CZ300452B6 - Zpusob cištení inhibitoru alfa-1-proteinasy - Google Patents
Zpusob cištení inhibitoru alfa-1-proteinasy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ300452B6 CZ300452B6 CZ0435698A CZ435698A CZ300452B6 CZ 300452 B6 CZ300452 B6 CZ 300452B6 CZ 0435698 A CZ0435698 A CZ 0435698A CZ 435698 A CZ435698 A CZ 435698A CZ 300452 B6 CZ300452 B6 CZ 300452B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- crude
- aqueous solution
- peg
- supernatant
- fraction
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 title claims description 7
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 title claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 31
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 claims description 7
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 claims description 7
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 7
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 5
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 claims description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 229940050929 polyethylene glycol 3350 Drugs 0.000 description 13
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 11
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 6
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 6
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 5
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 4
- 102000016799 Leukocyte elastase Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000018616 Apolipoproteins B Human genes 0.000 description 1
- 108010027006 Apolipoproteins B Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000353621 Eilat virus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 238000011178 cuno filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000003456 pulmonary alveoli Anatomy 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- -1 sucrose Chemical class 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob cištení inhibitoru .alfa.-1 proteinasy, neboli .alfa.-1-PI, zahrnuje následující stupne: opatrení znecištené proteinové frakce obsahující .alfa.-1-PI; suspendaci uvedené znecištené proteinové frakce, která obsahuje .alfa.-1-PI, ve vodném roztoku pri pH 6 .+-. 0,2 po dobu, která postacuje k tomu, aby došlo k rozpuštení rozpustných proteinu; filtraci supenze a izolaci nerozpustných proteinu; resuspendaci nerozpustného proteinu ve vodném roztoku pri pH 8,5 .+-. 0,5; pridání PEG k resuspendovanému nerozpustnému proteinu za úcelem vysrážení .alfa.-2-globulinu; izolaci supernatantu po srážení pomocí PEG, pricemž tento supernatant obsahuje .alfa.-1-PI; pridání ZnCl.sub.2.n. k supernatantu za úcelem vysrážení surového .alfa.-1-PI; izolaci surového .alfa.-1-PI; rozpuštení izolovaného surového .alfa.-1-PI; nanesení rozpušteného surového .alfa.-1-PI na médium pro výmenu aniontu; a izolaci frakce obsahující precištený .alfa.-1-PI z média pro výmenu aniontu.
Description
Způsob čištění inhibitoru α-1-proteinasy
Oblast techniky
Tento vynález se týká způsobu čištění inhibitoru α-1-proteinasy, který zahrnuje jedinečnou kombinaci stupňů čištění umožňující dosažení vysokého výtěžku a vysoké specifické aktivity a1-PI.
Dosavadní stav techniky
Inhibitor α-1-proteinasy (zde též α-1-ΡΙ), známý rovněž, jako α-antitrypsin, je sérový glykoprotein o molekulové hmotností 52 000. Tato látka je syntetizována v játrech a je obsažena v séru v množstvích mezi 150 až 350 mg/dl (což je 30 až 80μΜ ekvivalentem) stanoveno pomocí testování plazmovými standardy.
α-1-ΡΙ působí v plicích za účelem inhibiee neutrofilní elastasy, serinproteasy, jejíž přítomnost ve velkých množstvích může vést k destrukci alveolamích stěn. V normálních plicích zajišťuje a-120 Pl více než 90 % anti-neutrofilní ochrany elastasy v nižším dýchacím traktu.
Nedostatek α—l-PI je autosomální, recesivní dědičná porucha, která se projevuje celou řadou allelických variant a která je charakteristická allelickým uspořádáním označovaným jako proteasový inhibiční systém (Pi). Tyto allely jsou seskupeny na bázi hladin α-1-ΡΙ, které jsou dosaho25 vány v séru různých jedinců. Normální jedinci mají normální sérovou hladinu α-1-ΡΙ (normální jedinci se označují jako jedinci s PiMM fenotypem). Deficientní jednotlivci mají sérovou hladinu α-1-ΡΙ nižší než odpovídá 35 % průměrné normální hladiny (tito jedinci se označují jako jedinci s PiZZ fenotypem). Nuloví jedinci mají nedetekovatelný obsah α-1-ΡΙ proteinu v séru (tito jedinci se označují jako jedinci s Pi(nula)(nula) fenotypem].
Nedostatek α-1-ΡΙ je charakterizován nízkými hladinami α-1-ΡΙ v séru (méně než 35 % průměrné normální hladiny) a v plicích. Tito deficientní jedinci jsou vystaveni vysokému riziku vývoje panacinámího emťyzému. Tento emfyzém převládá u jedinců s fenotypy PiZZ, PiZ(nula) a PiZ(nula)(nula). Symptomy tohoto stavu se obvykle projeví u postižených jedinců v třetí nebo čtvrté dekádě jejich života.
Emfyzém spojený s nedostatkem α-1-ΡΪ se rozvíjí v důsledku koncentrací α-1-ΡΙ v nižších částech dýchacího traktu, které jsou nedostatečné pro inhibici neutrofilní elastasy, což vede k destrukci pletiva pojivové tkáně plicního parenchymu. Jedinci s nedostatkem α-1-ΡΙ jsou málo chráněni proti neutrofilní elastase, uvolňované neutrofíly v nižší části dýchacího traktu. Tato nerovnováha proteasa:inhibitor proteasy u jedinců s nedostatkem α-1-ΡΙ se projeví chronickým poškozováním a posléze i destrukcí plicního parenchymu a alveolámích stěn.
Jedinci s vážným nedostatkem α-1-ΡΙ se vyznačují typicky endogenními sérovými hladinami a45 1 —PI pod 50 mg/dl, dle stanovení standardizovanými postupy. U jedinců s tak nízkými sérovými hladinami α-1-ΡΙ existuje více než 80% riziko, že se u nich během života vyvine emfyzém. Odhaduje se, že alespoň u 40 000 pacientů v USA, neboli u 2 % ze všech pacientů trpících emťyzémem, je toto onemocnění výsledkem poškození genu kódujícího α-1-ΡΙ. Nedostatek α-1-ΡΙ představuje jednu z nejběžnějších dědičných smrtelných poruch u bělochů žijících ve Spojených státech a v Evropě.
Léčení pacientů s nedostatkem ct-l-PI je zaměřeno na náhradu nebo zvýšení hladiny α-1-ΡΙ v séru. Očekává se, že zvýší-li se hladina α-1-ΡΙ v séru, zvýší se v důsledku jeho koncentrace
- 1 CZ 300452 B6 v plicích, čímž se upraví nerovnováha neutrofilní elastasa:a-l-PI v plicích a zabrání se destrukcí plicní tkáně, nebo se tento pochod zpomalí. Studie normální a α-1-ΡΙ defícientní populace vedly k vyslovení názoru, že minimální ochranná hladina α-1-ΡΙ v séru odpovídá 80 mg/dl nebo 11 μΜ (přibližně 57 mg/dl; při použití čistých standardů). V důsledku toho je většina terapií a5 1-P1—deficientních pacientů zaměřena na zajištění minimální ochranné hladiny α-1-ΡΙ v séru, protože sérový a-l-Pije zdrojem alveolámího α-1-PL
Přípravky s obsahem α-1-ΡΙ pro terapeutické použití jsou dostupné od 80. let 20. století. Hlavní využití nacházejí při terapii spočívající ve zvýšení (náhradě) vrozeného nedostatku α-1-ΡΙ. io Poločas lidského α-1-ΡΙ in vivo odpovídá 4,38 dne se standardní odchylkou 1,27 dne. V současnosti doporučovaná dávka 60 mg α-1-PI/kg tělesné hmotnosti týdně upraví nízkou hladinu a-1PI v séru na hladinu překračující minimální ochrannou hladinu 11 μΜ nebo 80 mg/dl.
Dříve byl α-1-ΡΙ čištěn různými způsoby. Jeden z těchto způsobů kombinuje chromatografií na aniontově-výměnném chromatografickém médiu s následným srážením pomocí PEG. Jiné způsoby čistění využívají srážení pomocí PEG s následnou aniontově-výměnnou chromatografií, nebo několikanásobné srážení pomocí PEG a následnou aniontově-výměnnou chromatografií. Dále byly použity kombinace srážení pomocí PEG, jednoho ěi více stupňů aniontově-výměnné chromatografie a stupně chromatografie na bázi chelátů kovů.
Další způsoby využívají pro čištění α-1-ΡΙ techniku dělení fází. Pro přečištění α-1-ΡΙ se uvádí specifické aktivity 1,26 jedn./mg.
Podstata vynálezu
Předmětný vynález se týká zlepšeného způsobu čištění α-1-ΡΙ. Uvedený způsob zahrnuje opatření znečištěné proteinové frakce, s výhodou pastové Cohnovy frakce IVj + IV4, jež obsahuje a1—PI. Tato znečištěná proteinová frakce se suspenduje ve studené vodě nebo v solném roztoku při pH přibližně 6, aby došlo k rozpuštění rozpustných proteinů, včetně albuminu, α-2-globulinu (α-2-makroglobulinu a hatoglobulin) a β-globulinu (transferrinu). Suspenze se poté filtruje, čímž se získají nerozpustné proteiny včetně α-1-ΡΙ, které se promyjí vodou (nebo solným roztokem). Frakce promytých nerozpustných proteinů se znovu suspenduje ve vodě (nebo v solném roztoku), hodnota pH se upraví na přibližně 8,5 a přidáním PEG se vysráží α-2-globulin. Super35 natant se odlije a přidáním chloridu zinečnatého se vysráží surový α-1-ΡΙ. Tato surová látka se znovu rozpustí v NaEDTA pufru a viiy se deaktivují přidáním činidla Tween 80 a tri-n-butylfosfátu (TNBP). S výhodou se přidá někteiý ze sacharidů, jako je sacharosa, maltosa, glukosa apod., aby se stabilizoval α-1-ΡΙ v průběhu uvedené deaktivace virů a zvýšil se tak jeho výtěžek.
Takto zpracovaný roztok se nanese na aniontově-výměnné médium za účelem oddělení α-1-ΡΙ od dalších zbývajících proteinů. Frakce obsahující α-1-ΡΙ se oddělí a výhodně se knim přidá bentonit, aby se tak odstranily jakékoli apolipoproteiny, které jsou v této frakci přítomné. Vzniklý přečištěný roztok α-1-ΡΙ se izoluje a zahustí.
Tímto způsobem přečištěný α-1-ΡΙ má specifickou aktivitu větší než 1,0 jedn./OD28o· Tímto postupem lze dosáhnout výtěžku více než přibližně 1,0 jedn./g pasty, s výhodou pak více než přibližně l,3jedn./g pasty.
Použitím způsobu podle tohoto vynálezu se zlepší kvalita i výtěžek α-1-ΡΙ. Dále se tímto způso50 bem zkrátí doba čistění ve srovnání s jinými způsoby.
Způsob podle tohoto vynálezu zahrnuje jedinečnou kombinaci stupňů čistění, kterou se dosáhne vysokého výtěžku a vysoké specifické aktivity α-1-ΡΙ.
-2CZ 300452 B6
Čistění α— 1—PI vychází ze znečištěné proteinové frakce. Touto znečištěnou proteinovou frakcí může být plazma, dále α-1-ΡΙ získaný rekombinantními metodami nebo jakýkoli jiný zdroj obsahující α-1-ΡΙ protein. Ve výhodném provedení je znečištěnou proteinovou frakcí pastová
Cohnova frakce IVt + IV4, jejíž příprava je v daném oboru velmi dobře známa.
Výchozí zpracování pastové frakce IVi + IV4
Pastová frakce IV1 + IV4 (nebo jiná znečištěná proteinová frakce) se suspenduje v 5 ± 2 dílech vody nebo solného roztoku, tj. od přibližně 0,05 do přibližně 0,15 M chloridu sodného na 1 díl frakce, tedy IVi + IV4) při teplotě nižší než přibližně 15 °C a pH přibližně 6,0 ± 0,2, a to alespoň přibližně jednu hodinu. Rozpustné proteiny, včetně albuminu, α-2-globulinu a β-globulinu, se poté oddělí od nerozpustných proteinů, včetně inhibitoru α-1-proteinasy, a to pomocí filtračního lisu, odstředění apod. Zbytek se promyje při teplotě nižší než 15 °C vodou nebo solným roztokem při pH 6 ± 0,2, čímž se odstraní jakýkoli další rozpustný protein zachycený fyzicky v nerozpustné pastě, přičemž objem vody nebo solného roztoku použitého k promývání činí přibližně pětinásobek původního objemu pasty.
Bylo zjištěno, že suspendováním pastové frakce IVi + IV4 ve vodě nebo solném roztoku při pH
6,0 ± 0,2 s následným promýváním se odstraní téměř veškeiý albumin a vy sráží se většina a—2— a β-proteinů z frakcí IV1 + IV4.
Srážení s použitím PEG
Nerozpustný proteinový zbytek se znovu suspenduje v přibližně 5 ± 2 objemech vody na objem zbytku, při pH 8,5 ± 0,5, a to při teplotě přibližně 15 ± 5 °C, výhodně po dobu přibližně 6 hodin, ačkoliv se mohou využít kratší Či delší Časy. Kratší doby nejsou výhodné, protože výtěžek se s prodlužující se dobou suspendace zvyšuje. Jako optimální kombinace doby suspendace a výtěžku se v současnosti jeví doba 6 hodin. Poté se přidá pevný Tris do konečné 10 ± 5μΜ koncentra30 ce, pevný chlorid sodný do konečné 150 ± 20mM koncentrace a hodnota pH se upraví na 8,0. Následně se přidá polyethylenglykol 3350 (PEG) do konečné koncentrace 15±5% hmotn. a reakční směs se míchá přibližně hodinu při teplotě 15 ± 5 °C. PEG se přidává za účelem a-2globulinu.
Sraženina, jež se vyloučí po přidání PEG, se odstraní pomocí filtračního lisu. Filtrační lis se promyje před filtrací i po filtraci roztokem obsahujícím 150 ±25mM chloridu sodného a 5 % hmotn. PEG, při pH 8,0 ± 0,5. Alternativně lze sraženinu odstranit odstředěním.
Srážení chloridem zinečnatým
K PEG supematantu se přidá chlorid zinečnatý (100 ± 1 OmM) až do konečné 6 ± 5mM koncentrace a pH roztoku se upraví na 7,5 ± 0,5. Roztok se ochladí na teplotu 5 ± 5 °C a míchá se nejméně hodinu. Chlorid zinečnatý vysráží surový α-1-ΡΙ. Surový α-1-ΡΙ se oddělí filtrací, s výhodou použitím filtrace Prostak®, jak je popsána například v publikaci „Prostak Open45 Channel Modu les“, Millipore Corporation, jejíž obsah je zde zahrnut formou odkazu, nebo odstředěním a filtrát se odstraní. Koncentrovanou suspenzi nebo sraženinu lze pro další upotřebení zmrazit.
Deaktivace virů zpracováním bez použití rozpouštědla
Surový α-1-ΡΙ se znovu rozpustí v přibližně 50 mM roztoku NaEDTA s použitím filtrace Prostak a recirkulace. Přidá se sacharid, s výhodou sacharosa, a to v množství přibližně 15 ± 5 % hmotn. (nebo přibližně 0,25 ± 0,05 citranu sodného), které slouží jako stabilizátor během deaktivace viru. Roztok se míchá při teplotě 15 ± 5 °C, dokud se sacharosa nerozpustí.
-3 CZ 300452 B6
Roztok obsahující α-1-ΡΙ se z hlediska viru deaktivuje přidáním rozpouštědla-detergentu. K roztoku α-1-ΡΙ se přidá roztok 10 ± 1 % hmotn./obj. polysorbátu 80 a 3 ± 0,3 % hmotn. tri-nbutylfosfátu, a to až do konečné koncentrace 1,0 ±0,5 % hmotn./obj. polysorbátu—80 a 0,3 ± 0,15 % hmotn. tri-n-butyl fosfátu. Poté se roztok inkubuje při teplotě 27 ± 3 °C, pH 8 ± 0,5 po dobu nejméně 6 hodin, čímž se deaktivují jakékoli viry, které mohou být přítomné v α-1-ΡΙ.
Bylo zjištěno, že přítomnost sacharidu, například sacharosy, jakožto stabilizátoru během deaktivace viru pomocí přídavku rozpouštědla-detergentu zvyšuje výtěžek α-1-ΡΙ v jednotkách ve srovnání s kontrolním pokusem, tj. s deaktivací viru v roztoku α-1-ΡΙ přídavkem rozpouštědlaio detergentu bez použití sacharidu jakožto stabilizátoru. Zvýšení výtěžku činí s výhodou nejméně %, s výhodou nejméně 20 % a nejvýhodněji nejméně 30 %.
Po inkubaci se ošetřený roztok α-1-ΡΙ ochladí na 0 až -10 °C, pH se potom upraví na 8,0 ± 0,1.
Aniontově-výměnná chromatografíe
Upravený roztok se zředí přibližně jedním objemem vody na objem upraveného roztoku. Zředěný roztok se dále nanese na předem ekvilibrované chromatografické médium QAE nebo na jiné podobné médium pro výměnu aniontů, jež váže α-1-ΡΙ, což umožňuje oddělení této látky od jiných proteinů. Lze použít buď vsádkovou ehromatografií, nebo sloupcovou ehromatografií. Jakmile se ct-l-Pl absorbuje na médium, promyje se toto pufrem obsahujícím 20 ± 10 mM chloridu sodného a 20 ± lOmM dihydrogenfosforeěnanu sodného (NaH2PO4) při pH 8± 1, čímž se odstraní nenavázané podíly, včetně β-proteinů. Poté se z chromatografického média pro výměnu aniontů vymyje α-1-ΡΙ, a to elucí promývací kapalinou, která obsahuje 100 ± 50 mM chloridu sodného a 20 ± 10 mM fosforečnanu sodného, při pH 8 ± 1. Eluát obsahující α-1-ΡΙ se jímá pro další zpracovávání.
Po odstranění α-1-ΡΙ se médium pro výměnu aniontů vyčistí postupným promytím následujícími složkami: vodným roztokem obsahujícím 2 ± 0,2 mM chloridu sodného a 20 ± 10 mM fosforeč30 nanu sodného, pH 8 ± 1; vodou pro injekce (WFI); vodným roztokem obsahujícím 500 mM hydroxidu sodného; a potom znovu WFI. Chromatografické médium se potom uchovává v roztoku obsahujícím 2 ± 0,2 M roztoku chloridu sodného, 20 ± 10 mM roztoku fosforečnanu sodného, pH 8± 1.
Zpracovávání eluátu s obsahem α-1-ΡΙ
Eluát obsahující α-1-ΡΙ se spojí a přidá se k němu 0,1 až 1,0 % (hmotn./hmotn.) bentonitu, a to na přibližně 1 hodinu, čímž se sníží množství apolipoproteinů na méně než přibližně 0,01 mg/ml apolipoproteinu A a na méně než přibližně 0,01 mg/ml apolipoproteinů B. Bentonit se odfiltruje, s výhodou použitím filtrace Cuno, například tak, jak je popsáno v publikaci „Zeta Plus C Series Filter Medium“, Cuno lne., jejíž obsah je formou odkazu zahrnut v tomto textu. Získaný roztok se zahušťuje pomocí ultrafiltrační membrány dokud aktivita a-l-Pí není alespoň lOjedn./ml. Koncentrovaný produkt se dále filtruje přes filtr s póry o velikosti 0,45 gm, čímž se odstraní jakýkoli částicovitý materiál. α-1-ΡΙ se filtruje technologie „Plánová“, čímž se odstraní virus, sterilně se filtruje přes filtr s póry o velikosti 0,22 gm, filtrát se rozdělí do lékovek a pro uskladnění se lyofilizuje, α-1-ΡΙ se skladuje při teplotě 2 ± 8 °C.
Lyofilizovaný α-1-ΡΙ se může znovu rozpustit ve sterilní vodě za účelem podání pacientovi.
Testy aktivity α-1-ΡΙ
Chromogenní test se může využít k detekci α-1-ΡΙ aktivity rekonstituovaného α-1-ΡΙ. Test využívá trypsin-sensitivní chromogenní substrát, ze kterého se v přítomnosti trypsinu uvolňuje p-4CZ 300452 B6 nitroanilin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Uvolněný p-nitroanilin se detekuje při vlnové délce 405 nm. α-1-ΡΙ inhibuje uvolňování p-nitroanilinu ze substrátu. Aktivita α-1-ΡΙ v produktu se stanoví porovnáním s kalibrační křivkou aktivity α-1-ΡΙ. Při chromogenním testu rekonstituovaného lyofilizovaného α-1-ΡΙ, připraveného výše popsaným způsobem, je vykazo5 vána specifická aktivita alespoň přibližně 1,0 jedn./OD280.
Podávání
Pacientovi lze podávat α-1-ΡΙ infuzemi rychlostí přibližně 0,08 ml/kg tělesné hmotnosti za io minutu po dobu prvních 10 minut Pokud si pacient na nic nestěžuje, lze rychlost podávání zvýšit na tolerovanou míru. Pokud je toto podávání tolerováno, lze následné infuze témuž pacientovi podávat zvýšenou tychlostí. Dojde-li k opaku, sníží se rychlost podávání nebo se infuze přeruší do vymizení symptomů. Poté lze infuzi obnovit, a to rychlostí, ježje pacientem tolerována. Majíli se podávat vysoké dávky, pak lze několik ampulí α—1—Pl spojit s použitím aseptické techniky is do prázdného, sterilního i.v. infuzního zásobníku.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
600 g pastové frakce IVi + IV4 zCohnova frakcionaěního schématu se suspenduje při teplotě 5 °C a pH 6,0 v 1800 ml vody, bez jakékoli titrace po dobu jedné hodiny. Po skončení suspenda25 ce se suspenze filtruje při tlaku 10 CP přes filtr (Cuno). Filtrát se izoluje, testuje a změří se specifická aktivita (S. A.) α-1-ΡΙ (A1PI) a optická hustota při 280 nm (OD28o). Pasta zbylá ve filtračním lisu se promyje 600 ml vody o teplotě 5 °C, filtrát se jímá a tento postup se opakuje čtyřikrát. Všechny filtráty se spojí, testují a měří se specifická aktivita (S. A.) a optická hustota (OD28onm). Hmotnost výsledné pasty: 350 g. Specifická aktivita a optická hustota vzorků získaných tímto postupem j e popsána v následuj ící tabulce I,
Tabulka 1
Aktivita A1PI a O.D. 280 nm frakcí vymytých vodou
| Vzorek | Objem (ml) | A1PI (jedn./ml) | Celkový A1PI (jedu.) | O.D. 280 nm | S.A. (jedn./OD) |
| Promytí 0 | 1450 | 0,06 | 87 | 22,2 | 0,003 |
| Promytí 1 | 600 | 0,1 | 60 | 29,9 | 0,003 |
| Promytí 2 | 600 | 0,08 | 48 | 25,5 | 0,003 |
| Promytí 3 | 600 | 0,04 | 24 | 13,0 | 0,003 |
| Promytí 4 | 600 | 0 | 0 | 4,8 | 0 |
| Promytí 5 | 600 | 0 | 0 | 3,0 | 0 |
-5 CZ 300452 B6
Příklad 2
350 g výsledné pasty z příkladu 1 se resuspenduje v 1050 ml vody při pH 8,5 a teplotě 18 °C po 5 dobu 6 hodin. Přidá se pevný Tris do koncové 1 OmM koncentrace a pevný chlorid sodný do koncové 150mM koncentrace, pH se upraví na hodnotu 8,0. Dále se přidá polyethylenglykol (PEG 3350) do koncové koncentrace 15 % (hmotn.) a výsledná směs se míchá jednu hodinu při °C. Vzniklá sraženina se odstraní pomocí filtračního lisu s 10 CP filtrem, čímž se získá supernatant. Pasta ve filtračním lisu se následně promývá roztokem s obsahem 15 % (hmotn.) polyio ethylenglykolu PEG-3350, 10 mM Tris a 150 mM chloridu sodného. Filtrát a filtrát z následného promývání se spojí. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.
Tabulka 2
PEG-3350 srážení
| Vzorek | Objem (ml) | AlPI (jedn./ml) | Celkový AlPI (jedn.) | O.D. 280 nm | S.A. (jedn. /OD) |
| Resusp. | 1400 | 1,063 | 1488 | 13,32 | 0,0798 |
| PEG™ filtrát | 2465 | 0,513 | 1265 | 2,16 | 0,2375 |
Příklad 3
K získanému filtrátu PEG-3350 z příkladu 2 se přidává chlorid zinečnatý do koncové 2mM koncentrace, hodnota pH se upraví na 7,5 a teplota se sníží na 5 °C, čímž dojde k vysrážení surového
A1PI. Po jedné hodině míchání se surový A1PI odfiltruje pomocí filtrace Prostak a získaná suspenze se znovu rozpustí v roztoku NaEDTA. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
Srážení chloridem zinečnatým
| Vzorek | Objem (ml) | AlPI (jedn./ml) | Celkový AlPI (jedn.) | O.D. 280 nm | S.A. (jedn./OD) |
| Prostak filtrát | 2200 | 0,0159 | 35 | 0,15 | 0,106 |
| NaEDTA resusp. | 264 | 4,305 | 1065 | 13,72 | 0,3138 |
-6CZ 300452 B6
Příklad 4
Sacharosa v množství 16,7% (hmotn.) se přidá k rekonstituovanému NaEDTA roztoku 5 z příkladu 3 a výsledná směs se míchá při teplotě 18 °C až do úplného rozpuštění sacharosy.
K tomuto roztoku se přidá polysorbát-80 do konečné koncentrace 1,0 % a tri-n-butylfosfát do konečné koncentrace 0,3 %. Roztok se dále ínkubuje při teplotě 27,5 °C po dobu alespoň 6 hodin, aby došlo k deaktivaci možného kontaminujícího lipidem obaleného viru. Po skončení inkubace se roztok ochladí na 5 °C a hodnota pH se upraví na 8,0. Pro kontrolu se výše uvedený postup io opakuje bez přidání sacharosy. Stabilita A1PI během působení rozpouštědla-detergentu (SD) v přítomnosti 16,7 % sacharosy a bez sacharosy (kontrolní pokus) je vyjádřena v následující tabulce 4.
Tabulka 4
Stabilita A1PI během úpravy pomocí rozpouštědla-detergentu v přítomnosti sacharosy
| Vzorek | Objem (ml) | AlPI (jedn. /ml) | Celkový AlPI (jedn.) | % AlPI z NaEDTA |
| SD-A1PI | 311 | 3,35 | 1042 | 97,8 |
| Kontrola | 293 | 2,13 | 624 | 58,6 |
Příklad 5
K získanému SD A1PI roztoku z příkladu 4 se přidá 311 g destilované vody, aby se snížila ionto25 vá síla před nanesením na QAE kolonu. Roztok se nanese na 300 ml předem ekv i libro váné QAE kolony pro výměnu iontů s průtokem 12 ml/min. Kolona se promyje s použitím 6 ml solného fosfátového pufru (20mM NaCl, 20mM NaH2PO4, pH 8,0). Dále se AlPI eluuje pomocí 1,8 1 solného fosfátového pufru (lOOmM chlorid sodný, 20mM NaH2PO4, pH 8,0).
Iontoměničově médium se postupně promyje: 2M NaCl, 20mM NaH2PO4, pH 8,0, 500mM NaOH a destilovanou vodou. Chromatografícké médium se uchovává v 2M roztoku chloridu sodného, 20mM NaH2PO4, pH 8,0. Spojené frakce s obsahem AlPI se testují a výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 5.
Tabulka 5
QAE-iontová chromatografie
| Vzorek | Objem <λ1> | AlPI (jedn. /ml) | Celkový AlPI (jeda.) | O.D. 280 am | S.A. (jeda. /OD) |
| Eluát | 1500 | 0,62 | 930 | 0,58 | 1,058 |
-7CZ 300452 B6
Příklad 6
Ke spojenému eluátu z příkladu 5 se přidají 3,0 g depyrogenovaného bentonitu a vzniklá směs se míchá jednu hodinu při 20 °C. Bentonit se odstraní filtrací (Cuno). Filtrát se zahustí ultrafiltrací.
Koncentrát se filtruje (Plánová) a dále se sterilně filtruje v sériích. Filtrát se rozdělí do lékovek a lyofilizuje se za účelem skladování. Všechny procesní vzorky byly testovány a výsledky jsou shrnuty v tabulce 6:
io Tabulka 6
| Vzorek | Objem (ml) | A1PI (jedn./ml) | Celkový A1PI (jedn.) | O. D. 280 nm | S. A. (jedn./OD) |
| Filtrát (Cuno) | 1710 | 0,52 | 885 | 0,385 | 1,351 |
| Koncentrát | 75 | 11,6 | 870 | 8,092 | 1,434 |
| Konečný vzorek | 92 | 0,4 | 865 | 6,225 | 1,510 |
Vynález není jakkoli omezen na popsané konkrétní příklady provedení. Odborníkovi je zřejmé, 15 že ve výše popsaných výhodných provedeních lze provést změny materiálů, stupňů a procesních parametrů, aniž by došlo k vybočení z rozsahu tohoto vynálezu, V souladu s tím není rozsah předmětného vynálezu omezen na výše popsané příklady. Naopak, rozsah vynálezu je definován následujícími patentovými nároky.
Claims (18)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob čištění inhibitoru α-1-proteinasy, nebolí α-1-ΡΙ, vyznačující se tím, že 25 zahrnuje následující stupně:- opatření znečištěné proteinové frakce obsahuj ící a-1 -PI;- suspendaci uvedené znečištěné proteinové frakce, která obsahuje α-1-ΡΙ, ve vodném roztoku při pH 6 ± 0,2 po dobu, která postačuje k tomu, aby došlo k rozpuštění rozpustných proteinů;- filtraci suspenze a izolaci nerozpustných proteinů;30 - resuspendaci nerozpustného proteinu ve vodném roztoku při pH 8,5 ± 0,5;- přidání PEG k re suspendovanému nerozpustnému proteinu za účelem vysrážení α-2-globulinu;- izolaci supematantu po srážení pomocí PEG, přičemž tento supematant obsahuje α-1-ΡΙ;- přidání ZnCl2 k supematantu za účelem vysrážení surového α-1-ΡΙ;35 - izolaci surového α-1-ΡΙ;- rozpuštění izolovaného surového α-1-ΡΙ;- nanesení rozpuštěného surového α-1- ΡΙ na médium pro výměnu aniontů; a- izolaci frakce obsahující přečištěný α-1-ΡΙ z média pro výměnu aniontů.-8CZ 300452 B6
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená znečištěná proteinová frakce obsahující α— I—PI se suspenduje ve 3 až 7 objemech vodného roztoku na každý díl znečištěné proteinové frakce obsahující α-1-ΡΙ.
- 3. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že uvedený vodný roztok jak při suspendaci, tak při resuspendaci je vybraný ze souboru sestávajícího z vody a roztoků obsahujících NaCI v koncentraci od 0,05 do 0,15M.
- 4. Způsob podle nároku 1, vy zn ač uj íc í se centrace 10 až 20 % hmotn.t í m, že PEG se přidává do dosažení kon15
- 5. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se PEG se upraví na hodnotu 7,5 ± 0,5.t í m, že pH supernatantu ze srážení pomocí
- 6. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se 1 lmM koncentrace.t í m, že ZnCl2 se přidává do dosažení 1 až
- 7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím,že dále zahrnuje úpravu surového a20 1—PI izolovaného po srážení pomocí ZnCl2 za účelem deaktivace jakýchkoli virových kontaminantů.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že na uvedený surový α-1-ΡΙ se působí rozpouštědlem a detergentem.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že na uvedený surový α— 1 —PI se působí tri-n-butylfosfátem a polysorbátem 80.
- 10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že na uvedený surový α—1-PI se 30 působí tri-n-butylfosfátem o koncentraci 0,15 až 0,45 g/lOOml roztoku a polysorbátem 80 o koncentraci 0,5 až 1,5 g/100 ml roztoku.
- 11. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím,že dále zahrnuje přidávání bentonitu k eluentu, jenž obsahuje inhibitor α-1-proteinasy.
- 12. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím,že přečištěný α-1-ΡΙ má specifickou aktivitu ve výši l,Ojednotka/OD280.
- 13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že výtěžek α-1-ΡΙje alespoň 1 jed40 notka na gram pasty obsahující frakci IVt + IV4.
- 14. Způsob čištění α-1-ΡΙ podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:- opatření znečištěné proteinové frakce obsahující α-1-ΡΙ;45 - suspendaci uvedené znečištěné proteinové frakce, která obsahuje α-1-ΡΙ, ve vodném roztoku při pH 6 ± 0,2 po dobu, která postačuje k tomu, aby došlo k rozpuštění rozpustných proteinů;- filtraci suspenze a izolaci nerozpustných proteinů, které obsahují α-1-ΡΙ;- resuspendaci proteinů ve vodném roztoku při pH 8,5 ± 0,5;- přidávání PEG k vodnému roztoku obsahujícímu resuspendovaný nerozpustný protein do50 dosažení koncentrace 10 až 20 % hmotn., a to za účelem vysrážení α-2-gIobuIinu;- izolaci supernatantu po srážení pomocí PEG, přičemž tento supernatant obsahuje α-1-ΡΙ;- úpravu pH uvedeného supernatantu na hodnotu 7,5 ±0,5;-9CZ 300452 B6- přidání ZnCl2 k supematantu za účelem vysrážení surového ot-l-PI;- izolaci surového α-1-ΡΙ pomocí filtrace Prostak a opětovné rozpuštění surového α-1-ΡΙ ve vodném roztoku;- působení rozpouštědla a detergentů na rozpuštěný α-1-ΡΙ za účelem deaktivace jakýchkoli5 virových kontaminantů;- nanesení surového α-1-ΡΙ upraveného rozpouštědlem a detergentem na médium pro výměnu aniontů;- izolaci frakce obsahující přečištěný α-1-ΡΙ z média pro výměnu aniontů;- přidání bentonitu k uvedené frakci obsahující přečištěný α-1-ΡΙ za účelem adsorpce apolipoio proteinu; a- izolaci roztoku obsahujícího α-1-ΡΙ.
- 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále zahrnuje úpravu izolované frakce, která zahrnuje ultrafiltraci roztoku obsahujícího přečištěný α-1-ΡΙ.
- 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že dále zahrnuje lyofilizací ultrafiltrovaného roztoku obsahujícího přečištěný α-1-PL
- 17. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že přečištěný α-1-ΡΙ má specific20 kou aktivitu ve výši 1,0 jednotka/OD28o·
- 18. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že výtěžek α-1-ΡΙ je alespoň 1 jednotka na gram pasty obsahující frakci IV] + IV4.25 19. Způsob čištění α-1-ΡΙ podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:- opatření znečištěné proteinové frakce obsahující α-1-ΡΙ;- suspendaci uvedené znečištěné proteinové frakce ve vodném roztoku při pH 6 a teplotě, jež umožňuje rozpuštění albuminu, α-2-proteinu a β-proteinů aniž by došlo k rozpuštění a-130 Pl;- separaci nerozpustných proteinů, včetně α-1-ΡΙ, od rozpuštěných proteinů;- resuspendaci nerozpustných proteinů ve vodném roztoku a přidání PEG, přičemž koncentrace PEG se pohybuje v rozmezí od 10 do 20 % hmotnostních a teplota a pH roztoku jsou zvoleny tak, aby došlo k vysrážení α-2-proteinů bez vysrážení α-1-ΡΙ;35 - izolaci supematantu ze srážení pomocí PEG a přidání ZnCl2, přičemž pH roztoku je v rozmezí od 7 do 8, koncentrace ZnCl2 je v rozmezí od 1 do 1 lmM a teplota je zvolena tak, aby došlo k vysrážení surového α-1-ΡΙ;- izolaci vysráženého surového α-1-ΡΙ a rozpuštění uvedeného surového α-1-ΡΙ ve vodném roztoku;40 - nanesení vodného roztoku surového α-1-ΡΙ na médium pro výměnu aniontů; a- izolaci frakce obsahující přečištěný α-1-ΡΙ z média pro výměnu aniontů.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/673,064 US5616693A (en) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | Process for seperating alpha-1-proteinase inhibitor from COHN IV1 +1V4 paste |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ435698A3 CZ435698A3 (cs) | 1999-05-12 |
| CZ300452B6 true CZ300452B6 (cs) | 2009-05-20 |
Family
ID=24701177
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20070842A CZ302102B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob zvýšení výtežku jednotek proteinu v proteinovém roztoku podrobeném deaktivaci viru pomocí pridání rozpouštedla-detergentu |
| CZ20070841A CZ301332B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob odstranení apolipoproteinu z proteinového roztoku |
| CZ0435698A CZ300452B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob cištení inhibitoru alfa-1-proteinasy |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20070842A CZ302102B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob zvýšení výtežku jednotek proteinu v proteinovém roztoku podrobeném deaktivaci viru pomocí pridání rozpouštedla-detergentu |
| CZ20070841A CZ301332B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob odstranení apolipoproteinu z proteinového roztoku |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5616693A (cs) |
| EP (2) | EP0944392B1 (cs) |
| JP (3) | JP4390855B2 (cs) |
| KR (1) | KR20000022480A (cs) |
| AT (2) | ATE352569T1 (cs) |
| AU (1) | AU726233B2 (cs) |
| BR (1) | BR9710107B1 (cs) |
| CA (2) | CA2259499C (cs) |
| CZ (3) | CZ302102B6 (cs) |
| DE (2) | DE69739212D1 (cs) |
| DK (2) | DK1762576T3 (cs) |
| ES (2) | ES2320919T3 (cs) |
| IL (1) | IL127774A (cs) |
| PL (3) | PL188830B1 (cs) |
| PT (2) | PT1762576E (cs) |
| WO (1) | WO1998000154A1 (cs) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5616693A (en) * | 1996-07-01 | 1997-04-01 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for seperating alpha-1-proteinase inhibitor from COHN IV1 +1V4 paste |
| US6849605B1 (en) * | 1999-03-05 | 2005-02-01 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections |
| WO2000051623A2 (en) | 1999-03-05 | 2000-09-08 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide-induced clinical conditions |
| AU3864000A (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-21 | Trustees Of University Technology Corporation, The | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of herpes viruses |
| AU3731400A (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-21 | Trustees Of University Technology Corporation, The | Methods and compositions useful in inhibiting apoptosis |
| US6462180B1 (en) | 1999-11-24 | 2002-10-08 | Bayer Corporation | Method of preparing α-1 proteinase inhibitor |
| FI1343809T4 (fi) | 2000-12-14 | 2023-09-04 | Menetelmä alfa-1 proteinaasinestäjän valmistamiseksi | |
| KR100406870B1 (ko) * | 2001-05-25 | 2003-11-21 | 주식회사 두산 | 침전법을 이용한 계란 난황에서의 유용 수용성 성분의분리방법 및 침전 부산물의 이용 방법 |
| AU2002331306A1 (en) * | 2001-08-07 | 2003-02-24 | Novozymes North America, Inc. | Carbohydrates and polyols for dissolving protein crystals |
| EP1520012B1 (en) * | 2002-07-01 | 2009-01-07 | Novozymes A/S | Monopropylene glycol added to fermentation |
| US7777006B2 (en) * | 2002-12-31 | 2010-08-17 | Csl Behring L.L.C. | Method for purification of alpha-1-antitrypsin |
| US20040220242A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Leland Shapiro | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide induced clinical conditions |
| DK2520654T3 (en) * | 2003-08-26 | 2017-05-01 | Univ Colorado Regents | Inhibitors of serine protease activity and their use in methods and compositions for the treatment of bacterial infections |
| US7807435B2 (en) * | 2005-08-11 | 2010-10-05 | Baxter International Inc. | Method for the purification of alpha-1 proteinase inhibitor (a1PI) |
| GB0524432D0 (en) * | 2005-11-30 | 2006-01-11 | Nhs Blood & Transplant | Method |
| US20080124303A1 (en) * | 2005-12-12 | 2008-05-29 | Cavit Sciences, Inc | Methods and compositions for treatment of viral infections |
| SI1999262T1 (sl) * | 2006-03-30 | 2012-12-31 | Baxter Healthcare S.A. | Postopek za čiščenje rekombinantnega alfa 1-antitripsina, ki vključuje stopnjo anionske izmenjevalne kromatografije |
| US8772240B2 (en) | 2006-05-19 | 2014-07-08 | Baxter International Inc. | Ethanol dependence of alpha1 antitrypsin C-terminal lys truncation by basic carboxypeptidases |
| EP3412314A1 (en) | 2011-05-27 | 2018-12-12 | Baxalta GmbH | Therapeutic proteins conjugated to polysialic acid and methods of preparing same |
| EP3628327A1 (en) | 2011-06-24 | 2020-04-01 | The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules |
| KR20140137347A (ko) | 2012-01-10 | 2014-12-02 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 | 알파-1 안티트립신 융합 분자용 조성물, 방법 및 용도 |
| TWI629283B (zh) | 2012-02-23 | 2018-07-11 | 巴克斯歐塔公司 | 來自血漿中的免疫球蛋白之ｉ-ｉｖ-１部分沉澱 |
| US9353165B2 (en) | 2012-07-25 | 2016-05-31 | Grifols, S.A. | Purification of cell culture derived alpha1 protease inhibitor |
| CA2943938A1 (en) | 2013-03-29 | 2014-10-02 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions and methods for preparing a subject for organ or non-organ implantation |
| IL267923B2 (en) | 2018-08-02 | 2023-06-01 | Grifols Worldwide Operations Ltd | The composition containing the most concentrated alpha-1 type protein inhibitor and a method for obtaining it |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4056614A (en) * | 1972-09-22 | 1977-11-01 | Marc Bonneau | Immunity depressant medicine |
| EP0097274A2 (en) * | 1982-06-17 | 1984-01-04 | Miles Inc. | Method for separating alpha-1-proteinase inhibitor from blood plasma fractions |
| US4629567A (en) * | 1986-03-07 | 1986-12-16 | Smithkline-Rit | Alpha-1-antiprotease purification |
| US4656254A (en) * | 1985-12-02 | 1987-04-07 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor and antithrombin III |
| JPS6317899A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-25 | Green Cross Corp:The | ハプトグロビンの精製方法 |
| EP0288841A2 (en) * | 1987-04-27 | 1988-11-02 | Miles Inc. | Method of preparing highly purified alpha-1-proteinase inhibitor |
| EP0698615A1 (en) * | 1994-08-24 | 1996-02-28 | Bayer Corporation | Purification of alpha-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2770616A (en) * | 1951-01-29 | 1956-11-13 | Protein Foundation Inc | Fractionation of proteinaceous materials in blood plasma and liver tissue |
| US2761808A (en) * | 1952-09-06 | 1956-09-04 | Ortho Pharma Corp | Plasma fractionation process |
| JPS52128205A (en) * | 1976-04-16 | 1977-10-27 | Green Cross Corp:The | Prophylactic and therapeutic drugs for cerebro-vascular contraction |
| US4379087A (en) * | 1982-06-17 | 1983-04-05 | Cutter Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| US4540573A (en) * | 1983-07-14 | 1985-09-10 | New York Blood Center, Inc. | Undenatured virus-free biologically active protein derivatives |
| DE3426903A1 (de) * | 1984-07-20 | 1986-01-23 | Biotest Pharma GmbH, 6000 Frankfurt | Eine immunglobulinpraeparation in kombination mit einer anderen pharmakologisch wirksamen praeparation zur verwendung bei der behandlung von krankheiten |
| US4684723A (en) * | 1985-09-11 | 1987-08-04 | Miles Laboratories, Inc. | Method of separating proteins from aqueous solutions |
| US4697003A (en) * | 1985-11-01 | 1987-09-29 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| JPS63132898A (ja) * | 1986-11-26 | 1988-06-04 | Meito Sangyo Kk | 蛋白質の分離精製方法 |
| US5093316A (en) * | 1986-12-24 | 1992-03-03 | John Lezdey | Treatment of inflammation |
| US4829054A (en) * | 1987-04-13 | 1989-05-09 | Miles Laboratories, Inc. | Method of decreasing lung damage in a host following the onset of gram negative septicemia/endotoxemia |
| IL86417A (en) * | 1987-05-22 | 1992-09-06 | Armour Pharma | Process for the inactivation of pathogens in biological or pharmaceutical material by mixing with aqueous solution containing a sugar(alcohol)and neutral salts as stabilizers |
| US5073487A (en) * | 1989-01-30 | 1991-12-17 | Athens Research And Technology, Inc. | Rapid assay for functional human α1 -proteinase inhibitor |
| FR2672895B1 (fr) * | 1991-02-15 | 1995-05-12 | Transgene Sa | Procede de purification d'une proteine fortement glycosylee. |
| US6284874B1 (en) * | 1994-06-17 | 2001-09-04 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for separating α1-proteinase inhibitor from cohn fraction IV1 and IV4 paste |
| US5616693A (en) * | 1996-07-01 | 1997-04-01 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for seperating alpha-1-proteinase inhibitor from COHN IV1 +1V4 paste |
-
1996
- 1996-07-01 US US08/673,064 patent/US5616693A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-31 US US08/829,223 patent/US5981715A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 BR BRPI9710107-9A patent/BR9710107B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 CA CA002259499A patent/CA2259499C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-27 DK DK06025342T patent/DK1762576T3/da active
- 1997-06-27 CZ CZ20070842A patent/CZ302102B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 AU AU35831/97A patent/AU726233B2/en not_active Expired
- 1997-06-27 CA CA002489773A patent/CA2489773A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-27 EP EP97932347A patent/EP0944392B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 ES ES06025342T patent/ES2320919T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 DE DE69739212T patent/DE69739212D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 PT PT06025342T patent/PT1762576E/pt unknown
- 1997-06-27 AT AT97932347T patent/ATE352569T1/de active
- 1997-06-27 DE DE69737294T patent/DE69737294T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 EP EP06025342A patent/EP1762576B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 PL PL97330934A patent/PL188830B1/pl unknown
- 1997-06-27 IL IL12777497A patent/IL127774A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 AT AT06025342T patent/ATE420111T1/de active
- 1997-06-27 ES ES97932347T patent/ES2281104T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 CZ CZ20070841A patent/CZ301332B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 DK DK97932347T patent/DK0944392T3/da active
- 1997-06-27 PT PT97932347T patent/PT944392E/pt unknown
- 1997-06-27 KR KR1019980710920A patent/KR20000022480A/ko not_active Ceased
- 1997-06-27 PL PL97363607A patent/PL188874B1/pl unknown
- 1997-06-27 JP JP50433698A patent/JP4390855B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 WO PCT/US1997/011256 patent/WO1998000154A1/en not_active Ceased
- 1997-06-27 PL PL97363606A patent/PL188873B1/pl unknown
- 1997-06-27 CZ CZ0435698A patent/CZ300452B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-01-04 JP JP2008000174A patent/JP4588770B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-06-02 JP JP2009133123A patent/JP5245079B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4056614A (en) * | 1972-09-22 | 1977-11-01 | Marc Bonneau | Immunity depressant medicine |
| EP0097274A2 (en) * | 1982-06-17 | 1984-01-04 | Miles Inc. | Method for separating alpha-1-proteinase inhibitor from blood plasma fractions |
| US4656254A (en) * | 1985-12-02 | 1987-04-07 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor and antithrombin III |
| US4629567A (en) * | 1986-03-07 | 1986-12-16 | Smithkline-Rit | Alpha-1-antiprotease purification |
| JPS6317899A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-25 | Green Cross Corp:The | ハプトグロビンの精製方法 |
| EP0288841A2 (en) * | 1987-04-27 | 1988-11-02 | Miles Inc. | Method of preparing highly purified alpha-1-proteinase inhibitor |
| EP0698615A1 (en) * | 1994-08-24 | 1996-02-28 | Bayer Corporation | Purification of alpha-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4588770B2 (ja) | タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法 | |
| JP2008120822A6 (ja) | タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法 | |
| JP4324102B2 (ja) | フィブリノーゲンの調製方法 | |
| US6284874B1 (en) | Process for separating α1-proteinase inhibitor from cohn fraction IV1 and IV4 paste | |
| CA2538998C (en) | Large scale preparation of alpha-1 proteinase inhibitor and use thereof | |
| AU2004262578B2 (en) | Process for preparing an alpha-1-antitrypsin solution | |
| JP2012140452A (ja) | α−１プロテイナーゼインヒビター（ａ１ＰＩ）を精製するための方法 | |
| AU743904B2 (en) | Purification of proteins | |
| AU2004273696B2 (en) | Large scale preparation of alpha-1 proteinase inhibitor and use thereof | |
| MXPA06001112A (en) | Process for preparing an alpha-1-antitrypsin solution |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20170627 |