JPS6317899A - ハプトグロビンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はハプトグロビンの精製方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする問題点〕ハプトグ
ロビンは分子１８５．０００〜４００．０００のタンパ
ク質であって血中に遊離するヘモグロビンの代謝に重要
な役割を演する。血中に遊離した分子！ｉ６７．０００
のヘモグロビンは過剰になると腎糸球体を通して尿中に
排泄されるに至り、鉄分を消耗するばかりでなく腎細尿
管の障害を引き起こす。

ハプトグロビンはヘモグロビンと選択的に強固に結合し
、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成し、主と
して肝臓の細網内皮系に容易に取り込まれ、ここで代謝
されることによって、鉄ゐ回収と共に腎障害の防止に関
する重要な機能を有している。

ハプトグロビンは、たとえばヒト血漿のα−およびβ−
グロブリン画分より抽出精製されることが知られている
（日本国特許第９５８７７４号）。

ところで、当該画分には夾雑物（例えば、リポ蛋白など
）が含まれるために、当該画分の水溶液は混濁している
。そこで、この溶液を清澄化して、その後の操作を円滑
に進めることが必要となる。

この方法としては、ヒト血漿のα−およびβ−グロブリ
ン画分の水溶液にアクリノールを添加して夾雑物を沈澱
させ、上清を回収した後、アクリノールを除（ために通
掛または吸着処理を行う方法が開示されている（前述日
本国特許）。

しかし、この方法は操作が複雑であり、効果も充分でな
かった。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる実情下に、本発明者らは、ハブトグロビンの新た
な精製方法について検討した結果、粗製ハプトグロビン
を含む水溶液、特にヒト血崇のα〜およびβ−グロブリ
ン画分を含む水溶液をコロイド珪酸に接触させ、その非
吸着画分を回収することにより、ハプトグロビンを容易
に精製できることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、ハプトグロビンおよび夾雑物を含有す
る水溶液をコロイド珪酸と接触処理し、夾雑物を吸着除
去し、非吸着画分を回収することからなるハプトグロビ
ンの精製方法に関する。

（１）出発原料 本発明の処理対象となる出発原料はハプトグロビンおよ
び夾雑物を含有する水溶液であり、好適にはヒト血漿の
α−およびβ−グロブリン画分が例示される。

これは具体的には、コーンのエタノール分画法による第
■、■−１またはＩＶ−４画分、あるいは硫支分画法に
よる硫安飽和３５〜５０％濃度沈澱画分などが挙げられ
る。

（２）前処理 本発明は夾雑物を除去するためのコロイド珪酸との接触
処理に先立ち、好ましくは前処理を施す。

その前処理工程としては例えば、 ■当該画分をｐＨ６〜９の緩衝液で”！！濁した後に同
一緩衝液に対して透析する工程 ■当該百分をｐ１１６〜９の緩衝液で懸濁した後に遠心
分離して不溶物を除去する工程 ■当該画分をｐＨ６〜９の！１衝液で懸濁した後に９１
１４．５〜９の条件下、硫酸アンモニウムを３０〜３５
％飽和濃度（０，２３〜０．２７ｋｇ／ｊ！に相当）ま
で添加した後、遠心分離して上清を回収する工程 ■当該画分をｐＨ６〜９の緩衝液で懸濁した後にｐＨ６
〜９の条件下、硫酸アンモニウムを４０〜５０％飽和ｔ
；度（０，３〜０．３８ｋｇ／εに相当）まで添加した
後、遠心分離して沈澱を回収する工程等を挙げることが
できる。これらは組合せて用いることもできる。

（３）本処理 （１）または（２）で得られるハプトグロビンを含む水
溶液、たとえばヒト血漿のα−およびβ−グロブリン画
分を含む溶液をコロイド珪酸と接触・混和させる。

吸着剤として用いられるコロイド珪酸としては、シリカ
ゲル、軽質無水珪酸、ケイソウ土、酸性白土、ベントナ
イト、カオリン、珪酸アルミン酸マグネシウムなどが挙
げられる。好適には軽質無水珪酸が用いられる。

また、接触条件としては、蛍白濃度１〜１００ｇ／ｌ（
好ましくは１０〜１００ｇ／ｆｆ１）、吸着剤量１〜３
０ｇ／ｌ、ｐＨ４〜９　（好ましくはｐＨ６〜８）など
が挙げられる。

本処理はバッチ法、カラム法のどちらでも行われうるが
、好ましくはバッチ法を用いる。

バッチ法の場合の条件としては、５〜２５℃、５分〜１
時間程度、混和、撹拌される。

その後、濾過または遠心分離により上清（非吸着画分）
を回収する。この吸着処理によりリボプロティン、αｌ
−グロブリン等が除去される。

（４）製剤化 本発明の精製方法は、ハプトグロビンの公知の精製方法
の一工程として４入することも可能である。例えば、限
外濾過、陰イオン交換体処理、硫安分画などの方法と組
み合わせることにより、高度精製を行い、さらに公知の
製剤化技術を組み合わせることにより、臨床上適用でき
るハプトグロビン製剤を堤供することができる。

［効果〕 本発明の方法によれば、従来法（アクリノール法）に比
べて簡単な処理でハプトグロビン含有水溶液中の夾雑物
を除去することができる。

〔実施例〕 本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、
本発明はこれらによって限定されるものではない。

実施例１ 人血漿よりコーンの低温エタノール分画法で得た百分Ｉ
Ｖ　３０　ｋｇにｐｌ！８．２の０．０５モル酢酸アン
モニウム緩衝液１４５１を加え懸濁した。これに軽質無
水珪酸（第９改正日本薬局方）１ｋｇを加え、室温で１
時間攪拌した後、遠心分離して上清を回収した。この上
清中にハプトグロビンは９５％回収されていた。本処理
により主としてリボ蛋白が除かれ、純度が向上するとと
もに清澄な液が得られた。

実施例２ 人血齋をコーンのエタノール法で分画して得た画分ＩＶ
　３　ｋｇをｐＨ７の０．０５Ｍ酢酸緩衝液１５１中に
懸濁した後、酢酸緩衝液に対して透析し、エタノールを
除き、不溶物を遠心分離して除去した。

得られた上澄液に、３３％飽和となるように硫酸アンモ
ニウムを加え、生じた沈澱を遠心分離で除去した後、硫
酸アンモニウムを追加して飽和度を４０％とした。生じ
た沈澱を濾別採取し、水１０１に溶解した後、軽質無水
珪酸５０ｇを加え、室温で１時間攪拌した後、遠心分離
して上清を回収した。この上清中にハプトグロビンは７
０％回収されていた。本処理により、αｌ−グロブリン
、β−グロブリン、アルブミン、リボ蛋白等の不要蛋白
が除かれ、純度が向上するとともに清澄な液を得ること
ができた。

実施例３ 新規なプール血＝ｔｏｆｆから硫酸アンモニウム沈澱法
により得たα−１β−グロブリン画分を出発原料として
用いた。これに酢酸アンモニウムを加えてｐＨ１８の酢
酸アンモニウム緩衝液１０１を加え懸眉液となし、軽質
無水珪酸５０ｇを加え、室温で１時間攪拌した後、遠心
分離して上清を回収した。この上清中にハプトグロビン
は９５％回収されていた。本処理により、主としてリボ
蛋白が除かれ、純度が向上するとともに清澄な液を得る
ことができた。

実施例４ 大血漿をコーンのエタノール法で分画して得た画分１’
Ｖ　３０　ｋｇをｐｕｓ、２の０．０５　Ｍ酢酸アンモ
ニウム緩衝液１４０１に懸濁した後、硫酸アンモニウム
を３５％飽和となるように加え、生じた沈澱を遠心分離
して除いた。この上清をｐＨ７，５に調整した後、軽質
無水珪酸〔アエロジル（ジグサ社製）〕ｌ　ｋｇを加え
、室温で１時間攪拌した。その後に遠心分離して上清を
回収した。上滑中にハプトグロビンは７０％回収され、
溶液の濁りも完全に除去できた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ハプトグロビンおよび夾雑物を含有する水溶液をコロイ
   ド珪酸と接触処理し、夾雑物を吸着除去し、非吸着画分
   を回収することからなるハプトグロビンの精製方法。