JPH04117281A - ベタインアルデヒド脱水素酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属
に属するベタインアルデヒド脱水素酵素生産菌を培養し
、得られた培養物からベタインアルデヒド脱水素酵素を
取得する方法に関するものである。

ベタインアルデヒド脱水素酵素は、ベタインアルデヒド
をＮＡＤ（Ｐ）存在下で酸化もしくは脱水素し、ベタイ
ンを生成する反応を触媒する酵素として知られており、
その用途としてコリンエステラーゼ活性の測定あるいは
レシチンの定量に利用される。

また最近では、ベタインアルデヒド脱水素酵素は浸透圧
調整物質の１種であるベタインの生合成に関与する酵素
として浸透圧ストレスの面からも研究されており、ホウ
レン草由来の酵素が詳しく検討されている。

［従来技術および問題点］ 従来ベタインアルデヒド脱水素酵素生産菌としてはシュ
ードモナス・アルギノーサ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　
Ａ　−１６［アグリカルチュアル　アンド　バイオロジ
カルケミストリー（Ａｇｒｉｃａ！ｔｕａｌ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　４０巻
、１７４３〜１７４９　（１９７６年）］、シリンドロ
カルボン・ディディマム（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏ
ｎ　ｄｉｄｙｍｕｍ）　Ｍ　−１〔同誌４４巻、３０１
５〜３０１６　（１９８０年）〕あるいはペニシリウム
属（特開昭５６−１０２７８８）が知られている。

しかしながら、これらの菌株以外のベタインアルデヒド
脱水素酵素生産能を有する菌株による該酵素の製造方法
の開発が望まれていた。

［課題を解決するための手段及び作用コ本発明者らは、
ベタインアルデヒド脱水素酵素の工業的生産の可能な製
造法を求めて鋭意研究を重ねた結果、キサントモナス属
に属する菌株がベタインアルデヒド脱水素酵素生産能を
有することを見いだし本発明を完成した。

本発明はキサントモナス属に属するベタインアルデヒド
脱水素酵素生産菌を培養し、培養物からベタインアルデ
ヒド脱水素酵素を採取することを特徴とするベタインア
ルデヒド脱水素酵素の製造方法である。

以下に本発明について詳細に説明する 本発明者らは、キサントモナス属の菌株がコリンを単一
の炭素源、窒素源として利用でき、ベタインアルデヒド
脱水素酵素を生産することを見い出し、該酵素の精製を
行い、諸性質の検討を行った。

本発明における使用菌はキサントモナス属に属するベタ
インアルデヒド脱水素酵素生産菌であるが、例えば、キ
サントモナス・トランスルーセンスＩＦＯ１３５５８（
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ　Ｉ
ＦＯ１３５５８）が挙げられる。

本発明において、ベタインアルデヒド脱水素酵素生産菌
の培養には、通常の栄養培地に、コリンあるいはコリン
含有物質を加えたものを使用する。

コリンは炭素源、窒素源のいずれとしても利用されるが
、さらに炭素源としてブドウ糖、デンプン等、窒素源と
して硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アン
モニウム、肉エキス、酵母エキス等を加えても良い、無
機塩としてはリン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化ナトリウム等が使用できる１本発明に好適な培地成分
として一例を挙げると以下のような組成となる。

莢ヱヨ コリン塩酸塩　　　　　　　２．０％ リン酸二水素カリウム　　　０．５％ リン酸−水素カリウム　　　０．５％ 塩化ナトリウム　　　　　　０．１％ 硫酸マグネシウム　　　　　０．０５％酵母エキス　　
　　　　　　０．０５％なお培養条件としては、温度は
２０〜４０℃で好気的に０．５〜４日間培養するのがよ
い、培地のｐＨは５〜７が好ましい。

培養で得られた菌体は洗浄後、破砕し、粗酵素液を調製
するが、菌体の破砕方法としては、ガラスピーズ、活性
アルミナ等と菌体を混合して磨砕する方法、その他とし
ては、超音波、水圧、凍結融解等の物理的な力を利用す
るなどいずれの方法を用いても良い。

これらの方法によって得られた菌体破砕物に水又は適当
な緩衝液を加え、懸濁液とした後、遠心分離あるいはろ
過などで得られる上澄液又はろ過液を粗酵素液とする。

このようにして得られた粗酵素液からベタインアルデヒ
ド脱水素酵素以外の夾雑物を除くには塩析、ゲルろ過、
イオン交換クロマトグラフィー電気泳動などが単独ある
いは組み合わせて使用できる。

本発明における好適な菌株として挙げられるキサントモ
ナス・トランスルーセンスＩＦＯ１３５５８由来のベタ
インアルデヒド脱水素酵素の酵素化学的性質について述
べる。

（１）作用：電子受容体（ＮＡＤ等）の存在下でベタイ
ンアルデヒドを酸化してベタインを生成する。

（２）至適ｐＨ二本酵素の至適ｐＨは９．５付近にある
。

（第１図に示す、） （３）至適温度；本酵素の至適温度は３５〜４０℃にあ
る。　（第２図に示す、） （４）基質特異性二基質としてコリン、ベタインなどの
ベタインアルデヒド類縁物質、種々のアルデヒド及びア
ルドースについて検討したところ、ベタインアルデヒド
のみが酸化された。この結果を第１表に示す。

（以下余白） 第 表 （５）金属イオンの影響：その結果を第２表に示す。

（以下余白） 本酵素は１ｇ＋、１ｇ　２＋及びＣｕ２÷により完全に
阻害された。　また、Ｃｕ”、Ｆｅ”、Ｆｅ”、　　Ｚ
ｎ”十でも阻害がみられた。

阻害剤：その結果を第３表に示す。

第　　３　　表 本酵素活性はＳＨ基阻害剖であるｐ−ＣＭＢ（ｐ−ｃｈ
ｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｙｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、
ＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔ
ｒｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ））により強く阻害され
た。また、ＰＱＱ酵素の阻害剤であるセミカルバジドで
は阻害されなかった。

等電点：ｐＩ４．７ 活性測定法二ベタインアルデヒドを基質とし、次のよう
な反応組成で、３０℃で反応させ、ＮＡＤＨの３４０ｎ
ｍにおける吸光度の増加を経時的に測定した。

リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　１２５μモルベ
タインアルデヒド塩酸塩　　２．５μモルβ−ＮＡＤ”
　　　　　　　　　　　０．５μモル酵素液　　　　　
　　　　　１０．０ｇモル上記組成の反応液をＩＮの水
酸化ナトリウムでｐＩ（７，０に調製する。

この条件下で１分間に１ｇモルのＮＡＤＩ（を生成させ
る酵素量を１単位とする。

比活性はタンパク質１ｍｇ当たりの単位数と定義した。

また、タンパク質の測定は牛血清アルブミンを標準タン
パクとし、ローリ−法、あるいは２８０ｎｍの測定によ
り行った。

虱豊皇 キサントモナス・トランスルーセンスＩＦＯ１３５５８
から得られたベタインアルデヒド脱水素酵素（以下、本
酵素とする）の酵素化学的性質とシュードモナス・アル
ギノーサＡ−１６由来の酵素（以下、酵素ａとする）、
シリンドロカルボン・ディディマム由来の酵素（以下、
酵素すとする）及びホウレン草由来の酵素（以下、酵素
Ｃとする）とを比較した。その結果を第４表に示す。

（以下余白） 第４表 分子量は本酵素と酵素すは約２０万であるが、酵素ａで
は約１５万、酵素Ｃでは１１万と／ＪＳさい値になって
いる。

またサブユニットの数は酵素Ｃが２個であるのに対し、
本酵素と酵素すでは４個となり、サブユニット構造に違
いが認められた。

ベタインアルデヒドに対するＫｍ値は酵素Ｃの場合、他
の微生物由来の酵素と比べて１桁小さい値となっており
、基質に対してより親和性が高くなっている。

補酵素要求性では、酵素ＣではＮＡＤのみが補酵素とな
ったが、本酵素、酵素ａ及び酵素ＣはＮＡＤＰも補酵素
となった。

ＫＮ値は本酵素及び酵素ａの場合、ＮＡＤよりＮＡＤＰ
の方が低い値となり、酵素ＣではＮＡＤの方が低い値と
なっており、基質や補酵素に関しては、各酵素間ではか
なり大きな違いが認められた。

次に、本発明の実施例を示す。

裏層１ 前記した培地例の培地２０１でキサントモナス・トラン
スルーセンス　ＩＦＯ１３５５８を培養し、遠心分離で
集菌後、菌体を５＋＋＋Ｍのメルカプトエタノールを含
む６０！ＩＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐｉ（７，０）
に懸濁し、超音波処理を行った。得られた粗酵素液を４
０〜７０％飽和の硫安分画に供し、続いてＤＥＡＥ−ト
ヨパールのイオン交換クロマトグラフィーを行った。

溶出は塩化カリウムの０〜０．５Ｍのりニア−グラジェ
ントにより行った。さらに５０〜７０％飽和の硫安分画
、ブチル−トヨパールの疎水クロマトグラフィーを行っ
た。溶出は硫安濃度を２５％〜Ｏ％までリニアーグラジ
ェントにより低下させて行った。

最後に５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００によるゲルろ過
クロマトグラフィーを行い酵素を精製した。その結果、
粗酵素液から約１５０倍に精製された比活性６９．４の
ベタインアルデヒド脱水素酵素標品を得た。

得られたベタインアルデヒド脱水素酵素標品の純度を調
べるため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったと
ころ、４本のバンドが検出された。

これはサブユニットの解離あるいは会合によるものと思
われる。一方、５ＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、１本
のバンドとなり、得られた酵素標品はほぼ均一であると
考えられた。また、５ＤＳ−ＰＡＧＥよりサブユニット
の分子量は約５万と算出された。

５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００を用いて本酵素の分子
量の測定を行ったところ、分子量は約２０万となった。

サブユニットの分子量を考え合わせると、本酵素は分子
量５万の同一のサブユニット４個からなるものと考えら
れる。

ベタインアルデヒド脱水素酵素の精製過程の結果ム はグリシン 水酸化ナトリウム緩衝液を示す。

を第５表に示す。

第 表 第２図は同じく温度活性曲線を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）キサントモナス属に属するベタインアルデヒド脱
   水素酵素生産菌を培養し、培養物からベタインアルデヒ
   ド脱水素酵素を採取することを特徴とするベタインアル
   デヒド脱水素酵素の製造方法。