JPS63222200A - アビジンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は卵白アビジンの製造方法に関し、更に詳しくは
卵白中のりゾチームやアビジン等の塩基性蛋白質を吸着
させた陽イオン交換樹脂から高純度のアビジンを効率的
に製造する方法に関するものである。

ここでいう卵白とは生卵白、乾燥卵白、濃縮卵白、冷凍
卵白等をいう。

卵白アビジンは、ニワトリ卵白中に０．００３％程度含
まれる分子量６．８００の塩基性蛋白質であ、るが１本
物質はビオチンと強固に結合する性質を有することから
、近年分子生物学の分野における架橋試薬として広く利
用され、特に酵素免疫法における架橋試薬として種々の
診断薬に使用され需要が増大しつつある。

（従来技術） 卵白アビジンはこのように卵白中の微量成分であるため
、精製工程で卵白成分中のアルブミン類やオボムコイド
等の他の蛋白質成分の夾雑が生じやす（高純度のアビジ
ンを得ることは難かしい。

従って、夾雑蛋白質を除くため塩濃度勾配溶出という工
業的な製造法としては不適当なりロフトグラフィー法を
行っている。

すなわちこの溶出方法は、まず卵白液の塩基性蛋白質を
吸着し、ついで無機塩を用いた濃度勾配法によるクロマ
トグラフィーでアビジン画分を抽出し、これを濃縮後共
存するりゾチームを結晶化させて除去し、更にＣＭ−セ
ルローズによるクロマトグラムを再度行い、同じ（塩濃
度勾配法によってアビジン画分を溶出して、これを濃縮
後硫安による結晶化を行い分離する方法が行われている
。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら前述の従来法においては、一度に少量しか
アビジンを溶出できない上に、溶出に時間と手間を要す
るため、工業的大量生産する製造前として不適当である
という問題があった。

また、アビジンは現在市販されているが、９３％程度の
純度のものしか得られず、これらは前述したような医薬
的用途にむかないのが現状である。

（問題点を解決するための手段） そこでアビジンの需要が増大しつつある今日において、
アビジンを高純度でかつ工業的に製造する技術の確立が
望まれていることから９本発明者等は鋭意研究を重ねた
結果、卵白中の塩基性蛋白質に低分子吸着用イオン交換
デキストランに吸着させると、リゾチームが吸着される
とともに、驚１くべきことに高分子のアビジンをも吸着
し、夾雑スルアルブミン類やオボムコイドなどを容易に
除去しうろことを見い出し、高純度のアビジンを効率よ
（容易に製造する本発明を完成するに至った。

すなわち９本発明は卵白中の塩基性蛋白質に低分子吸着
用イオン交換デキストランを使用して。

アビジンを吸着させて分離することを特徴とするアビジ
ンの製造方法に関する。

本発明の実施にあたっては、まず生卵白液、乾燥卵白、
濃縮卵白、冷凍卵白のリゾチーム、アビジン等の塩基性
蛋白を含む原料を用意し、濃縮卵白、乾燥卵白は適宜水
で稀釈するか、あるいは水戻しすることにより適当な固
形分濃度に調整すると共に９次に行う樹脂による吸着を
容易にするため、予めホモゲナイズし。

そのｐＨを６．５〜７．５に調整しておくことが望まし
い。

次に上記原料に弱酸性陽イオン交換樹脂を添加してリゾ
チームアビジン等の塩基性蛋白を吸着させる。

本発明で使用する弱酸性陽イオン交換樹脂としては、デ
ュオライト−〇−４６４　（ダイヤモンドシャロックケ
ミカル社製）、アンバーライトＩＲＯ−５０（ロームア
ンドハースター社製）、ダウエックスＭＷＣ−１（ダウ
ケミカル社製）、ダイアイオンＷＫ−１０（三菱化成工
業社製）などの弱酸性陽イオン交換樹脂が使用できる。

次に吸着させた弱酸性陽イオン交換樹脂を水洗して洗浄
した後、塩溶液で脱着する。

塩溶液としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
す）　＋７ウム等強酸・強塩基の塩の水に溶解した時ｐ
Ｈ６〜８．！１度２〜６９６付近のものを使用する。

この脱着処理により樹脂に吸着されたリゾチーム・アビ
ジン等の塩基性蛋白が塩溶液中に溶出するが、アルブミ
ン類やオボムコイドなどの夾雑蛋白も共存して溶出する
。そこで電導度２０ｍ５／ｃｍ以下、　ｐＨ５４）〜７
りの条件下で低分子吸着用イオン交換デキストランに吸
着させ、同条件下で充分に洗浄することにより共存する
アルブミン類やオボムコイドなどが充分に除去される。

低分子吸着用イオン交換デキストランは９分子０、２５
　（ファルマシア社製）等を用いる。

この吸着樹脂の脱着処理は、ｐＨ５〜８．濃度２〜６９
６付近の塩溶液２例えば塩化す）＋Ｊウム、塩化カリウ
ム、硫酸ナトリウム等の強酸６強塩基の塩溶液で行い９
次に該塩溶液に夾雑するリゾチームを食塩による結晶化
法や硫安分画等の塩折あるいはキチンや、非イオン交換
性の吸着剤〔例えばアンバーライトＸＡＤ−７（オルガ
ノ社製）〕等による吸着によって除去する。

硫安分画の場合、硫安濃度３０〜８０％飽和、好ましく
は５０〜７５％飽和で行い、ここで得られる両分から夾
雑アルブミン類やオボムコイド、更にはりゾチームなど
を充分にとりのぞいた高純度のアビジンが得られる。

〔実施例〕

実施例１ 生卵白ＩＬをホモジナイズ後２　Ｎ　−ＨＣＩを加えｐ
Ｈ６，５とする。次に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５）で緩衝化したデュオライトＣ−４６４１６０ｇｒ　
（ｗｅｔ）（ダイヤモンドシャロックケミカル社製）に
接触せしめアビジンを吸着させた後、°水により充分洗
浄して、３％ＮａＣ１溶液１５０　ｍＬで溶出しアビジ
ンを含む溶出液１５０耐が得られた。

この溶出液を水で希釈し電導度１２ｍ５／ｃｍ、　ｐ）
４６．５にしてからＣＭ−シェフアダツクスＣ，２５５
ｇｒ（ｄｒｙ）（ファルマシア社製）に接触させた。電
導度１２ｍ５／（３のＮａＣ１溶液（ｐＨ６，５）によ
って充分に洗浄し９次に３　％　ＮａＣ１溶液１００　
ｍＬで溶出を行う。得られる溶出液をｐＨ３，５に調整
し、　ＮａＣ１を５％となるように加え４℃で放置し夾
雑するリゾチームを結晶化除去し、アビジン液を得た。

このアビジン液に硫安濃度５０９６飽和になるよう硫安
を加え共存リゾチームを除去後、硫安７５％飽和に加え
た。得られる両分を炉別し、溶解後セロファン膜で透析
・脱塩後、凍結乾燥にてアビジン末３００萼を得た。（
収率１０％）実施例２ 生卵白１０Ｌをホモジナイズ後、２Ｎ−ＨＣＩを加えｐ
）！　６．５とし９次に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
−５）で緩衝化したデュオライトＣ−４６４１，６００
ｇｒ　（ｗｅｔ）（ダイヤモンドシャロックケミカル社
製）に接触せしめアビジンを吸着させた。水により充分
に洗浄し、３９６ＮａＣ１溶液１．５００ｉｄテ溶出し
、アビジンを含む溶出液１．５００１ＬＬが得られた。

この溶出液を限外が過で脱塩し、電導度５ｍｓ　／　Ｃ
１ｌ　、　ｐＨ６，５にしてからＣＭ−シェフアダツク
ｘ　Ｃ，２５３５ｇｒ（＆ｙ）　（７フル−ｖシｙ社製
）に接触させた。次に電導度５ｍ８／αのＮａα溶液（
ｐＨ６，５）により充分に洗浄し、　　３４　ＮａＣ！
１溶液１００ｍ１で溶出を行う。得られる溶出液をｐＨ
３，５に調整しＮａＣ１を５％となるように加え４℃に
放置し夾雑するリゾチームを結晶しアビジン液を得る。

このアビジン液に硫安濃度５０９６飽和になるよう硫安
を加え沈殿除去後さらに硫安７５９６飽和になるよう加
えて分画を行つた。得られる百分を炉別し、水で溶解し
、セロファン膜で透析・脱塩後凍結乾燥にてアビジン末
２．５ｇｒを得た。（収率８．３９６） （純度試験） 実施例１で得られたアビジンを次の条件によるゲル浸透
−高速液体クロマトグラフィーによって分析した結果純
度９８．７９６であった。

ゲル浸透−高速液体クロマトグラフィー（ｃｐｃ−ＨＰ
ＬＣ）の条件 カラム：　ＴＳＫゲルＧ　３．０００　ＳＷ、　７５　
ｃｍ　ＩＤＸ６０α溶　　媒：　０．Ｉ　Ｍ燐酸緩衝液
、　０．２　Ｍ　ＮａＣ１−流　速＝１．０耐１分 検出波長：　２７５　ｎｍ （効　果） 以上のごとく、卵白中のりゾチーム・アビジン等の塩基
性蛋白質を低分子吸着用イオン交換デキストランに吸着
させる処理を一度だけ行うだけで。

効率よくしかも高純度のアビジンを溶出することができ
るもので、工業的製造を容易にした。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、卵白中の塩基性蛋白質に低分子吸着用イオン交換デ
   キストランを使用してアビジンを吸着させて、分離する
   ことを特徴とするアビジンの製造方法。 ２、低分子吸着用イオン交換デキストランは、分子量１
   ０，０００程度の低分子量蛋白質を吸着する架橋デキス
   トランあることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   のアビジンの製造方法。 ３、低分子吸着用イオン交換デキストランから吸着した
   アビジンを脱着するにあたり３％〜５％の中性塩溶液を
   使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   アビジンの製造方法。 ４、低分子吸着用イオン交換デキストランからアビジン
   を脱着させた後、塩折またはおよび吸着によって、アビ
   ジンを分離することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載のアビジンの製造方法。