JPS6188155A - フイコビリタンパク質による螢光エネルギ−転位 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に、可溶性物質又はアナライト（αｎａｌ
ｙｔｅｓ　）　、たとえば抗原を検出するためのイムノ
アッセイ法に有用々検出可能な標識に関し、更に特定的
には、エネルギー転位に基づき且つフィコビリタンパク
質（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ　）を使用す
る蛍光梓識（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　１ａｂｅｌｓ　
）に関する。

たとえば、血液、痰（ｓｐｕｔｕｍ）、尿等の如き体液
中の特異抗原（５ｐｅｃｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎｓ
　）（動物に導入するとそれと特異的に反応することが
できる抗体の生産を刺激する物質として定数された）、
ハプテン（動物に導入する前に追加の補助物質を必要と
する物質であってそれに対して特異的な抗体の生産を刺
激する物質）、アナライト及び同様な物質（以後総括し
てリガンドと呼ぶ）の検出は研究及び臨床環境において
極度に重要になってきた。リガンド、特に抗原及びそれ
に対する特異的抗体の検出はしばしば種々の病状に関連
しており、従って、診断及び病気の発生に関する基本的
理解を得ること及びその治療の効果を監視　　。

することにおいて非常に有用である。

ｒ是として、水性試料中のりがンドを検出するための改
良された方法は絶えず餘索されている。

本発明の目的は、一般に、かかるイムノアッセイ法と共
に使用するための改良されそして新規な検出可能な標識
を提供することによってかかるイムノアッセイ法を改良
することである。

イムノアッセイは、一般に、タンノ（り質、たとえば抗
体、抗体フラグメント（ａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇ−ｍ
ｅｎｔｓ）又は人工的に発生したペプチド〔以後県約的
にリガンド結合）ぐ−トナー（ｌｉｇａｎｄ　ｂｉｎｄ
−ｉｎｇ　ｐａｒｔｎｃｒｓ　）と呼ぶ〕と一般にリガ
ンドと本明紀書中では呼んでいる、それらに対して特異
的な物質との間の免疫反応に基づいている。免疫反応は
一般にそれらの高い特異性によって特許づけられ、従っ
てこの特性を利用するために多くの案が開発された。典
型的には、かかる案は測定されるべきリガンドと競合す
る精製されたリガンド並びに標識されそして固定化抗体
又はリガンド結合パートナ−１又はそれら自身とリガン
ドとの間で反応性である多重の固定化されそして標識さ
れたリガンド結合／セートナーを必要とする。これらの
方法はすべて一様に関連した標識の検出性に頼っている
。

検出の感度は使用される標識の種類並びにそれを検出す
るのに利用できる装置の品質及びＲ’ＡＥに関係してい
る。たとえば同位体は、現在の工学的能力が単一同位体
原子の検出を許容するので高い水準の感度を与えるもの
と従来から認識されてたが、それにもかかわらず放射性
同位体によす課される固有の健康上の危険により非常に
不評である。

更に、注意深い取扱い及び同位体試薬の陥棄により、必
要とされる操作上の困すはより良い標識の研究を刺激し
た。

この理由で、２つの種類の標識、即ち蛍光分子及び酵素
が近年非常に好評を得るに到った。酵素は、酵素の連続
的な又は持続性の化学的活性特性による生物学的増幅系
（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｍｐｌｉｆｉ−ｃａｔｉｏ
ｎ　ｓｙｓｔｅｍ）を有利に提供し、それにより基質は
検出可能な生成物に転換される。かくして酵素は、実際
には間接的標識である。何故力らば、検出されるのは酵
素活性の生成物であって、酵素それ自体ではないからで
ある。しかしながら、かかる酵素又は酵素結合免疫吸着
剤アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ　　１ｉｎｋｅｄ　ｉｗｎ、
ｕｎｏｓｏｒｂαｎｔ　α８８αＵＳ）（いわゆるＥＬ
ＩＳＡ系）は、得られる生成物への転化及び得られる生
成物の検出のために好適な午件下の基質を提供するため
に、余分の工程及び試薬を必夷゛とする点で不利である
。

蛍光分子（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｍｏｌｅｃｖ、ｌ
ｅｓ　）は、酵素の増幅の利点を提供しないけれども、
一般に、それらの検出及び関連した方法に必要な装置が
簡単であることＫより好都合であることが見出された。

蛍光分子は適当な周波数で押開されることのみが必要で
あり、そして得られる発光スペクトルは３’ｆ’ａ３な
発光スペクトル領域における感度を有する光検出器又は
同様なものにより検出される。

実際には、たとえばオルトスペクトルＴＩ！Ｔ　（０ｒ
−ｔｈｏ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　■）　（本発明の譲受人
から入手可能である）を含む多数の機器は蛍光性に標識
された抗体を使用して、照明ゾーンを通ってシングルフ
ァイル（ｓｉｎｇｌｅ　ｆｉｌｅ　）を違チするように
流体力学的に集中されている（　ｆｏｒ３ｓｅｔ　）セ
ル上の抗原性マーカ（ａ？Ｌｔｉｇｅｎｉｃ　ｎｗｒｋ
ｅｒｓ　）の存在を検出する。スペクトル的に特異的な
照明は適当な位置に配列された光検出器により検出され
るレーザ及び蛍光発光により有利に与えられる。事実、
種々の波長の蛍光発光を提供する多数の蛍光染料が見出
されておりそして開業的に入手可能である。

非常に多数の蛍光染料が入手可能であるにもかかわらず
、長彼長、即ち、赤色スペクトルにおいて励起されそし
て発光される分子が相対的に欠如している。このような
特性は、これらの波長が他の生物学的分子からの天然の
蛍光を排除してより容易に検出することができる故に望
ましい。かかる天然の蛍光は他の場合には、蛍光性標繊
からの所望の信号をしばしばマスクするバックグラウン
ド信号を生じ、それにより感度を似下させる。

更に、大抵の蛍光分子は典型的には、紫外線ａ域（テ近
い発光スペクトルを有しており、それによってアルゴン
レーザ等の如き相対的に高価な光源を必要とする。容易
に認められ得る通り、計測操業（１ｎｓｔｒｕｒｎ、ｅ
ｎｔａｔｉｏｎ　）の追加される複雑性及び価格（−１
１特１でＤＲＧ規制〔診断関連群（Ｄｉαｇ−ｎｏｓｉ
ｓ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｇｒａｓｐ）規制〕等により評さ
れる最近の財政上の圧迫に鑑みると、臨床検査室及び病
院のそれらの入手可能性を減少させる。

かくして本発明の目的は、ヘリウムネオンレーザの如き
相対的に安価な光跡により励起され得る蛍光標識を提供
することである。

オイ（Ｏｉ）”Ｊｕ、ザソヤーナルオプセルバイオロソ
ー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、９３：９８１−９８６（１９８２）におい
て“細胞及び分子の分析のための蛍光性フィコビリタン
パク質コンツユｌｆイトｎ（Ｆｔ１Ｌｏｒｅｓｃｅｎｔ
　ｐｈｙｃｏ−ｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅｓ　Ｆｏｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＣｅｌｌ　
ａｎｔｉ　ＡｆｏｔｅｃｕＬｅｓ　”　）　　と題する
論文において、ｆ３赤色スペクトル頌域において蛍光発
光を有する新らしい種類の染料の合成を記載している。

これらの蛍光性分子又はフィコビリタンパク質は様様な
種の藻類から導かれる。かかるフィコビリタンＡり質は
所望の波長の付近の波長において比較的高い効率を有利
に示す。オイにより述べられた染料試薬は、両方共フィ
コビリタンパク質である２種類の異なる蛍光性分子間の
エネルギー転位に基づいており、不利に大きい分子をも
たらす。

蛍光エネルギー転位（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｎ
ｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ　）は、その１つが供与体で
あるとみなされそして他が一般に受容体と呼ばれる２２
Ｑｎの分子間で時々起こるプロセスである。典型的には
、供与体分子は１つの波長（実際には好ましくは入手可
能な照明スペクトルのピークにあるように選ばれたピー
ク又は最適波長を有する波長のベル形状スペクトル）の
エネルギーにより励起され、そして典型的な発蛍光団の
蛍光エネルギー発光曲線とよく似た蛍光エネルギー発光
曲線を示す。受容体分子は、好ましくは、その励起スペ
クトルの重要力部分が供与体分子の発光波長スペクトル
内に入るように、好ましくは適当な励起波長を有するよ
うに選ばれる。最適条件下では、供与体ピーク発光波長
は受容体ピーク励起波長にほぼ等しいであろう。供与体
分子からのエネルギー転位機構による受容体分子による
エネルギーの受入れは供与体分子の見かけの減少した蛍
光をもたらす。受容体分子は発色団、即ち、固有の蛍光
を示さない分子であることができるが、好ましくは、エ
ネルギー転位と共に増加するそれ自身の特性的蛍光発光
スペクトルを有する蛍光分子である。

真の蛍光エネルギー転位対におけるエネルギー転位は、
双極子−双極子エネルギー転位プロセスにより起こシ、
その効率は供与体分子と受容体分子との間の距離の逆６
乗（１ｎｖｅｒｓｅ　ｔ、　ｔｈ　ｐｏｗ−ｅｒ）と共
に変わる。かくして、蛍光エネルギー発光における変化
は、受容体分子及び供与体分子又はそれらが結合してい
る分子間の近接関係（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　ｒｅｌａｔ
ｉｏｎ　５ｈｉｐｓ　）を決定するのに使用することが
できる。更に、フォースターの理論（Ｆｏｒｓｔｇｒ’
ｓ　ｔｈｅｏｒｙ　）に従う、双極子−双極子エネルギ
ー転位プロセスは転位効率に影響する配向成分（ｏｒｉ
ｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｔｎｐｏｎｅｎｔｓ　）も有す
る。これらの及び他の蛍光エネルギー転位考Ｕ　Ｉｄ　
、アニュアルズ　レビュー　バイオケム（Ａｎｎｒｂａ
ｌｓ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　）　、　＋　　
４７　：　８１９−８４６　（１９７８）における、“
分光ルーラ−とじての蛍光エネルギー転位”（”　Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＥｒｙｔｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ　ａｓ　ａ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃＲｕｌｅｒ
”）と題するルバートストリア−（Ｌｕｂｅ−ｒｔ　５
ｔｒｙｅｒ　）により書かれた普通の参考文献に記載さ
れた。

蛍光エネルギー転位のこの距離感受性の観点は米国特許
第４．１９９．５５９号、第３．９９６，３４５号、第
４．１７４．３８４号及び第４，２６１，９６８号にお
いてウル〜ン（Ｕｌ　１ｍαｎ）’！ｄり標識技術とし
て使用された。ウルマンは、蛍光剤分子が特定の波長の
光により励起されそしてより長い波長の蛍光を発するよ
うな分子の蛍光剤−消光剤対（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ−
ｑｗｅｎｃｈｅｒ　ｐａｉｒ　）の使用を教示している
。しかしながら、蛍光剤に極めて近接している非蛍光性
消光剤分子の存在はこの蛍光の消光をもたらし、それに
より測定可能な蛍光の総合的減少に寄与する。従って、
ウルマンのアッセイは、検出されるべきりがンドとの特
異的且つ同時的免疫学的反応のだめの、蛍光剤分子又は
消光剤分子で標識された２つの異なる抗体を使用する。

これらの方法は、多重抗体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｎｔ
ｉｂｏ−ｄｉｅｓ　）の結合のための必要な多重の結合
部位（ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅｓ　）を与えるために
、性質において多価であるリガンドを必要とする。これ
らの方法は蛍光エネルギ一対の２つのメンバーが別の試
薬の一部であることも必要とする。

これに替って、−価リガントの場合には、ウルマンはり
ｆｆ７Ｙ類似体（ｌｉｇａｎｄ−ａｎａｌｏｇ　）であ
って、その実質的部分は、リガンドと同じ空間的及び極
性構成を有していて受容体又は抗体の結合部位に対して
りがンドと競合することができる１つ又はそれより多く
の決定基又はエピトープ部位（ｅｐｉｔｏｐｉｃ　５ｉ
ｔｅｓ　）を規定するところのリガンド類似体の使用を
教示している。リガンド類似体は結合部位における原子
又は官能基の不存在又はリガンド中に始めから存在して
いる１つ又：伐それより多くの原子の代わりに導入され
たリンキング基（ｌｉｎｋｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　）を有
するという点テリガントとは異なる。そうすると、典型
的には、このリガンド類似体は蛍光剤又は消光剤分子の
何れかで標識されそして蛍光剤−消光剤対の他の分子で
標識されている抗体上の結合部位に対して試料のリガン
ドと競合する。この方式においては、リガンドの濃度を
増加させることは抗体結合部位に対してより有効に競合
し、それにより標識されたリガンド類似体を追い出しそ
してそうでなければそれらが寄与するでちろう蛍光消光
の量を減少させることが期待され得る。

ウルマンのアッセイは、検出されるべきリガンド又はア
ナライトの多価性を必要とするのが不才１ｊであり、又
はりがンドと競合するのに精製された損傷のない（１ｎ
ｔａｃｔ　）　リガンド類似体の製造を必要とするのが
不利である。経験によれば、かかる物質の製造は一般に
不利で、困ｔ！、「で、時間を消費しそして費用のかか
る提案であることが証明された。いずれにせよ、蛍光剤
−消光剤対の分子は免疫学的成分の不存在下においては
分かれている（　５ｅｐａ、ｒａｔｅ　）。

本発明の更に他の目的は、少なくとも２つの蛍光団であ
って、その１つは励起すると、第２の蛍光団を励起する
ことができる発光スペクトルを示１／、２ｕ　２蛍光団
は測定により検出可能で且つ第１の発ゾ１−スペクトル
とけ区別することができる発光を示しそして該蛍光団の
１つはフィコビリタンツク質である、少なくとも２つの
蛍光団を使用することである。

本発明の更に他の目的は、恒久的に相互に結合した（　
ｐｅｒｔｎｔｘｎｅｕｔｌｙ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｔｏｇ
ｅｔｉｂｅｒ　）蛍光エネルギー転位対の個々のメンバ
ーを有する標識であって該メンバーの１つはフィコピリ
タンノぐり質である標齢を提供することによって４１　
Ｒ技術を簡単にすることである。

蛍光エネルギー転位対のスペクトル的に近接した励起及
び発光スペクトルと関連した問題を認識したので、検出
の感度を増加するために発光周波数と励起周波数との間
のスペクトル差又はス）　−クスシフト（５ｔｏｋｅｓ
　５ｈｉｆｔ　）を増加するのに追加の方法が探索され
た。バイオフイソツクスソヤーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃｓ　Ｊｏｕｒｎａｌ　）　４３　：　３８３（１９８
３）においてグレーザー（Ｇｔａｚｅｒ　）及びストリ
アー（５ｔｒｙｅｒ　）は２つのフィコビリタンパク質
、即ちフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙ−ｔｈｒｉ
ｎ）及びアｏフィコシア＝：ｙ　（ａＬｌｏｐｈｙｃｏ
−ｃｙａ引ｎｅ）　　間の蛍光エネルギー転位を達成す
るために該２つのフィコビリタンパク質の共有結合（ｃ
ｏｖａｌｅｎｔ　ｌｉｎｋａｇｅ　）を述べている。か
くして１つの周阪数における発光はエネルギー転位及び
より大きい周波数における励起をもたらし、それにより
有意なストークスシフトを得る。しかしながら、グレザ
ー等の系は、上記コンジュケ゛イト（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ　）の約１対１のタンパク質対タンパク質結合比（ｐ
ｒｏｔｅｉｎ−ｔｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏ１Ｌｐｌｉ
ｎｇτａｔｉｏ）をもたらし、それによシ有用なストー
クスシフトを伴なうが効率の増加を殆んど生じないか又
は全然生じない。更に、フィコビリタンパク質は大きい
分子（１０５ダルトンのオーダー）である傾向があ沙、
そして２つのこのような大きい分子を結合することによ
って、種々のイムノアッセイ用途に実際に使用するのが
非常に困難である過度に大きい分子が導かれる。得られ
る標識は犬を揺する尾とでも比楡的に表現することがで
きる、免疫学的成分を児全に立体妨害する程に太きい。

結果として、本発明の更に他の目的は大きいストークス
シフトとカップリングしたより大きい効率を有するが、
多重フィコビリタンパク質（ｍｒｂｌｔｉｐｌｅ　ｐｈ
ｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ　）を使用しないフィ
コビリタンパク質をベースとする標識を提供することで
ある。

更に他の関連した目的は、蛍光エネルギー転位機構を使
用して、前記した効率増加及びストークスシフトを得る
が、１対１タンノ々り質対タンパク質結合比により生じ
るグレイザー及びストリアーの欠点を回避することであ
る。

本発明の原理及び目的に従えば、フィコビリタンパク質
の蛍光発光効率を増加させるのに蛍光エネルギー転位機
構を使用するイムノアッセイ用途に有用な蛍光標識が提
供される。これは少なくとも１つの、最も好ましい態様
においては、複数の有機染料分子を、エネルギー転位機
構が作用することを可能とするような方法でフィコビリ
タンパク質に共有結合させる（　ｃｏｖａＬｔｔｎｔＬ
ｙ　ｌｉｎｋｉｎｇ　）ことによって有利に達成される
。

かくして、理想的には、有様染料分子スペクトル周波数
の励起周波数における標識の照明はエネルギー転位機構
を介してそのエネルギーの少なくともいくらかのフィコ
ビリタンパク質への転位をもたらし、それによりもとの
励起周波数とフィコビリタン／Ｊり質発光周波数との間
のストークスシフトを達成する。複数の、好ましくは小
さい分子量の有機染料分子の存在は、フィコビリタンパ
クηそれ自体と比較してフィコビリタンパク質の蛍光効
率を増加する。

本発明の最も好ましい態様においては、蛍光標識はアロ
フィコシアニンに共有結合した（　ｃｏｖａ−１ｅｎｔ
ｌｙ　ｃｏｕｐｌｅｄ　）　　複数のアズ−／ｌ／　Ａ
　（ＡｚｒｔｒｅＡ）有機染料分子を含有して成る。

検出される蛍光信号における非特異的ノイズ成分をＰｌ
、／ｐするという所望に従って、本発明は、非特異的蛍
光ノイズ成分が自然に減少するところの、遠赤外又は近
赤外スペクトル領域において発光するフィコビリタンパ
ク＠受容体分子を使用する。

感度を最適化しそして高めるために、本発明は、エネル
ギー転位機構を介して大きいストークスシフトを達成す
るのに好適な補助分子と共にフィコビリタンツク質を含
有して成る標識も提供する。

かくして、励起周波数と発光周波数との間の減少したス
ペクトルオーバーラツプは、発光周波数の検出期間中ス
４クトルフィルタにより励起周波数の便利なスペクトル
排除（５ｐｅｃｔｒａｌ　　ｅｌｉｔｎｉｎａ−ｔｉｏ
ｎ）を高める。

かかるスト４クスシフトはフィコビリタンパク質をオイ
又はグレーザー等刊行物における如く他のフィコピリタ
ンノぐり質とではなくて、好ましくは小さい低分子量の
有機分子と結合させることによってフィコビリタンパク
質を用いてテ＊成され得ることが本発明者により発見さ
れた。フィコビリタンパク質分子の相対的に大きい寸法
のため、？多数の小さい有機染料がそれに結合している
のが好ましく、該有機染料の各々は蛍光エネルギーｉ、
：１４１（、′）を介してフィコピリタン）Ｅり質への
エネルギートで寄与し、それにより蛍光効率ケ増加させ
ることができる。予期される如く、より高い蛍光効率は
より低い標識邊匹での検出、従ってより高い感度を可能
とする。

小さい有機分子は、約１００乃至１０００グルトンの範
囲の分子量を有し、それにより得られる標識の寸法又は
重量を不必要に増加することなくフィコビリタンパク質
に多数のこのような分子の結合を許容するのが好ましい
。蛍光エネルギー転位機構の効果を更に高めるために、
好まし７い標識は、理惣的には、前記分光ルーラの論文
においてストリアーにより記載された考察に従って、有
機染料分子とフィコビリタンパク質との間の矩貴！を注
意深く調節することによってエネルギー転位を最適化す
るよう外方法で、フィコビリタンパク質に共有結合した
有機染料分子を有するであろう。

得られる標識は、試験されるべき成分及び行なわれるべ
きアッセイの種類（競合的、非競合的等）に依存して所
望に応じてリガンド又はリガンド受容体の如き適当な試
薬に標識を結合する工程のみを残して、非常に多様な種
類のイムノアッセイに使用することができる。実際の結
合方法は、前記オイ等の論文に記載されており、又は他
の種類の普通の周知の結合方法を使用することができる
。

追加の指示は添付実施例を参照して得ることができる。

容易に認められる如く有機染料分子は、最も望ましい又
は入手可能な照明源に極めて適合する励起周波数スペク
トルを与えるように好ましくは選ばれる。更に、それら
の間のエネルギー転位を最大にするために、選ばれたフ
ィコビリタンパク質の励起スペクトルに好ましくは極め
て近接して、即ち好ましくけ５ｎｍより少ない差で適合
する発光スペクトルを考慮するようにも選択がなされな
ければならない。

多分最も信頼性があり且つ経済的な高強度照明源はヘリ
ウム−ネオン（Ｈｅ−Ｈｅ）レーザーである。従って、
本発明の標証の最も好ましい態様は、フィコピリタンノ
ぐり質アロフィコシアニンに共有結合した小さい分子量
の有機染料、アズールＡ　（Ａｚｕｔｔｔ　Ａ　）、を
使用する。アズールＡは約６３２？ＺｒＩ′Ｌの励起周
波数を有し、従って約６３２．８ｎｍで発光するＨ　ｅ
　−Ｎ　ｅレーザーのスペクトル発光にきわめて適合す
る。更に、ｔ５４５ｎｍにおけるアズールＡの発光ピー
クは、アロフィコシアニンの励起ピークに密接に対応し
ている。検出は、適当にろ波された光電子増倍管又は他
の感光性デバイスを介して６５５ｎｍにピークを有する
アロフィコシアニンの発光を検出することにより達成さ
れる。かくして、もとの励起周波【と最終発−ｊに周波
数との間に約２３ｚｍの大きいストークスソフトがある
。

例として与えられ、限定することを意図し々い下記実施
例を参照して本発明の原理及び方法が更に理解される。

実施例１ アロフィコシアニン−アズールＡ標識の合成及び固相固
定化 アロフィコシアニン〔アプライドバイオシステムズ、　
シーｘイ（，４ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、
　ＣＡ）からの〕は約５　ｍり／　ｍＩ：の濃度で６５
％硫酸アンモニウム中１てｉ？′１液として得られた。

この懸濁液０．５ｒｒり乃至５，０昭を暗所で４°Ｃで
一夜１０ｍＭリン酸塩緩衝’Ｄ　（Ａｌｄｒｉｃｈ　）
　　１　ｌに対して透析した。

次いで透析したアロフィコシアニンを、１−エチル−３
−（３−ノメチルアミノグロビル）カルボソイミド−Ｍ
ＣＩ塩（Ｓ　ｉＱｍａ　）　　１．０〜５．　（１ｒｑ
ｔを加えることにより活性化し、そして室温で１時間混
合した。次に、１０　ｍ、１ｆ　＋）ン酸塩緩衝液１０
ｕｌ　〜１（］（ｌｕＪ中のアズールＡ　（Ａｌｄｒｉ
ｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ　）　　１０　ｕ　５１〜１０
０　ｕ　ｆを活性化されたアロフィコシアニンに加え、
そして得られる混合物を暗所で４℃で一夜反応させた。

反応が終了すると、アロフィコシアニン−アズールＡ標
識はセントリコｙ　（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　）　ｆＩｉ
縮装置（Ａｍ１−〇〇？Ｌ）を使用して繰返し濃縮及び
−Ｆ）懸濁により１６服された。次いでアロフィコシア
ニン−アズールＡコンツユグイテッド（ａｌｌｏｐｈｙ
ｃｏｃｙａｎｉｎ−ａｚｒｂｒｅ　Ａ　　ｃｏｒＬｊｕ
ｇａｔｅｄ　ｄｙｅ　）を、標準カルボジイミド法によ
って、カルボキシレイト　デリビタイズド　モノディス
／ｚ−ス（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄｅｒｉｖｉｔｉｚ
ｅｄ　ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ　）　１−６　？／、
ｍラテックスビーズ（ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｎｓ　）に
アロフィコシアニンアミノ基を介して結合させた。得ら
れる染料結合ビーズを洗浄しそして保存剤として０．１
％ナトリウムアジド（Ｆｉｓんｅｒ）を加えて５０ｍＪ
ｆホウ酸塩緩衝ｇ　（Ｂｏｒａｔｅ　５ａｌｉｎｅＢｕ
ｆｆｅｒ　）　ｐＨＥＬ　Ｓ中に貯蔵した。この固定化
方法はアズールＡラテックスピーズ及びアロフィコシア
ニンラテックスビーズの製造にも、適当な−一つ明らか
な変更を伴なって遂行された。

実施例２ 蛍光測定 標識されていないビーズ、アズールＡビーズ、アロフィ
コシアニンビーズ及びアズールＡｍアロフィコシアニン
で標識されたビーズの蛍光測定をスベクラム■■■フロ
ーサイトメーター（５ｐｅｃｔｒｕｔｎ１１［ｆｌｏｗ
　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）　（本発明の謬受入から入手ｉ
」能）を使って行なった。観測された結果は下記表に萼
約されている。

標昼、されていないビーズ　　　　　　　　　１．０ア
ズールＡビーズ　　　　　　　　　　　　３．７アロフ
イコシアニンビーズ　　　　　　　２９４容易に認めら
れる通り、本発明の標識、即ち、アロフィコシアニンに
共有結合されたアズールＡは、個々の成分の何れに対し
ても蛍光信号の有意な増加を与える。本発明の原理及び
目的に従えば、これは主として下記の結果と考えられる
：標識の励起周波数とより大きいストークスシフトでカ
ップリングされている好ましいヘリウムネオンレーザ−
光源との優れた適合、それにより励起周波数と発光周波
数との間のフィルタ識別効率（ｆｉｌｔｅｒｄｉｓｃｒ
ｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　）を増加
すること、高いエネルギー転位効率及びより大きい染料
対タンパク質結合比（ｄｙｅ−ｔｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ　
ｃｏｗｐ−１ｉｎσταｔｉｏ）。更に、本発明の原理
は前記に限定されるものではなく、たとえば化学ルミネ
ッセンス、リン光及び熱ルミネッセンスを含むイルミネ
ツセンスエネルギー転位プロセス（ｉＬｌｕｍｉｎｅ−
ｓｃｅｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａ？Ｌｓｆｅｒ　ｐ
ｒｏｃｅｓｓ　）に適用することができることが理解さ
れるであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フィコビリタンパク質に結合した少なくとも１種の
   有機染料分子を含有して成る蛍光標識であって、該有機
   染料の励起は該フィコビリタンパク質へのエネルギー転
   位を生じて該フィコビリタンパク質による検出可能な蛍
   光発光を生じることを特徴とする蛍光標識。 ２、該有機染料分子のスペクトル発光特性は該フィコビ
   リタンパク質の励起スペクトルに重なり、そして複数の
   該有機染料分子が該フィコビリタンパク質に結有結合し
   ている特許請求の範囲第１項記載の標識。 ３、該有機染料分子は約１００乃至１０００ダルトンの
   分子量を有する特許請求の範囲第２項記載の標識。 ４、該有機染料分子はアズールＡであり、該フィコビリ
   タンパク質はアロフィコシアニンである特許請求の範囲
   第１項記載の標識。 ５、アロフィコシアニンに共有結合した複数のアズール
   Ａ分子であって、該結合は該アズールＡ分子と該アロフ
   ィコシアニンとの間のエネルギー転位を許容することを
   特徴とする分子。 ６、リガンドとそれに対して特異的なリガンド結合受容
   体との間の免疫学的反応を検出することによるリガンド
   の検出方法において、該リガンド又はリガンド結合受容
   体成分の１つと関連した標識を検出することにより該免
   疫学的反応を検出することを含み、該標識は複数の低分
   子量有機染料とフィコビリタンパク質との間のエネルギ
   ー転位を許容する条件下にフィコビリタンパク質に共有
   結合した複数の低分子量有機染料を含有して成ることを
   特徴とする方法。 ７、該検出工程が、該有機染料を励起することができる
   第１の周波数において該標識を照明すること及び第２の
   周波数における該フィコビリタンパク質からの蛍光発光
   を検出することを更に含む特許請求の範囲第６項記載の
   方法。 ８、該検出工程が、該有機染料が約１００乃至１０００
   ダルトンの分子量を有するところの標識を検出すること
   を含む特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、議有機染料がアズールＡである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 １０、該フィコビリタンパク質がアロフィコシアニンで
   ある特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、フィコビリタンパク質染料に結合した励起スペク
   トルを有する複数の低分子量有機染料分子を含有して成
   る標識であって、該フィコビリタンパク質は、該有機染
   料分子の励起スペクトルにおいて該有機染料分子を照明
   するとき該有機染料分子からエネルギーを受け取ること
   ができることを特徴とする標識。 １２、該標識はリガンド−リガンド結合受容体対のメン
   バーを更に含んで成る特許請求の範囲第１１項記載の標
   識。