JPS6317433B2

JPS6317433B2 -

Info

Publication number: JPS6317433B2
Application number: JP54047184A
Authority: JP
Inventors: Masato Okada
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1979-04-19
Filing date: 1979-04-19
Publication date: 1988-04-13
Also published as: JPS55141193A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は酵素の精製方法に係り、特にプトレシ
ンオキシダーゼ、スペルミジンデヒドロゲナーゼ
等のポリアミンを特異的に基質とする特定酵素の
精製方法に関する。

酵素の従来の精製方法としては、一般のタンパ
ク質の精製方法に準じ、その電荷、サイズ、溶解
度、熱安定性、吸着力等の違いを利用する方法が
とられている。具体的には、イオン交換セルロー
ス、イオン交換セフアデツクス、ゲル濾過、ヒド
ロキシルアパタイト等のカラムを組合せて通過さ
せる方法が行なわれている。しかしながら、これ
ら従来の精製方法は、工程が長く煩雑でしかも精
製される酵素の収率が低いという難点がある。

また最近、酵素の精製方法として生物化学的特
異性を利用した分離精製法、即ちアフイニテイ
ー・クロマトグラフイーを使用する方法が行なわ
れるようになつてきた。この方法は目的とする酵
素を特異的に吸着させるため収率が高く、更に簡
単で迅速であるという特長を有している。しか
し、この方法を特定酵素の分離精製に応用するに
あたつては、該酵素を特異的乃至選択的に結合で
きる化合物、所謂リガンドと称されるものを見い
出すことが先ず重要である。

本発明者等は種々研究を続けた結果、ポリアミ
ンリガンドとして、これと支持体との結合体がプ
トレシンオキシダーゼ、スペルミジンデヒドロゲ
ナーゼ等のポリアミンを特異的に基質とする特定
酵素を特異的乃至選択的に吸着すること、また該
結合体に吸着された酵素は食塩等の塩溶液で容易
に溶出されるばかりでなく、これに低濃度のポリ
アミンを添加した溶液を用いると該特定酵素を容
易にかつ極めて特異的に溶出すること、更にポリ
アミンと支持体との結合体は、酵素により触媒作
用を受けることなく、繰返し使用が可能であるこ
とを知見した。

本発明はこれらの知見に基づいて完成されたも
のである。即ち本発明によれば、ポリアミンと支
持体との結合体にポリアミンを特異的に基質とす
る酵素の粗製液を接触させた後該結合体を塩また
は塩とポリアミンを含む溶液で接触させ所望の酵
素を溶出することを特徴とする酵素の精製方法が
提供される。

本発明の精製方法に適用される酵素はポリアミ
ンを特異的に基質とする酵素であり、例えばプト
レシンオキシダーゼ、スペルミジンデヒドロゲナ
ーゼ、スペルミンオキシダーゼ、スペルミジンオ
キシダーゼ（ザジヤーナルオブバイオロジ
カルケミストリー、237、3443−3448（1962）に記
載されるもの）、等がある。

本発明において、支持体に結合してリガンドと
して使用されるポリアミンはアミノ基を２個以上
有する鎖状炭化水素化合物であれば特に限定され
ないが、下記一般式ＡあるいはＢで示される化合
物が好ましく、あるいはそのHCl、HBr等の塩を
含めてポリアミンと総称する。

NH₂（CH₂）_xNH₂ ……Ａ NH₂（CH₂）_xNH（CH₂）_yNH₂ ……Ｂ（但し、ｘ＝２〜16、ｙ＝２〜16）例えばNH₂（CH₂）₄NH₂、NH₂（CH₂）₆NH₂、
NH₂（CH₂）₈NH₂、NH₂（CH₂）₁₂NH₂、NH₂
（CH₂）₃NH（CH₂）₃NH₂などを挙げることができ
る。しかして本発明において使用される上記式で
示されるポリアミンは、一般的にメチレン鎖が長
くなればなる程精製されるポリアミンを基質とす
る酵素に対する特異性および吸着性が強くなる傾
向にあるのでその点においては望ましいことであ
るが、反面該ポリアミンを結合した結合体から吸
着された酵素の溶出が困難になる。

また一般式Ｂで示されるポリアミンは高価であ
る。これらの観点から本発明においては一般式Ａ
で示され、且つｘが４〜８の範囲にあるポリアミ
ンを用いることが推奨される。

本発明においては、上述のポリアミンを結合さ
せるための支持体としてアガロース、アクリルア
ミド、セルロース、デキストラン等が用いられ
る。具体的には、アガロースとしては“セフアロ
ーズ”（商品名；フアルマシア社製）等が、アク
リルアミドとしては“バイオゲルＰ”（商品名；
バイオ・ラド社製）等が、セルロースとしては
“セルロースCF―１”（商品名；ワツトマン社製）
等が、またデキストランとしては“セフアデツク
ス”（商品名；ワツトマン社製）等の市販品が用
いられる。これらのうち、アガロースはカラムに
充填した場合に目詰まりを起こさない、マトリツ
クスの構造が疎であるためにリガンドとの反応容
量が大きくまた結合したリガンドと酵素との相互
作用に悪影響を及ぼさない等の利点があるので特
に好ましく用いられる。

本発明において、リガンドとしてのポリアミン
と支持体との結合体を製造する方法は、上記ポリ
アミンと支持体とが化学結合して結合体を形成で
きれば特に限定されない。一般には支持体を臭化
シアン、過ヨウ素酸、エピクロルヒドリン等で活
性化した後、ポリアミンを加えて支持体に結合さ
せる方法が採られる。支持体に結合させるポリア
ミンの量はリガンドとして該ポリアミンの末端の
一級アミノ基を残すように結合させるために、一
般に上記活性化試薬に対して等モル以上、好まし
くは４倍モル以上使用する。

本発明の実施に際しては、上記の支持体にリガ
ンドを結合した結合体をカラムに充填し精製する
粗製酵素を中性条件下好ましくはPH6.5−8.0で
通過させ、酵素を結合体に吸着させればよい。接
触条件としては一般に低温好ましくは０〜５℃で
カラム容量１時間を目安として適宜接触させれば
よい。その際通過液中には酵素の活性は認められ
ず、目的とする酵素は全て結合体に吸着されてい
ることが判明した。次に一般にカラムを適当な濃
度（リガンドの種類によつて変わる）の塩溶液で
洗浄して予め不純タンパクを除去する。その後洗
浄液よりも高濃度の塩もしくはポリアミンを添加
した塩水溶液を通過させることにより酵素が溶出
し、高純度の酵素が高収率で得られる。即ち本発
明においては酵素の結合体を塩またはこれにポリ
アミンを添加した塩溶液で接触処理することによ
つて所定酵素の溶出が行われる。

上記塩溶液として調製される塩としては一般に
塩化ナトリウム、塩化カリウム等の水溶液性アル
カリ金属塩であれば特に制限されないが、特に食
塩が入手容易で好適に用いられる。また塩溶液の
濃度は支持体にリガンドとして結合されたポリア
ミンの種類、結合量によつて適宜に調節すればよ
いが、一般に0.01〜1.0Mである。

しかして前記したように一般的にリガンドとし
て使用するポリアミン中のメチレン鎖長が短かく
なると酵素との吸着力が弱くなる傾向があるの
で、高濃度の塩水をカラムに通過させるだけで酵
素としてスペルミジンデヒドロゲナーゼは溶出さ
れる。例えばリガンドとして前記一般式Ａにおい
てｘが６のポリアミンを用いた場合は１規定濃度
以下の食塩水で溶出される。しかし、リガンドと
して同じくｘが８のポリアミンを用いた場合はも
はや食塩水のみでは酵素は溶出されない。このよ
うな場合は食塩水にポリアミンを少量一般に0.5
〜10ミリモル濃度となるように添加した溶液を用
いると酵素が溶出される。この溶出のため用いら
れるポリアミンは、前述のリガンドとして用いら
れるポリアミンが何等制限なく用いられるが、特
に前記一般式Ａにおいてｘが３〜８のポリアミン
および同じく一般式Ｂにおいてｘが３〜８、ｙが
３〜８のポリアミンが好ましく用いられる。

以上に述べた本発明は、操作が簡便で且つ迅速
に所望の酵素を高純度で且つ高収率で得ることが
できる精製方法である。

また本発明においては、結合体は酵素により触
媒作用を受けることなく繰返し使用が可能であ
り、経済的である。

以下、実施例をあげて説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。

なお、酵素の純度の測定は、デイビス、アナル
ズ・ニユーヨーク・アカデミー・サイエンシズ、
121、404（1964）に記載のあるポリアクリルアミ
ド・DISC・ゲル電気泳動及びウエーバー、オズ
ボーン、ジヤーナル・バイオロジカル・ケミスト
リー、244、4406（1969）に記載のあるSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により実施した。

またプトレシンオキシダーゼ活性測定にはプト
レシンを基質として使用し、酵素反応の進行に伴
なつて生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ
（ベーリンガー・マンハイム社製）と０―ジアニ
シジンとカツプリングさせて生成する酸化型０―
ジアニシジンを460nmの吸光度の増加を測定する
ことにより行つた。この過酸化水素の測定法はグ
イドツテイ等のアナリテイカル・ケミストリー、
33、151（1961）に記載されたものに準じた。活性
の表示は１分間に1μmoleの過酸化水素を生成す
るに必要な酸素量を１単位として行つた。更に、
スペルミジンデヒドロゲナーゼ活性測定には、ス
ペルミジンを基質として使用し、電子受容体とし
てフエリシアン化カリウムを用い、酵素反応の進
行に伴つて消費されるフエリシアン化カリウムの
量を、400nmの吸光度の減少速度で測定すること
により行つた。この酵素活性測定法は、ターバー
等のジヤーナル・バイオロジカル・ケミストリ
ー、245、5424（1970）に記載されたものに準じ
た。活性の表示は、１分間に1μmoleのスペルミ
ジンが脱水素されるに必要な酵素量を１単位とし
て行つた。

実施例１セフアローズ4B30mlを30mlの水に懸濁したも
のを60mlの2M炭酸ナトリウム溶液に入れる。室
温で撹拌しながら５mlのアセトニトリルに溶解さ
せた５ｇの臭化シアンを一度に加える。約５分間
撹拌した後ブツフナーロートで濾過し、あらかじ
め氷冷した0.1Mの炭酸ナトリウム緩衝液
（PH9.5）600ml、続いて600mlの氷冷水で洗浄を
行う。この活性化セフアローズ4Bを60mlの0.1M
炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.5）に懸濁する。こ
の懸濁液をあらかじめ氷冷した１，12―ジアミノ
ドデカン（NH₂（CH₂）₁₂NH₂）9.4ｇを加えた
0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.5）90mlに加
えて、４℃で16時間ゆるやかに振とうしながら反
応させる。反応後ブツフナーロートで濾過を行
い、以下に示す溶液で順次吸引濾過洗浄を行う。
水（500ml）、0.1M重炭酸水素ナトリウム溶液
（500ml）、水（500ml）、0.1M酢酸溶液（500ml）、
水（1000ml）。本操作により、セフアローズ１ml
当り18.3μmoleのリガンドが結合したω―アミノ
ドデシル・セフアローズ4Bが得られた。

次いで上記で調製したω―アミノドデシル・セ
フアローズ4Bをカラム（10×140mm；カラム容積
11ml）に充填し、10mMリン酸緩衝液（PH7.2）
で平衡化した後、粗製プトレシンオキシダーゼ溶
液30ml（総タンパク含量810mg、総酵素活性674単
位、比活性0.832単位／mgタンパク）を注加する。
この粗製プトレシンオキシダーゼ溶液は以下の如
く調製した。

プトレシン0.5％、ポリペプトン0.5％、グルコ
ース0.5％、酵母エキス0.2％、食塩0.1％よりなる
培地（pH7.0）にミクロコツカス・ローゼウス
（IFO−3768）を接種し、30℃、40時間通気培養
を行い、得られた培養物を10000rpm、10分間遠
心分離した。得られた湿菌体100ｇを0.85％の食
塩水で洗浄後、10mMリン酸緩衝液（pH7.2）
400mlに懸濁せしめ、５℃以上に温度が上昇しな
いよう冷却しながら20MHz、90W、60分間超音
波破砕処理を行つた。この破砕液を15000rpm、
60分間遠心分離を行い上清液を得た。この上清液
中の蛋白を硫安濃度40％飽和から70％飽和の間で
硫安分画を行つた。得られた硫安沈殿蛋白成分を
10mMリン酸緩衝液（pH7.2）100mlに溶解し、
同一緩衝液に対して４℃下で20時間透析を行い脱
塩を行つた。この蛋白溶液をDEAE―セルロース
（DE―52、ワツトマン社製）を充填したカラム
（22×500mm、pH7.2の10mMリン酸緩衝液にて平
衡化）に注加せしめ、食塩濃度が0.0Mから0.6M
の直線濃度勾配（総容量2000ml）にて吸着された
蛋白質を溶出させた。プトレシンオキシダーゼは
食塩濃度が約0.25Mから0.30Mの間に溶出され
た。このプトレシンオキシダーゼの活性画分を回
収し、10mMリン酸緩衝液に対して５℃下で20時
間透析し脱塩を行つた。これらの操作で得られた
酵素液を粗製プトレシンオキシダーゼ溶液とし
た。次いでカラムを110mlの10mMリン酸緩衝液
で洗浄した後、同緩衝液の0.9N食塩溶液500mlに
て不純タンパクを溶出させる。次いで、同緩衝液
に最終濃度が1.0N、5mMになるよう、それぞれ
食塩、プトレシン（NH₂（CH₂）₄NH₂）を添加し
た溶液を流すと選択的にプトレシンオキシダーゼ
が溶出される。酵素活性を有するフラクシヨンを
集めた結果、総タンパク重量19.3mg、総酵素活性
670単位、比活性は34.7単位／mgタンパクであつ
た。酵素活性回収率は99.5％、比活性の上昇は
41.7倍である。得られたプトレシンオキシダーゼ
の純度をポリアクリルアミド・DISC・ゲル電気
泳動により検定した結果、単一のバンドを示し純
粋であることが確認された。

実施例２リガンドとしてNH₂（CH₂）₄NH₂を用いて、ま
た、不純タンパクを溶出させる溶液として500ml
の0.1N食塩を含む緩衝液、プトレシンオキシダ
ーゼを溶出させる溶液として0.1N食塩・5mMプ
トレシンを含む緩衝液を使用した以外は実施例１
と同様に行つた。その結果、酵素活性回収率は
95.6％、比活性18.3単位／mgタンパク、比活性上
昇率は22.1倍であつた。

実施例３リガンドとしてNH₂（CH₂）₈NH₂を用いて、ま
た、不純タンパク洗浄液として500mlの0.3N食塩
を含む緩衝液、プトレシンオキシダーゼを溶出さ
せる溶液として0.3N食塩・5mM NH₂
（CH₂）₆NH₂を含む緩衝液を使用した以外は実施
例１と同様に行つた。その結果、酵素活性回収率
は99.5％、比活性24.2単位／mgタンパク、比活性
上昇率は29.2倍であつた。

実施例４リガンドとしてNH₂（CH₂）₃NH（CH₂）₃NH₂を
用いて、また不純タンパク洗浄溶液として500ml
の0.05N食塩を含む緩衝液、プトレシンオキシダ
ーゼを溶出させる溶液として0.05N食塩・5mM
NH₂（CH₂）₃NH（CH₂）₃NH₂を含む緩衝液を使用
した以外は実施例１と同様に行つた。その結果、
酵素活性回収率は86.7％、比活性13.2単位／mgタ
ンパク、比活性上昇率は15.9倍であつた。

実施例５リガンドとしてNH₂（CH₂）₈NH₂を用いて、ま
た不純タンパクを溶出させる溶液として500mlの
0.35N食塩を含む緩衝液、プトレシンオキシダー
ゼを溶出させる溶液として0.65N食塩を含む緩衝
液を使用した以外は実施例１と同様に行つた。そ
の結果、酵素活性回収率は98.2％、比活性19.5単
位／mgタンパク、比活性上昇率は23.5倍であつ
た。

実施例６ 30mlのセフアローズ4Bを30mlの水に懸濁した
ものを60mlの2M炭酸ナトリウム溶液に入れる。
室温で撹拌しながら５ｇの臭化シアンを５mlのア
セトニトリルに溶解させた溶液を一度に加える。
約５分間撹拌した後ブツフナーロートで濾過し、
あらかじめ氷冷した0.1Mの炭酸ナトリウム緩衝
液（PH9.5）600ml、続いて600mlの氷冷水で洗浄
を行う。この活性化セフアローズ4Bを60mlの
0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.5）に懸濁す
る。この懸濁液をあらかじめ氷冷した１，８―ジ
アミノオクタン（NH₂（CH₂）₈NH₂）6.8ｇを加え
た0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.5）90mlに
加えて、４℃で16時間ゆるやかに振とうしながら
反応させる。反応後ブツフナーロートで濾過を行
い、以下に示す溶液で順次吸引濾過洗浄を行う。
水（500ml）、0.1M重炭酸水素ナトリムム溶液
（500ml）、水（500ml）、0.1M酢酸溶液（500ml）、
水（1000ml）。本操作によりセフアローズ１ml当
り、16.6μmoleのリガンドが結合したω―アミノ
オクチル・セフアローズが得られた。

次いで上記で調製したω―アミノオクチル・セ
フアローズ4Bをカラム（10×40mm；カラム容積
11ml）に充填し、5mMリン酸緩衝液（PH7.2）
で平衡化した後、粗製スペルミジンデヒドロゲナ
ーゼ溶液45ml（総タンパク重量1256mg、総酵素活
性460単位、比活性0.366単位／mgタンパク）を注
加する。この粗製スペルミジンデヒドロゲナーゼ
は、以下に示す操作で調製したものである。カル
ジン0.5％、ポリペプトン0.5％、グルコース0.5
％、酵母エキス0.2％、食塩0.1％よりなる培地
（pH7.0）にセラチア・マルセセンス（ATCC−
25179）を接種し、30℃、40時間通気培養を行い、
得られた培養物を10000rpm、10分間遠心分離し
た。得られた湿菌体100ｇを0.85％の食塩水で洗
浄後、5mMリン酸緩衝液（pH7.2）400mlに懸濁
せしめ、５℃以上に温度が上昇しないよう冷却し
ながら20MHz、90W、60分間超音波破砕処理を
行つた。この破砕液を16000rpm、120分間遠心分
離を行い上清液を得た。この上清液を、あらかじ
め5mMリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化した
DEAE―セルロース（DE―52）カラム（28×500
mm）に注加せしめ、約500mlの平衡化緩衝液によ
つてカラムを洗浄した。洗浄後、食塩濃度が
0.0Mから0.4Mである直線濃度勾配（総容量2000
ml）にてカラムに吸着された蛋白質を分別した。
スペルミジンデヒドロゲナーゼの活性画分を集
め、5mMリン酸緩衝液に対して５℃下で18時間
透析を行い脱塩した。この脱塩後の酵素溶液を粗
製スペルミジンデヒドロゲナーゼ溶液とした。次
いで、カラムを56mlの5mMリン酸緩衝液で洗浄
した後、同緩衝液の0.9N食塩溶液500mlにて不純
タンパクを溶出させる。次いで、同緩衝液に最終
濃度が1.0N、5mMになるよう、それぞれ食塩、
Ｎ，N′―（３―アミノプロピル）―１，３―ジ
アミノプロパン（NH₂（CH₂）₃NH（CH₂）₃NH₂）
を添加した溶液を流すと、選択的にスペルミジン
デヒドロゲナーゼが溶出される。酵素活性を有す
るフラクシヨンを集めた結果、総タンパク重量
0.91mg、総酵素活性397単位、比活性436単位／mg
タンパクであつた。酵素活性回収率は86.4％、比
活性の上昇は1191倍である。得られたスペルミジ
ンデヒドロゲナーゼの純度をポリアクリルアミ
ド・DISC・ゲル電気泳動及びSDS・ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により検定した結果、単一
のバンドを示し、純粋であることが確認された。

実施例７リガンドとしてNH₂（CH₂）₄NH₂を用いて、ま
た不純タンパクを溶出させる溶液として500mlの
0.2N食塩を含む5mMリン酸緩衝液（PH7.2）を、
スペルミジンデヒドロゲナーゼを溶出させる溶液
として0.2N食塩、5mM NH₂（CH₂）₃NH
（CH₂）₃NH₂を含む5mMリン酸緩衝液を使用した
以外は実施例１と同様に行つた。その結果、酵素
活性回収率は79.7％、比活性118単位／mgタンパ
ク、比活性上昇率は322倍であつた。

実施例８リガンドとしてNH₂（CH₂）₃NH（CH₂）₃NH₂を
用いて、また不純タンパクを溶出させる溶液とし
て500mlの0.1N食塩を含む5mMリン酸緩衝液
（PH7.2）を、さらにスペルミジンデヒドロゲナ
ーゼを溶出させる溶液として0.1N食塩、5mM
NH₂（CH₂）₃NH（CH₂）₃NH₂を含む5mMリン酸
緩衝液を使用した以外は実施例１と同様に行つ
た。その結果、酵素活性回収率は71.6％、比活性
64.6単位／mgタンパク、比活性上昇率は177倍で
あつた。

実施例９リガンドとしてNH₂（CH₂）₆NH₂を用いて、ま
た不純タンパクを溶出させる溶液として500mlの
0.4N食塩を含む5mMリン酸緩衝液を、さらにス
ペルミジンデヒドロゲナーゼを溶出させる溶液と
して0.4N食塩、5mM NH₂（CH₂）₃NH
（CH₂）₃NH₂を含む5mMリン酸緩衝液を使用した
以外は実施例１と同様に行つた。その結果、酵素
活性回収率85.1％、比活性278単位／mgタンパク、
比活性上昇率は760倍であつた。

実施例 10 リガンドとしてNH₂（CH₂）₆NH₂を用いて、ま
た不純タンパクを溶出させる溶液として500mlの
0.4N食塩を含む5mMリン酸緩衝液、さらにスペ
ルミジンデヒドロゲナーゼを溶出させる溶液とし
て0.8N食塩を含む5mMリン酸緩衝液を使用した
以外は実施例１と同様に行つた。その結果、酵素
活性回収率は82.8％、比活性126単位／mgタンパ
ク、比活性上昇率344倍であつた。

Claims

【特許請求の範囲】１ポリアミンと支持体との結合体にポリアミン
を特異的に基質とする酵素の粗製液を接触させた
後、該結合体を塩または塩とポリアミンを含む溶
液で接触させ所望の酵素を溶出することを特徴と
する酵素の精製方法。２酵素がプトレシンオキシダーゼである特許請
求の範囲第１項記載の方法。３酵素がスペルミジンデヒドロゲナーゼである
特許請求の範囲第１項記載の方法。４支持体と結合されるポリアミンが一般式
NH₂（CH₂）_xNH₂（ｘ＝２〜16）で表わされる化
合物である特許請求の範囲第１項記載の方法。５支持体と結合されるポリアミンが一般式
NH₂（CH₂）_xNH（CH₂）_yNH₂（ｘ＝２〜16、ｙ＝
２〜16）で表わされる化合物である特許請求の範
囲第１項記載の方法。６支持体がアガロースである特許請求の範囲第
１項記載の方法。７塩が水溶性アルカリ金属塩である特許請求の
範囲第１項記載の方法。８水溶性アルカリ金属塩が塩化ナトリウムであ
る特許請求の範囲第７項記載の方法。