JPS6322100A - インタ−ロイキン−２誘発抗腫瘍性ペプチド - Google Patents
インタ−ロイキン−２誘発抗腫瘍性ペプチドInfo
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- JPS6322100A JPS6322100A JP62139632A JP13963287A JPS6322100A JP S6322100 A JPS6322100 A JP S6322100A JP 62139632 A JP62139632 A JP 62139632A JP 13963287 A JP13963287 A JP 13963287A JP S6322100 A JPS6322100 A JP S6322100A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
免疫系：まその攻撃し破壊する異質細胞のレパートリ−
内に腫瘍細胞を含むと思われるけれども、外部の関与を
要する悪性の高い発生率が自然の保護に限界があること
を示している。化学療法は多くの腫瘍患者の生命を延ば
し、多くの場合に治惠を与える能力を示したけれども、
しかし化学寮法はそれ自体または放射線とともに最後の
手段を意味する。薬物および照射頻度が多くの副作用を
有し、免疫系の抑制、日和見感染に対する１感受性、髪
の喪失、疲労および実質的に低下した機能能力を生ずる
。
内に腫瘍細胞を含むと思われるけれども、外部の関与を
要する悪性の高い発生率が自然の保護に限界があること
を示している。化学療法は多くの腫瘍患者の生命を延ば
し、多くの場合に治惠を与える能力を示したけれども、
しかし化学寮法はそれ自体または放射線とともに最後の
手段を意味する。薬物および照射頻度が多くの副作用を
有し、免疫系の抑制、日和見感染に対する１感受性、髪
の喪失、疲労および実質的に低下した機能能力を生ずる
。
＠瘍壊死因子力ヘキシン（ｃａｃｈｅｘｉｎ）が特異的
抗種瘍活性を有することが最近示された。浦乳動物宿主
中に生じた他の天然存在化合物もまた正常細胞と比較し
て腫瘍′４ａ胞に優先的抑制効果を有することが認めら
れた。身体がこれらの化合物を腫瘍の制御にどのように
用いるか明らかにされなかった。おそろく１種以上の化
合物が含まれるであろうっ ナチニラルキラー細胞；よ腫瘍細胞の役作用に有効であ
ることが知ふれている。これらの細胞が腫瘍細胞の成長
および増殖を制御する特定の機構は知ちれて一一；５ー
ナチュラルキラー細胞がその細胞毒活性をどのように示
すか、また＠瘍細胞を破壊する自然保護を高めるために
自然免疫系とともに使用できる個々の化合物を分離でき
るかどうかを理解する二とは重大な関心であろう。
抗種瘍活性を有することが最近示された。浦乳動物宿主
中に生じた他の天然存在化合物もまた正常細胞と比較し
て腫瘍′４ａ胞に優先的抑制効果を有することが認めら
れた。身体がこれらの化合物を腫瘍の制御にどのように
用いるか明らかにされなかった。おそろく１種以上の化
合物が含まれるであろうっ ナチニラルキラー細胞；よ腫瘍細胞の役作用に有効であ
ることが知ふれている。これらの細胞が腫瘍細胞の成長
および増殖を制御する特定の機構は知ちれて一一；５ー
ナチュラルキラー細胞がその細胞毒活性をどのように示
すか、また＠瘍細胞を破壊する自然保護を高めるために
自然免疫系とともに使用できる個々の化合物を分離でき
るかどうかを理解する二とは重大な関心であろう。
関連文献の簡単な説明
試験管内で制癌活性を有するリンパ球：′！生体内でそ
のよう一；活性を有し、＠瘍の退行を誘発するＳ正風：
まへルストロム（｝ｌｅｌｌｓｔｒｏｍ） ほか、プ
ロシーディングス・３ｆｈ・カナジアン・カンサー・コ
ン７ 工Ｌ／ ンス（Ｐｒｏｃ，３ｆｈ Ｃａｎａｄｉ
ａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｆ，）（１９６９）、４２
５〜４４２に報告された。ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ）および共同研究者は米国国立癌研究所でＩＬ
−２刺激リンパ球（ＬＡＫ細胞）が腫瘍細胞の成長を抑
制できることを見出した。例えばローゼンバーグ（Ｒｏ
ｓｅｎｂｅｒｇ）ほか、ニュー・イングランド・ジ〒−
ナル・オブ・メテ゛インン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ｊ． Ｍｅｄ． ） （ １ ９ ８ ５ ）、３１３
：１４ｇ５〜１４９２；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂ
ｅｒｇ） 、ジマーナル・オブ・ザ・ナンヨナル・カン
サー・インスティチュート （Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａ−ｎ
ｓｅｒ ｌｎｓｔ，）、（１９８５）７５：５９５〜６
０３；レイナー（Ｒａｙｎｅｒ）ほか、ジャーナル・オ
ブ・ザ・ナショナル・カンサー・インスティチュート（
Ｊ，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｎｓｔ，） 、（１
９ ８ ５） ７ ５ ：６７〜７５；ラフレニーレほ
かローゼンバーグ（Ｌａｆｒｅｎｉｅｒｅ ａｎｄＲｏ
ｓｅｎわｅｒｇ） 、カンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ．）、（１９８５）３７３５〜３７４ １；
エティングハウゼン（Ｅｔｔｉｎｇｈａｕ ｓｅｎ）
ｉｆか、ジャーナル・オブ・イムノロジ−（Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ， ）（１９８５）１３５：３６２３〜３６３
５ ；およびシューホかローインハーグ（Ｓｈｕ ａｎ
ｄ ｆｔｏｓｅｎｂｅｒｇ）、ジャーナル・オブ・イム
ノロジ−（Ｊ， Ｉｍｍｕｎｏｌ， ）（１９８５）１
３５ ：２８９５〜２９０３参照。
のよう一；活性を有し、＠瘍の退行を誘発するＳ正風：
まへルストロム（｝ｌｅｌｌｓｔｒｏｍ） ほか、プ
ロシーディングス・３ｆｈ・カナジアン・カンサー・コ
ン７ 工Ｌ／ ンス（Ｐｒｏｃ，３ｆｈ Ｃａｎａｄｉ
ａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｆ，）（１９６９）、４２
５〜４４２に報告された。ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ）および共同研究者は米国国立癌研究所でＩＬ
−２刺激リンパ球（ＬＡＫ細胞）が腫瘍細胞の成長を抑
制できることを見出した。例えばローゼンバーグ（Ｒｏ
ｓｅｎｂｅｒｇ）ほか、ニュー・イングランド・ジ〒−
ナル・オブ・メテ゛インン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ｊ． Ｍｅｄ． ） （ １ ９ ８ ５ ）、３１３
：１４ｇ５〜１４９２；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂ
ｅｒｇ） 、ジマーナル・オブ・ザ・ナンヨナル・カン
サー・インスティチュート （Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａ−ｎ
ｓｅｒ ｌｎｓｔ，）、（１９８５）７５：５９５〜６
０３；レイナー（Ｒａｙｎｅｒ）ほか、ジャーナル・オ
ブ・ザ・ナショナル・カンサー・インスティチュート（
Ｊ，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｎｓｔ，） 、（１
９ ８ ５） ７ ５ ：６７〜７５；ラフレニーレほ
かローゼンバーグ（Ｌａｆｒｅｎｉｅｒｅ ａｎｄＲｏ
ｓｅｎわｅｒｇ） 、カンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ．）、（１９８５）３７３５〜３７４ １；
エティングハウゼン（Ｅｔｔｉｎｇｈａｕ ｓｅｎ）
ｉｆか、ジャーナル・オブ・イムノロジ−（Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ， ）（１９８５）１３５：３６２３〜３６３
５ ；およびシューホかローインハーグ（Ｓｈｕ ａｎ
ｄ ｆｔｏｓｅｎｂｅｒｇ）、ジャーナル・オブ・イム
ノロジ−（Ｊ， Ｉｍｍｕｎｏｌ， ）（１９８５）１
３５ ：２８９５〜２９０３参照。
発明の概要
約１５〜２２キロドルトン（ｋ Ｄ）の範囲内の見掛は
分子量の酸安定性ポリペプチドがインターロイキン−２
活性化Ｔ ＩＪンバ球から得られる。該ポリペプチドは
アセトニドＩＪル酸性水溶液を溶離剤として用いる逆を
目ＨＰＬＣで精製することができる。該ポリペプチドは
腫瘍細胞に対し優先的抑制活性を有することが認ｔちれ
る。
分子量の酸安定性ポリペプチドがインターロイキン−２
活性化Ｔ ＩＪンバ球から得られる。該ポリペプチドは
アセトニドＩＪル酸性水溶液を溶離剤として用いる逆を
目ＨＰＬＣで精製することができる。該ポリペプチドは
腫瘍細胞に対し優先的抑制活性を有することが認ｔちれ
る。
特定態様の説明
インターロイキン−２活性化Ｔリンパ球から分離できる
新規な酸安定性ポリペプチドが提供される。該新規ポリ
ペプチドは、凝集を嫌う条件、すなわち４０％アセトニ
トリルおよび低ｐＨの０．０５％トリフルオロ酢酸下に
ＴＳＫ２５０ＨＰＬＣサイジングクロマトグラフイーに
より測定して約１５〜２２ｋＤの見掛は分子量を有する
。新規ポリペプチドは逆本目ＨＰＬＣＣｌｓμｍボンダ
パック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）カラムから０．０５％水性
トリフルオロ酢酸、ｐＨ１，９、中の４２〜４３％（未
補正）アセトニトリルで溶出される。
新規な酸安定性ポリペプチドが提供される。該新規ポリ
ペプチドは、凝集を嫌う条件、すなわち４０％アセトニ
トリルおよび低ｐＨの０．０５％トリフルオロ酢酸下に
ＴＳＫ２５０ＨＰＬＣサイジングクロマトグラフイーに
より測定して約１５〜２２ｋＤの見掛は分子量を有する
。新規ポリペプチドは逆本目ＨＰＬＣＣｌｓμｍボンダ
パック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）カラムから０．０５％水性
トリフルオロ酢酸、ｐＨ１，９、中の４２〜４３％（未
補正）アセトニトリルで溶出される。
主題（ヒ合吻はマウス、霊長類、ヒト、ウシ、ラット、
ウサギなどを含む種々の晴乳動物種のＴ細胞中に見出す
ことができるっ 赤血球を含まない末梢血液リンパ球：ま適当な培地中で
ＩＬ−２と結合させることができ、一般に約１〜５×１
０−’単位のＩＬ−２が約１０Ｓ〜１０８細抱毎ｍｌの
細胞濃度で毎Ｉａｌｌ’ｌ包に使用される。
ウサギなどを含む種々の晴乳動物種のＴ細胞中に見出す
ことができるっ 赤血球を含まない末梢血液リンパ球：ま適当な培地中で
ＩＬ−２と結合させることができ、一般に約１〜５×１
０−’単位のＩＬ−２が約１０Ｓ〜１０８細抱毎ｍｌの
細胞濃度で毎Ｉａｌｌ’ｌ包に使用される。
Ｔ細胞およびＩＬ−２を含む培地を次いで、約２０〜３
８℃の穏やかな温度で高い二酸化炭素濃度、約５％二酸
化炭素、を有する空気中で通常約５日を越えない、通常
約３日の長い時間インキュベー、トすることができる。
８℃の穏やかな温度で高い二酸化炭素濃度、約５％二酸
化炭素、を有する空気中で通常約５日を越えない、通常
約３日の長い時間インキュベー、トすることができる。
非付着細胞を細胞懸濁液から遠心分離により補集するこ
とができる。該旧目包は主（ごＴ細可包であり、暗頚粒
色を有すると思われるが、インターロイキンで前処理し
なし）培饗は有しない。
とができる。該旧目包は主（ごＴ細可包であり、暗頚粒
色を有すると思われるが、インターロイキンで前処理し
なし）培饗は有しない。
リンパ球源は末梢血液リンパ球源例えば狸Ａまたはリン
パ節であることができる。個々の源は臨界的でなく、牌
冊胞が便利である。
パ節であることができる。個々の源は臨界的でなく、牌
冊胞が便利である。
細胞性ペプチドＩＬ−２処理Ｔ Ｕンバ球（ＬＡＫ Ｉ
Ｊンバ球活性化キラーｍ抱）から酸エタノール抽出を用
いて可溶化することができる。〔ロバート（Ｒｏｂｅｒ
ｔｓ）ほか、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒ−ｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ） （１９８
０）ユニ：３４９３、その開示はこｈに参照される〕。
Ｊンバ球活性化キラーｍ抱）から酸エタノール抽出を用
いて可溶化することができる。〔ロバート（Ｒｏｂｅｒ
ｔｓ）ほか、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒ−ｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ） （１９８
０）ユニ：３４９３、その開示はこｈに参照される〕。
抽出し、遠心分離した後上澄みをプールすることができ
、溶液を約５〜５．５の範囲内のｐＨ！ｌ：部分中和し
、酢酸アンモニウム援衝液を加えると沈殿が生じ、それ
を除去する。次いで上澄みを冷無水エーテルおよび冷エ
タノールと低温（約−２０℃）で混合し、生じた沈澱を
分離する。
、溶液を約５〜５．５の範囲内のｐＨ！ｌ：部分中和し
、酢酸アンモニウム援衝液を加えると沈殿が生じ、それ
を除去する。次いで上澄みを冷無水エーテルおよび冷エ
タノールと低温（約−２０℃）で混合し、生じた沈澱を
分離する。
逆を目高速液体クロマトグラフィーを用いてさらに精製
を行なうことができる〔マークオートほか（！、Ｉａｒ
ｑｕａｒｄｔ ａｎｄ Ｔｏｄａｒｏ） 、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｉ：ｈｅｍ、）、（１９８２）２５７ ：５２２
０、それはこ＼に参照される〕。水性酸性アセトニ）
ＩＪルを濃度勾配溶離に用い、溶出ペプチドを個々の画
分の分離によりモニターすることができる。
を行なうことができる〔マークオートほか（！、Ｉａｒ
ｑｕａｒｄｔ ａｎｄ Ｔｏｄａｒｏ） 、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｉ：ｈｅｍ、）、（１９８２）２５７ ：５２２
０、それはこ＼に参照される〕。水性酸性アセトニ）
ＩＪルを濃度勾配溶離に用い、溶出ペプチドを個々の画
分の分離によりモニターすることができる。
主題ポリペプチド、生理活性を有するそのフラグメント
およびアミノ酸数で５％以下異なり、通常２％以下異な
り、好ましくは１％以下異なるがしかし生理活性を（呆
持するその類似体を本発明に用′７）ることができる。
およびアミノ酸数で５％以下異なり、通常２％以下異な
り、好ましくは１％以下異なるがしかし生理活性を（呆
持するその類似体を本発明に用′７）ることができる。
フラグメントは少くとも免疫活性を有し、天然に存在す
るペプチドと交差反応性である。通常フラグメントは少
くとも約８アミノ酸、より普通には少くとも約１２アミ
ノ酸であり、３０アミノ酸またはそれ以上であることが
できる。類似体は保存的または非保存的置換、欠損、挿
入を有することができ、あるいは広範囲のペプチドまた
はタンパク質に結合することができる。保存的置換は立
体および極性の要件が有意に変化しなかった１アミノ酸
の他のアミノ酸による置換を意味する。保存的置換の例
はＧ、４へ；Ｖ。
るペプチドと交差反応性である。通常フラグメントは少
くとも約８アミノ酸、より普通には少くとも約１２アミ
ノ酸であり、３０アミノ酸またはそれ以上であることが
できる。類似体は保存的または非保存的置換、欠損、挿
入を有することができ、あるいは広範囲のペプチドまた
はタンパク質に結合することができる。保存的置換は立
体および極性の要件が有意に変化しなかった１アミノ酸
の他のアミノ酸による置換を意味する。保存的置換の例
はＧ、４へ；Ｖ。
Ｉ、 Ｌ；Ｓ、 Ｔ；Ｄ、 Ｅ；Ｎ、 Ｑ；に、
Ｌ；およびＦ、 Ｗ、 Ｙである。通常非保存的置換
は２％以下、より普通には１％以下であり、約１〜５ア
ミノ酸に制限されることができる。
Ｌ；およびＦ、 Ｗ、 Ｙである。通常非保存的置換
は２％以下、より普通には１％以下であり、約１〜５ア
ミノ酸に制限されることができる。
主題ペプチドは広範囲のタンパク質に結合することがで
き、それが主題タンパク質に対する多クローン性また（
ま単クローン性抗体の産生を与える免疫原として（Ｌ）
＜二とができる。免疫原タンパクＸ：ま通常主題ペプチ
ドとは異なる種（異種）からであり、約３ＱｋＤより大
きいっ免疫原タンパク賃の例にはラン血清アルブミン、
キーホールリンベントヘモシアニン、β−グロビンおヨ
ヒタイズトリブンンインヒビターが含まれる。２つのペ
プチドを結合させる方法はよく知られ、その場合に２官
能基性化合物例えばグルタルアルデヒド、マレイシド安
息香酸、メチルジチオ酢酸などを用いることができる。
き、それが主題タンパク質に対する多クローン性また（
ま単クローン性抗体の産生を与える免疫原として（Ｌ）
＜二とができる。免疫原タンパクＸ：ま通常主題ペプチ
ドとは異なる種（異種）からであり、約３ＱｋＤより大
きいっ免疫原タンパク賃の例にはラン血清アルブミン、
キーホールリンベントヘモシアニン、β−グロビンおヨ
ヒタイズトリブンンインヒビターが含まれる。２つのペ
プチドを結合させる方法はよく知られ、その場合に２官
能基性化合物例えばグルタルアルデヒド、マレイシド安
息香酸、メチルジチオ酢酸などを用いることができる。
特異的抗体の生成のためにを准動物宿主を免疫処理する
方法はよく知ちれ、こ＼に記載する必要はない。
方法はよく知ちれ、こ＼に記載する必要はない。
主題ペプチドはキラー細目包のリンフォカイン活性化以
外の方法により調製することができる。主題ペプチドは
普通の技術により合成することができ、利用できる広範
囲の合成法および装置がある。
外の方法により調製することができる。主題ペプチドは
普通の技術により合成することができ、利用できる広範
囲の合成法および装置がある。
あるいは主題ペプチドは天然存在ペプチドのフラグメン
トまたはすべてを発現する遺伝子を宿主に導入する二と
により製造することができ、その場合に遺伝子は宿主中
で機能性である転写開始および終結傾城の調節制御下に
ある。細菌例えば大腸菌（巳、Ｃｏｌ＋）、枯草菌（Ｂ
、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ）など、酵母、糸状菌、または他
の単細胞微生物、浦乳動吻細胞例えばマウス細胞、サル
細胞、ヒト細胞などを含む広範囲の宿主の１吏用が見出
される。種、ヤの発現構築物が文献に記載され、本発明
のペプチドを発現する遺伝子に有利に使用できる。
トまたはすべてを発現する遺伝子を宿主に導入する二と
により製造することができ、その場合に遺伝子は宿主中
で機能性である転写開始および終結傾城の調節制御下に
ある。細菌例えば大腸菌（巳、Ｃｏｌ＋）、枯草菌（Ｂ
、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ）など、酵母、糸状菌、または他
の単細胞微生物、浦乳動吻細胞例えばマウス細胞、サル
細胞、ヒト細胞などを含む広範囲の宿主の１吏用が見出
される。種、ヤの発現構築物が文献に記載され、本発明
のペプチドを発現する遺伝子に有利に使用できる。
主題化合物は試験管内および生体内で用いる二とができ
る。試験管内において主題化合物を用いて細胞の混合物
中の腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。従って主
題化合物を培養中に用いることができ、その場合に正常
および腫瘍Ｏ旧称の混合物を腫瘍の細胞から遊離するこ
とが望ましい。
る。試験管内において主題化合物を用いて細胞の混合物
中の腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。従って主
題化合物を培養中に用いることができ、その場合に正常
および腫瘍Ｏ旧称の混合物を腫瘍の細胞から遊離するこ
とが望ましい。
例示状況には腫瘍細胞を除くためのゴ甫乳動物宿主から
の骨髄の除去および宿主に対する骨髄の返還が含まれる
。主題化合物は試験管内で腫瘍の成長速度を低下させる
のに用いることができる。
の骨髄の除去および宿主に対する骨髄の返還が含まれる
。主題化合物は試験管内で腫瘍の成長速度を低下させる
のに用いることができる。
生体内使用において＠癌細胞の増殖を抑制するために主
題化合物をそれ自体または他の化合物とともに、主題化
合物を血流、皮下、病巣内、腹腔内、筋肉内などに注入
することにより用いることができる。主題化合物はまた
診断試験に用いることができ、コンペティティブアッセ
イにおいて体液玉たは細胞甲の天然存在化合物の険８に
使用される。主題化合物はまた主題化合物に対する応答
の可能性を測定するために主題化合物に対する受容体の
滴定に用いることができる。
題化合物をそれ自体または他の化合物とともに、主題化
合物を血流、皮下、病巣内、腹腔内、筋肉内などに注入
することにより用いることができる。主題化合物はまた
診断試験に用いることができ、コンペティティブアッセ
イにおいて体液玉たは細胞甲の天然存在化合物の険８に
使用される。主題化合物はまた主題化合物に対する応答
の可能性を測定するために主題化合物に対する受容体の
滴定に用いることができる。
主題化合物は、天然存在化合物あるいはその類似体また
はフラグメントの使用によって、生理的に許容される液
体例えば蒸留水、生理食塩水、リン酸塩援（１食塩水な
どの中に普通の方法で配合することができる。
はフラグメントの使用によって、生理的に許容される液
体例えば蒸留水、生理食塩水、リン酸塩援（１食塩水な
どの中に普通の方法で配合することができる。
天然に存在する化合物は少くとも約１０％、好ましくは
少くとも約２０％、より好ましくは少くとも約３０％、
望ましく９０％以上の純度で得ることができる。化合物
は細胞状化合物例えば細胞破甲、膜、細胞内器管、他の
細胞タンパク質などを含まないで得ることができるユ少
くとも約１００〜２００［（ｇ、好ましくは５ ｘ ｌ
Ｏ’の腫瘍細胞苺ポリペプチド１０ｍｇ＆ｄの少くと
も約５０％の最大抑制の実験の節に記載する活性を有す
る組成物を得ることができるっ 次の実施例は例示として提供されるが、しかし限定とし
てではなし）。
少くとも約２０％、より好ましくは少くとも約３０％、
望ましく９０％以上の純度で得ることができる。化合物
は細胞状化合物例えば細胞破甲、膜、細胞内器管、他の
細胞タンパク質などを含まないで得ることができるユ少
くとも約１００〜２００［（ｇ、好ましくは５ ｘ ｌ
Ｏ’の腫瘍細胞苺ポリペプチド１０ｍｇ＆ｄの少くと
も約５０％の最大抑制の実験の節に記載する活性を有す
る組成物を得ることができるっ 次の実施例は例示として提供されるが、しかし限定とし
てではなし）。
実験
物質および方法
リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の調製弾備
をＣ５７已りめすマウスから無菌的に取出し、ルーズダ
ンス（Ｌｏｏｓｅ ｄｏｕｎｃｅ）で冷浸した。
をＣ５７已りめすマウスから無菌的に取出し、ルーズダ
ンス（Ｌｏｏｓｅ ｄｏｕｎｃｅ）で冷浸した。
次５１で冷浸した肺臓を１００メツシニマイテンクスグ
リツド（Ｍｙｔｅｘ ｇｒｉｄ）に通し、１５０’Ｏｒ
ｐｍで５分間遠心分離した。赤血球をトリス緩衝塩化ア
ンモニウム溶液中に再び懸濁することにより溶解した。
リツド（Ｍｙｔｅｘ ｇｒｉｄ）に通し、１５０’Ｏｒ
ｐｍで５分間遠心分離した。赤血球をトリス緩衝塩化ア
ンモニウム溶液中に再び懸濁することにより溶解した。
（０，１６Ｍ−ＮＨ４ＣＡ ９０ ｄと０９．１７〜
丁トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６５，１０ｄとを混合し、
希ＨＣβでｐＨ７，２に調整した）Ｃ細胞をこの溶液中
に室温で２分間保持し、次いでウシ胎仔血屑溶液中の遠
心分離により適当な細胞を回収した。、調製物を３回ハ
ンクス均衡塩類溶液５０ｍ１中で洗浄した。次いで約５
ｘ １０’細胞を組換えｌ、ｔＩＬ−２Ｃ’／−クス
社（Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ、）製Ｅ１７，５００単位、
・ ＲＰ：’ｖ丁 Ｉ １６４０・ １０％０
％ラン血清 ・ ０．０３％グルタミン ・ ストレプトマイシン（１００μｇ ／ｍＪり・ ペ
ニシリン（１００車位／顎） ・ ０．１ｍｍｌ非必須アミノ酸 ・ １μン１ピルビン酸ナトリウム ・ ２−メルカプトエタノール５ Ｘ １０−５Ｍ・
ゲンタマイシン（５μｇ ／ ｒｎｌ！ ）・ファンジ
ゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ） （０，５Ａｔ ｇ ／
ｍｌ）を含む７５ｍ、２組織培養フラスコに入れ、細胞
を５％ＣＯ２環境中で３７℃で３日間インキュベートし
た。次いでフラスコをかきまぜ、細胞懸濁液（非付着細
胞）を室温で１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した
。生じた調製物はシータ抗原の発現により示されるよう
に主にＴ細胞を含有した。
丁トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６５，１０ｄとを混合し、
希ＨＣβでｐＨ７，２に調整した）Ｃ細胞をこの溶液中
に室温で２分間保持し、次いでウシ胎仔血屑溶液中の遠
心分離により適当な細胞を回収した。、調製物を３回ハ
ンクス均衡塩類溶液５０ｍ１中で洗浄した。次いで約５
ｘ １０’細胞を組換えｌ、ｔＩＬ−２Ｃ’／−クス
社（Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ、）製Ｅ１７，５００単位、
・ ＲＰ：’ｖ丁 Ｉ １６４０・ １０％０
％ラン血清 ・ ０．０３％グルタミン ・ ストレプトマイシン（１００μｇ ／ｍＪり・ ペ
ニシリン（１００車位／顎） ・ ０．１ｍｍｌ非必須アミノ酸 ・ １μン１ピルビン酸ナトリウム ・ ２−メルカプトエタノール５ Ｘ １０−５Ｍ・
ゲンタマイシン（５μｇ ／ ｒｎｌ！ ）・ファンジ
ゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ） （０，５Ａｔ ｇ ／
ｍｌ）を含む７５ｍ、２組織培養フラスコに入れ、細胞
を５％ＣＯ２環境中で３７℃で３日間インキュベートし
た。次いでフラスコをかきまぜ、細胞懸濁液（非付着細
胞）を室温で１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した
。生じた調製物はシータ抗原の発現により示されるよう
に主にＴ細胞を含有した。
該細胞はＩＬ−２で処理しなかった同様の対照細胞に比
較して晧碩拉色を呈し、アンチネオブラスチン（ａｎｔ
＋ｎｅｏｐ １ａｓｔｉｎ）源として作用する。
較して晧碩拉色を呈し、アンチネオブラスチン（ａｎｔ
＋ｎｅｏｐ １ａｓｔｉｎ）源として作用する。
抽出操作
ペプチドを酸エタノーノＣ抽出操作・ごロバート（ＲＯ
ｂｅｒｔｓ）ほか、前掲〕を用いてＬ ＡＫ細細胞み抽
出した。９５％（Ｖ／Ｖ）エタノール３７５ｍ１および
ＪＨＣβ７．５ｄとフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド３３ｍｇおよびプロテアーゼインヒビターとしてつ／
肺臓かろのアプロチニン５６トリブシン抑制単位とを含
む溶液（４ｒｒ！／ｇ：４℃）中で細胞をホモジナイズ
した。容債を蒸留水で６ｄ／ｇに調整し、４℃で磁気か
きまぜ、棒による穏やかなかくはんにより一夜抽出し、
次に遠心分離した。上澄みをプールし、濃水酸化アンモ
ニウムでｐＨ５，２に調整した。溶液に２〜丁酢酸アン
モニウムＩＩ液ｐＨ５，２，１ｒｒｕ２毎１００ｒｎｌ
−抽出物を加えた。沈殿が生じ、それを遠心分、雑によ
り除去し、上澄みを冷無水エーテル４容債および冷エタ
ノール２容積（−２０℃）と混合し、２４時間維持した
。生じた沈殿を遠心分離により捕集し、凍結乾固した。
ｂｅｒｔｓ）ほか、前掲〕を用いてＬ ＡＫ細細胞み抽
出した。９５％（Ｖ／Ｖ）エタノール３７５ｍ１および
ＪＨＣβ７．５ｄとフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド３３ｍｇおよびプロテアーゼインヒビターとしてつ／
肺臓かろのアプロチニン５６トリブシン抑制単位とを含
む溶液（４ｒｒ！／ｇ：４℃）中で細胞をホモジナイズ
した。容債を蒸留水で６ｄ／ｇに調整し、４℃で磁気か
きまぜ、棒による穏やかなかくはんにより一夜抽出し、
次に遠心分離した。上澄みをプールし、濃水酸化アンモ
ニウムでｐＨ５，２に調整した。溶液に２〜丁酢酸アン
モニウムＩＩ液ｐＨ５，２，１ｒｒｕ２毎１００ｒｎｌ
−抽出物を加えた。沈殿が生じ、それを遠心分、雑によ
り除去し、上澄みを冷無水エーテル４容債および冷エタ
ノール２容積（−２０℃）と混合し、２４時間維持した
。生じた沈殿を遠心分離により捕集し、凍結乾固した。
逆相高速液体クロマトグラフィー
高速液体クロマトグラフィーは前に記載したようｉこ行
なったつ 〔マークオートほか（Ｍａｒｑｕａｒｄｔａ
ｎｄ Ｔｏｄａｒｏ） 、前掲〕。分離；まμｍボンダ
ノ餉りＣ１８カラム〔１９ｍｍ粒径、０．３９ Ｘ ３
０ｃｚ、ウォータ・アソンエーテス（Ｗａｔｅｒ Ａｓ
５ｏｃｉａｔｅｓ、 Ｍｉｌｆ−ｏｒｄ、ＣＴ）製二を
用いて行なった。移動相は０．０５％水性トリフルオロ
酢酸であり、移動相変性剤はアセトニトリル含有０．０
４５％トリフルオロ酢酸であった。勾配は１．５ｄ／分
の流量で２時間でＯ〜６０％アセトニ） ＩＪルであっ
た。分子量は既知ポリペプチド標準物質で校正した２タ
ンデム連結ＴＳＫ２５０カラム〔ノマイオラド（Ｂｉｏ
−ｒａｄ）製二を用いてＣＩ８μｍボンダ／＜−）フカ
ラムからの４２〜４３％アセトニ） ＋Ｊル溶出ペプチ
ド（頚）について測定した。
なったつ 〔マークオートほか（Ｍａｒｑｕａｒｄｔａ
ｎｄ Ｔｏｄａｒｏ） 、前掲〕。分離；まμｍボンダ
ノ餉りＣ１８カラム〔１９ｍｍ粒径、０．３９ Ｘ ３
０ｃｚ、ウォータ・アソンエーテス（Ｗａｔｅｒ Ａｓ
５ｏｃｉａｔｅｓ、 Ｍｉｌｆ−ｏｒｄ、ＣＴ）製二を
用いて行なった。移動相は０．０５％水性トリフルオロ
酢酸であり、移動相変性剤はアセトニトリル含有０．０
４５％トリフルオロ酢酸であった。勾配は１．５ｄ／分
の流量で２時間でＯ〜６０％アセトニ） ＩＪルであっ
た。分子量は既知ポリペプチド標準物質で校正した２タ
ンデム連結ＴＳＫ２５０カラム〔ノマイオラド（Ｂｉｏ
−ｒａｄ）製二を用いてＣＩ８μｍボンダ／＜−）フカ
ラムからの４２〜４３％アセトニ） ＋Ｊル溶出ペプチ
ド（頚）について測定した。
生成物はＴＳＫ２５０ＨＰＬＣサイジングクロマトグラ
フイー（４５％アセトニトリル、０．０５％トリフルオ
ロ酢酸）により測定して１５〜２２ｋＤの見掛；す分子
量を有した。生成物）は’−１８μ−ボンダバンクカラ
ムかろ０．０５％水性トリフルオロ酢酸、ｐＨ１，９、
中の４２〜４３％（未補正ζ直）で溶出した。生成物は
（氏ｐＨ処理後にわずかな活性が失なわれたにすぎない
ので酸安定性であると６＋。
フイー（４５％アセトニトリル、０．０５％トリフルオ
ロ酢酸）により測定して１５〜２２ｋＤの見掛；す分子
量を有した。生成物）は’−１８μ−ボンダバンクカラ
ムかろ０．０５％水性トリフルオロ酢酸、ｐＨ１，９、
中の４２〜４３％（未補正ζ直）で溶出した。生成物は
（氏ｐＨ処理後にわずかな活性が失なわれたにすぎない
ので酸安定性であると６＋。
められた。アンチネオブラスチンの種畜に対する細胞増
殖抑制剤としての活性は次のよう；こ測定した。
殖抑制剤としての活性は次のよう；こ測定した。
増殖抑制剤検定
腫瘍増殖抑制検定は前に記載された検定二イワタ（１ｗ
ａｊａ）ほか、カンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓｅａｒｃｈ）（１９８５） ４５ ：２６８９〜２
６９４〕の変法であった。腫瘍細胞を９６ウ工ル組織培
養平板〔ナンク （Ｎｕｎｃ） １６７００８）上、
完全培地５０μ！中てｌＸｌ０’細胞／ウニルの密度で
継代培養した。活性について検定するカラム画分からの
部分、標本を、１Ｍ酢酸中のウシ血清アルブミン〔ジグ
７ （Ｓｉｇｍａ） Ａ −５３Ｑ ３ Ｅの１ｍｇ／
ｍ／２溶液５０μβを含む無菌１２Ｘ７５器管〔ファル
コン（Ｆａｌｃｏｎ） ２０５８ Ｅに移し凍結乾燥し
た。検定の直前に凍結乾燥試料を再び完全培地２００μ
β中に懸濁し、各ウェルに加えた再懸濁試料５０μ２で
三重検定した。細胞を増湿５％Ｃ○２−９５％空気雰凹
気中で３７℃で７２時間インキュベートし、次いでＣ１
２’ Ｉ〕ｄＵｄ ｒ（１μｃｉ／ｍ）Ｃアマ−ジャム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＩＭ３３５Ｖ：を含む完全培地１
００μｌと−ともに２４時間インキュベートした。単層
を１回すン酸塩援１針食塩水で洗浄し、メタノール中で
１０分間面足し、３０分間空気乾燥した。細胞に取り込
まれた。ＣＩ２５Ｉ〕ｄＵｄ ｒをｌＮ−ＮａＯＨ２０
）〕μβと可溶化し、６５℃で１時間インキニベートし
た。試料をタイターチク（Ｔｉｔｅｒｔｅｃ） （登
録商標）プラグに吸収させ、プラグを計数した。
ａｊａ）ほか、カンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓｅａｒｃｈ）（１９８５） ４５ ：２６８９〜２
６９４〕の変法であった。腫瘍細胞を９６ウ工ル組織培
養平板〔ナンク （Ｎｕｎｃ） １６７００８）上、
完全培地５０μ！中てｌＸｌ０’細胞／ウニルの密度で
継代培養した。活性について検定するカラム画分からの
部分、標本を、１Ｍ酢酸中のウシ血清アルブミン〔ジグ
７ （Ｓｉｇｍａ） Ａ −５３Ｑ ３ Ｅの１ｍｇ／
ｍ／２溶液５０μβを含む無菌１２Ｘ７５器管〔ファル
コン（Ｆａｌｃｏｎ） ２０５８ Ｅに移し凍結乾燥し
た。検定の直前に凍結乾燥試料を再び完全培地２００μ
β中に懸濁し、各ウェルに加えた再懸濁試料５０μ２で
三重検定した。細胞を増湿５％Ｃ○２−９５％空気雰凹
気中で３７℃で７２時間インキュベートし、次いでＣ１
２’ Ｉ〕ｄＵｄ ｒ（１μｃｉ／ｍ）Ｃアマ−ジャム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＩＭ３３５Ｖ：を含む完全培地１
００μｌと−ともに２４時間インキュベートした。単層
を１回すン酸塩援１針食塩水で洗浄し、メタノール中で
１０分間面足し、３０分間空気乾燥した。細胞に取り込
まれた。ＣＩ２５Ｉ〕ｄＵｄ ｒをｌＮ−ＮａＯＨ２０
）〕μβと可溶化し、６５℃で１時間インキニベートし
た。試料をタイターチク（Ｔｉｔｅｒｔｅｃ） （登
録商標）プラグに吸収させ、プラグを計数した。
表 １
毎ウェル取り込み
＋２５１−チオキシウリジン（ｃｐｍ）標 的
対照 ］し−２誘２誘迎制率ヒト腺癌（、Ａ３４９
） ４９０８ ２５０７ ５８％ヒト黒色
腫（Ａ３７５） ４２４５ １９２０ ５
５％ヒト黒色種（Ａ２０５８） ４０１２ ２４
７５ ３８％ヒト平、骨筋 ８９６７
ｇ９５８ ０％ヒト包皮腺維芽細胞 ２
７０３ ３０３９ ０％値は三重測定の平均を
表わし；ＩＬ−２ＦｉＷ発アンチネオプラスチンＨＰＬ
Ｃにより部分精製し、クンバク質約（００ｎ毎−培養の
量に相当するっ細胞密度はｌＸ１０’細抱毎試験であっ
た。ＩＬ−２誘発アンチネオブラスチンを第１日に加え
、ウェルを第４日に放射性トレーサーでパルスし、取り
込まれた＋２５ ■−デオキシウリジンの量を前に記載
された〔イワタ（１ｗａｔａ）、前掲〕のように上記結
果は新規な自然生成物をリンフォカイン例えばＩＬ−２
を用いるＴ−リンパ球殊にナチニラルキラー細胞の誘発
により得ることができることを示す、・生じた生成物は
腫瘍細胞を特異的に指向する細胞増殖抑制活性を有する
ことが認めろれた。従って、主題化合物は、宿主中の腫
瘍細胞の存在、免疫系殊にＴｉ［包、またはより特定的
にナチュラルキラー！Ｅｌ胞の活性の指標である二とが
できる主題化合物の存在に対する診断薬であることがで
きる抗体の製造に使用することができる。主題化合物は
試験管内および主体内で、それ自体、並びに他の腫瘍阻
止剤と組合せて腫瘍細胞の増殖の低下に使用することが
できる。
対照 ］し−２誘２誘迎制率ヒト腺癌（、Ａ３４９
） ４９０８ ２５０７ ５８％ヒト黒色
腫（Ａ３７５） ４２４５ １９２０ ５
５％ヒト黒色種（Ａ２０５８） ４０１２ ２４
７５ ３８％ヒト平、骨筋 ８９６７
ｇ９５８ ０％ヒト包皮腺維芽細胞 ２
７０３ ３０３９ ０％値は三重測定の平均を
表わし；ＩＬ−２ＦｉＷ発アンチネオプラスチンＨＰＬ
Ｃにより部分精製し、クンバク質約（００ｎ毎−培養の
量に相当するっ細胞密度はｌＸ１０’細抱毎試験であっ
た。ＩＬ−２誘発アンチネオブラスチンを第１日に加え
、ウェルを第４日に放射性トレーサーでパルスし、取り
込まれた＋２５ ■−デオキシウリジンの量を前に記載
された〔イワタ（１ｗａｔａ）、前掲〕のように上記結
果は新規な自然生成物をリンフォカイン例えばＩＬ−２
を用いるＴ−リンパ球殊にナチニラルキラー細胞の誘発
により得ることができることを示す、・生じた生成物は
腫瘍細胞を特異的に指向する細胞増殖抑制活性を有する
ことが認めろれた。従って、主題化合物は、宿主中の腫
瘍細胞の存在、免疫系殊にＴｉ［包、またはより特定的
にナチュラルキラー！Ｅｌ胞の活性の指標である二とが
できる主題化合物の存在に対する診断薬であることがで
きる抗体の製造に使用することができる。主題化合物は
試験管内および主体内で、それ自体、並びに他の腫瘍阻
止剤と組合せて腫瘍細胞の増殖の低下に使用することが
できる。
前記不発明（ま例示並びに説明および理解のための実施
例としてかなり詳細に記載されているけれども、一定の
変更および変形が特許請求の範囲内で実施できることが
明らかであろう。
例としてかなり詳細に記載されているけれども、一定の
変更および変形が特許請求の範囲内で実施できることが
明らかであろう。
Claims (10)
- （１）Ｔ細胞のリンフォカイン活性化により誘発するこ
とができ、凝集を嫌う条件下にサイジングクロマトグラ
フィーにより測定して１５〜２２ｋＤの範囲内の見掛け
分子量を有し、Ｃ＿１＿８μ−ボンダパックカラムから
約４２〜４３％アクリロニトリルおよび０．０５％水性
トリフルオロ酢酸、ｐＨ１．９で溶出することができる
、細胞成分を実質的に含まないアンチネオプラスチンか
ら実質的になる組成物またはその生物活性フラグメント
。 - （２）特許請求の範囲第（１）項記載のアンチネオプラ
スチン。 - （３）少くとも９０％の純度の、成長抑制検定により測
定して肺癌、結腸癌および乳癌から選ばれる腫瘍細胞に
対して１０〜１００ｎｇ毎ｍｌで細胞の５０％の成長を
抑制する最低活性を有するアンチネオプラスチン。 - （４）腫瘍細胞を増殖抑制量の特許請求の範囲第（１）
項記載の組成物と接触させることを含む腫瘍細胞の増殖
を抑制する方法。 - （５）腫瘍細胞を増殖抑制量の特許請求の範囲第（２）
項記載の組成物と接触させることを含む腫瘍細胞の増殖
を抑制する方法。 - （６）特許請求の範囲第（１）項記載の組成物の腫瘍細
胞増殖抑制量を生理的に許容される担体中に含む、腫瘍
細胞の増殖抑制用配合物。 - （７）特許請求の範囲第（１）項記載の組成物に特異性
の抗体。 - （８）少くとも約３０ｋＤの異質タンパク質に共有結合
した特許請求の範囲第（１）項記載の組成物を含む免疫
原。 - （９）特許請求の範囲第（２）項記載の組成物を製造す
る方法であって、 成長活性化量のリンフォカインを含む培地中でＴ細胞を
その増殖に十分な時間成長させ、前記Ｔ細胞を回収し、 前記細胞を溶解し、 前記組成物を他の細胞成分から分離する、 ことを含む方法。 - （１０）Ｔ細胞がナチュラルキラー細胞であり、リンフ
ォカインがＩＬ−２である、特許請求の範囲第（９）項
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87044086A | 1986-06-04 | 1986-06-04 | |
| US870440 | 1992-04-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6322100A true JPS6322100A (ja) | 1988-01-29 |
Family
ID=25355375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62139632A Pending JPS6322100A (ja) | 1986-06-04 | 1987-06-03 | インタ−ロイキン−２誘発抗腫瘍性ペプチド |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0248642B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6322100A (ja) |
| AT (1) | ATE81591T1 (ja) |
| AU (1) | AU612575B2 (ja) |
| CA (1) | CA1320906C (ja) |
| DE (1) | DE3782276T2 (ja) |
| ES (1) | ES2052562T3 (ja) |
| GR (1) | GR3006212T3 (ja) |
| IL (1) | IL82734A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1196958B (it) * | 1986-07-10 | 1988-11-25 | Ellem Ind Farmaceutica | Derivato di timo attivo per via orale, procedimenti per la sua preparazione e relative composizioni farmaceutiche |
| AU609128B2 (en) * | 1987-04-02 | 1991-04-26 | Amrad Operations Pty. Limited | Leukaemia-inhibitory factor |
| AU2019215034C1 (en) | 2018-02-01 | 2022-01-06 | Nkmax Co., Ltd. | Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer |
-
1987
- 1987-05-29 CA CA000538400A patent/CA1320906C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-01 IL IL82734A patent/IL82734A/xx unknown
- 1987-06-03 EP EP87304883A patent/EP0248642B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-03 JP JP62139632A patent/JPS6322100A/ja active Pending
- 1987-06-03 AT AT87304883T patent/ATE81591T1/de active
- 1987-06-03 DE DE8787304883T patent/DE3782276T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-03 AU AU73780/87A patent/AU612575B2/en not_active Ceased
- 1987-06-03 ES ES87304883T patent/ES2052562T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-11-12 GR GR920402144T patent/GR3006212T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| ES2052562T3 (es) | 1994-07-16 |
| AU7378087A (en) | 1987-12-10 |
| ATE81591T1 (de) | 1992-11-15 |
| IL82734A (en) | 1992-05-25 |
| IL82734A0 (en) | 1987-12-20 |
| EP0248642A2 (en) | 1987-12-09 |
| EP0248642B1 (en) | 1992-10-21 |
| EP0248642A3 (en) | 1989-11-02 |
| GR3006212T3 (ja) | 1993-06-21 |
| CA1320906C (en) | 1993-08-03 |
| AU612575B2 (en) | 1991-07-18 |
| DE3782276T2 (de) | 1993-03-04 |
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