JPS6317843B2

JPS6317843B2 -

Info

Publication number: JPS6317843B2
Application number: JP6996079A
Authority: JP
Inventors: Kinzo Nagasawa; Akira Ogamo
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1979-06-06
Filing date: 1979-06-06
Publication date: 1988-04-15
Also published as: JPS55161801A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は蛍光標識された酸性ムコ多糖体および
それらの製造法に係り、詳しくはフルオレセイン
アミド化酸性ムコ多糖体およびそれらの塩、並び
にそれらの製造法に関する。本発明に係る酸性ムコ多糖体（以下、
「AMPS」と略記する）は、ヒヤルロン酸、コン
ドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫
酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫
酸並びにそれらの塩を包含するものであり、それ
らの化学構造および化学構造上の特色を表１に示
す。

【表】〓ない
〓

【表】アセチルおよびＤ〓グルクロン酸
含量が多く、Ｎ〓硫酸，Ｏ〓硫酸，Ｎ〓
イヅロン酸含量が少ない。
上記AMPSは、生体内において種々の結合組
識基質を構成するものとして存在し、又それぞれ
多くの生理機能に関与している。動物の組識、体
液中におけるAMPSの分布パターンは成熟又は
加令に伴つて変化することが知られている。この
AMPSの正常な代謝が乱れると、様々な症候に
より特徴ずけられるムコ多糖症
（mucopolysaccharidosis）と呼ばれる重篤な臨
床的異状を呈する。ヘパリンは、ほ乳動物のひ臓、肺臓、肝臓、腸
粘膜等に存在し、抗凝血作用（anticoagulant
activity）を有する重要な因子として知られてい
る。その強い血液凝固阻止活性の故に、動物臓器
から抽出製造されたヘパリンは臨床医学に広く用
いられている。また、デルマタン硫酸、ヘパラン
硫酸も弱いが抗凝血作用を有することが知られて
いる。ヘパリン以外のAMPSは、多くの動物組識、
例えば皮膚、骨、軟骨、靭帯のような結合組識、
分泌液中に見出される。これらは、コラーゲンや
エラスチン繊維とともに細胞間質又は基質を形成
し、そこに結合組識細胞が埋めこまれて結合組識
が構築されている。ヒアルロン酸は、臍帯、皮膚のほか関節滑液、
眼球硝子液等に見出され、組識の細胞感染を防ぐ
機能などを有している。また悪性腫瘍中に多いこ
とも知られている。コンドロイチン−４および６−硫酸はその強い
保水性から細胞の新陳代謝を円滑ならしめ組識維
持に有用な役割を果している。これらは、軟骨の
主成分であり、例えば壊血病に伴う軟骨の弱化は
コンドロイチン−４または６−硫酸合成機能の低
下に基くものである。また、これらは疼痛性疾
患、腎疾患などの治療に用いられている。また、ムコ多糖症として、Hurler症候群、
Hunter症候群、Marfan症候群などが知られてお
り、何れもデルマタン硫酸、ヘパラン硫酸などの
AMPSの異常排泄を伴うため、AMPSの代謝異
常に起因する疾病とされている。また、Hurler
症候群の場合、患者の肝臓にヘパラン硫酸、ひ臓
にデルマタン硫酸が蓄積するなどのごとく、
AMPSの異常分布が起ることがある。ムコ多糖
症は、多くの場合全身的な症状を呈し、皮膚病、
リウマチ様関節炎、動脈硬化、慢性肝臓疾患、眼
病が含まれる。上述のように、AMPSは、ヘパリンのごとく
生理活性物質として、また種々の生理機能に関与
する生体組織の構築因子として、それぞれに重要
な生体成分であり、これらAMPSの正常な代謝
と体内分布は生命活動の維持に極めて重要であ
る。従つてヒトにおけるこれらAMPSの代謝お
よび体内分布と疾病との関連など基礎医学的研究
およびムコ多糖症にたいする診断、治療など臨床
医学的対応の両面において、AMPSの代謝、排
泄、体内分布の測定およびAMPSの生合成、分
解に関与する酵素群の分布・活性の測定などが不
可欠となる。本発明の目的は、AMPSに関する上記のごと
き生物科学的研究や医学的応用に際して有用な蛍
光標識された酸性ムコ多糖体を提供することにあ
る。すなわち、本発明の蛍光標識された酸性ムコ
多糖体によれば、例えばその微量を生体内に投与
した場合、蛍光測定により感度よく検知すること
ができるため、生体内におけるAMPSの吸収、
移動、蓄積、排泄等の挙動を追跡することが容易
となる。また、AMPS分解酵素の所在やその分
布を測定することも容易になる。更に、抗凝血剤
としてヘパリンのごとく既に医薬としての用途が
開発されているものの生体内挙動を明らかにし、
その病理学的研究に役立て得ることは勿論、凝固
線溶系医薬としての可能性が期待される他の
AMPSについても医薬としての作用機序の解明
に有力な手段となるものである。更にまた、ムコ
多糖症等の疾病に対する医学的応用面では、
AMPSの異状な蓄積、排泄など代謝機構の解明
に寄与し得るものと期待され、その診断、治療に
貢献し得るであろう。以上の本発明の有用な効果
を、以下の記述により一層明らかにする。本発明の蛍光標識された酸性ムコ多糖体は、ヒ
ヤルロン酸フルオレセインアミド、コンドロイチ
ン−４−硫酸フルオレセインアミド、コンドロイ
チン−６−硫酸フルオレセインアミド、ヘパリン
フルオレセインアミド、ヘパラン硫酸フルオレセ
インアミドおよびデルマタン硫酸フルオレセイン
アミド並びにそれらの塩から成る群から選ばれる
フルオレセインアミド化酸性ムコ多糖体である。すなわち、本発明の蛍光標識された酸性ムコ多
糖体は、該ムコ多糖の構成ウロン酸残基が、次
式、［式中、R₁およびR₂の一方が水素原子を表し；
他方が次式、（式中、残基−HNCO−のフルオレセイン残基
との結合位置は５位又は６位である）で示されるフルオレセインアミド基を表す］で示される単位が該ウロン酸当たり0.1〜10モル
％と、残りが、次式、（式中、R₃およびR₄の一方が水素原子を表し；
他方がカルボキシル基を表す）で示される単位からなることを特徴とする。なお、以下の説明において、必要に応じてフル
オレセインアミンをFAと略記し、フルオレセイ
ンアミド化酸性ムコ多糖体をFA−AMPS、フル
オレセインアミド化コンドロイチン−４−硫酸を
FA−コンドロイチン−４−硫酸などのごとくフ
ルオレセインアミド化物を「FA−」を冠して表
す。そして、フルオレセインアミノ基置換度を、
FA置換度と略記する。本発明のFA−AMPSの製造法は、ヒヤルロン
酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン
−６−硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびデル
マタン硫酸並びにそれらの塩から成る群から選ば
れるAMPSとフルオレセインアミン（FA）と
を、酸性ないし中性の水性媒体中において、脱水
縮合剤の存在下に反応させる工程を具備すること
を特徴とする。ここで、酸性ないし中性の条件と
しては、PH３〜７が好ましく、更にはPH4.5〜５
が好ましい。本発明において用いられるそれぞれのAMPS
の分子量は如何なる範囲のものであつても良い
（表１参照）。本発明のFA−AMPSは下記式
（）によつて模式的に示されるように、これら
のAMPSに共通な構成糖であるウロン酸（Ｄ−
グルクロン酸またはＬ−イヅロン酸）のカルボキ
シル基と蛍光標識試薬であるフルオレセインアミ
ン（）とがアミド結合したものである。 AMPSとFAとを脱水縮合剤により結合せしめ
る場合、AMPSのウロン酸カルボキシル基は主
にFAのアミノ基と反応してアミド結合を形成す
るが、一部はFAのフエノール性水酸基と反応し
てエステル（）を形成する。このエステル結合
は化学的にも生化学的にもアミド結合より不安定
であり、アルカリ加水分解（例えば0.1NNaOH、
30℃、24時間の処理）により選択的に切断され
る。したがつて、本発明製造法の実施に当り、反
応生成物にこのアルカリ加水分解を施せば、上記
のように化学的にも生化学的にもより安定なフル
オレセインアミド化体のみよりなる蛍光標識
AMPSが製造されるのである。反応系に添加するFAの量は目的とするFA−
AMPS（FA置換度、AMPSの種類、分子量など）
によつて異なるが、一般に置換させようとする量
の数倍ないし数十倍であり、添加は一度に行つて
もよく、分割して行なつてもよい。こゝでフルオ
レセインアミンとは、５−アミノフルオレセイン
または６−アミノフルオレセインもしくはこれら
の混合物を云う。反応系に添加する脱水縮合剤としては、いわゆ
る水溶性カルボジイミド化合物たとえば１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド（一般に「EDC」と略記される）や１
−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４
−エチル）カルボジイミド・メト−ｐ−トルエン
スルホン酸塩や１−ベンジル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドなどが最も好
ましいが、一般のカルボジイミド化合物、たとえ
ばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジ−ｐ−ト
リルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイ
ミドなどでもよい。その他、トリクロロアセトニ
トリル、シアナミド類、炭酸無水物誘導体などの
脱水縮合剤も用いることが出来る。脱水縮合剤の
添加は一度に行なつてもよく、分割して行なつて
も良い。反応系に添加する脱水縮合剤の量は目的
とするFA−AMPSによつて異なり、また添加さ
れるFAの量に依存する。一般に、用いられるFA
の量と等モル量ないし10倍モル量である。水性媒体としては、反応に悪影響を及ぼさず、
出発物質（AMPSおよびFA）を溶解させ得るも
のであれば如何なるものであつてもよいが、好ま
しいものはPH３〜７の無機酸および有機塩基から
なる混合水性溶液であり、とくに好ましいものは
PH4.5〜5.0のHCl・ピリジン混液である。これら
の緩衝性溶液は、例えばジメチルスルホオキシ
ド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルなど
水と混合し、かつ前述の脱水縮合剤の存在下でも
AMPSおよびFAと反応しない極性有機性溶剤を
加えて反応を有利に行なわせることもできる。反応時間は通常30分間〜２時間が適当である
が、FA置換度の大なるFA−AMPSを調製する
場合などは、上記反応時間で反覆反応させること
もある。反応は通常、室温附近（15〜35℃）で行
なわれるが、必要に応じてより低温または高温で
行なわれることがある。その範囲は０〜80℃であ
る。上記のようにして、FA−AMPSが生成した
ら、その精製は例えば次のごとくして行なう。反
応混合物を透析し、透析内液に過剰量（たとえば
３倍容量）のエタノールまたはアセトンなどを加
えてFA−AMPSをすべて沈でんさせる。こゝに
得られた沈でんを0.1N−NaOH溶液に溶解して
30℃に24時間保つたのち塩酸などで中和し、これ
に過剰量（たとえば３倍容量）のエタノールまた
はアセトンなどを加える。生じた沈でんを分離
し、ふたたび水に溶解したのち透析し、透析内液
をエタノールまたはアセトンなどで沈でんさせる
か、または凍結乾燥することによりFA−AMPS
が精製される。次に、本発明のFA−AMPSの性状を以下に示
す。 (1) 蛍光性：フルオレセインアミン自体の発蛍光
性は極めて微弱であるが（フルオレセインの約
１／１５０）、AMPSをフルオレセインアミド化す
ることによりその蛍光は著しく増大する。FA
−AMPSの蛍光強度はPHに依存し、PH８附近
よりアルカリ性側で強くなる。このときの励起
最大波長は490nｍ、蛍光最大波長は510〜
512.5nｍである（測定例１参照……FA−ヘパ
リン）。 (2) 電気泳動：それぞれのFA−AMPSはPH2.0お
よび5.2の緩衝液を用いて泳動した場合、それ
ぞれのAMPSに特徴的なアルシアンブル−染
色バンドと一致する単一の蛍光性バンドを示し
た。その泳動度は、それぞれもとのAMPSと
ほとんど変らない。 (3) 分子量：適当なゲルろ過剤たとえばセフアロ
ース（Sepharose）2Bまたは6Bおよびセフア
デツクス（Sephadex）Ｇ−100などによるゲル
ろ過法で得られたFA−AMPSの溶出曲線は、
ヒヤルロン酸の場合を除いてそれぞれの出発物
質の溶出曲線とほとんど一致する（測定例２参
照……FA−ヘパリン）。ヒヤルロン酸の場合には、FA−ヒヤルロン
酸の製造行程で軽度の低分子化が起きたと推測
される溶出曲線の変化が見られた（測定例３参
照……FA−ヒヤルロン酸）。ヒヤルロン酸はさ
まざまな因子（溶存酸素、光線、遷移金属イオ
ン、ビタミンＣなど）の組合せにより、ラジカ
ル反応によると思われる解重合が起こり易い
AMPSとして知られている。アルカリ処理単
独ではヒヤルロン酸の低分子化は起きないの
で、本製造方法のアルカリ処理を含む反応行程
の組合せがヒヤルロン酸の低分子化の原因にな
つていると想像される。このように、FA−AMPSはフルオレセイン基
のAMPS分子内導入にもかゝわらず、物性の点
でそれぞれもとのAMPSとほとんど変らない事
が判明した。従つて本発明の方法により製造され
るFA−AMPSが生体内においてまたは生化学的
な条件のもとで、天然のAMPSと同様に行動す
ることが期待される。事実、表２に示したように
本製造方法により得られたFA−ヘパリンは原料
ヘパリンの抗凝血活性をほぼ完全に保持してお
り、またFA−ヒヤルロン酸およびFA−コンドロ
イチン硫酸はそれぞれ対応するもとのAMPSと
同じように酵素ヒヤルロニダーゼの基質となるこ
とが確認された（測定例４「ヒヤルロニダーゼに
よるFA−ヒヤルロン酸の分解」参照）。原料であるAMPSおよび本明細書実施例１〜
５で製造されたFA−AMPSの化学分析値および
生物活性を表２に示す。これらFA−AMPSの
FA置換度は必ずしも大きくない。FA−AMPS
がそれぞれの生物学的活性を保持するためには、
その蛍光が通常の測定手段によつて検知できる程
度であればむしろ適度のFA−置換度にとゞめる
ことが望ましい。表２に見るように、各FA−
AMPS1分子当りのFA置換基数は分子量の小さ
いヘパリンやヘパラン硫酸では１以下であり、明
らかにFA置換された分子種と置換されていない
分子種との混合物であることを示している。また
コンドロイチン−４および６−硫酸、デルマタン
硫酸のように、１分子当りのFA置換基数が１以
上であつても、すべてのAMPS分子が一様にFA
置換されている可能性は少ない。すでに述べたよ
うな生物科学領域でもFA−AMPSの利用にさい
して、FA−AMPSが標識分子種と非標識分子種
との混合物であることは何等支障とならない場合
が多いと思われるが、FA置換されたAMPS分子
種のみからなる製品を必要とする場合には、例え
ば実施例７に記載したように、疎水結合によるア
フイニテイー・クロマトグラフイーを適用するこ
とによりFA置換された分子種とそうでない分子
種とに分離することが出来る。以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説
明する。実施例１ヒヤルロン酸200mgをＮ−HCl・ピリジン
（３：１）混液（6N−HClでPH4.75に調整する）
100mlに溶解した。フルオレセインアミン300mgを
Ｎ−HCl・ピリジン（１：１）混液10mlに溶解し
た。両液を混合し、ふたたびPHを4.75に調整した
のち、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）
0.25mlを室温で撹拌しながら滴下した。反応液の
PHを6N−HClで常に4.75に保ち、１時間撹拌し
た。反応液を透析膜（Visking tube30/20）に移
し入れ、精製水にたいして24時間透析したのち、
透析内液にたいして３倍容量のエタノールを加え
た。生成した沈でんを遠心分離で集め、エタノー
ルで２回洗滌して黄色粉末（164mg）を得た。こ
れを0.1N−NaOH40mlに溶解し、30℃に24時間
保つたのち、希塩酸で中和し、３倍容量のエタノ
ールを加えて生じた沈でんを遠心分離した。この
沈でんをエタノールで３回洗滌してから精製水
200mlに溶解し精製水にたいして透析した。透析
内液のPHを0.1N−NaOHで6.5としたのち凍結乾
燥してヒヤルロン酸フルオレセインアミド（ナト
リウム塩）140mgを得た。実施例２コンドロイチン４−硫酸（ナトリウム塩）500
mgをＮ−HCl・ピリジン（３：１）混液（PH
4.75）100mlに溶解した。フルオレセインアミン
570mgをＮ−HCl・ピリジン（１：１）混液30ml
に溶解した。両液を混合しPHを4.75に調整したの
ち、水溶性カルボンジイミド（EDC）0.484mlを
室温で撹拌しながら滴下した。反応液のPHを4.75
に保ち、１時間撹拌したのち反応液を透析膜に移
し入れ、以下、実施例１と同様に透析、エタノー
ル沈でんを行ない、黄色粉末（398mg）を得た。
これを0.1N−NaOH100mlに溶解し、30℃に24時
間保つた後、希塩酸で中和し実施例１と同様にエ
タノール沈でん、透析を行ない、凍結乾燥により
コンドロイチン−４−硫酸フルオレセインアミド
（ナトリウム塩）362mgを得た。実施例３コンドロイチン−４−硫酸の場合（実施例２）
と同様の反応・操作により、コンドロイチン−６
−硫酸（ナトリウム塩）500mgからコンドロイチ
ン−６−硫酸フルオレセインアミド（ナトリウム
塩）354mgを得た。実施例４ヘパリン（ナトリウム塩）500mgをＮ−HCl・
ピリジン（３：１）混液（PH4.75）100mlに溶解
した。フルオレセインアミン1.15ｇをＮ−HCl・
ピリジン（１：１）混液50mlに溶解した。両液を
混合しPHを4.75に調整したのち、水溶性カルボジ
イミド（EDC）1.33mlを室温で撹拌しながら滴下
した。反応液のPHを4.75に保ち１時間撹拌した。
反応液を透析膜に移し入れ、以下、実施例１と同
様に透析、エタノール沈でんを行ない黄色粉末
（413mg）を得た。これを0.1N−NaOH100mlに溶
解し、30℃に24時間保つたのち希塩酸で中和し、
実施例１と同様にエタノール沈でん、透析を行な
い凍結乾燥によりヘパリン・フルオレセインアミ
ド（ナトリウム塩）352mgを得た。実施例５ヘパリンの場合（実施例４）と同様の反応、操
作により、ヘパラン硫酸（ナトリウム塩）500mg
からヘパラン硫酸フルオレセインアミド（ナトリ
ウム塩）370mgを得た。実施例６デルマタン硫酸（ナトリウム塩）500mgをＮ−
HCl・ピリジン（３：１）混液（PH4.75）100ml
に溶解した。フルオレセインアミン570mgをＮ−
HCl・ピリジン（１：１）混液30mlに溶解した。
両液を混合しPHを4.75に調整したのち、水溶性カ
ルボジイミド（EDC）0.484mlを室温で撹拌しな
がら滴下した。反応液のPHを4.75に保ち１時間撹
拌したのち、反応液を透析膜に移し入れ、以下、
実施例１と同様に透析、エタノール沈でんを行な
い。黄色粉末（402mg）を得た。これを0.1N−
NaOH100mlに溶解し、30℃に24時間保つたのち
希塩酸で中和し、実施例１と同様にエタノール沈
でん、透析を行ない、凍結乾燥によりデルマタン
硫酸フルオレセインアミド（ナトリウム塩）370
mgを得た。実施例７実施例４で製造されたヘパリン・フルオレセイ
ンアミド（ナトリウム塩）100mgを3M−硫酸アン
モニウム・0.05M−りん酸緩衝液（PH6.6）10ml
に溶解し、これを同じ緩衝液で平衡化させた疎水
性アフイニテイー・クロマト剤カラム（オクチル
セフアロースCL−4B、1.5×25.5cm）に流し込
み、つゞいて同じ緩衝液180mlで溶出した。つぎ
に1M−硫酸アンモニウム・0.05M−りん酸緩衝
液（PH6.8）200mlで溶出し、最後に0.05M−りん
酸緩衝液（PH7.0）140mlで溶出した。図１に各溶
出液画分についてウロン酸含量（実線）および相
対蛍光強度（波長512nｍ）（点線）を測定した作
製した溶出曲線を示した。溶出液量215〜255mlの
画分を集め、0.1NNaOH溶液でPH９とし、精製
水にたいして72時間透析したのち、凍結乾燥して
フルオレセインアミド化された分子種のみより成
るヘパリン・フルオレセインアミド（ナトリウム
塩）29mgを得た。

【表】測定例１ FAヘパリンの励起および蛍光スペクトル実施例４で製造したFA−ヘパリンについて測
定したところ、図２に示す結果を得た。実線は蛍
光スペクトルを、破線は励起スペクトルを示す。
蛍光最大波長は512nｍ、励起最大波長は490nｍ
であつた。測定には蛍光分光光度計を用い、蛍光強度は
10^-6M硫酸キニーネ（0.1M硫酸溶液）の蛍光強
度を10とした相対値で表わす。試料は0.05Mホウ
酸緩衝液（PH10.0）に溶解する。ゲルクロマトグ
ラフイーの場合は、同じホウ酸緩衝液を６倍希釈
して用いる。測定例２ FA−ヘパリンのゲルろ過クロマトグラム実施例４で製造したFA−ヘパリンと原料ヘパ
リンのゲルろ過クロマトグラフイーを行なつた。
使用カラムは、セフアデツクスＧ−100を充填し
たカラム（サイズ1.5×80cm）で、溶離液として
0.9％NaCl溶液を用いた。結合を図３に示す。図
中、実線はFA−ヘパリンのウロン酸含量による
溶出曲線を、点線は同じく相対蛍光強度による溶
出曲線である。また、破線は原料ヘパリンのウロ
ン酸含量による溶出曲線である。測定例３ FA−ヒヤルロン酸のゲルろ過クロマトグラム実施例１で製造したFA−ヒヤルロン酸と原料
ヒヤルロン酸のゲルろ過クロマトグラフイーを行
なつた。セフアロース2Bを充填したカラム（サ
イズ1.5×80cm）を用い、溶離液として0.9％NaCl
溶液により溶出させた。結果を図４に示す。図
中、実線はFA−ヒヤルロン酸のウロン酸含量に
よる溶出曲線で、点線は同じく相対蛍光強度によ
る溶出曲線である。また、破線は原料ヒヤルロン
酸のウロン酸含量による溶出曲線である。Voは
ボイド・ボリユームを示す。測定例４ヒヤルロニダーゼによるFA−ヒヤルロン酸の
分解実施例１で製造したFA−ヒヤルロン酸を、37
℃、17時間ヒヤルロニダーゼで処理した。ヒヤルロニダーゼ処理前のFA−ヒヤルロン酸
と前記によるヒヤルロニダーゼ処理後のFA−ヒ
ヤルロン酸のゲルろ過クロマトグラフイーを行な
つた。セフアロース6Bを充填したカラム（サイ
ズ1.5×80cm）を用い0.9％NaCl溶液により溶出さ
せた。得られた溶出曲線を図５に示す。（―●
―、‐‐‐●‐‐‐）はヒヤルロニダーゼ処理前の
FA−ヒヤルロン酸の、（―○―、‐‐‐○‐‐‐）は
処理後のFA−ヒヤルロン酸の溶出曲線を示す。
実線はウロン酸含量によるもの、点線は相対蛍光
強度によるものである。

【図面の簡単な説明】

図１は、FA−ヘパリンのオクチルセフアロー
スCL−4Bカラムによる溶出曲線を示し、実線は
ウロン酸含量による曲線であり、点線は相対蛍光
強度による曲線である（実施例７）。図２は、FA
−ヘパリンの蛍光スペクトル（実線）と励起スペ
クトル（破線）を示す図である（測定例１）。図
３は、FA−ヘパリンと原料ヘパリンのゲルろ過
クロマトグラフイーによる溶出曲線を示し、それ
ぞれウロン酸含量によるFA−ヘパリンの曲線
（実線）、相対蛍光強度によるFA−ヘパリンの曲
線（点線）、およびウロン酸含量による原料ヘパ
リンの曲線（破線）である（測定例２）。図４は、
FA−ヒヤルロン酸と原料ヒヤルロン酸のゲルろ
過クロマトグラフイーによる溶出曲線を示し、そ
れぞれウロン酸含量によるFA−ヒヤルロン酸
（実線）、相対蛍光強度によるFA−ヒヤルロン酸
（点線）、およびウロン酸含量による原料ヒヤルロ
ン酸の曲線（破線）である（測定例３）。第５図
は、セフアロース6Bカラムを用いたヒヤルロニ
ダーゼ処理前のFA−ヒヤルロン酸の溶出曲線
（―●―、‐‐‐●‐‐‐）と、ヒヤルロニダーゼ処
理後のヒヤルロン酸の溶出曲線（―○―、‐‐‐
○‐‐‐）を示す。実線はウロン酸含量による曲
線であり、点線は相対蛍光強度による曲線である
（測定例４）。

Claims

【特許請求の範囲】１ムコ多糖の構成ウロン酸残基が、次式、［式中、R₁およびR₂の一方が水素原子を表し；
他方が次式、（式中、残基−HNCO−のフルオレセイン残基
との結合位置は５位又は６位である）で示されるフルオレセインアミド基を表す］で示される単位が該ウロン酸当たり0.1〜10モル
％と、残りが、次式、（式中、R₃およびR₄の一方が水素原子を表し；
他方がカルボキシル基を表す）で示される単位からなることを特徴とするヒヤル
ロン酸フルオレセインアミド、コンドロイチン−
４−硫酸フルオレセインアミド、コンドロイチン
−６−硫酸フルオレセインアミド、ヘパリンフル
オレセインアミド、ヘパラン硫酸フルオレセイン
アミドおよびデルマタン硫酸フルオレセインアミ
ド並びにそれらの塩から成る群から選ばれる蛍光
標識された酸性ムコ多糖体。２ヒヤルロン酸、コンドロイチン−４−硫酸、
コンドロイチン−６−硫酸、ヘパリン、ヘパラン
硫酸およびデルマタン硫酸並びにそれらの塩から
成る群から選ばれる酸性ムコ多糖体とフルオレセ
インアミンとを、酸性ないし中性の水性媒体中に
おいて、脱水縮合剤の存在下に反応させることを
特徴とする蛍光標識された酸性ムコ多糖体の製造
法。