転によりボルテックスの
生じないものを選定しなければならないことがわかった
。

ところで、酸素移動速度を向上せしめる方法として、酸
素富化ガスを利用すると良い、そこで、酸素４０％の酸
素富化ガスを用いて、酸素移動容量係数を測定した。測
定条件は、攪拌羽根Ａを用いて、回転数を８０ｒｐａ＋
と一定とした。また、酸素富化ガスの通気量は、１２．
５ｆｆｉ／ｍ　とした。

測定結果を第７図に示す、空気を用いた場合に比べ１．
５倍程向上させることがわかった。本発明と酸素富化ガ
スを組合せることで、より高い酸素移動容量係数が得ら
れ効果的である。

実施例２ 実施例１で用いた装置において、ノズル穴径を０．３，
０．４９１．Ｏｆ　２．５及び５１ｍとした場合の各々
の条件での酸素移動容量係数を求めた。

測定条件は、次の通りである。各ノズルは、ガス吹き込
み管に６個をノズル六角が水面から２０−となるように
取り付けた。槽内の蒸留水の仕込み量は、２．５Ｑ、ま
た、攪拌羽根Ａを用いて、回転数は、８０ｒｐｍ一定と
した。なお、測定温度は、３７±１℃とし、測定方法は
、実施例１と同じガスアウト法である。

測定結果を第４図に示す１図において、ｆｏは、次に述
べるようにガス吹き込み管に吹き込んだガス量とノズル
先端におけるガス線速度との積である。

機械設計便覧〔機械設計便覧編集委員会編、丸善株式会
社発行、昭和３３年（１９５８）６月２５日〕２頁１５
０４において、平板に噴流が直角に当たる場合の平板に
がかる力Ｆは、■式のように示されている。

Ｆ＝（１７ｇ）　　Ｑｖ　　　　　　　　　　　・・・
■γは流体の単位体積の重量２ｇは重力加速度。

Ｑは流量、■は噴流の速さを示す。

ノズルから噴き出したガスの液面を押す力は上記式より
吹き込みガス流量とノズル先端におけるガス線速度との
積に比例すると考えられた。そこで、各条件におけるノ
ズル１個当りの吹き込みガス流量ｑ　（ａ＃／ｓｅｅ　
）及びノズル先端でのガス線速度ｖ　（ｃｍ／ｓｅｅ　
）を計算し、吹き込みガスの液面を押す力Ｆａを求めた
。即ち、ノズル１個当りから吹き出すガスの液面を押す
力ｆは、■式と考えた。

ｆ＝ｋＸｑＸｖ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　・・・■に：比例定数 したがって、ＦＯは、■式となる。

Ｆａ＝　６　Ｘ　ｆ　　　　　　　　　　　　　　　・
・・■ところで、ｑは、０式 ％式％ ＱＧ　；ガス吹き込み管に吹き込んだガス量であるので
、Ｆａは、０式となる。

Ｆｏ＝ｋＸＱａＸｖ　　　　　　　　　　　　−−−■
（０式において、ＱａＸｖ　　をｆａとした。）第４図
によれば、ノズル穴径を変えても、ｆ。

が同一であれば、酸素移動容量係数（ｈ−１）は、はぼ
同じであることが判明した。即ち、吹き込みガスの液面
を押す力が、同一であればノズル穴径を変えても同一の
酸素移動容量係数を得られることがわかった。また、各
ノズル穴径ともｆａ値が、３、ＯＸ　１０’　（（ａＪ
／５ｅｅ）”）では液中にガスを巻き込むのが１！察さ
れた。

この結果から、予め任意のノズルを用いて酸素移動容量
係数とｆａ値との関係を求めておけば、ノズル径を変え
た場合において、液面での線速度を測定せずどもｆａ値
を計算することで、酸素移動容量係数を求めることがで
きる。

実施例３ 実施例２に於いて、ノズル六回と静止水面との距離を変
えた時の吹き込みガスの液中への巻き込みが生じ始める
ｆａ値を求めた。

第５図に結果を示すｓＦａは、液中へのガス巻込みが生
じ始めた時のｆａ値である。ノズル六回と水面との距離
は、１，２．３及び４ａａとした。

図よりガスの液中への巻き込みが始まるｆａ値は、ノズ
ル六回と水面との距離に比例することが判明した。した
がって、図からノズル六回と静止水面との距離をｈａｍ
とすると、ガスの液中への巻き込みが生じないｆａ値は
、２．５　Ｘ　１０”Ｘ　ｈ（■’／ｓｅｅ”）以下と
すれば良いことがわかる。

実施例４ 実施例１で使用した培養槽にて培養試験を行った。なお
、比較例として従来法での培養試験を行った。

供試細胞は、ＪＴＣ−１（ラット復水肝ガン由未の株化
細胞で浮遊性）を用いた。また、培地は、ＤＭ−１６０
（極東製薬製）に新生仔牛血清１０％混合したものを使
用した。培地の仕込み量は、２．５Ｑ　とした、攪拌羽
根は、第３図のＡタイプを使用し、ガス吹き込み管のノ
ズル吹き出し面は。

液面から２０１とした。

培養条件は、次の通りである。攪拌羽根の回転数は８０
ｒｐｍ一定とし、培養温度は、３６±１℃にて制御した
。酸素含有ガスは、空気と炭酸ガスの混合ガスとし、予
め温度３７℃の温水にスパージングして飽和蒸気圧とし
たものを使用した。そして０．４５μの除菌フィルター
を通して、槽内に供給した。培養初期では該混合ガスを
液面に凹みを形成させない通気量０　、２　Ｑ　／＋ａ
ｉｎで通気した。

なお、炭酸ガス初期の濃度は５Ｖ／Ｖ％とした。

吹き込み酸素含有ガスによる液面での凹み形成の開始は
、溶存酸素濃度が２　ｐｐｍ以下となった時点とした。

それ以後、溶存酸素濃度が２　ｐｐｍとなるように、酸
素含有ガスの吹き込み量を制御した。

炭酸ガスの混合割合の減少は、細胞濃度１．５×１０８
個／ｍΩ　の時点から行った。なお、比較例では、炭酸
ガス濃度５Ｖ／Ｖ％の空気混合ガスを通気量０　、２　
ｎ　／＋１ｉｎ一定で通気した。また、老廃物の除去及
び栄養源の供給を行うため、途中培地交換を行った。そ
め交換率は１００％とした。

培養結果を第９．第１０．第１１図に示す。第９図に示
すように本発明では細胞は、比較例（従来法）と同じ増
殖速度で増加し、比較例が細胞濃度３　Ｘ　１０Ｂ個／
ｍＱ　程度まで頭打ちとなるに対して１．２×１０７個
／　ｍ　Ｑまではほぼ指数的に増殖した、培養期間を通
してのｐＨ値は第１１図に示すように両者とも６９〜７
５の範囲にあり１本株ではｐＨ値は、増殖の制限因子と
はなっていない。したがって、上記の差は１次の理由に
よる。

比較例の溶存酸素濃度は、第１０図に示すように細胞濃
度が１．４Ｘ１０’個／　ｍ　Ｑ以上でほとんどゼロと
なり、増殖の制限因子となっている。これに対して、本
発明では実施例１で示すように高い酸素移動速度が得ら
れるので培養終了まで溶存酸素濃度を１．８〜２　、６
　ｐｐｍとすることができ、増殖に必要な酸素を充分に
供給できたからである。

また、培養期間を通して著しい発泡はなく、培養終了時
の細胞生存率は８５％で培養開始時の８８％に比べ大き
な減少はなかった。

゛以上から、本発明により酸素含有ガスとして空気を用
いた場合でも細胞を従来法の３倍強の高密度で培養でき
ることが確認できた。

ところで、本発明では溶存炭酸ガスの液相と気相の置換
が良好に行なえる。これは、液面での凹み形成を開始し
た時点のｐＨの変化に現れている。

比較例ではｐＨ値は低下するのに対して、本発明では上
昇した。即ち本発明では酸素含有ガスを液面に吐出して
液面に凹みを形成することで液相−気相間の気体に物質
移動を促進し液相の炭酸ガスを良好に気相に排出できた
からである。また、炭酸ガス生成速度の高い高密度培養
でも、本発明では液相−気相間の気体の物質移動素度を
高くできるので、炭酸ガス濃度の低い酸素含有ガスを利
用することで液相から気相への炭酸ガスを排出できる。

このため、第１１図に示すように溶存炭酸ガスの蓄積に
伴うｐＨ値の低下を抑えることができた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、機械攪拌式の培養槽において槽上部の
気相と培養液の液相間との気体の物質移動を培養の発泡
を抑えて促進できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の槽内構造図、第２図は該槽
内に具備したガス吹き込み管の構造図、第３図は該槽内
に具備した攪拌羽根の構造図、第４図は液中へのガスの
巻込みが起こる臨界値を示す線図、第５図はガスの液中
への巻込みが生じ始めたときのｆａ値とノズル食面と水
面との距離との関係を示す線図、第６図はガス吹き込み
管のノズルから吐出したる空気の液面での垂直方向の線
速度と酸素移動速度係数との関係を示す線図、第７図、
第８図は吹き込み空気量をパラメーターとした攪拌羽根
の回転数と酸素移動速度係数との関係を示す線図、第９
図、第１０図及び第１１図は培養試験結果で各々細胞濃
度、溶存酸素濃度及びｐＨの経時変化を示す線図である
。 １・・・培養槽、２・・・ガス吹き込み管、３・・・攪
拌羽根、４・・・攪拌モータ、５・・・恒温水槽、６・
・・ｐＨセンサ、７・・・溶存酸素センサ、８・・温度
センサ、９・・・培地供給口、１ｏ・・・培養液取出し
口、１１・・・給気口。 乎　２　口 第　３　目 （αつ （谷つ 第　４　口 牢住」午開合りのガス吹秀込み量Ｙガス麿ｋｔａヒ　ｋ
、の坪１（子Ｇ（Ｃので５とシぞ（ｊｌ）（０票） 第６０ ノス゛ル０＼ら口丈出つれた空気ウ メ（面τ°の室直方勾６＞線Ｕ （Ｖフイ馳Ｃつ ＊　７　口 撹井羽様の回転数（ＹＦＭ） 第　８２ 攬拝羽木艮の回転数（ｔ”Ｆ’贈） 率　９　膿 珀）時間＜ｄｏ４） 第　１０　口 （の 鑑＋晴間（ｄ岬つ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物細胞を機械攪拌式の培養槽にて培養するに当り
   、培養液の攪拌を液面の乱れやボルテックス形成を抑え
   ながら行ない、かつ吹き込みノズルから酸素含有ガスを
   液面に向けて連続的に吐出し、液面に凹みを形成させる
   ことを特徴とする動物細胞の培養方法。 ２、特許請求の範囲第１項において、一つの吹き込みノ
   ズル先端から静止液面までの距離をｈとしたとき、酸素
   含有ガスの吹き込み量とノズル先端でのガス線速度との
   積が１．０×１０＾３×ｈ以上で２．５×１０＾５×ｈ
   （ｃｍ＾４／ｓｅｃ＾２）以下となるように上記ガスを
   吐出することを特徴とする動物細胞の培養方法。 ３、特許請求の範囲第１項において、吹き込みノズル穴
   径１ｍｍのノズルから吐出する酸素含有ガスの液面での
   垂直方向に対する線速度を５ｍ／ｓ以上６５ｍ／ｓ以下
   となるように上記ガスを吐出することを特徴とする動物
   細胞の培養方法。 ４、動物細胞を機械攪拌式の培養槽にて培養する装置に
   おいて、液面上部の気相空間に酸素含有ガスを連続的に
   吐出するための単一もしくは複数個の気体吹込みノズル
   を液面に向けて設置したことを特徴とする動物細胞の培
   養装置。 ５、特許請求の範囲第４項において、培養液を攪拌する
   ための攪拌羽根が、中央部を抜いた矩形板を１／２回転
   ひねつた構造であることを特徴とする動物細胞の培養装
   置。 ６、動物細胞を分散した培養液を攪拌機で攪拌しながら
   培養槽にて培養するにあたり、培養液の液面を実質上平
   滑に保ちつつ培養液の攪拌を行い、かつ多数の吹き込み
   穴を有する吹き込みノズルから酸素含有ガスを液面に向
   けて連続的に吐出し、液面に多数の凹みを形成させ酸素
   ガスを培養液に溶解することを特徴とする動物細胞の培
   養方法。 ７、動物細胞を分散した培養槽の培養液を機械攪拌しな
   がら培養する方法において、培養液の発泡及び該動物細
   胞の破壊を防止しながら培養液の攪拌をすること、及び
   吹き込みノズルから酸素含有ガスを液面に向けて吐出し
   、液面に凹みを形成させながら酸素ガスを培養液に溶解
   させること、を有することを特徴とする動物細胞の培養
   方法。 ８、動物細胞を機械攪拌式の培養槽にて培養するにあた
   り、培養液の撹拌を液面の乱れやボルテックス形成を抑
   えながら行い、かつ吹き込みノズルから酸素含有ガスを
   液面に向けて連続的に吐出し、液面に凹みを形成し凹み
   の底部から液面に向かう培養液の流れを形成しつつ酸素
   ガスを培養液に溶解させることを特徴とする動物細胞の
   培養方法。 ９、動物細胞を分散する培養液を収容する培養槽と、該
   培養液を撹拌する攪拌機と及び該培養液の液面に酸素ガ
   スを供給する手段とを有する培養装置において、液面上
   部の気相空間に、酸素含有ガスを液面に向けて連続的に
   吐出するための気体吹き込みノズルを設置したことを特
   徴とする動物細胞の培養装置。 １０、動物細胞を分散する培養液を収容する培養槽と、
   該培養液を攪拌する攪拌機と及び該培養液の液面に酸素
   ガスを供給する手段とを有する培養装置において、液面
   上部の気相空間に、酸素含有ガスを液面に向けてほぼ垂
   直に吐出するための気体吹き込みノズルを設置したこと
   を特徴とする動物細胞の培養装置。 １１、動物細胞を分散する培養液を収容する培養槽と、
   該培養液を攪拌する攪拌機と及び該培養液の液面に酸素
   ガスを供給する手段とを有する培養装置において、酸素
   含有ガスを液面に向けてほぼ垂直に吐出するための気体
   吹き込みノズルと、該ノズルからの吐出圧力を制御し該
   液面に凹みを形成する制御手段を有することを特徴とす
   る動物細胞の培養装置。 １２、培養槽の培養液に分散された動物細胞を機械攪拌
   しながら培養する方法において、培養液の発泡及び該動
   物細胞の破壊を防止しながら培養液の攪拌をすること、
   及び吹き込みノズルから酸素含有ガスを液面に向けて垂
   直方向に５ｍ／秒〜６５ｍ／秒（但しノズルの穴径を１
   ｍｍとして計算した場合の液面での線速度）の速度で吐
   出し、液面に凹みを形成させがら酸素ガスを培養液に溶
   解させること、を有することを特徴とする動物細胞の培
   養方法。