JPS63167799A - 微生物菌数測定法 - Google Patents
微生物菌数測定法Info
- Publication number
- JPS63167799A JPS63167799A JP31321686A JP31321686A JPS63167799A JP S63167799 A JPS63167799 A JP S63167799A JP 31321686 A JP31321686 A JP 31321686A JP 31321686 A JP31321686 A JP 31321686A JP S63167799 A JPS63167799 A JP S63167799A
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- Japan
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- microorganism
- specimen
- cytoplasmic membrane
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- microorganisms
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は食品、医薬品、化粧品、水等の中に存在する微
生物の菌数の迅速測定法に関する。食品、医薬品、化粧
品等の製造、品質管理のためにはこれら検体中に含まれ
る少量の微生物の菌数を短時間に測定することが求めら
れる。
生物の菌数の迅速測定法に関する。食品、医薬品、化粧
品等の製造、品質管理のためにはこれら検体中に含まれ
る少量の微生物の菌数を短時間に測定することが求めら
れる。
（従来の技術）
短時間に微生物の菌数を測定する方法として、４−メチ
ル−ウンベリフェロン誘導体（以下、４ＭＵ−誘導体と
略す。）及び、７−ア弯ノー４−メチルクマリン誘導体
（以下、ＡＭＣ−誘導体と略す。）を検体中に含まれる
微生物の酵素で水解させ、生成する４−メチル−ウンベ
リフェロン（以下、 ４ＭＵと略す。）及び７−ブーミ
ノ−４−メチルクマリン（以下、ＡＭＣと略す。）を蛍
光光度計で測定する方法が知られている（特開昭５７−
１４４９９５）。
ル−ウンベリフェロン誘導体（以下、４ＭＵ−誘導体と
略す。）及び、７−ア弯ノー４−メチルクマリン誘導体
（以下、ＡＭＣ−誘導体と略す。）を検体中に含まれる
微生物の酵素で水解させ、生成する４−メチル−ウンベ
リフェロン（以下、 ４ＭＵと略す。）及び７−ブーミ
ノ−４−メチルクマリン（以下、ＡＭＣと略す。）を蛍
光光度計で測定する方法が知られている（特開昭５７−
１４４９９５）。
この方法において、菌体あたシの酵素活性を高め菌検出
感度を上げる目的で、菌体の破壊法としてトルエンなど
の有機溶媒の添加、超音波処理酸Ｆｉフレンチグレスな
どの物理的破壊リゾチームなどの酵素的破壊などを行う
ことは、知られている。
感度を上げる目的で、菌体の破壊法としてトルエンなど
の有機溶媒の添加、超音波処理酸Ｆｉフレンチグレスな
どの物理的破壊リゾチームなどの酵素的破壊などを行う
ことは、知られている。
（発明が解決しようとしている問題点）従来の技術では
、検体ｉｐ戒はＩＩｔｌ！ａ、９１０’個以上の微生物
がいるときには、短時間（３時間以内）で測定すること
が出来る。しかし、これ以下の菌数の検体中の微生物菌
数を測定するには測定前に培養を行い菌数を増やさない
と出来なかつ念、またこの条件で測定出来る菌の種類は
限られており特に細菌類では多くのものが検体中に１０
５〜１０６個以上いないと短時間では測定出来なかつ念
。
、検体ｉｐ戒はＩＩｔｌ！ａ、９１０’個以上の微生物
がいるときには、短時間（３時間以内）で測定すること
が出来る。しかし、これ以下の菌数の検体中の微生物菌
数を測定するには測定前に培養を行い菌数を増やさない
と出来なかつ念、またこの条件で測定出来る菌の種類は
限られており特に細菌類では多くのものが検体中に１０
５〜１０６個以上いないと短時間では測定出来なかつ念
。
（問題点を解決する為の手段）
上記問題点を解決するために１種々検討を行ったところ
微生物を非蛍光物質に対し、微生物のもつ酵素を作用さ
せて蛍光物質を生成せしめ、この蛍光物質を測定するこ
とにより、微生物菌数を測定する方法において該微生物
の細胞膜溶解剤単独従来よりも多くの種類の微生物を検
体１ｇ或は等に存在する細菌ならびに真菌である。
微生物を非蛍光物質に対し、微生物のもつ酵素を作用さ
せて蛍光物質を生成せしめ、この蛍光物質を測定するこ
とにより、微生物菌数を測定する方法において該微生物
の細胞膜溶解剤単独従来よりも多くの種類の微生物を検
体１ｇ或は等に存在する細菌ならびに真菌である。
本発明における非蛍光物質とは、４−メチルウンベリフ
ェロン（以下４ＭＵ誘導体）と、７−アミノ−４−メチ
ル−クマリン誘導体Ｃ以下、ＡＭＣ誘導体と略す）であ
りこれらを１種或は２種以上添加する４ＭＵ−誘導体は
一般式〔１〕で示されるものでＸとしては糖類、アルコ
ール類、無機酸類などであり、該溶液或はけん濁液中に
含まれる微生物の加水分解酵素にエリ水解されることを
防げないものであればよい。
ェロン（以下４ＭＵ誘導体）と、７−アミノ−４−メチ
ル−クマリン誘導体Ｃ以下、ＡＭＣ誘導体と略す）であ
りこれらを１種或は２種以上添加する４ＭＵ−誘導体は
一般式〔１〕で示されるものでＸとしては糖類、アルコ
ール類、無機酸類などであり、該溶液或はけん濁液中に
含まれる微生物の加水分解酵素にエリ水解されることを
防げないものであればよい。
ＡＭＣ−誘導体は、一般式〔ｌ〕で示されるものでＲと
しては分子中の水素の−又は二以上が置換され又は置換
されていないアルキル基、アリル基、アラルキル基およ
び複素環基であり、該溶液又はけん濁液中に含まれる微
生物の加水分解酵素により水解されることを防げないも
のであればよい。
しては分子中の水素の−又は二以上が置換され又は置換
されていないアルキル基、アリル基、アラルキル基およ
び複素環基であり、該溶液又はけん濁液中に含まれる微
生物の加水分解酵素により水解されることを防げないも
のであればよい。
本発明における微生物菌数の測定法とは、一定量の検体
に、４ＭＵ誘導体及びＡＭＣ誘導体を１１！！又は２８
１以上を添加し、２５℃ないし６０℃に保ち生成され虎
７−アきノー４−メチルクマリンを測定することにより
成る微生物菌数の測定法である。検体に含まれる微生物
の菌数が蛍光強度と相関することに基づいて検体中の微
生物の菌数を測定するものである。
に、４ＭＵ誘導体及びＡＭＣ誘導体を１１！！又は２８
１以上を添加し、２５℃ないし６０℃に保ち生成され虎
７−アきノー４−メチルクマリンを測定することにより
成る微生物菌数の測定法である。検体に含まれる微生物
の菌数が蛍光強度と相関することに基づいて検体中の微
生物の菌数を測定するものである。
微生物の菌数を測定する検体は、飲食品、医薬品、化粧
品、飲料水など固体状、液状のもののいずれでもよい、
飲食品としては、固形ｖ４味料や乾燥食品のような固形
物、野菜サラダなどの生野菜や動物性の肉が含まれてい
るもの、一部水分を含むペースト状調味料などのもの、
さしみなどの生鮮魚貝類、ハムや畜肉などの畜産製品な
どが含まれる。固形物を含んでいる検体の場合には、ワ
一二ングプレンダー、ミキサーなどにより検体中の微生
物が死滅しない程度に固形物を微細粒子にホモダナイズ
すれば液状のものと同一に扱うことができる。
品、飲料水など固体状、液状のもののいずれでもよい、
飲食品としては、固形ｖ４味料や乾燥食品のような固形
物、野菜サラダなどの生野菜や動物性の肉が含まれてい
るもの、一部水分を含むペースト状調味料などのもの、
さしみなどの生鮮魚貝類、ハムや畜肉などの畜産製品な
どが含まれる。固形物を含んでいる検体の場合には、ワ
一二ングプレンダー、ミキサーなどにより検体中の微生
物が死滅しない程度に固形物を微細粒子にホモダナイズ
すれば液状のものと同一に扱うことができる。
この様に調整し穴該溶液或はけん濁液を遠心分離し、沈
殿部に４ＭＵ誘導体及びＡＭＣ誘導体を１種或はｚ１以
上添加する。
殿部に４ＭＵ誘導体及びＡＭＣ誘導体を１種或はｚ１以
上添加する。
添加量は該誘導体が該溶液或はけん濁液に溶解する最大
量まで可能であり本発明においては通常１０−５Ｍ添加
する。
量まで可能であり本発明においては通常１０−５Ｍ添加
する。
この時、細胞膜溶解剤１種或は２種以上又はリドリブ四
ピルチン又はこれらの壇は１〜１００μｍ１／ＩＬＩ望
ましくは１〜１０μに爾デカノシルーＮ−メチルグルカ
シド又はこれらの塩は、 １０〜１０００μυ値望ま
しくは、１００〜１０００μに包である。
ピルチン又はこれらの壇は１〜１００μｍ１／ＩＬＩ望
ましくは１〜１０μに爾デカノシルーＮ−メチルグルカ
シド又はこれらの塩は、 １０〜１０００μυ値望ま
しくは、１００〜１０００μに包である。
次に２５ないし６０℃で３０分ないし２時間程度保温す
る。この保温後、反応液中に生成されるＡＭＣ或は４Ｍ
Ｕの蛍光量を定量する。検体中に含まれる微生物菌数と
蛍光量は比例するので、予め求められている相関に基づ
いて該溶液或はけん濁液の蛍光量から検体中の微生物の
菌数を求める。
る。この保温後、反応液中に生成されるＡＭＣ或は４Ｍ
Ｕの蛍光量を定量する。検体中に含まれる微生物菌数と
蛍光量は比例するので、予め求められている相関に基づ
いて該溶液或はけん濁液の蛍光量から検体中の微生物の
菌数を求める。
４、実施例
実施例１
表１に示した菌株を肉エキス１チ、ペプトンｌ−、Ｎａ
Ｃｔｏ、５％、Ａｇａｒ １．５ ％を含有するｐＨ７
，０の平板培地で１７〜２４ｈｒ培養し、生理食塩水に
けん濁し、１０６コ／ｄ程度の菌液を作った。この１ｄ
を試敢管１０本に分注し、４ＭＵ−Ｐ 、 ４ＭＵ−Ｇ
ｔｕ 。
Ｃｔｏ、５％、Ａｇａｒ １．５ ％を含有するｐＨ７
，０の平板培地で１７〜２４ｈｒ培養し、生理食塩水に
けん濁し、１０６コ／ｄ程度の菌液を作った。この１ｄ
を試敢管１０本に分注し、４ＭＵ−Ｐ 、 ４ＭＵ−Ｇ
ｔｕ 。
Ａｒｇ−ＭＣＡ 、 Ｌｅｕ−ＭＣＡを各１０−５Ｍｆ
ｉ有するＰＨ７，０の５０Ｍのバルピトールパッファー
を３ｄ加え表１に示した菌体破壊法を行った０次に、４
０℃で２時間保温した後ｐＨ１１，０の１Ｍグリシンバ
ッファ１〇 −を１ゴ添加した後、蛍光光度計（島津製作所製ＲＦ−
５２０型）を用い励起波長３６０ ｎｎ１ｓ蛍光波長４
５０ｎｍの条件下で、蛍光強度を測定し、菌体破壊を行
なわなかった時の蛍光強度を１００にし九時の各破壊法
の蛍光強度を示した。
ｉ有するＰＨ７，０の５０Ｍのバルピトールパッファー
を３ｄ加え表１に示した菌体破壊法を行った０次に、４
０℃で２時間保温した後ｐＨ１１，０の１Ｍグリシンバ
ッファ１〇 −を１ゴ添加した後、蛍光光度計（島津製作所製ＲＦ−
５２０型）を用い励起波長３６０ ｎｎ１ｓ蛍光波長４
５０ｎｍの条件下で、蛍光強度を測定し、菌体破壊を行
なわなかった時の蛍光強度を１００にし九時の各破壊法
の蛍光強度を示した。
表１゛に示し′ｆＣ工うに、リゾチーム単独の場合、効
果のある菌の種類は限られていた。ま几トルエンの場合
は阻害を示す場合が多くソニック処理は、はとんど効果
がなかった。
果のある菌の種類は限られていた。ま几トルエンの場合
は阻害を示す場合が多くソニック処理は、はとんど効果
がなかった。
しかし、細胞膜溶解剤単独の場合は、はとんどの菌で効
果がみられ念、またリゾチームと併用すると、さらに効
果が倍増した。したがって、より少ない菌で、蛍光が測
定されるようになるため、細胞膜溶解剤単独又はリゾチ
ームと細胞膜溶解剤を添加すれば検出感度が上がること
がいえる。
果がみられ念、またリゾチームと併用すると、さらに効
果が倍増した。したがって、より少ない菌で、蛍光が測
定されるようになるため、細胞膜溶解剤単独又はリゾチ
ームと細胞膜溶解剤を添加すれば検出感度が上がること
がいえる。
を加えストマツカーを用いて均一化した後、１１５℃ｌ
Ｏ分オートクレーブをかけ殺菌した。これを１０威試験
管にとり、生理食塩水にけん濁したパシルス１色しミス
の菌体を１０ 〜１０ 個加えた。
Ｏ分オートクレーブをかけ殺菌した。これを１０威試験
管にとり、生理食塩水にけん濁したパシルス１色しミス
の菌体を１０ 〜１０ 個加えた。
３０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄液を除去
し穴。管底の沈殿部に実施例１で示した酵素基質液を３
ｒｎｌ加え１表１に示した様な処理を行った。
し穴。管底の沈殿部に実施例１で示した酵素基質液を３
ｒｎｌ加え１表１に示した様な処理を行った。
４０℃で２時間保温した後、口ＭのｐＨ１１，０のグリ
シンバッファーを１．ｄ添加し、３０００ ｒｐｍで１
０分間遠心分離を行い、上澄液の蛍光強度を実施例１と
同様の方法で測定した。また対照系として、検体に菌体
を加えないものを同様のフローを行い、試料系との差を
求め次。どの画数に：っで蛍光が検出されたかを表２に
示した 表２に示したように、細胞膜溶解剤とリゾチームを添加
した時は５Ｘ１０’コ／！ｊの菌の添加で蛍光が検出さ
れ次。
シンバッファーを１．ｄ添加し、３０００ ｒｐｍで１
０分間遠心分離を行い、上澄液の蛍光強度を実施例１と
同様の方法で測定した。また対照系として、検体に菌体
を加えないものを同様のフローを行い、試料系との差を
求め次。どの画数に：っで蛍光が検出されたかを表２に
示した 表２に示したように、細胞膜溶解剤とリゾチームを添加
した時は５Ｘ１０’コ／！ｊの菌の添加で蛍光が検出さ
れ次。
Claims (2)
- （１）微生物を非蛍光物質に対し、微生物のもつ酵素を
作用させて、蛍光物質を生成せしめ、この蛍光物質を測
定することにより、微生物菌数を測定する方法において
、該微生物の細胞膜溶解剤単独又はリゾチームと細胞膜
溶解剤を添加することを特徴とする微生物菌数測定方法
。 - （２）細胞膜溶解剤がトリブチルチン、トリプロピルチ
ン、デカノシル−Ｎ−メチルグルカミド又はこれらの塩
より成る群から選ばれる１以上の細胞膜溶解剤である特
許請求の範囲第１項記載の微生物菌数測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31321686A JPH0773511B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 微生物菌数測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31321686A JPH0773511B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 微生物菌数測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63167799A true JPS63167799A (ja) | 1988-07-11 |
| JPH0773511B2 JPH0773511B2 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=18038508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31321686A Expired - Lifetime JPH0773511B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 微生物菌数測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0773511B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013186885A1 (ja) | 2012-06-13 | 2013-12-19 | 旭化成株式会社 | 乳汁中の特定物質を検出する方法 |
| WO2015093545A1 (ja) | 2013-12-18 | 2015-06-25 | 旭化成株式会社 | 乳汁中の大腸菌群を検出する方法 |
| WO2015093544A1 (ja) | 2013-12-18 | 2015-06-25 | 旭化成株式会社 | 乳汁中のブドウ球菌を検出する方法 |
-
1986
- 1986-12-29 JP JP31321686A patent/JPH0773511B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013186885A1 (ja) | 2012-06-13 | 2013-12-19 | 旭化成株式会社 | 乳汁中の特定物質を検出する方法 |
| US10048262B2 (en) | 2012-06-13 | 2018-08-14 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Method for detecting specific substance in milk |
| US10545146B2 (en) | 2012-06-13 | 2020-01-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Method for detecting specific substance in milk |
| WO2015093545A1 (ja) | 2013-12-18 | 2015-06-25 | 旭化成株式会社 | 乳汁中の大腸菌群を検出する方法 |
| WO2015093544A1 (ja) | 2013-12-18 | 2015-06-25 | 旭化成株式会社 | 乳汁中のブドウ球菌を検出する方法 |
| US10345299B2 (en) | 2013-12-18 | 2019-07-09 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Method for detecting coliform bacteria contained in milk |
| US11567076B2 (en) | 2013-12-18 | 2023-01-31 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Method for detecting coliform bacteria contained in milk |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0773511B2 (ja) | 1995-08-09 |
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