JPS63203622A - 非経口投与用血液製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、非経口的投与を目的とした血漿由来の血液製
剤、この製剤の調製方法およびその用途に関する。

ヒト血液製剤に係る既知の調製方法には、純粋な状態で
個々の成分を得るだめの分画法の他に、副作用を惹起し
かねない不純物質を除去する方法などがある。これらの
例としては、血管作用物質を除去する方法（ＥＰ　　０
　１２０　８３５）、並びに上記の調製物中に存在する
可能性のあるウィルスを不活性化させる方法（ＥＰ　　
０　１５９　３１１、米国特許第４．２９７．３４４号
）などが挙げられる。

しかし、これら既知の方法は、調製物に於いて免疫調節
にかかわると考えられる副作用の問題を考慮に入れてい
ないものである。治療を媒介する免疫調節が存在し得る
ことが、血友病患者に於いて実施された研究にまず指摘
された。これらの患者は、細菌およびウィルス起源のあ
る種の感染症に対する感受性が増大している［文献、例
えばペダル（Ｂｅｄｄａｌｌ）らのジャーナル・オブ・
クリニカル・パンロジー（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ
、）ｌ　９８５　３８゜１１６３−１１６５；レチナー
（Ｋ、Ｌｅｃｈｎｅｒ）、ヘモフィリエ（Ｈｌｍｏｐｈ
ｉｌｏｅ、ｉｎ　”Ｈａｎｄｂｕｃｈ　ｄｅｒ　１ｎｎ
ｅｒｅｎ　Ｍｅｄｉｚｉｎ”）、１４３頁、ＩＩ／９巻
、１９８５、スプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖ
ａｒｌａｇ）　；レビン（Ｐ。

Ｈ，Ｌｅｖｉｎｅ）らのＨｅａｌｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　
Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙ　Ｔｒｅａｔｅｄ　Ｈａｍｏｐ
ｈｉｌ’ｉａｃ、Ｗｉｔｈ　５ｐｅｃｉａｌ　Ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅ　ｔｏ　Ａｂｎｏｒｍａｌ　Ｌｉｖｅｒ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ　ａｎｄ　Ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａ
ｌｙ％１９７７．５０、ｌ−９；マックベリ−（Ｂ、Ａ
、ＭｃＶｅｒｒｙ）らのジャーナル・オブ・クリニカル
・バンロジー、１９７９．３２，３７７−３８１１゜更
に、上記の患者の末梢血から単離される不足したリンパ
球は、免疫系の障害を意味している。この例としては、
ヘルパーＴ細胞のサプレッサーＴ細胞に対する割合の変
化［ケスラー（Ｃ，Ｍ、Ｋｅｓｓｌｅｒ）らの１９８３
、ザ・ランセット１９８３　（Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ１
９８３）、１９８３．９９１−９９２；セイディ（ｐ。

５ａｉｄｉ）らのニュー・イングランド・ジャーナル・
オプ・メディシン（Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、）、１
９８３　３０８．１２９１−１２９２１、ナチュラル・
キラー細胞活性の減少［レダーマン（Ｍ、Ｍ、Ｌｅｄｅ
ｒｍａｎ）、ニュー・イングランド・ジャーナルＯオブ
・メディシン、１９８３　３０８．７９−８２１　、並
びに単核食細胞を循環させる能力を示す抗原の減少［マ
ンハルター（Ｊ、Ｗ、Ｍａｎｎｈａｌｔｅｒ）らのクリ
ニカル・イムノロジー・オブ・イムツバソロジー（Ｃ１
ｉｎ、Ｉ關ｕｎｏ１．ｒｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、）、
１９８６　３８．３９０−３９７１が挙げられる。

本発明は、免疫調節を担う成分を本質的に含まない非経
口用製剤を提供することによって上記に掲げた問題を解
決するものであり、このことは白血球膜に於けるＦｃレ
セプターのダウンモデュレーション（ｄｏｗｎ−ｍｏｄ
ｕｌａｔｉｏｎ）の欠乏又は不存在によって示される。

このことは、免疫グロブリンＧのＦｃフラグメントに対
する、Ｆｃレセプター陽性の白血球例えば単球の膜に於
けるレセプターの発現性が、血液製剤との相互作用の後
で、減退しないか、又は有意に減退しない即ち３０％を
超えて減退しないことを意味している。半球の膜に於け
るＦｃレセプターの発現は、これらの細胞が免疫グロブ
リンＧに被覆されｔ；赤血球に付着する能力によって検
定される。この結果は、ロゼツト細胞の形成率（％ＲＦ
Ｃ）として表される。Ｆｃレセプターのダウンモデュレ
ーションを評価する方法は既知であり、例えば以下の文
献に開示されている：マンハルター（Ｊ、Ｗ、Ｍａｎｎ
ｈａｌｔｅｒ）らのクリニカル・イムノロジー・オブ・
イムツバソロジー、１９８６　３８．３９０−３９７　
ｉパーキン（Ａ、Ｂｅｒｋｅｎ）らのジャーナル・オブ
・エクスペリメンタルΦメディシン（Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　１９６６１２３．１１９−１４４
、およびスコツト（Ｃ，Ｓ、５ＣＯｔＬ）％　クリニカ
ル・エクスペリメンタル・イムノロ’；＋、１９７９　
３８．３００−３０５゜ 単球の膜に存在する、免疫グロブリンＧのＦｃフラグメ
ントに対するレセプター（Ｆｃレセプター）の発現は、
免疫防御機構が適正に機能する上での重要な前提事項で
ある。これらのレセプターは、オプソニン化された食細
胞の食作用を促進するばかりでなく　［コンテンポラリ
ー・トピックス・イン・イムノバイオロジー（Ｃｏｎｔ
ｅｍｐｏｒａｒｙ　Ｔｏｐｉｃｓｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ）、１４巻、白血球機能の調節（Ｒａｇｌ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎ）、スニダーマン（Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ）編ｓ　プ
レナン・プレス・ニューヨーク・アンド・ロンドン１９
７１１、これらのリガンドとこれらレセプターとの相互
作用によって、免疫応答の制御された過程に関連する多
くのシグナルを誘発させる［酸素ラジカルの形成誘導（
ジョンストン（Ｒ，Ｂ、Ｊｏｎｓｔｏｎ）ら、Ｊ、Ｅｘ
ｐ、Ｍｅｄ、　１９７６．１４３．１５５１−１５５６
；ラッシュ（Ｄ、Ｎ、Ｒｕ５ｈ）ら、セルラー・イムノ
ロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）ｌ　９
８４　８７．　２５２　２５８およびライ＋（Ｓ、Ｄ、
ＷｒｉｇＭ）、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　ｌ　９８３　　
上５８．２０１６−２０２３）、Ｔ細胞の活性化（グリ
フイン（Ｊ、Ａ、Ｇｒｉｆｆｉｎ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ、　ｌ　９７９上１隻、６５３−６７５およびグリ
フイン（Ｆ、Ｍ、Ｇｒｉｆｆｉｎ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　ｌ　９８０　１２５．８４４−４９）、抗原提
示（マンハルター（Ｊ、Ｗ、Ｍａｎｎｈａｌｔｅｒ）ら
、Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ｍｍｕｎｏｐａｔｈｏ
１．１９８６３９．４９１−５０３）］。従って、Ｆｃ
レセプターのダウンモデュレーションは、重要な臨床的
意義を有し、血液製剤による治療を受けている患者に於
いて、感染に対する感受性を増強させる一因となり得る
。

免疫調節成分を本質的に含まない本発明に係る血液製剤
は、以下の操作によって得られる：血液製剤を分子ふる
い、即ちゲル浸透クロマトグラフィー（ゲル濾過）にか
ける、および／又は血液製剤を、免疫調節成分を選択的
に吸着する分子ふるい様担体物質で処理する、又は血液
製剤を、直径１０ｎｍの孔又はそれ以下の孔を有するフ
ィルターで濾過する（但し、この濾過は吸清作用によっ
て支持され得る）。

ゲル浸透クロマトグラフィー（ゲル濾過）により、分子
の重量に応じて分子が分離される。このゲルは、特定の
大きさの孔を有する微細な粒子から構成されている。こ
れらの孔よりも大きい分子はゲル中を通過することがで
きず、最初に溶出される。しかし、孔よりも小さい分子
は、ゲルの孔を浸透することができ、従って大きな分子
よりもゆっくりと拡散する。この態様によって、タンパ
ク質混合体中の個々のタンパク質を分離することができ
る。

免疫調節成分を選択的に吸着させるための好ましい態様
は、固定化リガンド、詳細にはブドウ状球菌（ＳＬａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）のプロティンＡ１連鎖状球菌（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のプロティンＧおよびプロテ
ィンＭなどの細菌起源のタンパク質を結合させたセファ
ロースなどの不活性担体物質からなる吸着物質によって
血液製剤を処理することである。

好ましい方法に於ける他の方法は、免疫調節成分で免疫
することによって得られた抗体を結合させたセファロー
スなどの不活性担体物質からなる吸着物質によって血液
製剤を処理することである。

γ−グロブリン製剤を調製するのに特に適する濾過法と
しては、粒子をその大きさに基づいて分離する。この方
法を行うにあたり、大きさが非常に小さい孔（ｌｏｎｍ
又はそれ以下）を有する特別なフィルター膜を使用する
。これらの孔よりも大きな粒子は、濾過操作中に、膜に
保持される。この態様により大きな粒子（高分子）を、
タンパク質混合体から分離することができる。

本発明に係る血液製剤は、遺伝性および獲得性の凝固異
常の治療、原発性および続発性の免疫不全の治療、並び
に自己免疫疾患、免疫複合体病および感染症の治療に好
適に使用できる。

以下の実施例により、本発明に係る血液製剤の特徴、こ
れらの調製法、およびＦｃレセプターダウンモデュレー
ションが現れ得ることを血液製剤を含まない対照培地と
比較する評価法を詳細に説明する。

実施例１ 第８因子調製物を、ＥＰ　　Ｏ１２７６０３に開示され
た方法で調製する。この調製物を、以下に記載のバッチ
法に従って固定化プロティンＡのアフィニティークロマ
トグラフィーにかけた。凍結乾燥された第８因子調製物
（５００ＩＵの第８因子を含有）を、ヘパリンネ含の保
存液［イムノＡ　Ｇ（Ｉｍｍｕｎｏ　ＡＧ）、ウィーン
］　　ｌ０ＩＵを含有する蒸留水２０ＩＩ１１２に溶解
し、室温にて一晩、クエン酸緩衝液（０，０２４Ｍクエ
ン酸ナトリウム、０．１２０Ｍ　ＮａＣＱ、ＨＣＱでｐ
Ｈ−７，２に調節、ヘパリンネ含の保存液１０　Ｉ　Ｕ
／ｍＱを添加。

以下、これを「シトレートｐＨ−７，２４と表現する）
２ｆｆで透析した。透析した第８因子調製物８１ＩＱ（
第８因子約２００　ＩＵに対応）をプロティンＡ−セフ
ァロース懸濁液（シトレートｐＨ−７゜２中、５０％懸
濁液（ｖ／ｖ）　；プロティンＡ−セファロースは、前
置てシトレートｐＨ−７，２に平衡化させておいた）２
＋ｍｆｆに混合した。次いで、この混合物を、室温で４
時間時折振盪させながらインキュベートした。インキュ
ベートが終了した時点で、得られたプロティンＡ−セフ
ァロースを遠心分離（５分間％　７００Ｘり室温）シ、
上清を取り出してゲルをシトレートｐＨ＝７．２　１０
ｄで３回洗浄した。個々の遠心分離の上溝をまとめ、滅
菌濾過し、２１Ｕ第８因子／ｍＱに調節して検定を行う
まで４℃で保存した。

本発明に係る、既述の方法によって調製した第８因子調
製物を、以下のように免疫調節活性に関して検定した。

末梢血由来の単核細胞を、密度勾配遠心法［マンハルタ
ー（Ｊ、Ｗ、Ｍａｎｎｈａｌ　ｔｅｒ）らのＣ１１ｎ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ｍｍｕｎｏｐａｔｈｏ１．１９８６
　３８．３９０　３９７］によって単離した（以下の方
法参照）。密度グラジェント（ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａ
ｄｉｅｎｔ）　［りンホプレプ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ
）、ニエガード＆Ｃｏ＋（Ｎｙｅｇａａｒｄ　＆　Ｃｏ
、）、オスロー、ノルウェー１８＋ｍＩ２に、ヘパリン
処理車２０から２５ｍＱを重層し、室温で３５分間４０
０Ｘ９で遠心分離した。プラズマの静止期に集合した単
核細胞およびグラジェントを吸引して生理食塩水で３回
洗浄し、得られた細胞を、貯蔵しておいた温度−不活性
化（ｔｈｅｒｍｏ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）　（３０
分、５６°０）ＡＢ−血清、並びにペニシリン（１００
Ｉ　Ｕ／ｍＱ）、ストレプトマイシン（ｌｏｏμｇ／ｒ
ｎＱ）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を１５％含有す
るＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭ　Ｉ　５ｕｐｐ１、
）に懸濁させた。

付着によって、単核細胞の集合体から半球を単離した。

単球は、他の単核血細胞とは異なりガラス又はプラスチ
ック表面に付着する特徴を有する。

単球を単離するＩ；めには、単核細胞の濃度をＲＰＭ　
Ｉ　５ｕｐｐ１．１　ｍＱ当たりｌＸｌ０’細胞に調節
する。

次いで、この懸濁液２１ＩＩＱをピペットでプラスチッ
ク製培養プレート［マクロプレートＴ　Ｃ（Ｍａｃｒｏ
ｐｌａｔｅ　ＴＣ）、グレイナー＆シエーン（Ｇｒｅｉ
ｎｅｒ　＆　５６ｈｎｅ）、クレムスミュンスター（Ｋ
ｒｅｎ＋ｓｍｕｎｓ　ｔｅｒ）、オーストリア１に移し
、ＣＯ，インキュベーター中で、３７℃にてインキュベ
ートする（５％Ｃｏよ、９５％以上の湿度）。このイン
キュベートが終了した時点で、付着していない細胞を吸
引し、付着した細胞層（半球）を生理食塩水で３回洗浄
する。

次いで、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　５ｕｐｐ１．を加え、その後に
使用するまで、得られた細胞をｃｏ２インキュベーター
中で保存する。

単球の膜に於けるＦｃレセプターの発現を、ＩｇＧ被覆
ウシ赤血球の付着によって検出した［ベーク７　（Ａ、
Ｂｅｒｋｅｎ）らのＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１９６６　
１２３．１１９−１４４］。ウシ血液をアルセパ−液に
入れ、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ−７，２から７゜４
）［ＰＢＳ］で数回洗浄した。次いで、赤血球濃度をＰ
ＢＳ中２％に調節した。赤血球を免疫グロブリンＧで被
覆することは、抗−ウシ赤血球抗体の亜凝集量（ｓｕｂ
−ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　ｄｏｓｅ）と共にイン
キュベートすることによって行った（ＩｇＧ分画：　０
．１６７ｍｇ／ｍＱ　ＰＢＳ、インキュベート時間１時
間、３７℃）［スコツト（Ｃ，Ｓ、５ｃｏｔｔ）、Ｃ１
１ｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉ　９７９　３８．３
００−３０５］。このインキュベートが終了した時点で
、ＰＢＳで３回洗浄することによって遊離のＩｇＧを除
去し、この抗体で被覆された赤血球の濃度を、０゜２％
ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ　（ＰＢＳ−ＢＳ
Ａ）中、０．５％に調節した。次いで、この赤血球懸濁
液を使用し、単球の膜に於けるＦｃレセプターの存在に
関して検定した。

この目的のため、まず、プラスチック製組織培養プレー
トへの付着によって単離した単球を、注意してゴム付線
で組織培養プレートから削り取り、次いでその濃度を２
−３Ｘ１０″細胞／ｍＱＰＢｓ−ＢＳＡに調節した。こ
の単球懸濁液ｌＯＯμｇを既述した赤血球懸濁液１００
μＱと混合し、４℃にて１０分間、１２０Ｘ９で遠心分
離しｔ；。０℃で１時間インキュベートした後、ペレッ
ト化した細胞を注意して再懸濁し、赤血球が付着した単
球のバーセンテイジを位相差顕微鏡によって測定した。

少なくとも２００個の単球を、ＩｇＧ被覆赤血球でのロ
ゼツト形成能に関して調べた。得られた結果は、ロゼツ
ト形成細胞のパーセンテイジ（％ＲＦＣ）又は付着指数
（ＡＩ）として表わす。

ロゼツトという用語は、付着した３つ又はそれ以上の赤
血球を有する単球を意味している。付着指数は、単球１
個当たりの平均の赤血球数である。

第８因子調製物の免疫調節活性は、以下の方法によって
評価した。半球のプラスチック製組織培養グレートへの
付着の直後、この細胞を第８因子の存在下、ＣＯ，イン
キュベーター中３７℃で１時間インキュベートした。こ
のインキュベートの後、付着単球を生理食塩水で４回洗
浄し、ＲＰＭＩｓｕｐｐｌ、を加え、得られＩ；細胞を
ＣＯ，インキュベーター中、３７°０で１６時間インキ
ュベートした。このインキュベート時間は、血液製剤中
に存在する不純物の免疫調節作用を機能させるのに必要
である。このインキュベートの後に既述した方法を行う
ことによって、半球膜に於けるＦｃレセプターの発現を
検定した。

対照として、付着した直後の単球を、ＲＰＭＩ−１６４
０の存在下（第８因子は存在させない）に１時間インキ
ュベートし、次いで既述した方法で更に処理した。

Ｆｃレセプター発現に関する結果を、ロゼツト形成細胞
のバーセンテイジ（％ＲＦＣ）および付着指数（ＡＩ）
として表す。

（以下余白） ＲＰＭＩ培地（対照）−８１±２　４．４２±０．０５
第８因子　　　　　２１Ｕ／ｍｆｆ　　２０±３　０．
７９±０．０６（出発物質） 第８因子　　　　　２１Ｕ／ｍｉ２　７５＊４　３．７
８旬、１５（本発明に従い、 プロティンＡ−セ ファロースで処理） ａ）ＩｇＧ被覆赤血球が３つ又はそれ以上付着した半球
の％ ｂ）単球１つ当たりに付着した赤血球の数の平均。

このＡＩは、カウントした単球をすべて使用して計算し
た（赤血球が付着していない単球並びに１つ又はそれ以
上の赤血球が付着している半球）この表から明らかなよ
うに、最初の第８因子製剤は、Ｆｃレセプター発現を８
１％ＲＦＣから２０％ＲＦＣにダウンモデュレーション
する。これとは反対に、本発明に従って処理した第８因
子調製物と単球を相互作用させた後は、ロゼツト形成細
胞のパーセンテイジが７５％である。対照に於ける８１
％ＲＦＣと、本発明に従って処理した第８因子調製物と
相互作用させた後の７５％ＲＦＣとの差は、有意差がな
い（対のサンプルに係るスチューデントのｔ−検定）。

このことは、本発明に従って処理した製剤と半球とを相
互作用させた後では、処理した製剤のＲＦＣ値が対照の
値（第８因子で処理していない単球の％ＲＦＣ）と変わ
らないことから、本発明の第８因子製剤が免疫調節成分
を含まないことを意味している。

実施例２ スオメラ（Ｈ，Ｓｕｏｍｅｌａ）らのフォックス・ソン
グ（ＶｏｘＳａｎｇ−）１９７７　３３，３７−５０に
記載の方法に従って調製した第９因子調製物の凍結乾燥
品５００　ＩＵを、蒸留水２０ｉαに溶解し、４℃で一
晩、クエン酸緩衝液（シトレートｐＨ＝７．２、この緩
衝液の正確な組成は実施例１に記載している’）２（ｌ
で透析した。この調製物８ｍＱ（第９因子約２００　Ｉ
Ｕに対応）を取り出し、カラム法によるプロティンＡ−
セファロースのアフィニティータロマドグラフィーにか
けた。この操作法では、第９因子調製物８ｒａＱを、前
厄てシトレートｐＨ−７−２，５０ｍＱで平衡化させて
おいたプロティンＡ−セファロースカラム（ファルマシ
ア（ｐｈＢｒｍａｃｉａ）から入手したカラムＣＩＯ／
１０、ｌ＋Ｃ２ゲル容量）に通す。流速は０　、１　ｍ
Ｑ１分で行った。このカラムから溶出された第９因子を
、２ＩＵ／ｍαに調節し、滅菌濾過し、検定を行うまで
４℃で保存した。最初の調製物、並びに既述した本発明
の方法に従って処理した第９因子調製物の免疫調節活性
を実施例１に記載のように測定した。これらの検定の結
果を、以下の表に 示す。

（以下余白） ＲＰＭＩ培地（対照）−７５±１４．０叶０．０４第９
因子　　　　　２１０／ｍｆｆ１　　４２ｆ３　２．３
１±０．０７（出発物質） 第９因子　　　　２１Ｕ＃ａｆｆ　　７０±３　４．０
０±０．０８（本発明に従い 処理） ａ）ロゼツト形成細胞のパーセンテイジ、即ちＩｇＧ被
覆赤血球が３つ又はそれ以上付着した単球の％。

ｂ）付着指数、即ち単球１つ当たりに付着した赤血球の
数の平均。

この表の結果から、第９因子と単球との相互作用により
、Ｆｃレセプター発現が７５％ＲＦＣ（対照）から４２
％ＲＦＣ（第９因子との相互作用の後）に減少したこと
は明らかである。しかし、本発明に従って処理した第９
因子と単球との相互作用の後ではＦｃレセプター発現は
７０％ＲＦＣであった。対照に於ける７５％ＲＦＣと、
本発明に従って処理した第９因子と相互作用させた後の
７５％ＲＦＣとに於ける差には、有意差がない（対のサ
ンプルに係るスチューデントのｔ−検定）。

このことは、本発明の第９因子製剤が免疫調節作用を有
していないことを意味している。

実施例３ 凍結乾燥したＦＥＩＢＡ調製物（５００１Ｕ。

ｉｍｍｕｎｏ　ＡＧ）を蒸留水２０ｍＱに溶解し、第８
因子および第９因子に関するそれぞれ実施例１および実
施例２に記載の方法でシトレートｐＨ−７，２で透析し
た。免疫調節物質の除去は、カラム法によるプロティン
Ａ−セファロースを用いた吸着クロマトグラフィーによ
って行った。この正確な操作は、第９因子に関する実施
例２に記載の操作に従い行った。最初の製剤、並びに本
発明に従って処理したＦＥＩＢＡ調製物の免疫調節の作
用を、実施例１に記載のように検定した。これらの検定
結果を以下の表に示すが、これにより、本発明に係る固
定化プロティンＡでの処理によってＦＥＩＢＡから免疫
調節作用が排除されていることが分かる。

ＲＰＭＩ培地（対照）−７５±１　４．０９±０．０４
Ｆ　Ｅ　Ｉ　Ｂ　Ａ　　　　　２１Ｕ／ｍα　　３４±
４　１．８９±０．１５（出発物質） Ｆ　Ｅ　　Ｉ　　Ｂ　Ａ　　　　　　　　　　２１Ｕ／
ｍＱ　　　　７３±１　　３．９４±０．０５（本発明
に従い固 走化プロティンＡ で処理） ａ）ロゼツト形成細胞のバーセンテイジ、即ち■ｇＧ被
覆赤血球が３つ又はそれ以上付着した単球の％。

ｂ）付着指数、即ち半球１つ当たりに付着した赤血球の
数の平均。

調査してきた凝固因子調製物（第８因子、第９因子、Ｆ
ＥＩＢＡ）のすべてに関し、それらの免疫調節作用が、
上記のバッチ法およびカラム法の両方法に従い、固定化
プロティンＡで処理することによって排除されているこ
とが特記できる。

実施例４ 筋肉内投与に適する免疫グロブリンＧ調製物（ｉ、ｍ、
　Ｉ　ｇＧ）をエタノール分画法によって調製した［ド
ウチェ（Ｈ，Ｆ、Ｄｅｕｔｓｃｈ）らのＪ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、　ｌ　９４６　１６４、ｌ　Ｏ９ｃｏｎｔ、
］　。この調製物をゲル浸透クロマトグラフィーにかけ
た（以下参照）。

クロマトグラフィーカラム（Ｋ５０／６０、ファルマシ
ア）にクロマトグラフィーゲル（セファクリル（Ｓｅｐ
ｈａｃｒｙｌ）Ｓ　３００、ファルマシア）を詰め込み
、リン酸緩衝液（２０ｍＭ　Ｋ　Ｈｔ　ＯＰ　４．０゜
１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ−８，０
）で平衡化した。次いで、ｉ、ｍ、　Ｉ　ｇＧ　（リン
酸緩衝液１Ｏｉ１１２中）３００ｍｇをカラムに適用し
、流速１　ｙｒＱ１分で溶出した。溶出液をｆｌｕｆｆ
７ラクシヨンで集め、タンパク質の含有量を、２８０ｎ
ｍのＵＶ検出器で測定した。この溶出曲線を図に示す。

０のマークを付した分画をまとめ、実施例１に記載のよ
うにこれらの免疫調節活性を検定した。

この検定の結果を以下の表に示す。この表から、上記の
免疫グロブリンＧ調製物は、この処理によって効果的に
免疫調節成分が排除されていることを確認することがで
きる。単球と本発明に従って処理したｉ、ｍ、　Ｉ　ｇ
Ｇとの相互作用の後に得られたＲＦＣ値は、本質的に対
照の値に対応している。

ＲＰＭＩ培地（対照）−８４±３　７．１１旬、２２ｉ
、ｍ、Ｉ　　ｇＧ　　　　　　　　　　　１０．８　　
　　　　２０±２　　１．９７±０．０７（出発物質） ｉ、ｍ、Ｉ　　ｇＧ　　　　　　　　　　　１１．３　
　　　　　６４±２　　５．９４±０．０４（本発明に
従いゲ ル浸透りロマトグ ラフイーで処理） ａ）ロゼツト形成細胞のパーセンテイジ、即ち■ｇＧ被
覆赤血球が３つ又はそれ以上付着した単球の％。

ｂ）付着指数、即ち単球１つ当たりに付着した赤血球の
数の平均。

実施例５ 実施例４に記載のように調製した免疫グロブリンＧ調製
物（ｉ、ｍ、　Ｉ　ｇＧ）の濃度を、リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）中で５０ｍｇ／ｍａに調節した。適当な
フィルターで前景て適度に不純物を除去した後、得られ
た調製物を、非常に小さなサイズの孔を有する特別フィ
ルター（サルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）Ｓ　Ｍ　
ｌ　ｌ　３１８、孔サイズｌｏｎｍ）に通した。このこ
とは、フィルター膜を適当なフィルター容器に挿入し、
例えばｉ、ｍ、　Ｉ　ｇＧ溶液２０窺ａを１から１．５
バール（ｂａｒ）”Ｃ’７　イル’ｌ　−ニ通過させる
ことにより行った。次いで、得られた濾液を、実施例１
に記載のように有り得る免疫調節作用に関して検定した
。以下の表に示した結果により、上記の処理がこの調製
物の免疫調節作用を殆ど完全に排除していることが分か
る。半球を最初のｉ、ｍ、　Ｉ　ｇＧ製剤で処理すれば
、Ｆｃレセプター発現が７９％から２１％にダウンモデ
ュレーションするが、本発明に従って処理した製剤と相
互作用させた後のＦｃレセプター発現は６７％であった
。

従って、本発明に従い処理したＬｍ、ＩｇＧ分画は、免
疫調節作用が本質的に排除されている。

ＲＰＭＩ培地（対照）−７９±３ ｉ、ｍ、　Ｉ　ｇＧ　　　　　　　１０．０　　　　２
１±３（出発物質） ｉ、ｍ、　Ｉ　ｇＧ　　　　　　　　１０．０　　　　
６７±２（本発明に従い１０−ｎｍの サイズの孔を有する特 別なフィルターで鑵過） ａ）ロゼツト形成細胞のバーセンティジ、即ち■ｇＧ被
覆赤血球が３つ又はそれ以上付着した半球の％。

実施例６ 第８因子調製物をＥＰＡ−ｏ　　１２７　６０３に記載
の方法に従って調製した。この調製物を、免疫調節成分
に対する固定化抗体のアフィニティークロマトグラフィ
ーにかけた。

アフィニティークロマトグラフィーに必要な抗体を調製
するために、まず既述したように調製した第８因子調製
物から免疫調節成分を単離した。

これは、アフィニティークロマトグラフィーおよびカラ
ムクロマトグラフィーを組み合わせることによって行っ
た。この目的のため、第８因子２５００１Ｕを蒸留水１
００ｍｆｆに溶解し、シトレートｐＨ−７，２で２４時
間透析した。次いで、得られな生成物を、固定化プロテ
ィンＡを充填したカラム（プロティンＡ−セファロース
、１２ｍＱゲル容量、カラムＣＩ　Ｏ／２０、ファルマ
シア、スウェ　　　　′−デン）に付し、流速０　、５
　ｍＱ／分で室温にて一晩循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｅ）
させた。続いて、このカラムをシトレートｐＨ＝７．２
　１００ｍｆｆ１で洗浄シタ（流１１０．５ｔａＱ１分
）。次いで、プロティンＡ−セファロースに結合した物
質を、クエン酸緩衝液（５０ｍＭクエン酸玉ナトリウム
、５０ＩｏＭクエン酸、ｐＨ−３，０；以下、これをシ
トレートｐＨ−３，０と表現する）を用いて溶出させ、
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５）を素早く溶
出させて中和した。ＰＢＳで透析を行った後、得られた
物質を以下の要領で分子ふるいクロマトグラフィーにか
けた。透析したプロティンＡ溶出液をスペロース６プレ
プ・グレード・カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　６　Ｐｒｅ
ｐ　Ｇｒａｄｅ　Ｃｏｌｕｍ）　（ＨＲｌ　６　／　５
０　）に付し、流速０．５ｒｔｒＱ１分でクロマトにか
けた。既述したロゼツト検定によって測定すると、４０
０ｋＤ以上の分子量を有するフラクションが免疫調節成
分を含有していた。これらの７ラクシヨンをまとめ、こ
れらを使用して被検動物に抗体を産生させた。

免疫調節成分１５０μｇ　（ＰＢＳ２００ｉ中）を７０
インドの完全アジュバント２００μＱと混合し、家兎に
皮下的に２点で免疫化した。最初の免疫化の後２１日目
および２８日目に上記と同じ方法でブースター免疫（増
強免疫）した。３５日目以後、６週間にわたり１週間隔
で約３０ｍＱの血液を採血し、それから血清を調製した
。続いて、各種の採血日に於ける血清試料をまとめ、こ
れから免疫グロブリンＧの分画を単離した。

ｔＩｇＧ分画を単離するために、得られた血清をまず始
めに硫酸アンモニウムと混合して３５％の飽和状態にし
、室温で２５分間撹拌した後、８００×９で１５分間遠
心分離した。得られた沈澱物を再び３，３％飽和硫酸ア
ンモニウム液に懸濁し、１５分間撹拌して再度遠心分離
した。このようにして得られた沈澱物を、０．１％でア
ジ化ナトリウムを含有するＰＢＳに溶解し、スペロース
６プレプ・グレード・カラム（ＨＲｌ　６１５０、流速
０　、５　ｍ０１分）の分子ふるいクロマトグラフィー
にかけた。分子量範囲１５０ｋＤの分画（即ち免疫グロ
ブリンＧを含有する分画）を集め、０．１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝８．５　（
カップリング緩衝液）で透析した。

次に、これらの操作によって得られた抗体を、製造法（
ファルマシア、スウェーデン）の指示に従って臭化シア
ン（ＣＮＢｒ）−活性化セファロース４Ｂにカップリン
グさせて固定化した。ＣＮＢ　ｒ−活性化セファロース
４８　４ｇをまず、１ｍＭ塩酸中で膨張させた：これは
、ブ７ナー漏斗上に於いて１ｍＭ塩酸５００ｉで洗浄す
ることによって行った。このゲル１０ｍ１２をカップリ
ング緩衝液に存在する抗体４０ｍＱＣタンパク質９０ｍ
ｇに対応）と混合し、時折振盪させながら室温で２時間
インキュベートした。次いで、このゲル物質を遠心分離
にかけ（８００Ｘｙ、１５分間）、カップリング緩衝液
に再懸濁させた後、遠心分離にかけて洗浄し、最後にブ
ロッキング緩衝液（即ちカップリング緩衝液＋１Ｍエタ
ノールアミン）に懸濁した。

室温で２時間インキュベートした後、得られたゲル物質
を、最初に０．１Ｍ１−リス、０．５Ｍ塩化ナトリウＡ
　（ｐ　Ｈ＝　８−０）　　１００ｒｓＱテ、次に０．
１Ｍ酢酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ−４，０）１
００で洗浄することを２回行った。ｐＨ＝８からｐＨ−
４の洗浄工程を３回繰り返した（ゲルの洗浄は、再懸濁
および遠心分離によって行った）。

最後に、このゲル物質をＰＢＳ＋１０ＩＵヘパリン／ｒ
ｎＱ２０ｍＱに懸濁した。検定によって、免疫調節成分
に対する抗体９＋ｍｇがゲル１−当たりに結合している
ことが分かった。

このゲル４．５−をクロマトグラフィーカラム（ＣＩＯ
／１０、ファルマシア、スウェーデン）に詰め、３％ウ
シ血清アルブミン（ＰＢＳ中）３０ｍＱ、５０ｍＭクエ
ン酸三ナトリウム、５０ｍＭクエン酸（ｐＨ−３，０）
５０１１（２および最後ニＰＢＳ　（ｌ　ＯＩ　Ｕ／ｒ
ａＱでヘパリンを含有）２００顧で連続的に洗い流した
（流速０　、５　ｍ０１分）。次いで、このゲル物質を
使用して免疫調節成分を分離した。

この分離は、バッチ法又はカラム法のいずれによっても
行うことができる。例として、第８因子調製物由来の免
疫調節成分をカラム法によって分離する方法を述べる。

これと同じ原理に従えば、第９因子調製物およびＦＥＩ
ＢＡ調製物から免疫調節成分を排除することも可能であ
る。

例えば、既述の如く調製した第８因子調製物５００１Ｕ
を蒸留水２０１１１２に溶解し、１ｍ１２当たり１ＯＩ
Ｕヘパリンを含有するＰＢＳ　１１２での２４時間の透
析を２回行った。次いで、第８因子調製物の濃度を上記
と同じ緩衝液でｌ０ＩＵ第８因ギ／ｍＱにした。次いで
、この物質の１００ＩＵを既述した分離カラム（セファ
ロース、免疫調節成分に対する抗体をカップリングさせ
ているカラム）に適用し、流速０　、５　ｒａＱ１分で
室温にて１６時間カラムに循環させた。次いで、カラム
に結合しない物質を２１Ｕ第８因子／ｒａＱに調節し、
実施例１に記載のロゼツト検定によって免疫調節成分に
関して検定した。これらの調査によって得られた結果を
以下の表に示す。

以下の物質の存在第８因子％ＲＦＣ“”ＡＩゝ）下に於
ける単球の　活性 インキュベート ＲＰＭＩ培地（対照）−８１超　６．０６±１．７６第
８因子　　　　　２１Ｕ／ｍＱ３１±５　１．３６１０
．１３（出発物質） 第８因子　　　　２１０／ｍ１２　８０±６　４．７９
±１．４５（本発明に従って 処理 ａ）％ロゼツト形成細胞、即ちＩｇＧ被覆赤血球が３つ
又はそれ以上付着した半球の％。

ｂ）付着指数、即ち単球１つ当たりに付着した赤血球の
数の平均。

この表から明らかなように、最初の第８因子製剤は、免
疫“調節活性を示している。この最初の製剤と単球との
相互作用によって、Ｆｃレセプターの発現が８１±３％
ＲＦＣ（対照）から３１±５％ＲＦＣ（第８因子との相
互作用の後）に減少している。これとは反対に、本発明
に従って処理した第８因子調製物と半球との相互作用は
、単球の膜に於けるＦｃレセプターを減退させていない
（本発明に従って処理した第８因子製剤と相互作用させ
た後の８０±６％ＲＦＣに対して対照培地との相互作用
では８１±３％である）。８１±３％ＲＦＣと８０±６
％ＲＦＣとの差は、統計的に有意差がなく（対のサンプ
ルに係るスチューデントの七−検定）、このことは、本
発明に従って処理した製剤には免疫調節作用がないこと
を意味している。

【図面の簡単な説明】

図面は、調製した免疫グロブリンＧ調製物をゲル浸透ク
ロマトグラフィーにかけ、それを２８０ｎｍでＵＶ検出
した溶出曲線である。 特許出願人　イムノ・アクチェンゲゼルシャフト・フユ
ール・５ミシユーメデイツイニツ シエ・プロデュクテ 代　理　人　弁理士　責山　葆　（外１名）［ｍｌ］

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、非経口的投与を目的とした血漿由来の血液製剤であ
   って、白血球の膜に於けるＦｃレセプターのダウンモデ
   ュレーションの欠乏又は不存在によって示される如く免
   疫調節成分を本質的に含まない血液製剤。 ２、該白血球が単球であり、血液製剤がこの単球の膜に
   於けるＦｃレセプターのダウンモデュレーションを起こ
   さない、即ち免疫調節成分を含まないものであって、免
   疫グロブリンＧのＦｃフラグメントに対する単球膜に於
   けるレセプターの発現が血液製剤調製物と相互作用させ
   た後に減退しないか又は３０％を超えて減退しない、以
   下の調製法のいずれかによって得られる請求項１に記載
   の血液製剤： ゲル浸透クロマトグラフィー（ゲル濾過）によって血液
   製剤を分子ふるいにかける、 血液製剤を、免疫調節成分を選択的に吸着できる分子ふ
   るい様担体物質で処理する、 血液製剤を、直径１０ｎｍの孔又はそれ以下の孔を有す
   るフィルターで濾過する。 ３、血液製剤を、固定化リガンドを結合させた不活性担
   体物質で構成される吸着物質で処理することを特徴とす
   る、非経口的投与を目的とした血漿由来の血液製剤であ
   って、白血球の膜に於けるＦｃレセプターのダウンモデ
   ュレーションの欠乏又は不存在によって示される如く免
   疫調節成分を本質的に含まない血液製剤の調製方法。 ４、該不活性担体物質がセファロースである請求項３に
   記載の方法。 ５、該固定化リガンドが細菌起源のタンパク質である請
   求項３に記載の方法。 ６、細菌起源のタンパク質がブドウ状球菌のプロテイン
   Ａ、連鎖球菌のプロテインＧおよびＭの中から選ばれる
   請求項５に記載の方法。 ７、血液製剤を、免疫調節成分で免疫して得られた抗体
   を結合させた不活性担体物質で構成される吸着物質で処
   理することを特徴とする、非経口的投与を目的とした血
   漿由来の血液製剤であって、白血球の膜に於けるＦｃレ
   セプターのダウンモデュレーションの欠乏又は不存在に
   よって示される如く免疫調節成分を本質的に含まない血
   液製剤の調製方法。 ８、該不活性担体物質がセファロースである請求項７に
   記載の方法。 ９、非経口的投与を目的とした血漿由来の血液製剤であ
   って、白血球の膜に於けるＦｃレセプターのダウンモデ
   ュレーションの欠乏又は不存在によって示される如く免
   疫調節成分を本質的に含まない血液製剤の用途であって
   、遺伝性および獲得性の凝固異常の治療、原発性および
   続発性の免疫不全の治療、並びに自己免疫疾患、免疫複
   合体病および感染症の治療に使用する医薬製剤の製造に
   使用するための用途。