JPS63198868A - 電気泳動装置 - Google Patents
電気泳動装置Info
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- JPS63198868A JPS63198868A JP1236387A JP1236387A JPS63198868A JP S63198868 A JPS63198868 A JP S63198868A JP 1236387 A JP1236387 A JP 1236387A JP 1236387 A JP1236387 A JP 1236387A JP S63198868 A JPS63198868 A JP S63198868A
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- Japan
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本装置はDNAの塩基配列決定装置あるいはDNAプロ
ーブなど蛍光標識DNA検出装置に関するものである。
ーブなど蛍光標識DNA検出装置に関するものである。
従来、塩基配列の決定には放射性リン(32P )でD
NA断片を標識し、電気泳動分離後のパターンをオート
ラジオグラフィーで写真フィルムに転写する方式が用い
られていた。最近、紫外線励起の蛍光体や蛋白質の標識
に用いられるFITC(fluorpscein 1s
othiocyanate)、 TRITC(t6tr
amethyl rhodamin61sothioc
yanat6 ) 。
NA断片を標識し、電気泳動分離後のパターンをオート
ラジオグラフィーで写真フィルムに転写する方式が用い
られていた。最近、紫外線励起の蛍光体や蛋白質の標識
に用いられるFITC(fluorpscein 1s
othiocyanate)、 TRITC(t6tr
amethyl rhodamin61sothioc
yanat6 ) 。
Texas Red (sulforhodamine
101 )などの色素で核酸を標識し、紫外レーザー
あるいはアルゴンレーザ(488nm、514nm )
で標識DNAを励起して発する蛍光を検出する事で核酸
断片の検出を行なう方法が提案された。(Nature
l至1,674(1986)) 〔発明が解決しようとする問題点) このような蛍光標識によるDNA検出法の難点は十分な
検出感度が得られない点であった。すなわち、蛍光標識
DNAをゲル中に泳動させた後、あるいは泳動中に光を
照射してDNAを検出しようとすると蛍光標識DNAか
ら出る蛍光に加えて、ゲルから出る散乱光、蛍光が観測
されるためDNAから出る微弱な光を検出できない問題
があった。
101 )などの色素で核酸を標識し、紫外レーザー
あるいはアルゴンレーザ(488nm、514nm )
で標識DNAを励起して発する蛍光を検出する事で核酸
断片の検出を行なう方法が提案された。(Nature
l至1,674(1986)) 〔発明が解決しようとする問題点) このような蛍光標識によるDNA検出法の難点は十分な
検出感度が得られない点であった。すなわち、蛍光標識
DNAをゲル中に泳動させた後、あるいは泳動中に光を
照射してDNAを検出しようとすると蛍光標識DNAか
ら出る蛍光に加えて、ゲルから出る散乱光、蛍光が観測
されるためDNAから出る微弱な光を検出できない問題
があった。
本発明の目的は上記課題を克服し、高感度で蛍光標識D
NAを検出する事にある。
NAを検出する事にある。
上記目的は測定上妨害となるゲルからの蛍光の分光特性
の検討、原因の探究、および励起光源と蛍光色素の注意
深い選択により、励起光源の波長が54Qnm以上のレ
ーザーとして、ゲル蛍光を低減し、蛍光色素発光を相対
的に高める事により達成される。
の検討、原因の探究、および励起光源と蛍光色素の注意
深い選択により、励起光源の波長が54Qnm以上のレ
ーザーとして、ゲル蛍光を低減し、蛍光色素発光を相対
的に高める事により達成される。
標識用蛍光体として用いられているエテノアデノシン、
FITC,TRITCおよび’I’eXaS Redの
最適励起波長および極大蛍光発光波長はそれぞれ、(3
00mm、4 Loim)、(490mm 。
FITC,TRITCおよび’I’eXaS Redの
最適励起波長および極大蛍光発光波長はそれぞれ、(3
00mm、4 Loim)、(490mm 。
520nm)、(550mm、580mm)、および(
580mm、605mm)である。これら色素の励起に
都合が良く、出力の比較的大きなレーザー光源として、
YAG(4倍波265nm)やAr(488mm、51
4.5mm)レーザーが用いられている。一方、ゲルか
らの発光は励起波長および発光波長によって大きく変化
する。第1図はゲル発光強度の励起光依存性を示したも
ので発光波長は各色素の発光波長と一致させである。す
なわち101は5201m、102は580 n m1
103は605mmの発光である。これから励起波長お
よび発光波長が長くなるにつれゲルからの発光が小さく
なる事がわかる。ゲルからの発光にはゲル素材中の不紳
物の発するものと、アクリルアミドが重合した墨により
生ずるものがある。後者は励起波長が短かいと大きいが
、波長が長くなるにつれ減少し、530〜540nm以
上の励起波長では非常に小さくなる。そこで励起光源と
して530〜54Qnm以上の波長を持つレーザーを用
い、発光波長が5QQnm前後あるいはそれ以上の発光
波長を持つ蛍光色素を用いてDNAを標識する事により
高感度でDNA断片を検出できる。
580mm、605mm)である。これら色素の励起に
都合が良く、出力の比較的大きなレーザー光源として、
YAG(4倍波265nm)やAr(488mm、51
4.5mm)レーザーが用いられている。一方、ゲルか
らの発光は励起波長および発光波長によって大きく変化
する。第1図はゲル発光強度の励起光依存性を示したも
ので発光波長は各色素の発光波長と一致させである。す
なわち101は5201m、102は580 n m1
103は605mmの発光である。これから励起波長お
よび発光波長が長くなるにつれゲルからの発光が小さく
なる事がわかる。ゲルからの発光にはゲル素材中の不紳
物の発するものと、アクリルアミドが重合した墨により
生ずるものがある。後者は励起波長が短かいと大きいが
、波長が長くなるにつれ減少し、530〜540nm以
上の励起波長では非常に小さくなる。そこで励起光源と
して530〜54Qnm以上の波長を持つレーザーを用
い、発光波長が5QQnm前後あるいはそれ以上の発光
波長を持つ蛍光色素を用いてDNAを標識する事により
高感度でDNA断片を検出できる。
以下、本発明の一実施例を第2図により説明する。測定
装置は光源1、泳動分離器2、および検出器10からな
る。光源には543mm発振のHe −N eレーザー
(1mW)を用いた。泳動分離はポリアクリルアミド板
を用いた電気泳動で行なった。レーザー光はレンズで細
く絞られた後、泳動板の泳動始点から一定距離にある部
分を照射する。本実施例ではレーザー光はゲル平面に平
行な方向から、すなわちゲル側向からゲル中に入射して
いるが、レーザー光を斜め前方あるいは後方から入射さ
せスキャンさせることもできる0試料の調整は次のよう
に行なう。試料DNAの一端をTexas R6dある
いはTR,IT蛍光体で標識し、他端がアデニン塩基(
A)で終る柚々の長さの断片群(A)を作成する。同咋
に他端がG、C,あるいはTである断片群(G)、(C
1,および(Tlを作成する。すなわち、塩基配列を決
定しようとするDNA1mにつき4棟の断片群を作成す
る。これら断片群を別々のウェル3に注入し、電気泳動
を行なう。DNA断片は長いものほどゆっくり、短かい
ものは早く泳動するので図に示したようにバンド状に分
離され短かい断片から順次レーザー照射部に到達し、そ
こで蛍光を発する。
装置は光源1、泳動分離器2、および検出器10からな
る。光源には543mm発振のHe −N eレーザー
(1mW)を用いた。泳動分離はポリアクリルアミド板
を用いた電気泳動で行なった。レーザー光はレンズで細
く絞られた後、泳動板の泳動始点から一定距離にある部
分を照射する。本実施例ではレーザー光はゲル平面に平
行な方向から、すなわちゲル側向からゲル中に入射して
いるが、レーザー光を斜め前方あるいは後方から入射さ
せスキャンさせることもできる0試料の調整は次のよう
に行なう。試料DNAの一端をTexas R6dある
いはTR,IT蛍光体で標識し、他端がアデニン塩基(
A)で終る柚々の長さの断片群(A)を作成する。同咋
に他端がG、C,あるいはTである断片群(G)、(C
1,および(Tlを作成する。すなわち、塩基配列を決
定しようとするDNA1mにつき4棟の断片群を作成す
る。これら断片群を別々のウェル3に注入し、電気泳動
を行なう。DNA断片は長いものほどゆっくり、短かい
ものは早く泳動するので図に示したようにバンド状に分
離され短かい断片から順次レーザー照射部に到達し、そ
こで蛍光を発する。
蛍光はフィルターを通過後、集光レンズを用いてイメー
ジ増幅器7上に蛍光像として結像され増幅された後にフ
ォトダイオードアレー8で検出されコンピー−ター12
で処理される。本実施例ではレーザー照射部分のab間
の領域が検出されるが、この領域をいくつもの泳動路が
交叉する。1つの泳動路に注目すると蛍光ラベルDNA
が照射ラインを通過する毎に蛍光信号が増加するので各
泳動路毎の信号の時間変化は図中14に示したようにな
る。泳動路毎に注入した断片群の種類(A、G。
ジ増幅器7上に蛍光像として結像され増幅された後にフ
ォトダイオードアレー8で検出されコンピー−ター12
で処理される。本実施例ではレーザー照射部分のab間
の領域が検出されるが、この領域をいくつもの泳動路が
交叉する。1つの泳動路に注目すると蛍光ラベルDNA
が照射ラインを通過する毎に蛍光信号が増加するので各
泳動路毎の信号の時間変化は図中14に示したようにな
る。泳動路毎に注入した断片群の種類(A、G。
C9あるいはT)は既知なので、時間と共に出現する信
号を順次読む挙1こより塩基配列が決定できる0 第3図は蛍光標識に用いられるFITCSTRITCお
よびTexas R6dの励起スペクトルである。試料
濃度はI Q n mole/ Iである。励起光源と
してFITC用には4881mアルゴンレーザー、TR
ITC用には543nmのHe −N eレーザー、T
exas R6d用には557nmのクリプトンレーザ
ーが最適である。これらを用いた時、発光強度はTex
as Red、FITC,TRITCの順である。F’
I T Cは溶媒のpHなどによっても強度が変化する
がほぼTexaa Redと同等と評価できる。しかし
、ゲルからの背景光強度で規格化した蛍光強度は大きく
異なる。第4図はゲル背景光を1とした時の各蛍光体の
強度を示したものである。蛍光体の濃度は1nrnol
e/lである。
号を順次読む挙1こより塩基配列が決定できる0 第3図は蛍光標識に用いられるFITCSTRITCお
よびTexas R6dの励起スペクトルである。試料
濃度はI Q n mole/ Iである。励起光源と
してFITC用には4881mアルゴンレーザー、TR
ITC用には543nmのHe −N eレーザー、T
exas R6d用には557nmのクリプトンレーザ
ーが最適である。これらを用いた時、発光強度はTex
as Red、FITC,TRITCの順である。F’
I T Cは溶媒のpHなどによっても強度が変化する
がほぼTexaa Redと同等と評価できる。しかし
、ゲルからの背景光強度で規格化した蛍光強度は大きく
異なる。第4図はゲル背景光を1とした時の各蛍光体の
強度を示したものである。蛍光体の濃度は1nrnol
e/lである。
543nm励起の’feXas Redから出る蛍光の
絶対量はFITCより少ないが、ゲル蛍光の量が少ない
(第1図参照)ため相対強度はFITCより大きくなり
高い感度が得られる事になる。He −Neレーザーは
アルゴンレーザーに比べて非常に安価であり、安価なレ
ーザーでより高感度が得られる。実際の検出限界は蛍光
の絶対強度にも依存する。蛍光強度が大きいとそのゆら
ぎも小さくなり、微量まで検出できる事になる。通常、
蛍光体からの発光信号は干渉フィルターを通して受光さ
れる。干渉フィルターは透過波長帯域が狭く、透過率も
低い。本実施例のようにArレーザー(通常10〜20
mWを使用)より出力の小さい543nmHe−Ne(
最高出力1 mW ) L/−ザーを用イる場合には受
光系を工夫し受光量をふやすことやフィルター設計を最
適にして蛍光の損失を防ぐ必要がある。本実施例では透
過波長帯域が広く、透過率モ高いバンドパスフィルター
を用いている。
絶対量はFITCより少ないが、ゲル蛍光の量が少ない
(第1図参照)ため相対強度はFITCより大きくなり
高い感度が得られる事になる。He −Neレーザーは
アルゴンレーザーに比べて非常に安価であり、安価なレ
ーザーでより高感度が得られる。実際の検出限界は蛍光
の絶対強度にも依存する。蛍光強度が大きいとそのゆら
ぎも小さくなり、微量まで検出できる事になる。通常、
蛍光体からの発光信号は干渉フィルターを通して受光さ
れる。干渉フィルターは透過波長帯域が狭く、透過率も
低い。本実施例のようにArレーザー(通常10〜20
mWを使用)より出力の小さい543nmHe−Ne(
最高出力1 mW ) L/−ザーを用イる場合には受
光系を工夫し受光量をふやすことやフィルター設計を最
適にして蛍光の損失を防ぐ必要がある。本実施例では透
過波長帯域が広く、透過率モ高いバンドパスフィルター
を用いている。
バンドパスフィルターの透過帯の立ち上がりは急なほど
良いが、通常、透過率が0%となる波長と透過率が70
〜80%以上の透過帯の波長領域との波長差は20〜3
Qnm以上である。第4図を用いてフィルターの設計を
し、5951m 〜620nm′の領域を高透過率にし
、これより短および長波長側で急激に透過率が減衰する
フィルターを用いた。このフィルターでは570 nm
での透過率はほとんど0%である。光源にクリプトンレ
ーザー(568nm)を用いると更に高感度が得られる
が、受光系に入る散乱光を除去するため、色ガラスフィ
ルターをバンドパスフィルターと合わせて用いる必要が
ある。光源として570〜580nmに波長をセットし
た色素レーザーや銅蒸気レーザーあるいは半導体レーザ
ーなどを使用することもできる。
良いが、通常、透過率が0%となる波長と透過率が70
〜80%以上の透過帯の波長領域との波長差は20〜3
Qnm以上である。第4図を用いてフィルターの設計を
し、5951m 〜620nm′の領域を高透過率にし
、これより短および長波長側で急激に透過率が減衰する
フィルターを用いた。このフィルターでは570 nm
での透過率はほとんど0%である。光源にクリプトンレ
ーザー(568nm)を用いると更に高感度が得られる
が、受光系に入る散乱光を除去するため、色ガラスフィ
ルターをバンドパスフィルターと合わせて用いる必要が
ある。光源として570〜580nmに波長をセットし
た色素レーザーや銅蒸気レーザーあるいは半導体レーザ
ーなどを使用することもできる。
本発明によれば、ゲル発光の小さい波長領域での蛍光発
光を利用するので微量の蛍光ラベルDNAを高感度で検
出する事ができる。
光を利用するので微量の蛍光ラベルDNAを高感度で検
出する事ができる。
第1図はゲルからでる蛍光強度の励起光依存−を示す特
性図、第2図は計測装置の概念図、第3図は各種色素の
励起スペクトル、第4図はゲル蛍光で規格化した色素蛍
光強度の発光波長依存性を示す特性図である。 1・・・レーザー、2・・・電気泳動ゲル、3・・・試
料注入ウェル、4・・・レーザー光路、5・・・ミラー
、6・・・レンズ、7・・・イメージ増幅器、8・・・
ダイオードアレー、9・・・フィルター、10・・・蛍
光受光系、11・・・泳動電源、12・・・コンピュー
ター、13・・・出力器機、14・・・データチャート
。 代理人 弁理士 小 川 勝 艷−゛ 嘱7面 、hg三に委 (へ弼) 猶λ図 厖起3z表 昆4面 燵光還蓑
性図、第2図は計測装置の概念図、第3図は各種色素の
励起スペクトル、第4図はゲル蛍光で規格化した色素蛍
光強度の発光波長依存性を示す特性図である。 1・・・レーザー、2・・・電気泳動ゲル、3・・・試
料注入ウェル、4・・・レーザー光路、5・・・ミラー
、6・・・レンズ、7・・・イメージ増幅器、8・・・
ダイオードアレー、9・・・フィルター、10・・・蛍
光受光系、11・・・泳動電源、12・・・コンピュー
ター、13・・・出力器機、14・・・データチャート
。 代理人 弁理士 小 川 勝 艷−゛ 嘱7面 、hg三に委 (へ弼) 猶λ図 厖起3z表 昆4面 燵光還蓑
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、蛍光標識されたDNA断片を分離検出する光検出型
塩基配列決定装置において、少くともゲル電気泳動部、
蛍光体励起用光源、および蛍光体検出器を具備し、励起
光源の波長が540nm以上のレーザーである事を特徴
とする光検出型塩基配列決定装置。 2、特許請求の範囲第1項記載の装置において、ゲル電
気泳動部がポリアクリルアミドゲルにより構成されてい
る事を特徴とする光検出型塩基配列決定装置。 3、特許請求の範囲第1項記載の装置において、励起光
源が540nm以上の波長のHe−Neレーザー、クリ
プトンレーザー、半導体レーザーあるいは色素レーザー
である事を特徴とする光検出型塩基配列決定装置。 4、特許請求の範囲第1項記載の装置において蛍光受光
系の最大透過帯が600nm以上であることを特徴とす
る光検出型塩基配列決定装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62012363A JP2594925B2 (ja) | 1987-01-23 | 1987-01-23 | 電気泳動装置 |
| EP19870117976 EP0275440B1 (en) | 1987-01-23 | 1987-12-04 | Photo detection system for dna base analysis |
| DE19873787521 DE3787521T2 (de) | 1987-01-23 | 1987-12-04 | Photodetektionssystem für die DNA-Basen-Analyse. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62012363A JP2594925B2 (ja) | 1987-01-23 | 1987-01-23 | 電気泳動装置 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8170883A Division JP2661606B2 (ja) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | 電気泳動装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63198868A true JPS63198868A (ja) | 1988-08-17 |
| JP2594925B2 JP2594925B2 (ja) | 1997-03-26 |
Family
ID=11803188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62012363A Expired - Lifetime JP2594925B2 (ja) | 1987-01-23 | 1987-01-23 | 電気泳動装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0275440B1 (ja) |
| JP (1) | JP2594925B2 (ja) |
| DE (1) | DE3787521T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06502912A (ja) * | 1990-06-21 | 1994-03-31 | アクシス バイオケミカルズ エイエス | アナライト変異体分析 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4591550A (en) * | 1984-03-01 | 1986-05-27 | Molecular Devices Corporation | Device having photoresponsive electrode for determining analytes including ligands and antibodies |
| JP2814408B2 (ja) * | 1990-05-22 | 1998-10-22 | 日立ソフトウェアエンジニアリング 株式会社 | 蛍光パターン読み取り装置および蛍光パターン読み取り方法 |
| EP0626578B1 (en) * | 1993-05-26 | 1998-07-29 | Hitachi Electronics Engineering Co., Ltd. | Apparatus for gel electrophoresis |
| SE9404274D0 (sv) * | 1994-12-08 | 1994-12-08 | Pharmacia Biotech Ab | Anordning vid en gelelektroforesapparat |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60220860A (ja) * | 1984-01-16 | 1985-11-05 | カリフオルニア・インステイテユ−ト・オブ・テクノロジ− | オリゴヌクレオチドの分析法 |
| JPS6188155A (ja) * | 1984-08-14 | 1986-05-06 | オ−ソ・ダイアグノステイツク・システムズ・インコ−ポレ−テツド | フイコビリタンパク質による螢光エネルギ−転位 |
| JPS61173158A (ja) * | 1985-01-02 | 1986-08-04 | カリフオルニア・インステイテユ−ト・オブ・テクノロジ− | Dna配列決定法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4239612A (en) * | 1979-02-28 | 1980-12-16 | Pen Kem, Inc. | Automatic electrophoresis apparatus |
-
1987
- 1987-01-23 JP JP62012363A patent/JP2594925B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-04 EP EP19870117976 patent/EP0275440B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-04 DE DE19873787521 patent/DE3787521T2/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
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| JPS60220860A (ja) * | 1984-01-16 | 1985-11-05 | カリフオルニア・インステイテユ−ト・オブ・テクノロジ− | オリゴヌクレオチドの分析法 |
| JPS6188155A (ja) * | 1984-08-14 | 1986-05-06 | オ−ソ・ダイアグノステイツク・システムズ・インコ−ポレ−テツド | フイコビリタンパク質による螢光エネルギ−転位 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3787521D1 (de) | 1993-10-28 |
| EP0275440B1 (en) | 1993-09-22 |
| DE3787521T2 (de) | 1994-05-11 |
| JP2594925B2 (ja) | 1997-03-26 |
| EP0275440A3 (en) | 1990-04-04 |
| EP0275440A2 (en) | 1988-07-27 |
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