JPS6317434B2

JPS6317434B2 -

Info

Publication number: JPS6317434B2
Application number: JP10770879A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Ooshima; Kimitsuna Watanabe; Izumi Kumagai
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1979-08-24
Filing date: 1979-08-24
Publication date: 1988-04-13
Also published as: JPS5632990A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は転移アール・エヌ・エー（グアノシン
−2′）メチル基転移酵素に存する。メチル基転移
酵素は、トランスメチラーゼまたはメチルトラン
スフエラーゼともいい、Ｓ−アデノシルメチオニ
ン、ベタイン、ジメチルテチン等をメチル基供与
体とし、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基
をメチル化する酵素であり、各種の特異的な酵素
が知られているが、転移アール・エヌ・エー（以
下において、これをtRANという）のＤループ中
の5′…−Ｇ−Ｇ−…3′（Ｇはグアノシンを示す。
以下においても同意義を有する）のグアノシンを
特異的にメチル化する酵素は単離されていない。本発明者等は高度好熱性細菌サーマス・サーモ
フイラス（Thermus thermophilus）から各種
の耐熱性酵素を分離精製し研究をおこなつたとこ
ろ、上述のような特異性をもつメチル基転移酵素
の単離精製に成功し、本発明に到達した。すなわち、本発明の要旨は、次の物理化学的性質を有する転移アール・エヌ・
エー（グアノシン−2′）メチル基転移酵素 (イ) 作用転移アール・エヌ・エーのＤループ中の5′…
−Ｇ−Ｇ−…3′（式中、Ｇはグアノシンを示す）
で示されるヌクレチオド配列の5′側のグアノシ
ンを、メチル基供与体の存在下に、2′−Ｏ−メ
チルグアノシンにメチル化する (ロ) 基質特異性Ｄループ中に5′…−Ｇ−Ｇ−…3′（式中、Ｇ
はグアノシンを示す）で示されるヌクレチオド
配列をもつ転移アール・エヌ・エーに作用する (ハ) 至適PH 6.6〜7.4 (ニ) 安定PH範囲 5.5〜9.3（37℃、４時間） (ホ) 分子量 21000（ゲル過法による）に存する。以下に本発明をさらに詳細に説明する。本発明の酵素転移アール・エヌ・エー（グアノ
シン−2′）メチル基転移酵素の物理化学的性質は
次の様である。 (イ) 作用 tRNAのＤループ中の5′…−Ｇ−Ｇ−…3′で
示されるヌクレチオド配列中の5′側のグアノシ
ンを、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンのよう
なメチル基供与体の存在下に、2′−Ｏ−メチル
グアノシンにメチル化する。ここでＤループと
は5′末端に一番近く常にジヒドロウリジンを含
むループを意味する。tRNAのクローバ葉型２
次構造またはＬ字型３次元立体構造を認識して
作用するものと考えられる。活性化剤としては
Mg⁺⁺イオンが用いられる。 (ロ) 基質特異性Ｄループ中に5′…−Ｇ−Ｇ−…3′で示される
ヌクレチオド配列をもつtRNAに作用する。具
体的には、酵素tRNA^Phe、大腸菌tRNA^Met _f、仝
tRNA^Met _n、仝tRNA^Phe、仝tRNA^Ile（こゝで、
Pheはフエニルアラニン、Metはメチオニン、
ｆはホルミル化、ｍは非ホルミル化、Ileはイ
ソロイシンを示す）等に対して作用しＤループ
中に既にメチル化されたグアノシン、すなわち
5′…Gm−Ｇ−…3′（Gmは2′−Ｏ−メチルグア
ノシンを示す）で表わされるヌクレチオド配列
をもつtRNA、例えば大腸菌（tRNA^Tyr（Tyr
はチロシンを示す）高度好熱性細菌の各種
tRNAは殆んどメチル化されない。 (ハ) 至適PH 6.6〜7.4 (ニ) 安定PH範囲 5.5〜9.0（37℃、４時間） (ホ) 分子量 21000 セフアクリル（Sephacryl）Ｓ−200
（Sephacrylはフアルマシア・フアイン・ケミ
カルズ社製ゲル過剤、商標）を用いたゲル
過法による。 (ハ) 至適温度70〜72℃での活性は50℃での活性の
約５〜７倍である。次に本発明の酵素の製造法について説明する。本発明の酵素は、サーマス属に属する細菌の菌
体を破砕し、その破砕液から採取される。酵素源
として使用されるサーマス（Thermus）属に属
する細菌としては、サーマス・サーモフイラス
（Thermus thermophilus）が挙げられる。菌株
としてはサーマス・サーモフイラスHB27が挙げ
られる。この菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている菌株（受託番号微工研菌
寄第5160号）で、次の菌学的性質を有する。形態：長さ3μｍ×巾0.5μｍ、桿状、胞子形成せ
ず、グラム陰性、培養状態ほとんど単細胞コロニー：凸、円形、オレンジイエロー、径２〜
８ミリイーストエキス、ペブトンを含む液体培地での生
育状態：表面に薄膜が生成し、濁る。生育温度：83℃以下塩化ナトリウム濃度：１％まで生育 DNA：Ｇ＋Ｃ＝67.6〜69.6％栄養要求性：ビチオン生化学的性質 NO₃還元：マイナスインドールの生産：プラス糖類からの酸およびガスの生成：グルコース：プラス（多量）ガラクトース：プラス（多量）ラクトース：プラス（僅か）シヨ糖：プラスマルトース：プラス（多量）デンプン：プラス酵素の分離精製法をサーマスサーモフイラス
HB27の場合について具体的に説明すると、ま
ず、菌株を0.5％ペプトン、0.4％酵母エキス、0.2
％塩化ナトリウム、0.1％グリコースおよび0.05
％の無機塩ビタミン溶液からなる培地を使用して
80℃で５〜６時間通気培養し、300クレツト前後
で集菌し、得られた菌体を常法により、例えばア
ルミナ摩砕により破砕する。破砕液に緩衝液を加
えて抽出処理し、抽出液にウシすい臓デオキシリ
ボヌクレアーゼを加えて反応させ、上清をとり、
ジエチルアミノエチルセルロース（以下におい
て、DEAEセルロースと略す）、ホスセルロース
（以下においてＰ−セルロースと略す）、次いでカ
ルボキシメチル化したセフアテツクス（セフアテ
ツクスはフアルマシア社の商標、以下において、
CM−セフアデツクス）のカラムに順次通し、カ
ラムクロマトグラフイーにより分離精製する。以上詳細に説明したように、本発明の酵素は、
tRNAのＤループ中の5′…−Ｇ−Ｇ−…3′のグア
ノシンを特異的にメチル化する酵素で、このよう
な酵素が安定に分離された例はない。そしてこの
酵素は特異的な酵素試薬として、遺伝子工学、生
化学研究において、有用なものである。以下において実施例によりさらに詳細に説明す
る。なお、実施例中A₂₆₀は、260nmでの吸光度で
ある。実施例１ (1) サーマスサーモフイラスHB27の培養サーマスサーモフイラスHB27を0.5％ペプト
ン、0.4％酵母エキス、0.2％塩化ナトリウム、
0.1％グルコース及び0.05％の無機塩ビタミン
溶液（水１中に25ｇMgCl₂・6H₂O、５ｇ
CaCl₂、２ｇMnSO₄・6H₂O、0.5ｇZnSO₄・
7H₂O、0.5ｇH₃BO₃、５ｇFeCl₃・6H₂O、15
mgCuSO₄、25ｇNaMoO₄・2H₂O、50mg
CoNO₃・6H₂O、20mgNiNO₃・6H₂O、80mgピ
リドキサン、10mg葉酸、0.5mlH₂SO₄、10mgチ
アミンピロリン酸、40mgリボフラビン、80mgニ
コチンアミド、80mgパラアミノ安息香酸、10mg
ビチオン、0.4mgシアノコバラミン、80mgパン
トテイン酸、20mgリポ酸、200mgイノシトール、
50mgコリン、50mgオロチン酸、100mgスペルミ
ンを含む）を含む培地を用いて、80℃で５〜６
時間通気培養し、300クレツト前後で集菌した。
80から約400ｇのHB27の菌体を得ることが
できた。 (2) 酵素の分離、精製すべての操作は４℃でおこなつた。 (A) 酵素の抽出以上のように得られたHB27の菌体約１Kg
に等量のアルミナを加えて約１時間磨砕し
た。これに、２の標準緩衝液（0.01M、
Tris−HCl（PH7.5）−0.01M MgCl₂−0.05M
KCl−6mMβ−メルカプトエタノール、以下
においても同じ組成を示す）を加えて酵素を
抽出した。抽出液は10000ｇ20分の遠心でア
ルミナ、細胞残渣の沈殿と上清とに分け、沈
殿は再び１の標準緩衝液で抽出後、遠心分
離し上清を取得した。２回の遠心による上清
を合せて、ウシすい臓デオキシリボヌクレア
ーゼを１μｇ/ml加えて15分放置した。この
溶液を105000ｇ３時間超遠心を行ない、得ら
れた上清を粗酵素抽出液（2.5）とした。 (B) DEAE−セルロースカラムクロマトグラフ
イー (A)で得られた粗酵素液に硫安を80％飽和に
まで加え、一晩放置後、10000ｇ30分の遠心
で生成した沈殿を集めた。この沈殿をできる
限り少量の標準緩衝液に溶解して、同じ緩衝
液に対して一晩透析を行なつた。この透析し
た酵素溶液（1.3）を、同じ標準緩衝液で
平衡化したDEAE−セルロースのカラム
（5.2×54.5cm）に添加し、標準緩衝液で展開
した。このカラムの未吸着分画にtRNA（グ
アノシン−2′）メチル基転移酵素は含まれ
る。なお、酵素活性の測定は、以下のようにし
ておこなつた。基質として大腸菌未分画tRNA、メチル基
供与体としてはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオ
ニンを用いる。酵素反応は、80μの0.01M
Tris−HCl（PH7.5）、0.01M MgCl₂、5mMア
デノシントリリン酸、6mMβ−メルカプトエ
タノール、0.4OD₂₆₀単位の大腸菌未分画
tRNA、8.1μM Ｓ−アデノシル−Ｌ−〔メチ
ル−¹⁴C〕−メチオニン（62Ci/mole）を含む
溶液に、20μの酵素溶液を添加して行な
う。65℃で30分加温後、80μの反応溶液を
分取し、これを、2.5cmの円型ロ紙につけ、
しみこんだ所で、氷冷した５％トリクロロ酢
酸につけて、３回洗浄し、その後、エタノー
ル−エーテル（１：１v/v）、エーテルで順
次洗う。乾燥後紙上に残つた放射活性を液
体シチレーシヨンカウンターで測定する。この条件下で、１時間に1nmoleのメチル
基を転移し得る酵素量を１単位と定義した。 (C) Ｐ−セルロースカラムクロマトグラフイー (B)のDEAE−セルロースカラムクロマトグ
ラフイーにおける未吸着画分を直接、やはり
標準緩衝液で平衡化したＰ−セルロースのカ
ラム（3.5×39.5cm）に添加するとメチル基
転移酵素は、このカラムに吸着された。標準
緩衝液で洗浄後、KCl濃度、0.05Mから0.8M
の直線濃度勾配（２）で溶出を行なつた。
メチル基転移酵素活性は、KCl濃度0.44M〜
0.54Mの分画（分画という）に小さいピー
クが、KCl濃度0.64M〜0.79Mの分画（分画
という）に大きいピークが表われ、２つの
分画に分離するが、分画がtRNA（グアノ
シン−2′）メチル基転移酵素活性に対応して
いる。ここでの酵素液（分画）は275mlで、
酵素量は2358単位であつた。 (D) CM−セフアデツクスＣ−50（セフアデツ
クスは商標）カラムクロマトグラフイー (C)で得られたtRNA（グアノシン−2′）メ
チル基転移酵素分画275mlをDiaflo PM−10
（Diafloは商標、アミコン社製）の膜で限外
過を行ない75mlにまで濃縮した。この溶液
を0.01M Tris−HCl（PH7.5）−0.01M MgCl₂
−0.1M KCl−6mM βメルカプトエタノー
ルの緩衝液に対して透析した。生成した沈殿
を低速遠心で除き、その上清を同じ緩衝液で
平衡化したCM−Sephdex Ｃ−50のカラム
（1.57×23.5cm）に添加し、KCl濃度0.1Mか
ら0.5Mの直線濃度勾配（400ml）で溶出を行
なうとメチル基転移酵素はA₂₆₀のピークとほ
ぼ一致して対称性の良いピークで溶出され
た。ピーク位置は、KCl濃度で0.26〜0.31M
であつた。得られたメチル基転移酵素液は59mlでは、
酵素量は1610単位であつた。 (3) 酵素の性質の測定 (2)の(D)で得られた酵素液を用いて測定した。 (A) 至適PH、安定PH範囲、至適温度至適PHは6.6〜7.4で、37℃４時間処理した
ときの安定PH範囲は5.5〜9.0であり、70℃〜
72℃での活性は50℃での活性の約５〜７倍で
あつた。 (B) 基質特異性、作用 (a) ヌクレチオドについての特異性大腸菌未分画tRNAは良い基質となる
が、このtRNAをメチル化後リボヌクレア
ーゼT₂で完全分解して２次元の薄層クロ
マトグラフイーでメチル化ヌクレチオドを
分析するとGm Gp（ここではGmは2′−Ｏ
−メチルグアノシン、Gpはグアノシンを
示す）の位置にのみ放射活性が見いださ
れ、この酵素は5′…−Ｇ−Ｇ−…3′という
ヌクレチオド配列の5′側のグアノシンを
2′−Ｏ−メチルグアノシンにメチル化する
ことが示された。 (b) 大腸菌tRNA^Met _fにおけるメチル化部位大腸菌tRNA^Met _fは、ヌクレチオド配列が
決定されており、2′−Ｏ−メチルグアノシ
ンは含まれていない。メチル化tRNA^Met _fの
リボヌクレアーゼT₂分解物を分析すると
(a)と同様にGm Gpが生成していた。次に
リボヌクレアーゼT₁で完全分解後、7M尿
素の存在下DEAE−セフアデツクスＡ−25
でオリゴヌクレチオドを分画すると未修飾
大腸菌tRNA^Met _fのリボヌクレアーゼT₁分
解物には見られないペンタヌクレチオドが
検出され、放射活性のピークと一致した。
この放射活性を持つペンタヌクレチオド
を、ヘビ毒、ホスホジエステラーゼ及び大
腸菌ホスホモノエステラーゼでヌクレチオ
ドにまで分解後高速液体クロマトグラフイ
ーで分析した。Ｃ、Ｕ、Gm、Ｇが2.1：
0.78：0.75：1.0（リボヌクレアーゼT₁分解
物なのでＧを1.0モルとして計算）のモル
比で検出され放射活性はGmの所にのみ存
在した。このことからメチル化部位は
（Ｃ、Ｃ、Ｕ）Gm Gpなるペンタヌクレチ
オドであることが判明した。大腸菌
tRNA^Met _fの構造から考えて、この様なヌク
レチオド組成を持つ可能性のあるのは、
CCU Gm Gpだけであるので、この酵素
によるメチル化部位は5′−末端から19番目
にある、Ｄループ中のG₁₉のリボースであ
ることが結論された。これは、高度好熱菌
のtRNA^Met _fで見られたメチル化部位と同じ
である。 (C) 各種アミノ酸特異tRNAに対する活性 (2)の(B)に記載した酵素活性の測定の条件下
で、第１表に示した。酵母、大腸菌、高度好
熱菌のtRNAの0.10〜0.14A₂₆₀単位を、(2)の
(D)で得られた酵素0.21単位でメチル化をおこ
なつた。その結果を第１表に示す。 (C)セフアクリル（Sephacryl）Ｓ−200を
用いたゲル過法により測定した分子量は
21000であつた。

【表】

【表】第１表から明らかなように酵母tRNA^Phe、大腸
菌tRNA^Met _f、tRNA^Met _n、tRNA^Phe、tRNA^Ileは良
い基質となる。一方、Ｄループ中に既に…Gm
Gp…と言う修飾部位を持つ大腸菌tRNA_Tyr、高
度好熱菌の各種tRNAは、ほとんどメチル化され
ない。以上本酵素はtRNAのＤループ中の5′…−Ｇ−
Ｇ−…3′という配列に特異的なメチル基転移酵素
であるということが判る。つまりtRNAのクロー
バ型２次構造はＬ字型３次元立体構造を認識して
いると思われる。これは生体内でのこの酵素の役
割はtRNAをメチル化することにあると考えられ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１次の物理化学的性質を有する転移アール・エ
ヌ・エー（グアノシン−2′）メチル基転移酵素。 (イ) 作用転移アール・エヌ・エーのＤループ中の5′…
−Ｇ−Ｇ−…3′（式中、Ｇはグアノシンを示す）
で示されるヌクレオチド配列の5′側のグアノシ
ンを、メチル基供与体の存在下に、2′−０−メ
チルグアノシンにメチル化する (ロ) 基質特異性Ｄループ中に5′…−Ｇ−Ｇ−…3′（式中、Ｇ
はグアノシンを示す）で示されるヌクレチオド
配列をもつ転移アール・エヌ・エーに作用する (ハ) 至適PH 6.6〜7.4 (ニ) 安定PH範囲 5.5〜9.0（37℃、４時間） (ホ) 分子量 21000（ゲル過法による）