JPS63209588A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮呈上ｐ別月豆■ 本発明は、医薬品、食品及びその他の酵素反応を利用す
る分野で、いわゆるバイオリアクターとして使用するの
に適した固定化酵素の製造方法に関する。

従米挟古本土辺■■嘉 酵素反応を利用する医薬品や食品の製造プロセスは、近
年急速に発展してきたが、従来、その多くは、水溶液中
で酵素と基質を反応させて生成物を得る方法であって、
反応条件の管理、酵素の補給、反応後における生成物と
酵素の分離、及び酵素の回収等の繁雑な操作を含んでお
り、加うるに、反応を回分式で行うため生産性が劣ると
いう問題があった。

而して、最近このような問題点を改善するために、酵素
を担体内に固定した固定化酵素を基質と接触させること
により、上述の繁雑な操作から解放されると共に生産性
を高めることが可能となった。

この固定化酵素の製造法としては、水不溶性の樹脂に酵
素を共有結合、イオン結合又は物理的吸着によって結合
させることから成る担体結合法が知られている。これら
の方法のうち、特に、水不溶性樹脂として・イオン交換
能をイｊする樹脂を用い、該樹脂に酵素をイオン結合に
より固定する方法が多く報告される。

しかし、これまでに報告されている」記聞のイオン交換
能を有する樹脂にイオン結合により酵素固定化する方法
の多くは、イオン性解Ｍ基として、カナオン性に解離す
る四級アンモニウム基や１級乃至３級のアミノ基を有す
る樹脂を用いたものであって、カルボキシル基、スルホ
ン酸基、リン酸基等のアニオン性に解離する基を有する
樹脂を用いたものについては、あまり報告されていない
。

そして、このことは、固定化に際し、通常酵素が用いら
れるｐｉがその等電点以上の場合が多いため、単なるイ
オン結合のみで固定化した酵素では基質と反応を行う場
合、基質のｐＨや塩濃度等の影響を受けて酵素が容易に
担体から離脱して基質中に溶出してしまい、その結果固
定化酵素の寿命が短くなるという実用上の問題点に基い
ている。

光曹しｊわ及しようとする課題 本発明は、叙上の理由により、従来、固定化酵素の担体
としてほとんど用いられていなかったアニオン性解離基
を有する樹脂、すなわち、カルボキシル基、スルホンＭ
基、リン酸基等の陽イオン交換能を有する樹脂を担体と
して用い、該担体に固定化した固定化酵素を基質と接触
させてもｐＨや溶存塩類の影響によって酵素が担体から
離脱し難いところの、カラム方式や流動床方式等のバイ
オリアクターに有効に用い得る固定化酵素を製造するた
めの方法を提供することを課題とする。

以下本発明の詳細な説明する。

世肱 本発明の特徴は、アニオン性解離基を含有し、水中で自
重の１０乃至〜１０００倍の水を吸収して！１潤する性
質を有する樹脂を、水の存在下に、酵素とその等電点以
下において接触させ、次いでアンモニア及び／又は３個
以上の活性水素を有するアミン化合物とジアルデヒド化
合物とを作用させて、酵素を上記樹脂に固定化させるこ
とにある。

ここで“アニオン性解離基を含有する樹脂”とは、カル
ボキシル基、スルホン酸基、リン酸基等の陽イオン交換
能を有する単量体を構成単位として含有する樹脂を意味
する。

課鴎Ａ邂迭１に−（框ｑ丁役 本発明において、酵素を固定化するための担体に用いる
アニオン性解離基を含有する樹脂は、上述のごとく、水
中で自重の１０〜１０００倍に達する水を吸収する水膨
潤性の特性を有する樹脂であって、このような樹脂は、
上記解離基を有するモノマー、例えばビニルモノマー単
独の重合物又はこのビニルモノマーと共重合可能な他の
ビニルモノマーとの共重合物、アクリルニトリル、アク
リルアミドのような加水分解によりカルボキシル基を形
成ずルヒニルモノマーの単独重合物又はこのビニルモノ
マーと他のビニルモノマーとの共重合物のｆＪｎ　水分
解物、澱粉等の水溶性高分子に上記解離基を有するビニ
ルモノマー又は加水分解によりカルボキシル基を形成す
るビニルモノマー等のグラフト重合物等を、架橋剤の共
存下に、重合又はグラフト重合したもの、又は、重合又
はグラフト重合後架橋反応により架橋させて得ることが
できる。

ここで用いるアニオン性の解離基を有するモノマーとし
ては、アクリル酸、メタアクリル酸及びそれらのアルカ
リ塩、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリル
アミド−２プロパンスルホン酸塩、スルホプロピルメタ
クリレート、アシッドホスホキシエチルメタクリレート
、３−クロロ−２アシツドホスホキシプロピルメタクリ
レート等を例示し得、又、これらのモノマーと共重合ｉ
ｉＪ能なモノマーとしてはアクリルアミド、スチレン、
アクリルニトリル、酢酸ビニル等を例示し得る。

また、架橋剤としては、Ｎ−Ｎメチレンビス（メタ）ア
クリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド
、ジビニルベンゼン、ポリエチレンジグリシジルエーテ
ル等を例示し得、これらの架橋剤の共存下に重合を行う
か、もしくはグルタルアルデヒ１′、ホルマリン、並び
にポリエチレングリコールジグリシジルエーテル等のジ
グリシジル化合物やイソシアネー１−等を重合させた後
、上記架橋剤で架橋させてもよい。なお、架橋剤の使用
量は、重合時に用いるモノマーに対して通常０ｏ０１〜
１．０％（重け）であって、０．１％より少ないと可溶
性成分が多くなり、一方１％を超えると架橋密度が高く
なるので好ましくない。

上述のごとくして重合させて得られる、カルボキシル基
、スルホン酸基、リン酸基等の酸基を解Ｍ基として有す
る単量体を構成単位として含有する樹脂は、水中で自重
に対して１０〜１０００倍の水を吸収して膨潤する性質
を有する。

したがって、本発明を実施するに当っては、上記樹脂を
予め、水性液体に分散させて吸水膨潤させた後、これに
固定化すべき酵素の分散液を加える。

本発明では、上記水に膨潤させた樹脂に酵素分散液を加
えて樹脂と酵素を接触させるが、その際接触系のｐＨを
酵素の等電点以下に調整して数十分から数時間、０℃〜
４０℃の温度に放置することにより、酵素を樹脂に固定
化することができる７ここで上記ｐＨを酵素の等電点以
下に調整するのは、基質の条件により酵素が樹脂から離
脱し藩いように固定化するためである。

すなわち、酵素分子は、分子内に多くのアニオン性解離
基及びカチオン性解離基を有しているが、等電点のｐＨ
では解離している両性基の数が同数となって酵素分子全
体としては電荷を有しなくなり、一方等電点以上のｐＨ
では負の電荷を有するようになる。

これに対し、等電点以下ではアニオン性解離基を有する
水膨潤性樹脂と酵素を接触させることにより、酵素の有
するカチオン性解離基と樹脂のアニオン性解離基との間
でイオンコンプレックスを形成して、酵素が固定される
。

なお、」記聞樹脂と酵素の接触に際ξ７、酵素を予め水
性液体中に分散させた後、この液に樹脂を投入して、吸
水膨潤させたものを、−１二記と同様にして固定化する
こともできる。

上述のようにして得られる樹脂への酵素の固定化はイオ
ン結合に因るものであるが、このイオン結合のみでは固
定が−Ｆ分でないので、本発明ではさらに次の処理を施
す。

上記により酵素を固定化した樹脂を、好ましくは純水又
は酵素の等電点以下のｐＨを有する緩衝液を用いて洗浄
して未結合の酵素及び樹脂に含まれる可溶性成分を除去
した後、アンモニア又は３個以上の活性水素を有するア
ミン化合物とジアルデヒド化合物とで処理する。なお、
酵素を固定化し７た樹脂を、上記洗浄による可溶性成分
の除去操作を行うことなく、上記の処理を行っても酵素
の固定化には支障をきたさない。

上記アンモニア又はアミン化合物とジアルデヒド化合物
とによる処理は、ｐＨ５〜９において上記樹脂に作用さ
せることが好ましく、さらにはｐＨ５〜７で作用させる
と一層好ましい。すなわち、上記作用による反応速度は
ｐＨが高いほど急激に進行し、ｐＨが低いほど緩徐に進
行するが、ｌ）Ｈが上記範囲外になると酵素の活性Ａ’
ｔｌなわれるようになるので好ましくない。

上記処理に際し、酵素を固定化した水膨潤性樹脂にジア
ルデヒド化合物を添加し、次いでアンモニア又はアミン
化合物を添加しても、また、その添加順序を逆にしても
よいが、両昔を混合して添加するのは好ましくない、な
お、アンモニアとアミン化合物は中、独でも、２種類以
上併用しても差支えがない。

また、これらの添加量は、ジアルデヒド化合物では樹脂
に対して０゜１〜３００％（重量）、アンモニア又はア
ミン化合物では樹脂に対して０．１〜１００％（重量）
の範囲が適当である。ジアルデヒド化合物を余り多量に
添加すると酵素の失活をきたすため、実際上は水膨潤性
樹脂の膨潤程度が乾燥樹脂の２〜５倍になるジアルデヒ
ド化合物とアンモニア又はアミン化合物の量を予め、酵
素を含まない樹脂の単独系で実験的に求めておくとよい
。

上述のようにして、ジアルデヒド化合物とアンモニア又
はアミン化合物とを、酵素を固定化した水膨潤性樹脂に
添加すると、水膨潤性樹脂は、本来の水膨潤能力を失っ
て収縮し、その内部に酵素を包含した形態となり、その
結果酵素が樹脂内に十分に固定されるようになる。

したがって、このようにして固定された酵素は、酵素反
応に際し、反応基質と接触させても、樹脂担体から離脱
する割合が極めて小さく、長期にわたって酵素反応を持
続させることができる。

このような酵素の固定機構は、アニオン性解離基を有す
る樹脂内において、ジアルデヒド化合物とアンモニア又
はアミン化合物の縮合物が形成され、この縮合物が多価
カチオン電解質として、樹脂内のアニオン性解離基と結
合してイオンコンプレックスを形成し、このイオンコン
ブ１／ツクスの形成によって樹脂内の架橋が進行すると
同時に、樹脂自体が親水性を失ない、その結果、樹脂は
水膨潤性を失って収縮するものと推定される。

因に、上述の反応は、酵素の存在しない樹脂単独の系に
おいても同様に起ることから、酵素自体がこの反応に積
極的に関与しているとは考え難いが、酵素内に含有され
るアミノ基の活性水素もその一部がジアルデヒド化合物
と縮合反応を起し、樹脂内において、アミン化合物、ジ
アルデヒド化合物及び酵素の三者間の架橋が進行して樹
脂の収縮と共に酵素の樹脂内よりの溶出が抑制されるも
のと考えられる。

したがって、上述のようにして得られる樹脂内に包含さ
れた酵素は、ｐＨの変動や高い塩濃度の共存下に基質と
接触させても、樹脂から基質内に溶出することがなく、
前述したごとく、長期間安定な酵素活性を示すのみなら
ず、担体としての水膨潤性樹脂が分子内イオンコンプレ
ックスを形成することにより収縮して架橋密度が向上す
るので、担体樹脂そのものの物理的（機械的）強度も向
上するようになり、バイオリアクターへの適応性が−そ
う高くなる。

次に、本発明において用いられるジアルデヒド化合物を
例示すると、グルタルアルデヒド、グリオキザールマロ
ンアルデヒド、スクシンアルデヒ（・、アジピンジアル
デヒド（アジボアルデヒ（・）等が挙げられ、また、ア
ミン化合物としては、エチレンジアミン、プロピレンシ
アミニ／、ヘキサメチレンジアミン等のアルキレンジア
ミン；トリエチレンテトラミン、デトラエチレンベンタ
ミン、ペンタエチレンへキサミン等のポリアルキレンポ
リアミン、及び−ト、記アルキレンジアミン、ポリアル
４゛レンジアミンの活性水素の一部をジメチル硫酸、ジ
エチル硫酸等の硫酸エステルや塩化メチル、臭化メチル
等のハロゲン化アルキル等でアルキル化したもの等の３
個以上の活性水素を有するものを例示し得る。

また、本発明に従って固定し得る酵素については、特に
限定されることなく、はとんど全ての酵素に適応するこ
とができる。例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、
トリプシン、キモ【リプシン、ペプシン、パパイン０、
バンクレアチン、アミノアシラーゼ、ヌクレアーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、ＡＴＰデアミナーゼ、ホスファターゼ
、ストレプトキナーゼ、アビラーゼ（ＡＴＰ−ジキスフ
ァターゼ）　、ＡＴＰクレアチンリン酸転移酵素、ペク
チナーゼ、マルターゼ、ラクターゼ、ウレアーゼ、タン
ナーゼ、リパーゼ、グルコースイソメラーゼ、メリビア
ーゼ、アルドラーゼ、セルラーゼ、アルドラ−ゼ、ナリ
ンジナーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスパラキシダ
ーゼ等を挙げることができ、これらはいずれも本発明の
方法に従って簡易に固定し得る。

去り一六２発朋−ｐカー果 以下に実施例並びに比較例を示して本発明及びその効果
を具体的に説明する。

実施例中に示した固定化酵素の活性度の測定は、０．０
５モルのクエン酸−リン酸緩衝液ｃｐｏ　４．２）に熔
解したシュークロースの１０％溶液１００ｇ中に、固定
化した酵素の適攪を添加して４０℃において、６０分間
反応させ、形成された還元糖屓をメチレンブルー法によ
り求め、固定化酵素１ｇ当り及び１時間当りのシューク
ロース分解ｆｆｉ　（ｇ）を計算により求めた。

また、酵素の溶出量の測定は、固定化酵素１ｇを、０．
０５モルのクエン酸−リン酸緩衝液に分散し、隘５の濾
紙により濾過する。次いで１０％食塩水１００ａ＋１！
に濾過残渣を分散し、同様にして濾過する操作を１０回
繰返し行った後、再度シュークロース分解能を測定して
、残存している酵素の活性を測定する。

その結果を、に記燥作を行っていない固定化酵素の活性
と比較して活性残存率を求めた。

実施例１ アクリル酸５２．７ｇとアクリルアミド１７．３ｇを蒸
留水２５ｇに溶解し、これに水酸化カリウム３２．８ｇ
を加えアクリル酸の８０％を中和した。これにメチレン
ビスアクリルアミドを０゜００７ｇ加え、触媒として２
−２′−アゾビスイソブチルニトリル０．７ｇを溶解し
たアセトン溶液を１０ｍＪ加えた。この溶液を、重合容
器に移し、６０℃に加熱して、含水率の低い、かつ多孔
質な白色重合体を得た。これを粉砕して篩により分級し
て、粒径１０〜６０メツシユの水膨潤性粉末を調整した
。

得られた樹脂は、蒸留水中で４４０倍、１％食塩水中で
３７倍の吸水倍率を有している。

この水膨潤性樹脂の乾燥粉末１ｇを採取して蒸留水ＩＥ
に膨潤させた後、濾過し、それを０．０５モルのリン酸
−クエン酸緩衝液１７！に浸清し濾過した。

次いで、再度０．０５モルのリン酸−クエン酸緩衝液１
００ｍ１中に市販のインベルターゼ液（三共株式会社製
）　５＋ｍβを加え、それを前記の濾過した樹脂に加え
、３時間室温にて撹拌しながら固定化を行った。次いで
、これを濾別して、再度０．０５モルのリン酸−クエン
酸緩衝液に１時間浸漬、攪拌を行った。次いでこれにゲ
ルタールアルデヒド２５％溶液７．２ｇを添加し、次に
３．６％のアンモニア１４ｇを加えた後、塩酸あるいは
苛性ソーダにてｐＨを６に維持して室温にて２時間放置
した後濾過して、その濾過物を再度、前記リン酸−クエ
ン酸緩衝液にて洗浄して、固定化酵素５．３ｇを得た。

これをサンプルｌ１ｉＩｋｌとした。

また、ゲルタールアルデヒドとアンモニアを作用させる
ｐＨを７、及び８にする以外は、上記と同様の操作を行
う事により、固定化酵素３．４ｇ及び３．１ｇが得られ
た。これをサンプルｌ１ｈ２及び隘３とした。

比較例１ 実施例１において、アンモニアを共存させないで、ゲル
タールアルデヒドのみを添加した後、ｐＨを６．７．８
に苛性ソーダにて調整し、室温にて２時間放置したもの
をサンプル！ｌｈ４、隘５、隘６とし、得られた固定化
酵素は、それぞれ２５ｇ、２８ｇ、２７ｇであった。

実施例２ 実施例１と同一組成のモノマー溶液を調整する。

冷却管を具備したセパラブルフラスコ内に、シクロヘキ
サン５００ｍ　ｌ　、エチルセルロース５ｇヲ入し、窒
素雰囲気下に、湯浴で内温６０℃に加熱した。これに攪
拌しながら、調整した七ツマー溶液を滴下し、内温か７
０℃を越えない様にして重合を行った。

モノマー溶液の滴下終了後、液温を高めて共沸により水
分を留去し、次いで濾過、乾燥して、球状の粉末を得た
。

これを篩により篩って、粒径１０〜６０メツシユの水膨
潤性樹脂を得た。

得られた樹脂は、蒸留水中で４６０倍、１％食塩水中で
３８倍の吸水率を有する。

この樹脂を実施例１と同じ操作によって酵素を固定化し
た。樹脂１ｇをｐＨ７で処理する事により、３．９ｇ、
また、ｐｌ＋　８で処理して３．５ｇの固定化酵素がそ
れぞれ得られた。それらをサンプル隘７．１）１８とし
た。

比較例２ 実施例２においてアンモニアを共存させないで苛性ソー
ダにてｐＨ７，８に調整して、室温にて２時間放置した
後、濾過して、固定化酵素をそれぞれ３１ｇ、３３ｇを
得、サンプル漱９、ｔ’ｈｌＯとした。

実施例３ 水膨潤性樹脂として１、市販のハイモサブ＃３００（ポ
リアクリル酸架橋タイプ）を用いて、本発明の方法を実
施した。ハイモサブ＃３００の吸水倍率は、蒸留水中で
７３０倍、１％食塩水中で４４倍であった。

実施例１と同様の方法で、固定化酵素を製造するに当り
、アンモニアの代わりに、ヘキサメナレンジアミン、テ
トラエチレンペンタミンを用い、ｐ１）７で反応させて
得られた固定化酵素は、それぞれ、２．４ｇ、　１．８
ｇであり、サンプ、ル隘１）隘１２とした。

比較例３ 実施例３と同じ樹脂を用いて、同じ操作により、酵素を
固定化するに当り、アンモニアの代わりにジメチルアミ
ン、モノメチルアミン、モノエタノールアミンを用いた
。得られた固定化酵素は樹脂Ｉｇからそれぞれ、２０．
３ｇ　、　１８．１ｇ　、　２６．６ｇであり、サンプ
ル漱１３．１ｌｋＬ１４、磁１５とした。

上記により得られた各固定化酵素のサッカロース分解能
及びリン酸−クエン酸緩衝液及び１０％食塩水で洗浄後
の固定化酵素のサッカロース分解能を測定した結果を表
１、表２、表３にそれぞれ示す。

表１ 表２ 表３ 表１乃至表３にみられるとおり、本発明の方法に従って
得られた固定化酵素は、比較例のものに比べて酵素の溶
出量が著しく少なく、活性残存率が顕著に向上している
ことが認められる。

次に、本発明に従って製造した固定化酵素を用い、カラ
ム方式で基質と接触させて反応させた例を実施例４とし
て示し、比較例と対比した。

実施例４ 実施例１　（サンプル隘３）の方法に準じて調製した固
定化インベルターゼ２ｇ　（酵素活性２６．７．シュー
クロース／ｇ−ｈｒ）と木粉４ｇを内径８■のジャケッ
ト付ガラスカラムに充填し、０．０５モルクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐｌ！　４．２）の３０％シュークロース
溶液を５０℃、流速１００ｍ　ｆ！　／　ｈｒで通液し
た。流出液中の還元糖分をメチレンブルー法で求め、次
式によりシュークロース分解率を算出した。

結果は表４に示すとおりである。

比較例４ 比較例１　（サンプルＮ１）６）の方法に準じて調製し
た固定化インベルターゼＩｇ　（酵素活性６０．４４ｇ
シュークロース／ｇ−ｈｒ）を実施例４と同一方法で通
液した。同様にシュークロース分解率を算出した。

結果を併せて表４に示した。

表４にみられるとおり、本発明による固定化酵素は、比
較例のものに比べて分解活性が長期間持続することがわ
かる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アニオン性解離基を含有し、水中で自重の１０乃
   至１０００倍の水を吸収して膨潤する性質を有する樹脂
   を、水の存在下に、酵素とその等電点以下において接触
   させ、次いでアンモニア及び／又は３個以上の活性水素
   を有するアミン化合物とジアルデヒド化合物とを作用さ
   せることを特徴とする固定化酵素の製造方法。
2. （２）上記樹脂と酵素を接触させた後、ｐＨ５乃至９の
   範囲内においてアンモニア及び／又は３個以上の活性水
   素を有するアミン化合物とジアルデヒド化合物を作用さ
   せる特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。
3. （３）アンモニア及び／又はアミン化合物を樹脂に対し
   て０．１重量％乃至１００重量％とジアルデヒド化合物
   を樹脂に対して０．１重量％乃至３００重量％作用させ
   る特許請求の範囲第（１）項又は第（２）項記載の製造
   方法。