JPH06500072A - ｎｅｕ遺伝子産物のためのリガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の名称】

ｎｅｕ遺伝子産物のためのリガンド

【技術分野】

本発明は細胞の代謝を変えるのに有用な物質の分野に関する；特に本発明は細胞 の代謝を変えるのに有用な蛋白様物質に関する。

【関連出願】

本出願は１９９０年４月６日に出願された米国特許出願番号第５０５，８３７号 の一部継続出願であり、それは本出願の譲渡人に譲渡されており、本明細書にお いて上記出願の援用がなされている。

【背景技術】

ｎｅｕ遺伝子産物はトランスメンブラン増殖因子受容体様チロシンキナーゼ（ｔ ｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ− １ｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ）である、■ れは最初妊娠期間中にとびとびにエチルニトロソ尿素に暴露された替歯類の子供 中に発生した化学物質誘発ラット神経芽腫から単離された。化学物質誘発突然変 異はｎｅｕ遺伝子中ヌクレオチドレベルで点突然変異（アデニンがチミジンへ） を生じｎｅｕ遺伝子産物のトランスメンブラン領域中での一つのアミノ酸が置換 されるように翻訳される（バリンがグルタミン酸へ）。ラットｎｅｕ遺伝子産物 のチロシンキナーゼ領域はこの点突然変異によりそのトランスメンブラン領域が 構成上活性化されるようになる。ｎｅｕ遺伝子はチロシンキナーゼ活性を持ち、 ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで上皮増殖因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ 　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　：　Ｅ　Ｇ　Ｆ　Ｒ）と構造 的に類似している１８５ｋｄの表面糖蛋白質（ｐ１８５と称されている）をコー ドしている。しかしながら、詳細な分子分析および染色体位置決定研究によりｎ ｅｕ遺伝子は上皮増殖因子受容体コード遺伝子（ｃ−ｅｒｂ−Ｂ遺伝子）とは異 なっていることが示されている。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）とのｎｅｕ遺 伝子産物が類似していることはｐ１８５もまたまだ同定されていない増殖調節因 子の増殖因子受容体であることを示唆している。ラットおよびヒトのｎｅｕ遺伝 子は９０％相同である。それらの蛋白生成物の相対分子量はわずかに異なってお り、ラット蛋白質はＭｒ＝１８５ＫＤａでありヒト蛋白質は１９０ＫＤａである 。この不一致は翻訳後修飾での種間の相違により生じると考えられている。ｎｅ ｕ発癌遺伝子、その生成物および機能の総説としてはＧｒｅｅｎｅ、Ｍ、　ｆ、 　ｅｔ　ａｌ、”神経系の組織における受容体システム”、１ｍ＊ｕｎｏｌｏｇ ｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、１００号、１９８７年１２月、を参照されたい。 本明細書においてｎｅｕ遺伝子およびｎｅｕ遺伝子産物とは本遺伝子のすべての 哺乳類およびを椎動物相同体およびその蛋白質産物を意味している６本明細書で 使用される場合、ラットｎｅｕ遺伝子産物の癌遺伝子形はｐ１８５ｎｅｕとして 示されるであろう、正常細胞非癌遺伝子遺伝子産物はｐ１８５ｃｍｎｅｕとして 示されるであろう、ラットｎｅｕ遺伝子産物のヒト同族体は本明細書ではｃ　− ｅｒｂ−Ｂ−２またはヒトｎｅｕとして示される。単に２１８５と書かれている 時は本明細書ではラットおよびヒトおよびラットｎｅｕ遺伝子産物の他の哺乳類 同族体を広く示している。異常増殖に２１８５が関係していることおよびその増 殖因子受容体様特質はｐ１８５蛋白質が発現されている細胞の正常および異常な 増殖および分化において２１８５蛋白質が重要な役割を果たしていることを示唆 している。 ｐ１８５は発育期にあるおよび成熟した動物由来の種々の組織中に発育段階およ び組織特異的様式で見い出されている、にｏｋａｉ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、（ １９８７）　Ｐｒｏｅ、Ｎ１ｔｌ。 ＾ｃａｄ、　Ｓｅｉ、ＵＳ＾、８４　：　８４９８−８５０１　；　Ｍｉｇｕｉ ｒｅ、　Ｈ，Ｃ，、ｅｔ　ａｌ　、、　（１９８９）Ｊ、Ｉ獅魔■唐狽堰@ａｔ ｉｖｅ ７９２　：　７８６−７９０　；　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、＾、　ｅｔ　ｍｌ　、　 、　（１９８９）　、　部臼舷凹４　：　８１−８８゜成熟ラットおよびヒト中 でのｐ１８５の発現は腸絨毛、皮膚の基底層および毛嚢、原線気管支、近位尿細 管、ファロビー管（ｆａｌｌｏｐｉａｎ　ｔｕｂｅｓ）　、乳腺管、膀胱および 子宮内膜の上皮層中およびいくつかの発育期および成熟末梢および中心ダリア細 胞中に検出されている。神経および結合組織は妊娠中期から後期の比較的狭い時 間枠の間にｎｅｕを発現するが、成熟しては発現しない。他の器官の分泌性上皮 層においてはｎｅｕ遺伝子の発現は成人期まで持続する。リンパ系組織はどの発 育段階においてもｎｅｕ遺伝子を発現しないようである。 １８５−ｎｅｕは多数の正常細胞型の表面およびある種の腫瘍の表面上に発現さ れる、ｐ１８５ｃｍｎｅｕの微小発現（ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）は脳室上衣、脈絡叢、毛様体、終末細気管支上皮、卵巣間質上皮、およびヘン レ係蹄で観察された。泌尿生殖器上皮および正常皮膚付属器ではわずかに高く発 現されていた。これらの組織には膀胱移行上皮、ファロビー管上皮、胆管、集合 管、子宮内膜腺上皮、表皮、毛嚢、皮脂腺および尿道上皮が含まれる。ｐ１８５ のより高い発現は胸部および胃腸組織の急速に分裂している組織で観察された。 これらの構造物には胸部肺胞および孔管上皮、肝細胞、近位および遠位尿細管、 ランゲルハンス島細胞および胃粘膜が含まれる。ｐ１８５が最も高いレベルで発 現されているのは分泌上皮の急速に分裂している組織で観察されており、眼のマ イボーム腺、角膜、腸絨毛上皮、膵腺房、膵管上皮、および唾液前上皮が含まれ る。いくつかの型の組織でｐ１８５の異なった発現が観察されている。腎臓にお いては近位および遠位尿細管は高い発現を持つが、一方ヘンレ係蹄（ｔｈｅ　１ ｏｏｐ　ｏｒ　Ｈｅｎ１ｅ）　においては発現は少ない。小腸上皮において、原 案では微小な発現しかないが、柔突起先端にいくほど発現が徐々に増加している 。皮膚において、基底層では微小な発現しかないが表皮においては発現は増加し ている０毛嚢においてもまた染色が見られる。 ヒトおよびラット組織において、静的組織および成人細胞代謝回転の遅い速度を 持つ組織はｐ１８５を発現しない。これらの組織は内胚葉および中胚葉起原であ りリンパ組織が含まれる。９１８５を発現しない組織には副腎、血管、脳実質、 軟骨、精巣上体、心臓、リンパ節、膵臓、横紋筋、精巣、胸腺および甲状腺が含 まれる。 ｎｅｕ遺伝子はクローン化されているが、その蛋白産物に対する１次リガンドの 同定は困難であった。いくつかの内因性ｐ１８５調節因子が存在するかもしれな いが、ｐ１８５に対する１次リガンドの影響はＥＧＦおよびＰＤＧＦ受容体に対 するＥＧＦおよびＰＤＧＦの影響と類似してなくてはならない（なぜなら、これ らの受容体はｐ１８５に非常に関連しているチロシンキナーゼである）、　Ｙａ ｒｄｅｎ。 Ｙ、、（１９８８）　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒ　５７　：　４４３　；　ＹａｒｄｅｎおよびＳｃｈｌ■唐唐奄■ ｇｅｒ（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２６　：　１４４３　；　Ｂ１５ｈａ ｙｅｅ、　ｅｔ　ｍｌ、、（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　AＣｈｅｍ、　２８ ４　： １１６９９゜ 哺乳類、特にヒト、の細胞代謝を変える物質および方法を提供することが本発明 の目的である。哺乳類腫瘍、特にヒト腫瘍を処置するための物質を提供すること も本発明の目的である。現在の腫瘍処置はほとんどの場合薬剤の細胞毒性効果お よび放射線療法に頼っている。これらの処置はいく人かの患者に軽快化および治 癒をもたらすが、それらは腫瘍細胞を殺すだけでなくいくつかの正常非腫瘍細胞 もまた殺すので重大な副作用を不幸にも示すことがある。主として腫瘍細胞に影 響し、正常細胞および細胞機能にはほとんど相互作用しない哺乳動物腫瘍処置に 対する強い要求がある。細胞表面上にｐ１８５を発現している腫瘍診断法を提供 するのも本発明の更なる目的である。ヒトｎｅｕ遺伝子の増幅および続いてのヒ トｎｅｕ遺伝子産物の過剰発現は乳、胃、結腸直腸、卵巣および膵臓組織を含む いくつかの組織型中の腺癌とかかわりがあるとされている。そのため、Ｃ−ｅｒ ｂＢ−２蛋白質発現レベルは乳房、卵巣および肺癌の有用な予後指標のようであ る。これらおよび他の目的は本明細および付随する請求の範囲を見ることにより 当業者には明らかになるであろう。 〔発明の要約〕 本発明はｎｅｕ遺伝子の翻訳生成物であるｐ１８５と選択的に結合可能な精製さ れた蛋白様物質および蛋白様物質の精製法を提供する０本発明の蛋白様物質はＮ ＡＦと名付けられており、それは“ｎｅｕ蛋白質活性化因子”を表わしている。 本明細書で言及する場合、“ＮＡＦ”、“ｎｅｕ蛋白質活性化因子”および“蛋 白様物質”は等価であり同一の化合物を表わす、ＮＡＦはｐ１８５中に含まれて いるチロシンキナーゼの活性を増加させるが上皮増殖因子受容体のチロシンキナ ーゼの活性は増加させない。蛋白様物質はｐ１８５二重化およびインターナリゼ ーションを誘発する。さらに本発明の蛋白様物質はｎｅｕを運ぶ細胞の増殖にも 影響する。ＮＡＦは５６℃および１００℃で熱安定性であり、ある種のプロテア ーゼにより分解可能である。その最も小さい活を単離可能形の分子量は約７，０ ００および約１４，０００ダルトンの間である。約３０，０００ダルトンまでの 分子量を持つＮＡＦの形が存在し、第２の活性範囲は約１４，０００および約２ ４，０００の間に存在すると同定されている。これらのより大きな形は最も小さ い活性／単離可能形のオリゴマー形を表わしているのであろう。 他の実施態様において、本発明は哺乳類の代謝状態を変えるのに有効な量の蛋白 様物質またはその断片を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の代謝状態を変え るための哺乳類の処置方法も提供する。本発明はさらにｐ１８５を発現している 哺乳類腫瘍の処置方法を提供する。本発明の蛋白様物質および方法はｐ１８５を 正常に（変形された形として）、または変化されたレベルで発現している任意の 型の細胞の処置に有用である。 本発明は付随する請求の範囲によりより特別に示され以下のその好適な実施態様 で説明される。 〔発明の詳細な説明〕 ＮＡＦはヒトＴ細胞リンパ栄養性ウィルス−１（ＨＴＬＶ−１）により形質転換 されているＴ細胞により条件付けられた培地から精製されるであろう、好適な細 胞株（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）はＡＴＬ−２，インターロイキン−２−非依存性Ｈ ＴＬＶ（＋）Ｔ細胞株である。ＡＴＬ−２細胞株はアメリカンタイプカルチャー コレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、に１９９０年３月２ ３日に寄託され、ＣＲＬ１０３８８の受入番号を持っている。この因子の内因性 源はつかまえ所がないことが証明されており、多分因子の量がここに記載したア ッセイによっては検出されないほど非常に低いためであろう。 本発明の好適な実施態様において、ＡＴＬ−２細胞は２回ＰＢＳで洗浄され、続 いて血清を含まないＲＰＭ１１６４０培地（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、＾、　Ｂ ｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ、。 Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）中３　Ｘ　１０’／ｍ１で７ ２時間培養された。この培養土清液は“条件付は培地”（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅ ｄ　ｍｅｄｉｕｍ　：　Ｃ，Ｍ、　）と呼ばれＮＡＦの精製に使用された。ＡＴ Ｌ−２細胞増殖を支えるであろう他の培地もまた細胞の培養に使用してもよい。 ＮＡＦは１，０００ダルトンの孔径を持つ膜を用いる条件付は培地の限外濾過に より製造されるであろう。条件付は培地は企画されＹＭ−２膜（八−１ｃｏｎ、 　Ｄａｎｖｅｒｓ。 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　）を用いる限外Ｐ通により１００倍に濃縮された 。１，０００ダルトン未満の分子量を持つ条件付は培地中の成分は膜を通過する ；一方１，０００ダルトンより大きな分子量を持つ条件付は培地の成分は濃縮条 件付は培地中に残る。ＮＡＦはフィルターに保持され、ｉ、ｏｏｏダルトンより 大きな分子量を持つ成分を含む条件付は培地の分画中に見い出される。 ＮＡＦは条件付は培地の一過に続いての陰イオン交換クロマトグラフィー、好適 には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるジエチルアミノエチル（Ｄ ＥＡＥ）セルロースを用いて更に精製される。実施例７に記載したインビトロ免 疫複合体キナーゼ技術または他のチロシンキナーゼ活性を測定する適当なアッセ イを用いて決定された活性分画をプールし、濃縮して逆相クロマトグラフィー（ 好適にはＣ１８のようなシリカマトリックスカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｉｎｃ、、 Ｍｉｌｆｏｒｄ。 ＭＡ）を用いて）にかける。実施例７に記載したようなインビトロ免疫複合体キ ナーゼまたは類似の技術により活性であると決定された分画は最初のＡＴＬ−２ 条件付は培地の約ｔ、ｏｏｏ倍の相対比活性を持っている。ＮＡＦは第２のシリ カマトリックスカラム、好適にはＣｌ８（ここではＣ１８＃２と称される）、を 用いる逆相クロマトグラフィーによりさらに精製されるであろう、ポリアクリル アミド勾配ゲルを用いるゲル電気泳動（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔ ｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｈｙｄｅ　Ｐａｒｋ。 ＭＤまたは＾ａ＋ｅｒｓｈａｍ、＾ｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉ　Ｌ によるＰ■ｏｒｅｅａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ）、続いての活性分画の銀染色により ＮＡＦに特徴的である３つの独特なバンドが１０ＫＤ、２０ＫＤおよび２６ＫＤ に示された。 本発明の蛋白様物質はそのｐ１８５に対する結合特異性、そのｎｅｕ蛋白質の活 性に対する影響およびｐ１８５を運ぶ細胞に対する影響などの物理性質により特 徴付けられるであろう、ＮＡＦはｐ１８５ｎｅｕ、ｐ１８５ｃｍｎｅｕおよびｃ −ｅｒｂＢ−２のチロシンキナーゼ活性を促進させる。チロシンキナーゼ活性の 増加は実施例７に詳述されているような免疫複合体キナーゼアッセイまたはチロ シンキナーゼ活性を測定する他の適当なアッセイにより試験されるであろう。 本発明の蛋白様物質は少くとも１００℃まで加熱しても安定である。この安定性 はＣ，Ｍ、を５６℃および１００℃で３０分間処理することにより決定された。 蛋白様物質は両方の処理後でも正常な活性を示した。加えて、キモトリプシンお よび細菌プロテアーゼ処理では本発明の蛋白様物質はプロテアーゼ感受性を示し た。 ｐ１８５チロシンキナーゼ活性のＮＡＦ活性化はそのｐ１８５への特異的結合に 依存している。ｐ１８５の細胞外領域上の異なったエピトープに特異的であり、 それを阻止する抗体を用いた試験は蛋白様物質が特定の細胞外領域で２１８５を 認識することを示した。 ＮＡＦはその標的蛋白質の二量体形成または集合を起こすことが観察されている 。これは受容体チロシンキナーゼがその同起原のリガンドに応答して起こす普通 の反応である。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方が形成される。本明細 書に記載されている架橋研究はＰＮ−ＮＲ６細胞においてｐ１８５ホモダイマー の形成をＮＡＦが用量依存的に増加させることを示している。Ｍ１細胞のように ＥＧＦおよびＮＡＦの両方を発現する細胞においてはへテロダイマー受容体構造 （ｐ１８５／ＥＧＦＲ）の形成がＥＧＦまたはＮＡＦによる処理に対し用量依存 的である。 いくつかの試験はＥＧＦのような他のチロシンキナーゼリガンドと類似している ＮＡＦの特徴を示した。これらの試験はＮＡＦおよびＥＧＦは類似の機構および 機能を持っているが、お互いに別個のものであることを示した。その同起原リガ ンドへの暴露に応答してｐ１８５のような受容体チロシンキナーゼは細胞表面か らダウンレギュレーションされる（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕＩａｔｅｄ）　。ＮＡＦ はｐ１８５のダウンレギュレーションを起こす。ＮＡＦへの暴露はＰＮ−ＮＲ６ 細胞によるｐ１８５の表面発現を減少させた。ＮＥ−１９上のＥＧＦＲの表面発 現はＥＧＦの添加により下方調節されたが、ＮＡＦでは起こらなかった。ＮＡＦ およびＥＧＦとのインキュベーションにおいて３７℃でインキュベートされた細 胞のダウンレギュレーションは起こったのに対し４℃でインキュベートされた細 胞のダウンレギュレーションは起こらなかったのでこの応答は温度感受性である ようである。 Ｒ後に２１８５を発現する細胞に対するＮＡＦの影響が調べられた。ＮＡＦはｐ １８５を発現するＰＮ−ＮＲ６細胞の軟寒天増殖能力を増加させることが示され た。ＮＡＦはｐ１８５を発現しないＮＥ−１９細胞に対しては何の影響も及ぼさ なかった。ＮＡＦまたはＥＧＦのどちらも、ＥＧＦＲもｐ１８５も発現しない親 ＮＲ−６細胞に対しては増殖促進効果を示さなかった。他の増殖因子が試験され たがこの増殖応答とは無関係であることが示された。ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βお よびＰＤＧＦのような増殖因子はＰＮ−ＮＲ６またはＮＲ６細胞の増殖は起こさ なかった。 本発明の蛋白様物質は最初にヒト細胞株から精製されたが、同一または実質的に 同一の結合親和性を持ち、またはｐ１８５ｎｅｕまたはＰ１８５ｃｍｎｅｕと結 合できる他の種の細胞からの蛋白様物質もまた本発明の範囲である。ゲル沢山ク ロマトグラフィーおよび限外Ｐ”Ａ膜分析に基づくと、ＮＡＰは約７，０００か ら約１４．０００ダルトンの分子量を持っている。ＮＡＦは約１４，０００から 約２４，０００ダルトンの分子量を持つ形でもまた存在してもよい。ポリアクリ ルアミド勾配ゲルを用いるゲル電気泳動（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｅｐａｒａ ｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｈｙｄｅ　Ｐａｒｋ、ＭＤまたはＰＨｏｒｅｃａ ｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　、　Ａｏ＋ｅｒｓｈａ（＾ｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈ ｔｓ、Ｉ　Ｌ）続いての銀染色は第２の０１８精製工程を通して精製されたＮＡ Ｆ試料中にｌ０ＫＤ、２０ＫＤおよび２６ＫＤの３つの独特のバンドを示してい た。ＮＡＦの分子量の変化はそれがオリゴマー形、即ち二量体または三量体形で 存在しているかもしれないことを示唆している。蛋白様物質のすべてのサブユニ ット（より小さなまたはより大きな分子量形であるにしろ）およびサブユニット の集合形も本発明の範囲内である。 化学合成、組換えＤＮＡ技術、精製蛋白様物質の分解丈たは修飾またはこれらの 組合せを含む任意の方法により製造されたＮＡＦの断片または一部も２１８５ｎ ｅｕに結合できるものは本発明の範囲内である。さらに、化学的に修飾されてい る、または融合蛋白質として遺伝子工学的に形成されたまたは蛋白様物質に由来 しないアミノ酸を含む蛋白様物質の断片または一部もまた本発明の範囲内である 。 指摘したごとく、本発明の蛋白様物質の二量体または三量体形のサブユニットの 組合せもまた本発明の範囲内である。二量体または三量体は二つまたは三つの同 じサブユニットから成っていても（すなわち、ホモダイマーまたはホモトライマ ー）または二つまたは三つの異なったサブユニットから成っていてもよい（すな わち、ヘテロダイマーまたはへテロトライマー）。サブユニットは天然起源から の精製、組換えＤＮＡ技術、化学合成またはこれらの方法の組合せを含む適した 方法により製造されるであろう。適したサブユニットにはまた蛋白様物質の断片 または一部が含まれる。サブユニットはまた随意に化学修飾されていてもよいし 、本発明の蛋白様物質から由来しないアミノ酸を含んでいてもよくまたは融合蛋 白質として合成由来のアミノ酸配列を含んでいてもよい。ｐ１８５に結合し表面 にｐ１８５を発現している細胞に影響を及ぼす本発明の蛋白様物質の一部または 断片（本発明の蛋白様物質の任意の他の形を含む）の能力は本明細書の実施例に 記載されている検定法を用いて都合よく決定できるであろう。 本発明の蛋白様物質はその表面にｐ１８５を発現している細胞の哺乳類疾患およ び状態の処置に有用であると期待される。特別の理論または作動様式に結びつけ られることを望んではいないが、現在のところ本発明の蛋白様物質は細胞の表面 上のｐ１８５に結合することにより細胞の機能を調節するであろうし、それは次 に細胞の酵素活性を変化させるであろうし、結果的に細胞の機能を変化させると 信じられている。 例えば、分泌上皮細胞はその表面に正常細胞ｐ１８５を発現している。火傷また は他の型の細胞破壊のように細胞の再増殖が必要とされる場合、または皮膚の小 胞からの再生毛増殖のような効果のある細胞の代謝生成物を増加または再刺激す ることが望まれている場合のような状況においては細胞増殖または代謝を刺激す るこの受容体に結合可能な物質は有用であろう。 本発明の蛋白様物質は処置される特定の障害、個々の患者の状態、蛋白様物質の 送り届は部位、投与方法および開業医には既知の他の因子に従って処方および適 用量が決定されるであろう６すなわち、本明細書の目的のための蛋白様物質の有 効量とは細胞代謝を刺激するのに有効な量であり、病的状態の予防、悪化を少く する、緩和するまたは治癒させるために蛋白様物質が投与される。 本発明の蛋白様物質は無菌の水、塩溶液または他の緩衝液または乳化剤のような 薬学的に受容可能な担体と組合わせて晴乳顕へ投与されるであろう。本発明の蛋 白様物質はその表面にｐ１８５を発現している哺乳類の細胞へ、経口、静脈内、 皮下、局所および他の投与様式のような都合のよい経路により投与されるであろ う。本発明の蛋白様物質は噛■患者に細胞の代謝を調節するのに十分な濃度およ び時間の間投与される。与えられる特定の濃度はそれが与えられる病的状態、受 容者の年令および体重および投与様式のような因子に依存するであろう。 蛋白様物質は放射標識分子（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ） および２１８５を発現している細胞に対して蛋白様物質の効果を増加させるため の腫瘍処置のために使用される他の化合物のような細胞毒性物質と組み合わせて もよい。 腫瘍細胞の表面上にＰ１８５ｎｅｕを過剰発現している腫瘍またはｐ１８５の異 常形を発現している腫瘍の処置のためには、本発明の蛋白様物質またはその活性 な断片または一部が腫瘍または腫瘍に効果を持つと期待される腫瘍の部位に投与 される。 本発明の蛋白様物質はまた腫瘍細胞の表面にｐ１８５および上皮増殖因子受容体 の両方を発現している腫瘍の処置にも使用されるであろう。本発明のこの実施態 様においては、蛋白様物質またはその活性な断片または一部および上皮増殖因子 受容体に特異的な抗体が腫瘍増殖を減少させるのに有効な量そのような腫瘍を持 つ哺乳動物に投与される６そのような腫瘍の処置のための方法および試薬はＭａ ｒｋ　１．　Ｇｒｅｅｎｅの名前で“抗受容体抗体による癌性細胞の処置法”と 題して１９８９年７月２７日に出願された出願番号０７／３８６．８２０号の同 時係属中の出願に記載されている（その記載はここにそのま）完全に示されてい るように特別に援用する）。本発明の蛋白様物質はｐ１８５に対して特異的な抗 体で置換され、単独で、または上皮増殖因子受容体に特異的な抗体と組合わせて 投与される。 本発明の蛋白様物質はある種の腺癌、乳、肺および卵巣癌のように細胞の表面に ２１８５を発現する腫瘍の診断およびｐ１８５を発現している細胞の同定に使用 できるであろう６本発明の蛋白様物質とそのような腫瘍細胞を含むと疑われる組 織試料を本蛋白様物質の組織試料への結合を可能にする条件下に接触させる。 ｐ１８５発現腫瘍細胞の組織試料中での存在を示す組織試料中の細胞への蛋白様 物質の結合は次に酵素、蛍光分子、放射性標識、フェリチンのような電子が密な 化合物コロイド状金のような光散乱粒子または以上のものの組合せまたは置換で 標識された蛋白様物質に対し特異的な抗体のような市販品として入手可能な試薬 および常法を用いて検出される。蛋白様物質に特異的な抗体はポリクローナルお よびモノクローナル抗体を作製する標準技術により産生されるであろう。 〔実施例〕 曵−語 ｐ１８５ｎｅｕ、ラットｎｅｕ癌遺伝子の生成物：Ｐ１８５ｃｍｎｅｕ、ラッ） ｎｅｕＪＪ（癌遺伝子の生成物；　ｃ−ｅ　ｒｂ−Ｂ−２、ラットｎｅｕ遺伝子 産物のヒト同族体、ｐ１８５、広くラット、ヒトおよび他の哺乳動物からの癌遺 伝子性および原癌遺伝子性ｎｅｕ遺伝子産物およびｎｅｕ遺伝子産物のを椎動物 同族体；ＨＴＬＶ−１、ヒトＴ＃胞すンパ栄養性ウィルス−１，ＦＣＳ、ウシ胎 児血清；ＥＧＦＲ１上皮増殖因子受容体。 以下の実施例は例示であり本発明を制限するものではない。実施例１および２は 本発明の蛋白様物質の製造および物理特性を説明している。実施例４がら１４で 実施されたアッセイにおいては条件付は培地または一部精製された条件付は培地 が使用された。実施例１５から２１ではより精製された形の本発明の蛋白様物質 が使用された。 実施例１　蛋白様物質の製造および精製ＡＴＬ−２細胞株はＩＬ−２−非依存性 ＨＴＬＶ−１（＋）Ｔ細胞株テアル。 マイコプラズマを含まないＡＴＬ−２細胞は１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６４ ０培地（ＩＣ）％ＦＣ３−ＲＰＭ１１８４０）を培養培地とし、３７℃で５％ｃ ○２を含む加湿した雰囲気下にて維持された。 蛋白様物質の精製のために、ＡＴＬ−２細胞は１ＸＰＢＳで２度洗浄され、血清 を含まないＲＰＭ１１６４０培地／２ｍＭＬ培地／２芝７２時間培養され、続い て細胞はベレット化された。このようにして作られた培養土清液は“条件付は培 地”　（Ｃ．Ｍ．）と称される。 １０００　ｄカットオフ（ｃｕｔ　ｏｆｆ）を持ッＹＭ−２　Ｄｉａｆｌｏメン プラン（ｍｅａ＋ｂｒａｎｅ　）（八ｍ１ｃｏｎ．Ｈｏ５ｔｏｎ，　ＭＡ）を用 いてＣ．Ｍ．を１００分の１に濃縮した（１リツトルから１０ｍ１へ）、いくつ かのアッセイに使用するため、１０１００Ｏより多い成分を含む濃縮Ｃ．Ｍ．を ＲＰＭＩ培地にて本来の量まで再希釈した．ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｉｎ ｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｈｙｄｅ　Ｐａ ｒｋ，　ＭＤまたは＾ｍｅｒｓｈａｍ　、＾ｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ ，　Ｉ　ＬによるＰ）ｆｏｒｅｃａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　）を用い、続いて１リ ツトル調整液からのいくつかのこの２カラム精製物質の銀染色により、少くとも ４つからの５つのバンド（ＩＯＫＤおよび２０ＫＤバンド）はこの物質に独特で あったことが示された。１０１００Ｏ未溝の成分を含む通過したＣ．Ｍ．は希釈 なしで使用された。 濃縮されたＣ．Ｍ．は、４５μユニフロ（ｕｎｉｆｌｏ）フィルター（　５ｅｈ ｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕｅ　Ｉ　ｌ　、Ｋｅｅｎｅ　、　Ｎ　Ｈ　）を 用いて濾過滅菌され、次に前もって１０ｍＭ）リス−ＣＩ　、ｐＨ８．１で平衡 化されているＤＥＡＥ−ＳＷ陰イオン交換樹脂（ｌｌｌａｔｅｒｓ，　Ｉｎｃ， 　Ｍｉｌｆｏｒｄ，　ＭＡ）を用いて更に精製された。ＨＰＬＣ実験当り、１リ ツトルの最初のＡＴＬ−２条件付は培地分の濃縮Ｃ．Ｍ．蛋白質をカラムに吸着 させ、次にＯｍＭから４　０　０１１１ＭＮａｅ１の直線濃度勾配、４ｍ１／分 の流速で溶出した。適当なりＥＡＥ分画（１カラム精製物質）の１０％または適 当なｃｌｓ分画く２カラム精製物質）の１％を用い、実施例７に記載したような インビトロ免疫複合体キナーゼアッセイを用いて分画を検定した。実施例７に記 載したインビトロ免疫複合体キナーゼアッセイを用いて用量依存様式でｐ１８５ ｃｍｎｅｕのチロシンキナーゼ活性を増加させる活性は、２２０がら２４０−の Ｎａｃ１濃度付近の４がら５分画（３６−４０）に渡る１つのおもなピークとし て溶出された。ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥ精製後、活性分画中の蛋白質を濃縮してプー ルし、濃縮し、０１８（シリカマトリックス）逆相クロマトグラフィー　（Ｗａ ｔｅｒｓ，　Ｉｎｃ．　Ｍｉｌｆｏｒｄ，　ＭＡ）にかけた（Ｃ１８＃１工程ま たは２カラム精製物質と称される）　、　０．１％ＴＦＡに対する２−プロパツ ールの直線濃度勾配により溶出を実施した．すべての分画をＲＰＭ１１６４０培 地に対して透析して２−プロパツールを除去し、実施例７に記載されているイン ビトロ免疫複合体キナーゼアッセイおよび適当な分画の１％濃度を用いて検定し た．ｐ１８５ｃｍｎｅｕのチロシンキナーゼ活性を増加させた活性は２つのピー クとして溶出された．１つは分画１１−１３に溶出し、一方、わずかに活性が低 い第２のピークの活性は分画２０−２３に溶出した。これらの２つのピークは各 々大体５がら７％インプロパツールおよび１１がら１４％インプロパツールに対 応する。ｃ１８＃１による分画１１−１３が物質の確認研究に使用された。２番 目のタロマト工程がらの活性分画はプールされ、蛋白様物質試料と称された。 ２０リツトルの調製液（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　）が同じ精製戦略で使用され た．ＤＥＡＥ活性分画３５−４１がプールされ上記のようにｃ１８クロマトグラ フィーにがけられた，ｃ１８＃１分画１１−１３および２１−２４の両方とも用 量依存性活性を持っていた０分画１１−１３をプールしたものはさらにｃ１８ク ロマトグラフィ一工程にかけられた（ｃ１８＃２または３カラム精製物質と称さ れる）。再び分画１１−１３および２１−２４が活性を持っていた。実施例７に 記載したようなインビトロ免疫複合体キナーゼアッセイにより決定されたような 分画２３の用量応答は分画２３の容量の０．００５％および分画２３の容量の０ ．０５％を加えることにより得られるであろう．このことは最大の純度が達成さ れたことを示している。 分子量範囲はゲルヂ過クロマトグラフィーおよび限外ヂ過膜に基づいて決定され た。１０，０００分子量カットオフフィルターではチロシンキナーゼ活性のほと んど等しい量が保持されまた通過した，　３０，０００分子量カットオフフィル ターによってはほとんどすべての活性が通過した．活性なりロマトグラフィー分 画の分子量範囲は用量依存性ｎｅｕ−活性化活性を含む分画を、−組の蛋白質分 子量標品（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａＩＣｏ．、　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　Ｍ Ｏ）の溶出プロフィールと比較することにより決定された．活性の低分子量領域 は７，０００および１４０００ダルトンの間と同定された。活性の第２の範囲は 約１４，０００から約２４，０００ダルトンにわたっていた。 ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　 Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｈｙｄｅ　Ｐａｒｋ。 ＭＤまたは＾ｍｅｒｓｈａｍ，＾ｒｌｉｎｇｔｏｎ　ｆｌｅｉｇｈｔｓ，　Ｉ　 ＬによるＰＨｏｒｅｃａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いるゲル電気泳動後、市販品 として入手可能な銀染色キット（Ｂｉｏｒａｄ，　ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＣｅｎｔ ｒｅ，　ＮＹ）により３カラム精製物質（ｃ１８＃２）の銀染色が実施された。 ２０リツトル調製液のｃ１８＃２精製がらの分画２１，２２．２３および２４が マーカーとともに実験された１分画２２および２３は最も強い用量応答を示した 。 これらの分画に独特ないくつかのバンドが分子量１０ＫＤ，２０ＫＤおよび２６ ＫＤのところに現れた。 実施例２　相対比活性 表１に示したごとく、試料の相対比活性は推定１０００倍および精製後３５００ 倍はど増加した。 相対比活性は定量されたｎｅｕ−キナーゼ活性の用量依存的増加を発生させるの に必要とされる最初のＡＴＬ−２条件付は培地中の活性量を、等しい応答を発生 させるのに必要とされる単一クロマトグラフィ一工程精製物質および２クロマト グラフイ一工程精製物質と比較することにより決定された．比活性とはｐ１８５ バンド強度を増加させるのに必要とされるＮＡＦ含有試料中の総蛋白量のμｇで あり、実施例７に記載されたようなインビトロ免疫複合体キナーゼアッセイで非 処理試料に比較して２．５倍とデンシトメーター（ＬＫＢ　Ｕｌｔｒａｓｃａｎ ，　ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ，　ＮＪ）を用いて定量される。インビトロ免疫複合キナーゼアッセイ は実施例７に記載されている。Ｐ１８５バンド強度の２、５倍の増加は容量で最 初のＡＴＬ−２条件付は培地の１０％、容量でプールされたＤＥＡＥ活性分画の １％、およびｃ１８＃１活性分画の０．０１％で得られた。 ｃ１８＃１と称される活性分画は生化学的および細胞の確認に使用された．最初 のＡＴＬ−２条件付は培地の活性は７０００単位と独断的に称された（最初のＡ ＴＬ−２上清液ｍ１２当り７単位）、続いてのＤＥＡＥおよびｃ１８精製工程に おける活性の総単位値は、１０容量％で検定された場合の最初のＡＴＬ−２上滑 液での増加と同じバンド強度増加を発生させるのに必要とされる物質の減少量に 基づいている（ＤＥＡＥ試料については容量で１％、およびｃ１８＃１物質につ いては容量で０．０１％）、これらの数字を用いると、最初のＡＴＬ−２条件付 は培地に比較してＤＥＡＥおよびｃ１８＃１試料には各々ｍ１当り１０倍以上の 単位数および１０００倍以上の単位数があると見積もられた．約４倍のＤＥＡＥ 精製物質および約２５０倍のｃ１８＃１精製物質の比活性の増加はこれらの２つ のクロマトグラフィー技術の分離能力と矛盾しない。 相対比活性の増加に伴なって、高まった純度の２つの他の指標もまた注目される であろう。第１に、プールされたｃ１８＃１分離物の活性は最初の上清液よりは るかに高い。二重化、ダウンモジュレーションおよび分裂実験は何も示さずおよ びｃ１８＃１物質でより容易に再現可能であることはに度が増加したことを示唆 している。精製された分子は用量応答研究においてより低い温度（〈２７℃）で さえも活性であった。低温で増加した活性および機能もまた蛋白様物質の純度の 上昇を反映している。 」Ｌ」− 純度の異なった段階での蛋白様物質の比活性（単位／ｐｇ） 培養上清液　７　１０００　７０００　７０００　１（分画１ｌ−１３）　０． ６３　３　１．８９　２１００　１１１１叉施信旦　細胞株の維持および確認 すべての細胞株は１０％ＦＣ３および２ｍＭＬ−グルタミンを含むＲＰＭ１１６ ４０培地中３７℃で５％Ｃ０２を含む加湿した雰囲気下で維持された。ＮＲ６細 胞は検出可能なレベルのＥＧＦＲを発現しないスイス３Ｔ３細胞のサブクローン であり、ＥＧＦに応答せずｐ１８５を発現しない。ＮＲ６細胞はＣａ”リン酸塩 沈澱技術によりＰＳＶ２−ＮＥ○およびＰＳＶ２−ｎｅｕＮで同時トランスフェ クシヨンされた。得られる細胞株、ＰＮ−ＮＲ６と称される（癌原遺伝子性ｎｅ ｕ　）、はｐ１８５ｃｍｎｅｕを高水準で発現する。ＮＥ−１９細胞はヒトＥＧ ＦＲ遺伝子でトランスフェクトされたＮＲ６細胞であり、ＥＧＦＲを高水準で発 現する。 Ｍ１１細胞はＮＲ６細胞から誘導され、ＥＧＦＲおよびＰ１８５ｃｍｎｅｕを高 水準で発現する。これらの細胞株はＫｏｋａｉ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８９）　 Ｃｅ旦競・２８７により記載されている。Ａ４３１細胞（アメリカンタイプカル チャーコレクション）はヒト表皮癌腫由来細胞株であり、高水準のＥＧＦＲを発 現する。５ＫＢＲ１１１細胞はヒト乳腺癌腫由来細胞株であり、ＥＧＦＲおよび ｃ−ｅｒｂＢ−２の両方を発現する。Ｂ１０４細胞はエチルニトロソ尿素誘発ラ ット神経外胚葉性腫瘍から誘導された。Ｂ１０４−１’−１’細胞はＤＮＡでト ランスフェクトされたＮＩＨ／ｗ細胞であり、最初はＢ１０４細胞株から単離さ れ、その後ｎｅｕ癌遺伝子をコードしていることが発見された。ＮＩＨ／ｗ細胞 株はＮＩＨ３Ｔ３細胞サブクローンであり、低頻度の自発的腫瘍形成を示し、Ｅ ＧＦＲが欠けている。 実施１　足場依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　）増殖ア ッセイ足場依存性増殖能力は軟寒天内に懸濁した細胞のコロニー形成効率を算定 することにより決定された。コロニー形成効率を決定するためのすべての実験は ３社の細胞を含まない細胞支持層および細胞が懸濁される１−の上層を含む６０ ｍｍの組織培養皿を用いて実施された。細胞支持層は１０％ウシ胎児血清、２ｍ ＭＬ−グルタミンを補給した０、２４％アガロースＲＰＭ　Ｉ　−１６４０から 構成されていた。 重積層は１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを補給した０、１８％ア ガロースＲＰＭ　Ｉ　−１６４０中にＩ　Ｘ　１０’細胞を含んでいた。蛋白様 物質を含む試料が軟寒天培養物に添加された場合それは］内のみに含まれていた 。直径が０．５龍より大きなコロナ−を７日目に解剖盟微鏡を用いて計数した。 各々の６０論の皿から無作意に４つの視野（Ｘ１００）を選んだ、各々の６０論 皿を代表させるためこれらの４つの視野からの平均値が決定された。各々の実験 群は３つの皿の平均を表わしている。表においては括弧は３つの試料の標準偏差 を示している。 大施河旦　足場依有性増殖アッセイー熱処理条件付は培地条件付は培地（Ｃ，Ｍ 、）は５６℃にまたは１００℃に３０分間加熱された６表２に示したごとく、非 処理および熱処理Ｃ，Ｍ、の両方においてＢ　１０４−１’　−１’細胞のコロ ニー形成を増加させた。この活性は熱処理後においてさえも安定であった。 表２ Ｂ　１０４−１′−１′細胞の足場依存性アッセイ条件付は培地の熱処理 条件付は培地の濃度 ０％　１．０％　１０％ 非処理　１０．００（０，８１）　２０．００（５，８８）５６℃処理　７．５ ０（０，８１）　１９．７５（６，１３）１００℃処理　１４．００（５，５９ ）　１８．７５（２，９８）対照　５．２５（２，６２） 大旌己旦　分画された条件ｒ＝ｔ＋す培地の足場依存性増殖能力Ｂ　１０４−１ ′−１′のコロニー形成を増加させる能力はＹＭ−２メンプランにより濃縮され たＣ、Ｍ、中に含まれており、それは１ｏｏｏダルトンより大きな分子量を持つ 成分を含んでいる。分画された条件付は培地の足場依存性増殖能力は表３に示さ れている。 表３ 分画した条件付は培地の足場依存性増殖能力Ｃ，Ｍ、の濃度 ０％　１．０％　１０％ 非処理　１７．５０（８，４５）　２９．２５（７，１３）濃縮物　１９．２５ （５，６１）　５６．２５（８，１８）通過物　１５．２５（４，１９＞　１９ ．００（５，２９）対照　１４．００（４，１９） 去施凹ヱ　免疫複合体キナーゼアッセイこのアッセイは種々の量のＡＴＬ−２条 件付は培地（Ｃ，Ｍ、ンまたは蛋白様物質とのＰＮ−ＮＲ６細胞溶解物の前イン キュベーションにより誘導される免疫沈降ｐ１８５の自己リン酸化活性の相違を 反映し、以後ｎｅｕ活性化活性と称される。細胞株は詳細に実施例３に記載され ている。 免疫複合体キナーゼアッセイに使用される細胞株はＫｏｋａｉ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ　５Ｂ　＋２８７−２９２　（１９８９年７月２８日）（その発表内容 はそのま−ここに完全に示されているように引例として含まれている）およびＭ ａｒｋ　１．　Ｇｒｅｅｎｅの名前で“抗容受体抗体による癌性細胞の処１方法 ”と題して１９８９年７月２７日に出願された米国特許出願第３８６，８２０号 （その開示内容はそのま〜ここに完全に示されているように引例として含まれて いる）に記載されている方法に従って入手、調製および培養された。 細胞株はすべて５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中（５％ＦＣ３−ＤＭＥＭ＞、３ ７℃で５％Ｃ○２を含む加湿した雰囲気下で維持された。 １５０■培養皿中の細胞の密培養物は２度冷ＰＢＳで洗浄し、１０−の凍結乾燥 Ｍ衝液（１５０ａ＋Ｍ　ＮａＣｌ！、　１ｍＭ　ＨｇＣ１ｚ、　２０−ヘベス、 ｐ　Ｈ７，２，１０％グリセロール、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１％アプロチニン）内 へ削り入れ、遠心分離した（８００ｘ６．１０分）。細胞ベレットは１社の溶解 Ｗｄｆｌ液（５０ｍＭヘベス、　ｐＨ７，５，１５〇−ＮａＣ１，３％Ｂｒ１ｊ ３５　、１ｉＭ　ＭＥＤＴＡ　、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭ　ＭＥＧＴＡ 、３０ｐＨＮａ、ＶＯ４，１０グリセロール）に再懸濁し、４℃で３０分間回転 させた。すべての化学薬品は特に指示しない限り、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、、ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ２からのものであった。不溶性物質は ４０．ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分離して除去された。 続いて使用される透明な上清液は細胞溶解物と称される。 細胞溶解物は５０ｕｌの５０％（容量／容量）蛋白質Ａ−セファロース（Ｓｉｇ 鮎Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）と１ ５分間インキュベートし、２分間遠心分離して溶解物を前透明化した。前透明化 細胞溶解物の一部５０μｌの条件付は培地、蛋白様物質または特定された他の因 子と溶解緩衝液で１ｍｌの最終容量とした後１５分間氷上でインキュベートされ た。試料は次に５μｇの７．１６．４モノクローナル抗体（ｐ１８５ｎｅｕおよ びｐ１８５−ｎｅｕの細胞外領域を認識する〉または他の適当な抗体と氷上で２ ０分間インキュベートし、続いて４℃で回転させながら５０μｐの５０％（容量 ／容量）蛋白質Ａ−セファロースと２０分間インキュベートした。免疫複合体は 遠心分離により集め、５００μｌの洗浄緩衝節０＋ａＭヘペス、　ｐＨ７，５， ０，１％Ｂｒ１ｊ３５．１５０ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　ＭＥＤＴＡ　、１％ア ブロンチニン、３０１１８　ＮａｔＶ（Ｌ　、＞で４回洗浄し、次に反応１ｉ１ 衝液（５０ｍＭヘペス。 ｐ　Ｈ７，４，３ｍＭ　ＨｕＣｌｔおよび０．１％Ｂｒ１ｊ　３５　、３０　ｐ ＨＨａ、ＶＯ，）で２度洗浄した。 ベレットは５０ｔｔ１の反応！ＩＩｒ液に再懸濁し、〔ガンマ−”Ｐ）ＡＴＰ（ ＾−ｅｒｓｂａａ。 ＾ｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　ＩＬ）を最終濃度ｏ、ｚｐＭになるよう に添加した。試料は２７℃で２０分間またはより純粋な試料に対しては４℃で２ ５分間インキュベートした。 ２ｍＭ　ＡＴＰおよび２ｍＭ　ＥＤＴＡを含む３ＸＳＤＳ試料緩衝液を加え、１ ００℃で５分間インキュベートすることにより反応を終結させた。試料は１０％ アクリルアミドゲル上５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。ゲルを染色し、乾燥し増 感紙（ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　５ｃｒｅｅｎｓ）を持つＫｏｄａｋ　ＸＡＲ またはＸＲＰフィルムに暴露させた。 栗施倒旦　ＰＮ−ＮＲ６およびＭ１細胞のキナーゼ活性に対するＣ、Ｍ。 の影響 ＰＮ−ＮＲ６およびＭ１細胞の溶解物は実施例７に記載したように処理され、次 のものが添加された：添加なしく対照）：０．１％のＣ，Ｍ、、１．０％のＣ， Ｍ、。 または１０％のＣ，Ｍ、、条件性は培地の添加は条件性は培地のすべての濃度で ＰＮ−ＮＲ６およびＭ１細胞からのＰ１８５ｃｍｎｅｕのチロシンキナーゼ活性 を増加させた０条件付は培地で処理されていないレーンに比敦して１０％条件条 件培地処理レーンではｐ１８５バンド強度が２から４倍増加していた。 寒旌例２　上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ活性に対する条件性は培地の 影響 チロシンキナーゼ活性は実施例７に記載した免疫複合体キナーゼアッセイを用い て決定した。　Ａ４３１細胞の溶解物が前記のように処理され、以下のものが添 加された：添加なしく対照）　；　０．１ｎｇ／ｍｌのＥ　Ｇ　Ｆ　；　１　、 Ｏｎｇ／ｄのＥＧＦ　；　１０ｎｇ／ｍ／のＥＧＦ；０．１％のＣ，Ｍ、：１． ０％のＣ，Ｍ、；または１０％のＣ，Ｍ、、ＥＧＦの添加はＡ４３１細胞からの ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を増加させた６条件付は培地の添加はＡ４３１ 細胞からのＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を増加させなかった。 上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼ活性はＥＧＦの添加により 増加するが条件性は培地では増加しない。このことはその因子の受容体特異性を 示している。 ｍよＯＰ１８５ｃｍｎｅｕのキナーゼによるヒストンのリン酸化に対する条件性 は培地の影響 チロシンキナーゼ活性は実施例７に記載した免疫複合体キナーゼアッセイを用い て決定された。ＰＮ−ＮＲ６細胞の溶解物が前記のように処理され、以下のもの が添加された：添加なし；１．０％のＣ，Ｍ、、または１０％のＣ−Ｍ−、ｐ１ ８５ｃｍｎｅｕのチロシンキナーゼの基質として”Ｐ−ｒ−ＡＴＰとともに２μ ｌのヒストン（２ｍｇ／ｍ１）が添加された。ｐ１８５ｃｍｎｅｕのチロシンキ ナーゼによるヒストンのリン酸化は条件性は培地の添加により２から６倍増加し た。 実施暦１１　ｐ１８５ｃｍｎｅｕのチロシンキナーゼに対する熱処理の影響 チロシンキナーゼ活性は実施例７に記載した免疫複合体キナーゼアッセイを用い て決定された。Ｃ，Ｍ、は５６℃でまたは１００℃で３０分間処理された。ＰＮ −ＮＲ６ｍ胞の溶解物は前記のように処理され以下のものが添加された：添加な し；１％の熱処理または未処理Ｃ，Ｍ、：　１０％の熱処理または未処理Ｃ，Ｍ 、、Ｃ。 Ｍ、に含まれている活性は５６℃または１００℃での３０分間の熱処理後も安定 であった。それ故Ｃ，Ｍ、中のｐ１８５ｃｍｎｅｕチロシンキナーゼ活性化活性 は熱処理により影響されなかった。 叉施医上２　分画された条件性は培地のチロシンキナーゼ活性条件性は培地は実 施例１に記載したように濃縮された。　１０１００Ｏより大きな成分を含んでい る濃縮Ｃ，Ｍ、は蒸留水により最初の容量に再希釈されアッセイに使用された。 　１０１００Ｏ未満の成分を含む通過Ｃ，Ｍ、は希釈することなく使用された。 チロシンキナーゼ活性は実施例７に記載された免疫複合体キナーゼアッセイを用 いて決定された。ＰＮ−ＮＲ６細胞の溶解物は前記のように処理され、以下のも のが添加された：添加なし；１．０％のＣ，Ｍ、；１０％のＣ，Ｍ、；未処理Ｃ ，Ｍ、。 濃縮Ｃ，Ｍ、、通過Ｃ，Ｍ、、ｐ１８５ｃｍｎｅｕのチロシンキナーゼの増加は １０００より大きな分子量を持つ濃縮されたＣ、Ｍ、中で観察された。　１０， ０００分子量カットオフフィルターではほとんど等しい量の活性が保持されまた 通過した。はとんどすべての活性が３０，０００分子量カットオフフィルターで は通過した。 叉施伝１旦　条件性は培地のチロシンキナーゼ活性に対するプロテアーゼの影響 チロシンキナーゼ活性は実施例７に記載した免疫複合体キナーゼアッセイを用い て決定した。Ｃ，Ｍ、の第１の部分は１００．、のアルファーキモトリプシン（ Ｓｉｇｍａ。 ＳＴ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＮＯ）で２時間３７℃に処理された。２倍モル過剰のキ モトリプシン阻害剤（Ｓｉｇ＠ａ、　ＳＴ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）の添加によ り反応を停止させた。Ｃ，Ｍ、の第２の部分は１００．、の細菌プロテアーゼ（ Ｓｉｇ＋ｓａ、　ＳＴ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｎｏ＞で２時間３７℃にて処理された 。反応は５分間煮沸してプロテアーゼを熱不活性化することにより停止された。 ＰＮ−ＮＲ５細胞の溶解物は前記のように処理され、以下のものが添加された： Ａ）添加なし；Ｂ）キモトリプシンで処理されたＣ、Ｍ、、阻害剤なし一部）キ モトリプシン−阻害剤のみで処理されたＣ、Ｍ、；Ｄ）キモトリプシン処理に続 いて阻害剤で処理されたＣ、Ｍ、；Ｅ）キモトリプシン阻害剤で前もって不活性 化されているキモトリプシンで処理されたＣ、Ｍ、；Ｆ）＃菌プロテアーゼによ り処理され続いて熱不活性化されたＣ、Ｍ、：Ｇ）熱処理により前もって不活性 化されている細菌プロテアーゼにより処理されたＣ、Ｍ、、およびＨ）未処理Ｃ ，Ｍ、。 ＳＤＳ／ＰＡＧＥ後、７０テア一ゼ処理ｐ１８５ｃｍｎｅｕ試料のバンド強度は プロテアーゼで処理されていない試料のものよりは小さかった。プロテアーゼ処 理試料のバンドはまたプロテアーゼ阻害剤または熱処理により全部または一部が 不活性化されているプロテアーゼで処理された試料のバンドよりもより弱かった 。これらのデータはＣ，Ｍ、中のｐ１８５ｃｍｎｅｕ特異性活性はキモトリプシ ンおよび細菌プロテアーゼによる消化に敏感であることを示している。 実施伝１丘　ｐ１８５ｃｍｎｅｕに対する抗体の結合活性に対する条件性は培地 の影響 、　チロシンキナーゼ活性は実施例７に記載した免疫複合体キナーゼアッセイを 用いて決定された。免疫沈降前にＣ，Ｍ、に７．１６．４モノクローナル抗体を 添加した。 モノクローナル抗体７．１６．４はｐ１８５ｎｅｕおよびｐ１８５ｃｍｎｅｕの 細胞外領域を認識する。ｐ１８５ｃｍｎｅｕ　（ＰＮ−ＮＲ６細胞から）は７． １６．４モノクローナル抗体により免疫沈降され、免疫複合体は一度洗浄緩衝液 で洗浄され、次に免疫複合体はＣ，Ｍ、と４℃にて１５分間インキュベートされ た。これらの工程後、実施例７に示した免疫複合体キナーゼアッセイが前記のよ うに実施された。ＰＮ−ＮＲ６の溶解物は前記のように処理され以下のものが添 加された：添加なし；１．０％のＣ，Ｍ、、および１０％のＣ，Ｍ、、Ｃ，Ｍ、 のチロシンキナーゼ活性は７．１６．４モノクローナル抗体による前処理により 阻害された。これらのデータは条件性は培地中の成分がｐ１８５ｃｍｎｅｕと結 合することを示している。 叉施倒工旦　ｐ１８５ｃｍｎｅｕのキナーゼ活性に対するＡＴＬ−２分泌性増殖 調節物質の影響 ＡＴＬ−２細胞株から分泌されるＡＤＦ（ＩＬ−２受容体誘導因子）、ＴＧＦ− α（形質転換増殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、ＰＤＧＦ（血 小板由来増殖因子）、ＩＬ−１（インターロイキン１）およびＩＬ−６（インタ ーロイキン６）のような増殖調節物質（ｇｒｏｗｔｈ　ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　 ５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ）が実施例７に示したインビトロ免疫複合体キナーゼアッ セイを用いで試験された。 これらの因子のどれもｐ１８５ｃｍｎｅｕのキナーゼ活性に影響を及ぼさなかっ た。得られた代表的な結果はＰＮ−ＮＲ６溶解物を１０または１００単位のＩＬ −１または２５または２５０単位のＩＬ−６で処理したもので、それらはキナー ゼ活性を増加させなかった。 実施ｆｆＪＪｊ　ｐ１８５のホスホチロシン含量および同一の線維芽細胞バック グラウンドにおいて発現されたＥＧＦＲに対するＮＡＦおよびＥＧＦの影響 Ｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ　、（１９９０）　Ｃｅｌ　ｌ　６１　：　１３３９に記 載されているようなウェスタンプロット分析がＮＡＦの添加により特異的に増加 したｐ１８５中のホスホチロシンの量を示すために用いられた。無傷のＰＮ−Ｎ Ｒ６（ｐ１８５＋／ＧＥＲＦ−）およびＮＥ−１９（ＥＧＲＦ＋／ｐ１８５−） 細胞（２Ｘ１０’）をＬｏａｍの培養皿中、容量で０．０１または１．０％のＮ ＡＦまたは０．１０または１１００ｎ／−のＥＧＦと３７℃で８分間インキュベ ートした。細胞を４００ＥＤＴＡ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭフ ッ化ナトリウムおよび４００．Ｍオルトバナジン酸ナトリウムを含む冷リン酸緩 衝化塩溶液で３回洗浄し、ＰＩ／ＲＩＰＡＩＩＩ’ｉ液中（１％トリトンＸ−１ ００，１％デオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１！、０． ＯＩＭビロリン酸ナトリウムｐ　Ｈ７，４，１％トラシロール、１μＭ　ＰＭＳ Ｆ、２＋＊Ｍ　ＥＢＴＡ、１〇−フッ化ナトリウム、１０ｍＭヨードアセトアミ ドおよび１ｍＭ　ＡＴＰ）３０分間溶解させた。前透明化上清液を各々モノクロ ーナル抗体７．１６．４（ラットｐ１８５と特異的に反応）または抗ＥＧＦＲカ ルボキシ末端抗体＜５ｔｕａｒｔ　Ｄｅｅｋｅｒ博士、Ｒｏｃｋｅｆｅｌ　ｌｅ ｒ大学、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、から提供を受けた）と免疫沈降させた。免疫 沈降物は洗浄ＩＩ衝液〈０．１％トリトンＸ−１００、Ｏ，軸Ｍ　ＥＤＴＡ、１ ０ｕＭフッ化ナトリウム、１０−ピロリン酸ナトリウム、４００ｔ＋Ｍオルドパ ジン酸ナトリウム、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４）で２回洗浄した 。洗浄免疫沈降物は５ＤＳ−試料緩衝液（ｐＨ６，８）（３％ＳＤＳ、１０％グ リセロール、５％２ＭＥ、０．４％ブロモフェノールブルー）中で煮沸し、１０ ％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。　Ｈａｄａ　ｅｔ　ａｔ、、　（１９９ ０）　Ｃｅ１ｌ　６１　：　１３３９に記載されているように、蛋白質をニトロ セルロースに移し、抗ホスホチロシン抗体ＰＹ−２０ＭＡｂ　（ＩＣＮ　Ｂｉｏ ＋＊ｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、、　Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、　ＣＡ）により検出 した。 ＰＮ−ＮＲ６細Ｊ１２！（ｐ１８５＋／ＥＧＦＲ−）からのｐ１８５ｃｍｎｅｕ 中のホスホチロシン量は０．１％または１．０％ＮＡＦの添加により用量依存様 式で増加したが、一方、１０および１１００ｎ／ｍｊ！　ＥＧＦの添加は同−条 件下何の影響も及ぼさなかった。ＮＥ−１９細胞（ＥＧＦＲ＋／Ｐ１８５−ンか らのＥＧＦＲ中の検出可能なホスホチロシンの量は１０または１１００ｎ／ｍｊ ！　ＥＧＦの添加により増加したが０．１％腋たは１．０％ＮＡＦの添加では増 加しなかった。ＮＡＦはＮＲ６細胞バックグラウンド（ＰＮ−ＮＲ６細胞）中に 発現されたｐ１８５ｃｍｎｅｕのチロシンキナーゼ活性は影響したが、同じＮＲ ６細胞バックグラウンド（ＮＥ−１９細胞）中のＥＧＦＲには影響を及ぼさず再 び観察された影響がＥＧＦおよびその受容体により誘発されていることを示して いる。ＮＡＦまたはＥＧＦを添加しなかった対照では両方の細胞株において応答 がみられなかった。 実施例１ヱ　ＮＡＦとｎｅｕ蛋白質ｐ１８５の細胞外領域との相互作用実施例７ に記載したような免疫複合体キナーゼアッセイを用いてｐ１８５の細胞外領域上 の異なったエピトープに対し特異的なモノクローナル抗体の、ＮＡＦ誘発ｐ１８ ５キナーゼ活性増加の阻害に対する能力を試験した。ＰＮ−ＮＲ６細胞を１１１ ｇｋｌ抗体とまたは抗体なしで（対照）４℃にて３０分間前もってインキュベー トし、冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞は次に１％（容量）ＮＡＦとまたはＮＡＦ なしで（対照）３７℃にて１０分間インキュベートした。細胞を溶解し、７．１ ６．４抗ｐ１８５抗体でｐ１８５を免疫沈降させ、免疫複合体キナーゼアッセイ を実施例７に記載されているように実施した。 精製ｐ１８５細胞外領域特異性モノクローナル抗体７．１６．４　（Ｄｒｅｂｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、。 （１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１２　；　５４５　；　Ｄｒｅｂｉｎ　ｅｔ　 ａｔ、　、（１９８５）Ｃｅｌ　ｌ　４１　：　６９５）と■oＮ−ＮＲ ６細胞（ｐ１８５＋／ＥＧＦＲ−）のブレインキュベーションはｐ１８５のＮＡ Ｆ誘発活性化を阻止したが、一方アイソタイプが合っていないモノクローナル抗 体９８Ｇ５、レトロウィルスタイプ３、ヘマグルタニンと反応性のＩｇＧ２ａモ ノクローナル抗体（Ｄｒｅｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）　、部竺舷凹 ２　：　２７３　）　、はｐ１８５のＮＡＦ誘発活性化を阻止しなかった。モノ クローナル抗体７．９．５は２１８５の異なった細胞外領域を認識しくＤｒｅｂ ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８８）　部四銭匣２　：　２７３）　９１８５のＮ ＡＦ誘発活性化を部分的にのみ阻止した。同様にＥＧＦおよびＰＤＧＦのその受 容体への結合を阻止することが示されている（ＹａｒｄｅｎおよびＮｅｉｎｂｅ ｒｇ、（１９８９）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、 ＾、８６　：　３１７９およびり、Ｔ、Ｈｉｌｌｉａ暑ｓ、　ｅｔ@ａｌ、。 （１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、　２５９　：　５２８７）スラミ ンと細胞とのプレインキュベーシゴンｐ１８５のＮＡＦ誘発活性化を阻止した。 さらに、ｐ１８５−Ｄ４と称されｐ１８５ｃｍｎｅｕの細胞外領域の第２のシス ティンに富む領域のアミノ酸４７５から６４８（読みわく内）に対応する５２３ 塩基対欠失を含む突然変異体ｐ１８５を用いて抗ホスホチロシンモノクローナル 抗体とのウェスタンプロット分析が実施された。ＮＡＦはｐ１８５ｃｍｎｅｕの 細胞外推定リガンド結合領域の部分が欠けたこの２１８５突然変異体（ＮＲ６細 胞内へトランスフェクトされた）のキナーゼ活性を増加させなかった。これらの 結果を総合すると、ＮＡＦはｎｅｕ蛋白質細胞外領域の離散した部分と相互作用 していることが示されている。 実施泗上旦　ｐ１８５二量化に対するＮＡＦの影響受容体チロシンキナーゼはそ の同起原のリガンドにより誘導され受容体凝集体を形成する。ｐ１８５−ｎｅｕ のホモダイマーおよびヘテロダイマ一種がすでに記載されている。ｐ１８５−ｎ ｅｕのトランスメンブラン領域中の点突然変異（残基６６４でのアデニンからグ ルタミン酸への）はホモダイマー形成を容易にすることができる。（綽ｅｉｎｅ ｒ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）　、Ｎａ胆匹影狙：２３０）。 ｐ１８５二量化に対するＮＡＦの影響を決定するなめに架橋研究が実施された。 Ｎａｄａ　ｅｔ　ｉｆ、、　（１９９０）　Ｃｅ１ｌ　６１　：　１３３９に記 載されているように化学的架橋形成が行われた。１０ｃｍ培養血中に３Ｘ１０’ の細胞を入れ、５％ＦＣ９と一夜インキユベートした。培地をＩＴＳ−ＤＭＥＭ に替え一夜培養した。示された量のＮＡＦ、ｔたはＥＧＦを含むまたは含まない ＩＴＳ含有または非含有ＤＭＥＭと細胞を３７℃で８分間インキュベートし、冷 ＰＢＳで２度洗浄した。　４ｍＭＢ　５ｓ（Ｐｉｅｒｃｅ。 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＰＬ）を含む５−のＰＢＳを細胞に加え、２２℃で３０分 間インキュベートした０反応停止緩衝液の添加により架橋反応を停止させた。細 胞を可溶化し、その溶解物を７．１６．４抗体での免疫沈降に用いた。蛋白質を ４％−７，５％勾配５ＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル上で分離し、ニトロセルロースに 移した。ｐ１８５ｅ−ｎｅｕの単量および二量体は抗ホスホチロシンＭＡｂ　Ｐ Ｙ−２０（ＩＣＮＢｉｏｓｅｄｉｅａｌｓ、　Ｉｎｃ、　Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ 、　ＣＡ）およびＤＢＷ２（抗ｐ１８５細胞内領域）抗体で検出した。抗体は１ ２５ニー蛋白質Ａ　（Ｎｅｕ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏ ｎ、　Ｍ＾）で検出した。 架橋研究はＰＮ−ＮＲ６細胞（ｐ１８５＋／ＥＧＦＲ−）中のＰｉ８５ｃｍｎｅ ｕホモダイマーの量は０．１％または１．０％ＮＡＦへの暴露に対し用量依存様 式で増加したことを明らかにした。ＮＡＦを添加しない対照物では応答が起きな かった。ｐ１８５ｃｍｎｅｕホモダイマー中のホスホチロシンの量もまた０、１ ％または１．０％ＮＡＦの添加に対して用量依存様式で増加した。ｐ１８５ｃｍ ｎｅｕのヘテロダイマ一種は最近Ｋｏｋａｉ　ｅｔ　ａｔ、（１９８９）　、　 ｅｅｌ！　５８　：　２８７．　Ｎａｃｆａ　ｅｔ　ａｌ。 （１９９０）　Ｃｅｌ　ｌ　６１　：　１３３９に記述された。ｐ１８５ｃｍｎ ｅｕおよびＥＧＦＲの両方を高水準で発見するＭ１細胞において、Ｋｏｋａｉ、 　ｅｔ　ａｌ　、　（１９８９）　Ｃｅ１ｌ　５８　：　２８７゜ｐ１８５ｃｍ ｎｅｕ／ＥＧＦＲヘテロダイマーが存在し、Ｍ１細胞のＥＧＦ処理はまた用量依 存様式でｐ１８５ｃｍｎｅｕ／ＥＧＦＲヘテロダイマーの検出可能な量を増加さ せていた。 ！　ｐ１８５およびＥＧＦＲインターナリゼーションに対するＮＡＦおよびＥＧ Ｆの影響 同起原リガンドに対しての暴露に応答して受容体チロシンキナーゼは細胞表面で ダウンレギュレーションされる。ＰＮ−ＮＲ６細胞の表面からのｐ１８５ｃｍｎ ｅｕＴ方調節に対するＮＡＰｏ能力が、ＮＡＦ処理後のＰＮ−ＮＲ６細胞上の細 胞表面２１８５の量を免疫学的に定量的に算定することにより試験された。 Ｙａｒｄｅｎおよｐｅｉｎｂｅｒｇ　（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８６　：　３１７９に記載されているようなｐ１ ８５ｃｍｎｅｕＴ方調節アッセイが実方調れた。細胞はＩＴＳ含有ＤＭＥＭ中で 一夜培養し、示された時間ＮＡＦまたはＥＧＦとインキュベートした。ｌＸ１０ ’ＰＮ−ＮＲ６またはＮＥ１９細胞を２４をウェルディツシュ（Ｃｏｓｔａｒ、 　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ＾）に播種し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む ＤＭＥＭ培地中で一夜インキユベートした。これらの細胞はＤＭＥＭで洗浄し、 ＤＭＥＭで１時間インキュベートし、続いて１％ＮＡＦ　（容量）を含むまたは 含まない、または５０ｎｇ／ｍｉ’　ＥＧＦを含む結合緩衝液（２０ｍＭヘベス （ｐＨ７，２）および０．１％ウシ血清アルブミンを補給したＤＭＥＭ）とイン キュベートした。 ３７℃でのインキュベーション後、単層をＤＭＥＭで洗浄後、４℃で２μｇ／− の７．１６．４または抗−ＥＧＦＲ抗体とインキュベートした。このモノクロー ナル抗体はヒトＥＧＦ受容体の細１１％領域を認識し、１ｌｉｓｔｅｒ研究所Ｐ ｈ１ｌａｄｅ！ｐｈｉａ、　Ｐ＾。 のＭ、　Ｈｅｒｌｙｎ博士から提供を受けた。２時間のインキュベーションの後 、細胞結合抗体は１２ｓ工標識蛋白質Ａと４５分間インキュベーションすること により決定された。 ＰＮ−ＮＲ６細胞上のｐ１８５ｃｍｎｅｕの表面発現はＮＡＦ添加添加後置０分 ０％および９０分で４０％減少したが、ＥＧＦはこれらの同じ細胞中のｐ１８５ ０−ｎｅｕのインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）に対 して何の影響も与えなかった。ＮＥ−１９細胞上の表面ＥＧＦＲはＥＧＦの添加 により下方調節されたが、蛋白様物質によっては下方調節されなかった。細胞が ＮＡＦまたはＥＧＦと３７℃ではなく４℃でインキュベートされた場合、ｐ１８ ５ｃｍｎｅｕまたはＥＧＦＨのどちらも両方の細胞上で下方調節できながった。 ｍλ旦　〔用〕−チミジン取り込みで測定された細胞増殖に対するＮＡＦおよび 他の因子の影響 細胞の増殖に対するＮＡＦの影響が、トリチウム化チミジン取り込みを用いて評 価された。 サブコンフルエント細胞をトリプシン処理し、ｌＸｌ０’細胞を１０％ＦＣ８を 含むＤＭＥＭ培地中に懸濁し、９６ウエルプレートに播種した。−皮細胞を付着 させた後ＩＴＳを補給したＤＭＥＭ培地（インシュリン、トランスフェリンおよ びセレンの３つの最も共通の成分として持つと定義された培養培地、Ｃｏ　ｌ　 Ｉ　ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＨＡ）に置 き替えた。この血清を含まない培地中更に４８時間インキュベーションを続けた 。その後、細胞をＮＡＦ、ＥＧＦ　（上皮増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増 殖因子α）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子βン、またはＰＤＧＦ　（血小板由 来増殖因子ン因子に１６時間暴露した。細胞は６時間パルスで採取に先立って（ ’Ｈ）チミジン（０，５μＣｉ／■ｌ）を受けた。 ＮＡＦはＰＮ−ＮＲ６細胞（Ｐ１８５＋／ＥＧＦＲ−）の培養物のＤＮＡ合成の 相対レベルを上昇させた。■、０％ＮＡＦはＤＮＡ合成を３倍増加させた。ＮＡ ＦはＮＥ−１９細胞（Ｐ２Ｓ５−／ＥＧＦＲ＋）の培養物のＤＮＡ合成のレベル には影響しなかった。ＮＥ−１９細胞の培養物ＤＮＡ合成はＥＧＦをＬｏｎｇ／ −から１１００ｎ／−に増加させることにより２倍増加した。ＥＧＦ、ＴＧＦ− α（Ｌｏｎｇ／ｄまたは１１００ｎ／ｍｆｆ１）　、　ＴＧＦ−β（Ｌｏｎｇ／ ｄ）またはＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　（１０ｎｇ／ｄ　）因子はＰＮ−ＮＲ６細胞の培養 物のＤＮＡ合成にはどれも有意には影響しなかった。 ｍλ１　足場依存性増殖アッセイ−因子類の能力ＰＮ−ＮＲ６，ＮＥ−１９およ びＮＲ−６細胞株に対するＮＡＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＰＤ ＧＦの増殖能力を決定するため実施例４に記載した足場依存性増殖アッセイが実 施された。結果は表４に示されている。 ＰＮ−ＮＲ６細胞は本来軟寒天中ではコロニーを形成しないが、ＮＩＨ／３Ｔ３ トランスフェクト体（ＥＧＦＲを過剰発現する）はＥＧＦを添加した時のみ軟寒 天中にコロニーを形成する（ＤｉＦｉｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８７）　Ｃ ｅ旦５１　：　１０６３）　、ＮＡＦ特表千６−５０００７２　（９） もまたＰＮ−ＮＲ６細胞（Ｐ１８５＋／ＥＧＦＲ−）の軟寒天増殖能を増加させ たがＮＥ−１９細胞（ＥＧＦＲ−／ｐ１８５−）には何の影響も及ぼさなかった 。 逆にＥＧＦはＮＥ−１９細胞の軟寒天増殖能力を増加させたが、ｎｅｕを運ぶＰ Ｎ−ＮＲ６には何の効果もなかった。親ＮＲ−６細胞（Ｐ１Ｓ５−／ＥＧＦＲ− ）はＥＧＦによってもまたはＮＡＦによっても影響を受けなかった。すなわち、 蛋白様物質の増殖促進効果はＰ１８５ｃｍｎｅｕを発現する細胞においてのみ見 られた。さらに、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦは軟寒天中ＰＮ−ＮＲ ６またはＮＲ６細胞を増殖させてコロニーを形成させることがなかったので他の 因子がこれらの結果に関係することはありそうもない。 因子　濃度　ＰＮ−ＮＲ−６ＮＥ−１９ＮＲ−６−−００Ｏ ＮＡＦ（＄）　０．１　６　０　０ １．０　２５　０　０ ＥＧＦ（ｎｇ／ｍｆ）　１０　０　２２．　０ＴＧＦ−α（ｎｇ／ｄ）　１０　 ０　ｎ、ｄ＊　ｎ、ｄｌｏｏ　０　ｎ、ｄ　ｎ、ｄ ＴＧＦ−β（ｎｇ／ｍｆｆ１）　１　０　ｎ、ｄ　ｎ、ｄｌｏ　０　ｎ、ｄ　ｎ 、ｄ Ｉｎ、ｄ＝測測定れていない（ｎｏｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　）手続補正書 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０２３３１ 、発明の名称 ｎｅｕ遺伝子産物のためのリガンド ３、補正をする者 名　称　ザ・トラスティーズφオブ・ザ・ユニバーシティ・オブ拳ペンシルバニ ア ４８代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正の対象 （別紙） 請求の範囲を下記の通り補正する。 「　請求の範囲 １、Ｐ１Ｓ５に結合可能である精製蛋白様物質（ここで該蛋白様物質は Ｐ１Ｓ５に含まれているチロシンキナーゼの活性を増加させるが上皮増殖因子受 容 体のチロシンキナーゼの活性は増加さ せず； Ｐ１Ｓ５の三量化を誘導し： Ｐ１Ｓ５のインターナリゼーションを誘導しＰ１Ｓ５を発現する細胞の増殖に用 量依存性様式で影響し； 約５６℃から約１００℃で熱安定であり；プロテアーゼで分解可能であり；およ びクロマトグラフィー条件に依存して約７．０００から約１４．０００ダルトン の分子量を持つ）または、Ｐ１Ｓ５に対する結合親和性を持つその断片。」 以上 手続補正書 平成　４年１０月ｌア日１

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ｐ１８５に結合可能である精製蛋白様物質（ここで該蛋白様物質はｐ１８５ に含まれているチロシンキナーゼの活性を増加させるが上皮増殖因子受容体のチ ロシンキナーゼの活性は増加させず；ｐ１８５の二量化を誘導し； ｐ１８５のインクーナリゼーションを誘導し；ｐ１８５を発現する細胞の増殖に 用量依存性様式で影響し；約５６℃から約１００℃で熱安定性であり；アロテア ーゼで分解可能であり；およびクロマトグラフィー条件に依存して約７，０００ から約１４，０００ダルトンの分子量を持つ） または、ｐ１８５に対する結合親和性を持つその断片。
2. ２．請求項１の蛋白様物質の二量体。
3. ３．請求項１の蛋白様物質の三量体。
4. ４．哺乳動物に請求項１の蛋白様物質をその哺乳動物の代謝状態を変えるのに十 分な量投与することからなる哺乳動物の代謝状態を変えるための哺乳動物の処置 方法。
5. ５．請求項１の該蛋白様物質と相乗的態様で哺乳動物の代謝状態を変えるのに十 分な量の上皮増殖因子を該哺乳動物に投与する段階をさらに含む請求項２記載の 方法。
6. ６．腫瘍増殖の低下に有効な請求項１の蛋白様物質および上皮増殖因子の量をそ のような腫瘍を持つ哺乳動物に投与することからなる腫瘍細胞の表面にｐ１８５ および上皮増殖因子受容体を発現する哺乳類腫瘍の処置方法。
7. ７．該哺乳動物がヒトである請求項４に記載の方法。
8. ８．該蛋白様物質が細胞毒性分子と複合されている請求項４に記載の方法。
9. ９．該上皮増殖因子が細胞毒性分子と複合されている請求項４に記載の方法。
10. １０．腫瘍増殖を変えるのに有効な蛋白様物質の量をそのような腫瘍を持つ哺乳 動物へ投与することからなる、腫瘍細胞の表面にｐ１８５ｎｅｕまたはｐ１８５ の異常形を発現する哺乳類腫瘍の処置方法。
11. １１．該哺乳動物がヒトである請求項８に記載の方法。
12. １２．該蛋白様物質が細胞毒性分子と複合されている請求項８に記載の方法。
13. １３．結合条件下疑われた腫瘍細胞と請求項１の蛋白様物質を接触させ；および 結合蛋白様物質を検出する（それにより結合された請求項１の蛋白様物質の存在 はｐ１８５を発現している腫瘍の存在を示している）ことから成る腫瘍細胞の表 面にｐ１８５を発現している哺乳類腫瘍の診断方法。