JPS63173594A - 発癌遺伝子により誘導される分泌タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト肝癌細胞に発癌遺伝子を導入することに
より得られる細胞から分泌されるわ１規なタンパク質並
びに該タンパク質の製造方法に関する。

［従来の技術］ 従来、癌の診断における１つの手段として、α−フェト
プロティン（ＡＦＰ）や癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等の癌
関連抗原が＋ｔａ瘍マーカーとして利用されてきた。　
　これは、α−フェトプロティンは正常人では胎児器に
産生され、出生後にはほとんど検出されなくなるか、肝
癌が発生すると合成が再び開始され、その血中濃度は正
常値の１．０００培にも達するためである。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、これらの抗原又はそれに対応する抗体の検出試
験のみでは不充分離面もあり、さらに新しい抗原等の開
発が特に望まれている。

［発明の背景］ ところで、ｒ５１在までに腫瘍マーカーとなっているも
のは、すてに腫瘍化した細胞自身から分泌されたもので
あり、腫瘍化細胞に発癌遺伝子を導入して、この系から
得られる細胞による分泌タンパク質に着目された例はな
い。　また、これまでに、リン酸カルシウム法等を利用
して培養動物細胞へ遺伝子を導入し発現させる例は数多
く報告されている（ワインバーブら（Ｗｅ−ｉｎｂｅｒ
ｇ　ｅｔ　　ａｌ、）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）
　＋止１ｆｉ、　５９６−６０２　（１９［１３）　、
等）が、導入遺伝子自身の発現による゛形質転換”に着
目している例かはとんとで、ヒト肝癌培養細胞に発癌遺
伝子を導入し新たに分泌されたタンパク質に注目した例
はない。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、これらの事実にかんがみ、ヒト肝癌細胞
に細胞の癌化過程で重要な役割を果たすと推定されてい
る発癌遺伝子を導入して、いわば発癌過程を解析する１
つのアプローチとして鋭意研究を行っていたところ、こ
れらの系がある種の新規なタンパク質を特異的に分圧、
することを見い出した。　　これらの新規なタンパク質
は、分子量約４６，０００で等電点が７．１〜７．３で
あり、正常血清中には存在しないことから、増殖細胞に
特異的であり、腫瘍に対するマーカーとなり得るものと
考え本発明を完成した。

従って、本発明はこれらの新規なタンパク質及びその製
造方法を提供するものである。

次に、本発明の詳細な説明する。

本発明に用いられる発癌遺伝子としては、細胞の癌化過
程で役割を果たすと推定されるものなら何でもよく、例
えばｃ−ｍｙｃにワトリ刊髄球症ウィルスＭＣ２９のオ
ンコシンＶ−ｎ１５／Ｃに対応するプロトオンコシン）
が例示される。

これらの発癌遺伝子は、その転写活性が示されるエクソ
ン（Ｅｘｓｏｎ）部位を、ヘクターとしての各種プラス
ミドに、必要ならばエンハンサ−（Ｅｎｌｌａｎｃｅｒ
）と共に、常法により絹込むことにより複合プラスミド
として使用される。

プラスミドとしては、選択マーカーをもつものなら河で
も使用する弓とができ、シミアン・ウィルス４０　（Ｓ
Ｖ４０）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片に種々の遺伝子を接続した一
連のプラスミド、例えばｐＳＶ２−ｇｐｔ　、　ｐＲ３
Ｖ−ｃａｔ　、ｐＳＶ２−ｎｅｏ等が挙げられる。

エンハンサ−としては、各種プラスミドのＬＴＲ断片等
が用いられる。

これらから製造される複合プラスミドの一例としては、
プラスミドｐＳＶ２−ｇｐ　Ｌの断片にプラスミドｐＲ
５Ｖ−ｃａｔのＬＴＲ部分と発癌遺伝子Ｃ−１ｎｙＣの
エクソン２及びエクソン３の部分を組込んだ複合プラス
ミド（これをｐＳＶ２　ｍｙｃと呼ぶことにする。）等
が例示される。

次に、本発明に用いられるヒト肝癌細胞としては、例え
ばＨｕＨ−７ｃｌ−４等が用いられる。

細胞への導入は、公知の方法で行えばよく、ヒト肝癌細
胞を培地に０．５Ｘ　１０４〜５Ｘ１０’細胞／ｃｍ２
　の密度てペトリ皿にまき、比較的低酸素分圧下におい
て、すなわちＣＯ２が３〜１０％下で、３７℃において
１〜４日培還した後、発癌遺伝子を組込んだプラスミド
をリン酸カルシウム法等により細胞中に導入する。　　
このときの培地としては、イーグルの最小限必須培地（
ＭＥＭ）　、ダルベツコの改良ＭＥＭ、ＲＰＭｌ−１０
４０等の通常よく使用されているものに、ｌＯ％胎児子
牛の血ｉ＊（Ｆｅ２）を加えた培地が好適である。

発癌遺伝子を絹込んだプラスミドを細胞内に取り込ませ
た後、２〜４日ごとに培地（培養液）を新しいものと交
換しながら培養を続け、常法により生き残った細胞のコ
ロニーを単離しクローニングを行う。

このようにして得られた細胞を１０４〜１０６細胞／ｃ
ｍ２の密度て、イーグルのＭＥＭ、ダルヘッコの改良Ｍ
ＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等の通常よく使用されている
ものに、ｌＯ％牛血清（Ｃ５）　、あるいは５％ＦＣ５
＋５％Ｃ８、あるいは１０％ＦＣＳ等を加えた培地で２
〜４日、３７℃で３〜ｌＯ％ＣＯ２下培養すると目的物
であるタンパク質が培養液中に産生されるので、これら
の培養液を集めて、公知の精製分離法、例えば、塩析、
透析、ろ過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥等で処理するこ
とにより容易に精製分離し、採取することができる。　
　さらにこれらのタンパク質を精製するためには、例え
ば、イオン交換体への吸着・脱着、ゲルろ過、アフィニ
ティークロマトグラフィー、等電点分画、電気泳動等の
公知の方法を必要に応して適宜組み合わせて用いればよ
い。

［作用及び発明の効果コ このようにして得られたタンパク質は、発癌遺伝子の導
入時に特異的に分泌されることから生体内での発癌過程
において、このタンパク質が分泌されている可能性は非
常に高い。　　また、腫瘍化のある一時期のみに分ｄ、
されていたとしても、それに対する抗体が生体内もご残
存する。　　従って、本タンパク質あるいは本タンパク
質に対する抗体検出をラジオイムノアッセイ技術等によ
り行うことにより、癌の早期発見におけるスクリーニン
グ、あるいは治療効果・再発のモタリング等にその有用
性がｌ１１１　ｆ−！ｊされる。

［実施例］ 以下、参考例及び実施例を挙げて発明を説明する。

参考例） ＳＶ−ｒｅ’・ まず、ｐＳＶ２−ｇｐｔ　（第１図の１−ａに構造を示
す。）（プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド
・ステーツφオブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）　、ｎ（４）　＋
２０７０−２０７６（１９８１）参ｐ、ｒｐ　）に制限
酵素ＥｃｏＲＩ。

ＢａｍＨｌを作用させて断片（第１図の１−ｂ　’）を
得る。

別に、ｐＲ５Ｖ−ｃａｔ　（第２図の２−ａに構造を示
す。）（プロシーディング・オブ拳ザ・ナシ、ヨナル・
アカデミ−・オブφサイエンス・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステーツ礫オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）＋皿。

Ｇ７７７−６７８１（１９Ｂ２）参！］りから導かれる
ｐＲ５Ｖ−ｃ　ａ　ｔ　（Ｉ３ａｍＨＩ）　　（第２図
の２−ｂ）にＢａｍＨＩ。

ＨｉｎｄＩＩＩＩを作用させてＬＴＲ断片（第２図の２
−ｃ）を得る。

また、ｃ−ｍｙｃ遺伝子にＸｈｏＩ　、ＨｊｎｄＩＩＩ
を作用させ、エクソン１〜３を含む断片（第３図の３−
ｂ）（セル（Ｃｅｌｌ）、旦、　７７９−７８７　（１
９８３）、参照）を得、これに、ＳｍａＴ　、　Ｉｌｉ
ｎｄｍリンカ−１ＨｉｎｄＩＩｒ、　ＥｃｏＲＩを作用
させてエクソン２及びエクソン３を含む断片（第３図の
３−ｃ）を得る。

以上の１−ｂ、２−ｃ、３−ｃを常法により連結するこ
とにより、複合プラスミドｐＳＶ２−ｍｙｃ（第４図に
構造を示す。）を得ることができる。

（なお、このｐＳＶ２−ｍｙｃ　については、大阪大学
細胞工学センター、谷口維紹氏より譲与を受く。） 実施例） ヒト肝癌培養細胞・）ｌｕＨ−７ｃｌ−４（岡山大学医
学部付属癌源研究施設、佐藤二部氏より譲与を受けたも
ので、キャンサー・リサーチ（Ｃａ−ｎｃｅｒ　Ｒｅ５
ｅｒｃｈ、　弧、　３８５Ｂ−：Ｈ３６３（１９８２）
の記載に従って調製されたものである。）を５×１０５
ｃｅｌｌｓ　ずつ１０ｃｍ−のプラスチック培養ペトリ
皿にまき１０％ＦＣ３を含むＭＥＭ培地（以下、１０％
Ｆ　ＣＳ　−Ｍ　Ｅ　Ｍと略す）中、３７℃、５％ＣＯ
２下で４８時間培養後、ｐＳＶ２−ｍ５／Ｃを最終濃度
５μｇ／ペトリ皿になるよう、リン酸カルシウム法（ウ
ィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒｅｔ　ａｌ、）！セル（Ｃｅ
　ｌ　ｌ）　、Ｊｊ４−　、？２５−７３１　（１９７
１３））に従い細胞に導入した。

１２時間ｐ　Ｓ　Ｖ　２−　ｍ　ｙ　ｃを細胞内に取り
込ませた後、培地を１０％ＦＣＳ−ＭＥＭに換え、４８
時間培養し、その後、培地をセレクション・メディアム
（マイコフェノリック　アシンド１００　ｌ１ｇ／ｍ　
ｌ　、ヒボキサンチン１５　μｇ／ｍｌ。

チミジン１０μｇ／ｍｌ、アミノプテリン２μｇ／ｍ１
．キサンチン２５０　μｇ　／ｍ　ｌを含むｌＯ％Ｆ　
ＣＳ−ＭＥＭ培地）に換え、約３週間培養を続けた。

次にｌＯ％Ｆ　ＣＳ−ＭＥＭ培地て培養を続け、生き残
った細胞のコロニーをカップ法て単離しクローニングを
行い、ｐ　Ｓ　Ｖ　２−　ｍ　Ｖ　ｃ組込み細胞（ＨＭ
　４と略す）を得た。

（ＨｕＨ−７ｃ　Ｉ−４及びｌ−Ｉ　Ｍ　、’ｘの顕微
鏡写真を第５図及び第６図に示した。） ＨＭ　４を１０％Ｆ　ＣＳ−Ｍ　Ｅ　ＭｔＢ地中、３７
℃、５％Ｃ０２下で培養し、１５ｃｍ−のベトリ皿がコ
ンフルエントになった状態で培養上清を取り、フォスフ
ェート・バッフアート・セーライン（Ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ　　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　”　５ａｌｉｎｅ　）（ＰＢ
Ｓ　（−）　）で２回細胞表面を洗った後、血清を含ま
ないＭＥＭ培地に換え、７２時間培養した。　　こうし
て得られた培養上清に硫酸アンモニウムを濃度４０％に
なるように加え、−夜放置後１０．０００　ｇで３０分
間遠心し、上清部分に硫安を１度９０％になるように加
え同様の操作を行った。

遠心により得られたペレットを１０ｍＭリン酸緩衝液　
（ｐＨ６，０）に！Ｑ濁し、−夜回緩衝液で透析した。

　　この透析物を同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロ
−？ｃＬ−６Ｂのカラムにかけ、０．１５Ｍから０．４
ＭのＮａＣｌの直線濃度匂配をかけることにより、目的
のタンパク質（分子量が４６，０００であるのでｐ４（
３と略す）を溶出した。

解析は、１０％アクリルアミドケルを用いた５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより行い、泳動終了後、２５％イソプロパノ−
ルー１０％酢酸で固定し、第一化学のキットを用い銀染
色法により行った。

次に、ｐ４６が溶出された両分を１０ｍＭ）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，６）に透析１＆、ＤＥＡＥ−３ｅｐｈ
ａｄｅｘＯＡ−２５カラムにかけ０から０．３　ＭのＮ
ａＣｌの濃度匂配によりｐ４６を単離した。　　なお、
分子量が同じて等電点の異なるタンパク質が存在するの
で、これらを９４６−１〜３とする。　　これらｐ４（
３の分子量と等電点の値を記す。

タンパク質　　　分子量　　　　等電点ｐ４（３−１４
６，０００７，１ ｐ４６−２　　４６，０００　　　７．２ｐ４６−３　
　４６，０００　　　７．３なお、Ｈｕ　ｌ−Ｔ　−７
ｃ　ｌ　−４にｐＳＶ２−ｍｙｃを導入しないで同様に
操作したところ、９４６のタンパク質は誘導されてこな
かった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＳＶ２−ｇｐ　ｔ　由来の断片製造のフロ
ーチャートを示す。 第２図は、ｐＲ５Ｖ−ｃａｔ　由来のＬＴＲ断片製造の
フローチャートを示す。 第３図は、Ｃ−ｒＴｌｙｃ　由来のエクソン２及びエク
ソン３を含む断片製造のフローチャートを示す。 第４図は、断片１−ｂ、２−ｃ、３−ｃｌを連結して得
られるｐＳＶ２−ｍｙｃの構造を示す。 第５図は、ｐＳＶ２−ｍｙｃ組込み前のヒト肝癌細胞・
ＨＩＪＨ−７ｃｌ　−４の顕微鏡写真を示す。 第６図は、ｐＳＶ２−ｍｙｃＷ込み細胞−ＨＭ４の顕微
鏡写真を示す。 （以　上） 特許出願人　メディサ新薬株式会社 同　　　　　　内　　１）　　　　　驕第　　　２Ｕｆ
Ｕ Ｌ丁Ｒ エフｔル１　　　ニアシン２　　１．７ソン３（内容に
変更なし） （内容に変更なし） 手続補正書く方式） １、事件の表示 σ３和６１年特許願第２４２３１８号 ２、発明の名称 発癌遺伝子により誘導される分泌タンパク質３、補正を
する者 事件との関係　　特許出願人 住所　　　〒１０３東京都中央区日本橋本町４丁目１５
１号４、補正命令の日付（発送日） 昭和６１年１２月２３日 ５、補正の対象 （１）　図面 ６、補正の内容 （１）　　第５図及び第６図について、写真に割印をし
であるのを割印をしないものに訂正する。（別紙のとお
り）なお、これは「生物の形態」を表わすもので、図面
にかわる写真である。 以上

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト肝癌細胞に発癌遺伝子を導入して得られる細
   胞を培養することにより特異的に分泌される、分子量約
   ４６，０００で等電点が７．１〜７．３であるタンパク
   質。
2. （２）ヒト肝癌細胞がＨｕＨ−７ｃｌ−４であるときの
   特許請求の範囲第１項記載のタンパク質。
3. （３）発癌遺伝子がｍｙｃ遺伝子であるときの特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載のタンパク質。
4. （４）ヒト肝癌細胞に発癌遺伝子を導入して得られる細
   胞を培養することにより特異的に分泌されるタンパク質
   を分離精製することよりなるタンパク質の製造方法。
5. （５）分泌されるタンパク質が分子量約４６，０００で
   、等電点が７．１〜７．３である特許請求の範囲第４項
   記載のタンパク質の製造方法。
6. （６）ヒト肝癌細胞がＨｕＨ−７ｃｌ−４であるときの
   特許請求の範囲第４〜５項記載のタンパク質の製造方法
   。
7. （７）発癌遺伝子がｍｙｃ遺伝子であるときの特許請求
   の範囲第４〜６項記載のタンパク質の製造方法。