JPS63198868A - 電気泳動装置 - Google Patents

電気泳動装置

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JPS63198868A
JPS63198868A JP1236387A JP1236387A JPS63198868A JP S63198868 A JPS63198868 A JP S63198868A JP 1236387 A JP1236387 A JP 1236387A JP 1236387 A JP1236387 A JP 1236387A JP S63198868 A JPS63198868 A JP S63198868A
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秀記 神原
Tetsuo Nishikawa
哲夫 西川
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    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本装置はDNAの塩基配列決定装置あるいはDNAプロ
ーブなど蛍光標識DNA検出装置に関するものである。
〔従来の技術〕
従来、塩基配列の決定には放射性リン(32P )でD
NA断片を標識し、電気泳動分離後のパターンをオート
ラジオグラフィーで写真フィルムに転写する方式が用い
られていた。最近、紫外線励起の蛍光体や蛋白質の標識
に用いられるFITC(fluorpscein 1s
othiocyanate)、 TRITC(t6tr
amethyl rhodamin61sothioc
yanat6 ) 。
Texas Red (sulforhodamine
 101 )などの色素で核酸を標識し、紫外レーザー
あるいはアルゴンレーザ(488nm、514nm )
で標識DNAを励起して発する蛍光を検出する事で核酸
断片の検出を行なう方法が提案された。(Nature
l至1,674(1986)) 〔発明が解決しようとする問題点) このような蛍光標識によるDNA検出法の難点は十分な
検出感度が得られない点であった。すなわち、蛍光標識
DNAをゲル中に泳動させた後、あるいは泳動中に光を
照射してDNAを検出しようとすると蛍光標識DNAか
ら出る蛍光に加えて、ゲルから出る散乱光、蛍光が観測
されるためDNAから出る微弱な光を検出できない問題
があった。
本発明の目的は上記課題を克服し、高感度で蛍光標識D
NAを検出する事にある。
〔問題点を解決するための手段〕
上記目的は測定上妨害となるゲルからの蛍光の分光特性
の検討、原因の探究、および励起光源と蛍光色素の注意
深い選択により、励起光源の波長が54Qnm以上のレ
ーザーとして、ゲル蛍光を低減し、蛍光色素発光を相対
的に高める事により達成される。
〔作用〕
標識用蛍光体として用いられているエテノアデノシン、
FITC,TRITCおよび’I’eXaS Redの
最適励起波長および極大蛍光発光波長はそれぞれ、(3
00mm、4 Loim)、(490mm 。
520nm)、(550mm、580mm)、および(
580mm、605mm)である。これら色素の励起に
都合が良く、出力の比較的大きなレーザー光源として、
YAG(4倍波265nm)やAr(488mm、51
4.5mm)レーザーが用いられている。一方、ゲルか
らの発光は励起波長および発光波長によって大きく変化
する。第1図はゲル発光強度の励起光依存性を示したも
ので発光波長は各色素の発光波長と一致させである。す
なわち101は5201m、102は580 n m1
103は605mmの発光である。これから励起波長お
よび発光波長が長くなるにつれゲルからの発光が小さく
なる事がわかる。ゲルからの発光にはゲル素材中の不紳
物の発するものと、アクリルアミドが重合した墨により
生ずるものがある。後者は励起波長が短かいと大きいが
、波長が長くなるにつれ減少し、530〜540nm以
上の励起波長では非常に小さくなる。そこで励起光源と
して530〜54Qnm以上の波長を持つレーザーを用
い、発光波長が5QQnm前後あるいはそれ以上の発光
波長を持つ蛍光色素を用いてDNAを標識する事により
高感度でDNA断片を検出できる。
〔実施例〕
以下、本発明の一実施例を第2図により説明する。測定
装置は光源1、泳動分離器2、および検出器10からな
る。光源には543mm発振のHe −N eレーザー
(1mW)を用いた。泳動分離はポリアクリルアミド板
を用いた電気泳動で行なった。レーザー光はレンズで細
く絞られた後、泳動板の泳動始点から一定距離にある部
分を照射する。本実施例ではレーザー光はゲル平面に平
行な方向から、すなわちゲル側向からゲル中に入射して
いるが、レーザー光を斜め前方あるいは後方から入射さ
せスキャンさせることもできる0試料の調整は次のよう
に行なう。試料DNAの一端をTexas R6dある
いはTR,IT蛍光体で標識し、他端がアデニン塩基(
A)で終る柚々の長さの断片群(A)を作成する。同咋
に他端がG、C,あるいはTである断片群(G)、(C
1,および(Tlを作成する。すなわち、塩基配列を決
定しようとするDNA1mにつき4棟の断片群を作成す
る。これら断片群を別々のウェル3に注入し、電気泳動
を行なう。DNA断片は長いものほどゆっくり、短かい
ものは早く泳動するので図に示したようにバンド状に分
離され短かい断片から順次レーザー照射部に到達し、そ
こで蛍光を発する。
蛍光はフィルターを通過後、集光レンズを用いてイメー
ジ増幅器7上に蛍光像として結像され増幅された後にフ
ォトダイオードアレー8で検出されコンピー−ター12
で処理される。本実施例ではレーザー照射部分のab間
の領域が検出されるが、この領域をいくつもの泳動路が
交叉する。1つの泳動路に注目すると蛍光ラベルDNA
が照射ラインを通過する毎に蛍光信号が増加するので各
泳動路毎の信号の時間変化は図中14に示したようにな
る。泳動路毎に注入した断片群の種類(A、G。
C9あるいはT)は既知なので、時間と共に出現する信
号を順次読む挙1こより塩基配列が決定できる0 第3図は蛍光標識に用いられるFITCSTRITCお
よびTexas R6dの励起スペクトルである。試料
濃度はI Q n mole/ Iである。励起光源と
してFITC用には4881mアルゴンレーザー、TR
ITC用には543nmのHe −N eレーザー、T
exas R6d用には557nmのクリプトンレーザ
ーが最適である。これらを用いた時、発光強度はTex
as Red、FITC,TRITCの順である。F’
I T Cは溶媒のpHなどによっても強度が変化する
がほぼTexaa Redと同等と評価できる。しかし
、ゲルからの背景光強度で規格化した蛍光強度は大きく
異なる。第4図はゲル背景光を1とした時の各蛍光体の
強度を示したものである。蛍光体の濃度は1nrnol
e/lである。
543nm励起の’feXas Redから出る蛍光の
絶対量はFITCより少ないが、ゲル蛍光の量が少ない
(第1図参照)ため相対強度はFITCより大きくなり
高い感度が得られる事になる。He −Neレーザーは
アルゴンレーザーに比べて非常に安価であり、安価なレ
ーザーでより高感度が得られる。実際の検出限界は蛍光
の絶対強度にも依存する。蛍光強度が大きいとそのゆら
ぎも小さくなり、微量まで検出できる事になる。通常、
蛍光体からの発光信号は干渉フィルターを通して受光さ
れる。干渉フィルターは透過波長帯域が狭く、透過率も
低い。本実施例のようにArレーザー(通常10〜20
mWを使用)より出力の小さい543nmHe−Ne(
最高出力1 mW ) L/−ザーを用イる場合には受
光系を工夫し受光量をふやすことやフィルター設計を最
適にして蛍光の損失を防ぐ必要がある。本実施例では透
過波長帯域が広く、透過率モ高いバンドパスフィルター
を用いている。
バンドパスフィルターの透過帯の立ち上がりは急なほど
良いが、通常、透過率が0%となる波長と透過率が70
〜80%以上の透過帯の波長領域との波長差は20〜3
Qnm以上である。第4図を用いてフィルターの設計を
し、5951m 〜620nm′の領域を高透過率にし
、これより短および長波長側で急激に透過率が減衰する
フィルターを用いた。このフィルターでは570 nm
での透過率はほとんど0%である。光源にクリプトンレ
ーザー(568nm)を用いると更に高感度が得られる
が、受光系に入る散乱光を除去するため、色ガラスフィ
ルターをバンドパスフィルターと合わせて用いる必要が
ある。光源として570〜580nmに波長をセットし
た色素レーザーや銅蒸気レーザーあるいは半導体レーザ
ーなどを使用することもできる。
〔発明の効果〕
本発明によれば、ゲル発光の小さい波長領域での蛍光発
光を利用するので微量の蛍光ラベルDNAを高感度で検
出する事ができる。
【図面の簡単な説明】
第1図はゲルからでる蛍光強度の励起光依存−を示す特
性図、第2図は計測装置の概念図、第3図は各種色素の
励起スペクトル、第4図はゲル蛍光で規格化した色素蛍
光強度の発光波長依存性を示す特性図である。 1・・・レーザー、2・・・電気泳動ゲル、3・・・試
料注入ウェル、4・・・レーザー光路、5・・・ミラー
、6・・・レンズ、7・・・イメージ増幅器、8・・・
ダイオードアレー、9・・・フィルター、10・・・蛍
光受光系、11・・・泳動電源、12・・・コンピュー
ター、13・・・出力器機、14・・・データチャート
。 代理人 弁理士 小 川 勝 艷−゛ 嘱7面 、hg三に委 (へ弼) 猶λ図 厖起3z表 昆4面 燵光還蓑

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、蛍光標識されたDNA断片を分離検出する光検出型
    塩基配列決定装置において、少くともゲル電気泳動部、
    蛍光体励起用光源、および蛍光体検出器を具備し、励起
    光源の波長が540nm以上のレーザーである事を特徴
    とする光検出型塩基配列決定装置。 2、特許請求の範囲第1項記載の装置において、ゲル電
    気泳動部がポリアクリルアミドゲルにより構成されてい
    る事を特徴とする光検出型塩基配列決定装置。 3、特許請求の範囲第1項記載の装置において、励起光
    源が540nm以上の波長のHe−Neレーザー、クリ
    プトンレーザー、半導体レーザーあるいは色素レーザー
    である事を特徴とする光検出型塩基配列決定装置。 4、特許請求の範囲第1項記載の装置において蛍光受光
    系の最大透過帯が600nm以上であることを特徴とす
    る光検出型塩基配列決定装置。
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