JPH0121836B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0121836B2 JPH0121836B2 JP17650381A JP17650381A JPH0121836B2 JP H0121836 B2 JPH0121836 B2 JP H0121836B2 JP 17650381 A JP17650381 A JP 17650381A JP 17650381 A JP17650381 A JP 17650381A JP H0121836 B2 JPH0121836 B2 JP H0121836B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gangliosides
- proteins
- mixture
- mixed
- elution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は医薬として有用なスフインゴ糖脂質、
とくにシアル酸残基を有するガングリオシドの精
製法に関するものである。 ガングリオシドは近年細胞表面に局在する特異
な活性分子として、神経機能のみならず、癌、炎
症、免疫、ウイルス感染、ホルモンレセプターな
どに関与することがわかつてきた。 またその分子内にシアル酸を有することにより
強い酸性を呈し、シアル酸のカルボキシル基を介
して、他の塩基性分子とのイオン結合、アルカリ
金属の受け渡し、あるいは特定条件下ではラクト
ンを形成する。さらにシアル酸のカルボキシル基
の存在により水溶性であるが、分子内のセラミド
のため、水に溶解した場合、ミセルを形成するこ
とがわかつており、その酸性度は１分子中に含ま
れるシアル酸の数により決定される。同じ数のシ
アル酸を有する場合にはシアル酸の結合位置の異
なる位置異性体が存在し、それらの酸性度は若干
ことなる。 以上のようなガングリオシドの多様性により、
ガングリオシドの精製は極めてむずかしいことが
わかつている。 本発明においてはスベネルホルム
（Svennerholm）により提案された命名法をもち
いた。すなわちモノ、ジ、トリおよびテトラシア
ル酸含有ガングリオシドに対して、略号Ｇの後に
それぞれＭ、Ｄ、ＴおよびＱをつけ、またそれぞ
れの位置異性体については文字の後に数字を付し
て区別した。 また本明細書中においては、とくにことわりの
ない限り、モノ、ジ、トリおよびテトラシアル酸
含有ガングリオシドの混合物をガングリオシドと
呼ぶこととする。 ガングリオシドは哺乳動物の神経組織中に多く
含有され、その他の臓器における含量は低い。こ
のためガングリオシドを得るための原料としては
通常ウシ脳灰白質が用いられている。 ガングリオシドの抽出法としては一般にクロロ
ホルム―メタノール（以下Ｃ―Ｍと略す）混合溶
媒法が常用され、被抽出原料の性状（例えばアセ
トン粉末、凍結乾燥組織、ホルマリン固定組織、
新鮮組織など）により適切なＣ―Ｍ混合比が選択
されている。またこの他のテトラヒドロフランを
用いる方法（E.G.Trams，C.J.Lauter，Biochim
Biophys Acta，60，350（1962））も知られてい
る。 Ｃ―Ｍ抽出法あるいはテトラヒドロフラン法で
得られたガングリオシドの精製は、通常ガングリ
オシドの酸性度を利用して、塩基性イオン交換
体、たとえばジエチルアミノエチル（DEAE）―
セルローズあるいはDEAE―セフアデツクスを用
いたクロマトグラフイーにより行われる。更にシ
アル酸含有量の異なるガングリオシドの単離は硅
酸カラムクロマトグラフイーが用いられる。しか
し神経組織中でのガングリオシドは組織のPHや１
価イオンの含量により蛋白質と強く結合し、この
ガングリオシド結合蛋白質は、ガングリオシドと
物理化学的性状が極めて類似しているため、イオ
ン交換クロマトグラフイーではガングリオシド中
に含有されている蛋白質の分離は極めて困難であ
る。例えばＣ―Ｍ抽出法とDEAE―セフアデツク
スカラムクロマトグラフイーの組合せにより精製
したガングリオシド中の蛋白質含量は３乃至８％
の範囲にあることがわかつた。 ガングリオシドを医薬あるいは機能研究に用い
る場合、混在する不純物とくに蛋白質を可及的に
除去、精製することが望ましいが、公知の方法で
得たガングリオシド中には３乃至８％の蛋白質を
含有しており、この除去方法が問題となる。 被精製物質より蛋白質の除去、精製法は大別し
て以下１）から５）に示す方法が知られている
が、以下に列記する。 １）は溶解度法と呼ばれる方法であり、塩析
法、有機溶媒法、重金属法、等電点法および非イ
オン性ポリマー法がこれに該当する。 ２）はクロマトグラフイー法で吸着溶離法、イ
オン交換法および二相分配法などあり、３）は分
子ふるい法と呼ばれるもので、ゲルろ過法、限外
過法および超遠心法が知られている。この他
４）電気泳動法、５）生物学的方法がある。 しかしいずれの方法を用いる場合においても被
精製物質と除去すべき蛋白質の物理化学的あるい
は生物学的性状およびその精製規模により制約を
うける。 ガングリオシドは水溶液あるいは極性溶媒中で
はミセルを形成することが知られ、また混在する
蛋白質はDEAE―セルロースまたはDEAE―セフ
アデツクスによるクロマトグラフイーではガング
リオシドと極めて類似した挙動を示すことがわか
り、このため１）、３）、４）および５）の方法は
適当でないことがわかつた。 ２）のクロマトグラフイー法によるガングリオ
シドのシアル酸含量の異なる各成分の単離につい
ては以下１）〜３）に示すような文献が知られて
いるが、この目的は各成分の単離であり、混在す
る蛋白質の除去、分離については詳細な検討は行
われていない。 １ Susumu Ando，Miyoko Isobe， Yoshitaka Nagai， Biochimica et Biophisica Acta， 424，98（1976） ２ Takashi Momoi，Susumu Ando， Yoshitaka Nagai， Biochimica et Biophisica Acta， 441，488（1976） ３ G.Tettamanti，F.Bonali， S.Marchesini，Y.Zambotti， Biochimica et Biophisica Acta， 296，160（1973） ガングリオシド中に含まれる蛋白質は単一の成
分ではなく、その物理化学的性状もわずかではあ
るが異つており、いずれも水溶性蛋白質であるこ
とがわかつた。文献１）から３）ではガングリオ
シドの成分単離に含水混合溶媒の濃度勾配法によ
り実施される。しかしこれらの方法はガングリオ
シドの成分単離を目的としない場合には実用的で
はなく、混在する蛋白質の除去は不充分であるこ
とがわかつた。そこでガングリオシド中に混在す
る蛋白質を除去する方法につき種々検討の結果以
下のごとき方法を確立した。すなわちガングリオ
シドを任意の混合割合の混合溶媒に溶解させたの
ち、吸着剤カラムに通して、ガングリオシドおよ
び蛋白質をカラムに吸着させ、段階的に混合溶媒
組成比を変えて溶出する。最後に極性溶媒による
溶出を行うが、この操作はカラムに吸着残存する
蛋白質を溶出するために行うものであつて、精製
には直接関係はなく、特に実施する必要はない。 上記操作を行つた後、更にカラムに吸着残存す
る蛋白質の分離、精製については適当な緩衡液に
よる濃度勾配法により達成される。 本発明に係る吸着剤とは硅酸、酸性白土および
活性炭などが望ましく、いずれか１種あるいは２
種以上を組合わせて使用してもよい。またアンバ
ーライトXAD樹脂のごとき合成吸着剤も使用す
ることが出来る。 ガングリオシドをカラムに吸着させるために
は、クロロホルム、塩化メチレンなどの非極性溶
媒とメタノール、エタノールなどの極性溶媒の混
合溶媒に溶解させるが、非極性溶媒と極性溶媒の
混合割合は任意に行つてよい。しかし好ましくは
混合割合が１：１（Ｖ／Ｖ）乃至３：１（Ｖ／Ｖ）
が望ましい。 カラムに吸着させたガングリオシドと蛋白質の
溶出分離は、まずクロロホルム、塩化メチレンな
どの非極性溶媒で溶出したのち、上記非極性溶媒
にメタノール、エタノールなどの極性溶媒を段階
的に増加させた混合溶媒で溶出する。この混合比
は特に限定するものではないが、混合溶媒中の極
性溶媒含量を10％づつ増加させるのが望ましい。
また溶出に要する混合溶媒量はそれぞれカラム容
量の２乃至10倍量でよいが４乃至８倍量が望まし
い。 非極性溶媒と極性溶媒の混合溶媒で段階的に溶
出した画分を濃縮して、目的とする画分を混合
し、適当な方法、たとえば再結晶法あるいは凍結
乾燥法などによる結晶化を行うことにより、精製
前とガングリオシドの成分組成比がほとんど変ら
ず、かつ蛋白質含量の極めて低い精製ガングリオ
シドを得ることが出来る。ここで目的とする画分
とは混合溶媒中の極性溶媒の含量が50乃至60％の
画分をさすものとする。 本発明の方法は予めカラムに吸着させたガング
リオシドおよび混在する蛋白質を、その物理化学
的性質を利用して、非極性溶媒と極性溶媒の混合
溶媒で段階的に溶出させることにより、精製前の
ガングリオシドの成分組成比を変えることなく、
蛋白質を除去することが出来る極めて有用な方法
である。 以下本発明の実施例について記述するが、本発
明はこれらの実施例のみに限定されるものではな
い。 実施例 １ 牛脳より公知の方法で得たガングリオシド18ｇ
（シアル酸含量29.9％、蛋白質含量54％）をＣ―
Ｍ（３：1V／Ｖ）混液200mlに溶解させ、予め同
一混液で充分洗浄したシリカゲルカラム（100メ
ツシユ、６×40cm）に吸着させた。次いで１）ク
ロロホルム４、２）Ｃ―Ｍ混液（３：1V／Ｖ）
１、３）Ｃ―Ｍ混液（３：2V／Ｖ）２、４）
Ｃ―Ｍ混液（１：1V／Ｖ）２、５）Ｃ―Ｍ混
液（２：3V／Ｖ）２、および６）メタノール
２で段階的に溶出した。それぞれの画分を濃縮
後、シアル酸および蛋白質を定量し、表１の結果
を得た。画分４）および５）を混合して凍結乾燥
し、15.3ｇの精製ガングリオシドを得た。収率85
％、シアル酸含量28.7％、蛋白質含量0.37％。精
製前後の各成分組成はシリカゲルプレート上に塗
付したのち、クロロホルム―メタノール―0.2％
塩化カルシウム水溶液（55：45：10V／Ｖ）展開
溶媒で展開後、レゾルシノール試薬を噴霧し、
120℃で10分間発色させたのちクロマトスキヤナ
ーで定量した。この結果を表２に示した。
とくにシアル酸残基を有するガングリオシドの精
製法に関するものである。 ガングリオシドは近年細胞表面に局在する特異
な活性分子として、神経機能のみならず、癌、炎
症、免疫、ウイルス感染、ホルモンレセプターな
どに関与することがわかつてきた。 またその分子内にシアル酸を有することにより
強い酸性を呈し、シアル酸のカルボキシル基を介
して、他の塩基性分子とのイオン結合、アルカリ
金属の受け渡し、あるいは特定条件下ではラクト
ンを形成する。さらにシアル酸のカルボキシル基
の存在により水溶性であるが、分子内のセラミド
のため、水に溶解した場合、ミセルを形成するこ
とがわかつており、その酸性度は１分子中に含ま
れるシアル酸の数により決定される。同じ数のシ
アル酸を有する場合にはシアル酸の結合位置の異
なる位置異性体が存在し、それらの酸性度は若干
ことなる。 以上のようなガングリオシドの多様性により、
ガングリオシドの精製は極めてむずかしいことが
わかつている。 本発明においてはスベネルホルム
（Svennerholm）により提案された命名法をもち
いた。すなわちモノ、ジ、トリおよびテトラシア
ル酸含有ガングリオシドに対して、略号Ｇの後に
それぞれＭ、Ｄ、ＴおよびＱをつけ、またそれぞ
れの位置異性体については文字の後に数字を付し
て区別した。 また本明細書中においては、とくにことわりの
ない限り、モノ、ジ、トリおよびテトラシアル酸
含有ガングリオシドの混合物をガングリオシドと
呼ぶこととする。 ガングリオシドは哺乳動物の神経組織中に多く
含有され、その他の臓器における含量は低い。こ
のためガングリオシドを得るための原料としては
通常ウシ脳灰白質が用いられている。 ガングリオシドの抽出法としては一般にクロロ
ホルム―メタノール（以下Ｃ―Ｍと略す）混合溶
媒法が常用され、被抽出原料の性状（例えばアセ
トン粉末、凍結乾燥組織、ホルマリン固定組織、
新鮮組織など）により適切なＣ―Ｍ混合比が選択
されている。またこの他のテトラヒドロフランを
用いる方法（E.G.Trams，C.J.Lauter，Biochim
Biophys Acta，60，350（1962））も知られてい
る。 Ｃ―Ｍ抽出法あるいはテトラヒドロフラン法で
得られたガングリオシドの精製は、通常ガングリ
オシドの酸性度を利用して、塩基性イオン交換
体、たとえばジエチルアミノエチル（DEAE）―
セルローズあるいはDEAE―セフアデツクスを用
いたクロマトグラフイーにより行われる。更にシ
アル酸含有量の異なるガングリオシドの単離は硅
酸カラムクロマトグラフイーが用いられる。しか
し神経組織中でのガングリオシドは組織のPHや１
価イオンの含量により蛋白質と強く結合し、この
ガングリオシド結合蛋白質は、ガングリオシドと
物理化学的性状が極めて類似しているため、イオ
ン交換クロマトグラフイーではガングリオシド中
に含有されている蛋白質の分離は極めて困難であ
る。例えばＣ―Ｍ抽出法とDEAE―セフアデツク
スカラムクロマトグラフイーの組合せにより精製
したガングリオシド中の蛋白質含量は３乃至８％
の範囲にあることがわかつた。 ガングリオシドを医薬あるいは機能研究に用い
る場合、混在する不純物とくに蛋白質を可及的に
除去、精製することが望ましいが、公知の方法で
得たガングリオシド中には３乃至８％の蛋白質を
含有しており、この除去方法が問題となる。 被精製物質より蛋白質の除去、精製法は大別し
て以下１）から５）に示す方法が知られている
が、以下に列記する。 １）は溶解度法と呼ばれる方法であり、塩析
法、有機溶媒法、重金属法、等電点法および非イ
オン性ポリマー法がこれに該当する。 ２）はクロマトグラフイー法で吸着溶離法、イ
オン交換法および二相分配法などあり、３）は分
子ふるい法と呼ばれるもので、ゲルろ過法、限外
過法および超遠心法が知られている。この他
４）電気泳動法、５）生物学的方法がある。 しかしいずれの方法を用いる場合においても被
精製物質と除去すべき蛋白質の物理化学的あるい
は生物学的性状およびその精製規模により制約を
うける。 ガングリオシドは水溶液あるいは極性溶媒中で
はミセルを形成することが知られ、また混在する
蛋白質はDEAE―セルロースまたはDEAE―セフ
アデツクスによるクロマトグラフイーではガング
リオシドと極めて類似した挙動を示すことがわか
り、このため１）、３）、４）および５）の方法は
適当でないことがわかつた。 ２）のクロマトグラフイー法によるガングリオ
シドのシアル酸含量の異なる各成分の単離につい
ては以下１）〜３）に示すような文献が知られて
いるが、この目的は各成分の単離であり、混在す
る蛋白質の除去、分離については詳細な検討は行
われていない。 １ Susumu Ando，Miyoko Isobe， Yoshitaka Nagai， Biochimica et Biophisica Acta， 424，98（1976） ２ Takashi Momoi，Susumu Ando， Yoshitaka Nagai， Biochimica et Biophisica Acta， 441，488（1976） ３ G.Tettamanti，F.Bonali， S.Marchesini，Y.Zambotti， Biochimica et Biophisica Acta， 296，160（1973） ガングリオシド中に含まれる蛋白質は単一の成
分ではなく、その物理化学的性状もわずかではあ
るが異つており、いずれも水溶性蛋白質であるこ
とがわかつた。文献１）から３）ではガングリオ
シドの成分単離に含水混合溶媒の濃度勾配法によ
り実施される。しかしこれらの方法はガングリオ
シドの成分単離を目的としない場合には実用的で
はなく、混在する蛋白質の除去は不充分であるこ
とがわかつた。そこでガングリオシド中に混在す
る蛋白質を除去する方法につき種々検討の結果以
下のごとき方法を確立した。すなわちガングリオ
シドを任意の混合割合の混合溶媒に溶解させたの
ち、吸着剤カラムに通して、ガングリオシドおよ
び蛋白質をカラムに吸着させ、段階的に混合溶媒
組成比を変えて溶出する。最後に極性溶媒による
溶出を行うが、この操作はカラムに吸着残存する
蛋白質を溶出するために行うものであつて、精製
には直接関係はなく、特に実施する必要はない。 上記操作を行つた後、更にカラムに吸着残存す
る蛋白質の分離、精製については適当な緩衡液に
よる濃度勾配法により達成される。 本発明に係る吸着剤とは硅酸、酸性白土および
活性炭などが望ましく、いずれか１種あるいは２
種以上を組合わせて使用してもよい。またアンバ
ーライトXAD樹脂のごとき合成吸着剤も使用す
ることが出来る。 ガングリオシドをカラムに吸着させるために
は、クロロホルム、塩化メチレンなどの非極性溶
媒とメタノール、エタノールなどの極性溶媒の混
合溶媒に溶解させるが、非極性溶媒と極性溶媒の
混合割合は任意に行つてよい。しかし好ましくは
混合割合が１：１（Ｖ／Ｖ）乃至３：１（Ｖ／Ｖ）
が望ましい。 カラムに吸着させたガングリオシドと蛋白質の
溶出分離は、まずクロロホルム、塩化メチレンな
どの非極性溶媒で溶出したのち、上記非極性溶媒
にメタノール、エタノールなどの極性溶媒を段階
的に増加させた混合溶媒で溶出する。この混合比
は特に限定するものではないが、混合溶媒中の極
性溶媒含量を10％づつ増加させるのが望ましい。
また溶出に要する混合溶媒量はそれぞれカラム容
量の２乃至10倍量でよいが４乃至８倍量が望まし
い。 非極性溶媒と極性溶媒の混合溶媒で段階的に溶
出した画分を濃縮して、目的とする画分を混合
し、適当な方法、たとえば再結晶法あるいは凍結
乾燥法などによる結晶化を行うことにより、精製
前とガングリオシドの成分組成比がほとんど変ら
ず、かつ蛋白質含量の極めて低い精製ガングリオ
シドを得ることが出来る。ここで目的とする画分
とは混合溶媒中の極性溶媒の含量が50乃至60％の
画分をさすものとする。 本発明の方法は予めカラムに吸着させたガング
リオシドおよび混在する蛋白質を、その物理化学
的性質を利用して、非極性溶媒と極性溶媒の混合
溶媒で段階的に溶出させることにより、精製前の
ガングリオシドの成分組成比を変えることなく、
蛋白質を除去することが出来る極めて有用な方法
である。 以下本発明の実施例について記述するが、本発
明はこれらの実施例のみに限定されるものではな
い。 実施例 １ 牛脳より公知の方法で得たガングリオシド18ｇ
（シアル酸含量29.9％、蛋白質含量54％）をＣ―
Ｍ（３：1V／Ｖ）混液200mlに溶解させ、予め同
一混液で充分洗浄したシリカゲルカラム（100メ
ツシユ、６×40cm）に吸着させた。次いで１）ク
ロロホルム４、２）Ｃ―Ｍ混液（３：1V／Ｖ）
１、３）Ｃ―Ｍ混液（３：2V／Ｖ）２、４）
Ｃ―Ｍ混液（１：1V／Ｖ）２、５）Ｃ―Ｍ混
液（２：3V／Ｖ）２、および６）メタノール
２で段階的に溶出した。それぞれの画分を濃縮
後、シアル酸および蛋白質を定量し、表１の結果
を得た。画分４）および５）を混合して凍結乾燥
し、15.3ｇの精製ガングリオシドを得た。収率85
％、シアル酸含量28.7％、蛋白質含量0.37％。精
製前後の各成分組成はシリカゲルプレート上に塗
付したのち、クロロホルム―メタノール―0.2％
塩化カルシウム水溶液（55：45：10V／Ｖ）展開
溶媒で展開後、レゾルシノール試薬を噴霧し、
120℃で10分間発色させたのちクロマトスキヤナ
ーで定量した。この結果を表２に示した。
【表】
Ｃ：クロロホルム，Ｍ：メタノール
【表】
実施例 ２
実施例１で用いたガングリオシド10ｇを塩化メ
チレン―メタノール（以下MC―Ｍと略す）
（１：1V／Ｖ）混液100mlに溶解させ、予め同一
混液で充分洗浄したシリカゲル―酸性白土（１：
1W／Ｗ）カラムに吸着させた。次いで１）塩化
メチレン２、２）MC―Ｍ（３：１）混液１、
３）MC―Ｍ（３：2V／Ｖ）混液１、４）MC
―Ｍ（１：1V／Ｖ）混液２、５）MC―Ｍ（２：
3V／Ｖ）混液２、６）メタノール１で段階
的に溶出し、それぞれの画分を濃縮後シアル酸お
よび蛋白質を定量し、表３の結果を得た。画分
４）および５）を混合して凍結乾燥し、8.62ｇの
精製ガングリオシドを得た。収率86.2％、シアル
酸含量29.1％、蛋白質含量0.42％。
チレン―メタノール（以下MC―Ｍと略す）
（１：1V／Ｖ）混液100mlに溶解させ、予め同一
混液で充分洗浄したシリカゲル―酸性白土（１：
1W／Ｗ）カラムに吸着させた。次いで１）塩化
メチレン２、２）MC―Ｍ（３：１）混液１、
３）MC―Ｍ（３：2V／Ｖ）混液１、４）MC
―Ｍ（１：1V／Ｖ）混液２、５）MC―Ｍ（２：
3V／Ｖ）混液２、６）メタノール１で段階
的に溶出し、それぞれの画分を濃縮後シアル酸お
よび蛋白質を定量し、表３の結果を得た。画分
４）および５）を混合して凍結乾燥し、8.62ｇの
精製ガングリオシドを得た。収率86.2％、シアル
酸含量29.1％、蛋白質含量0.42％。
【表】
Claims (1)
- １ 硅酸、酸性白土および活性炭などの無機吸着
剤あるいはアンバーライトXAD―２樹脂などの
合成吸着剤に蛋白質を含有するガングリオシドを
吸着させ、溶媒組成比を段階的に変えて溶出を行
つて、吸着剤より蛋白質を溶出除去したのち、ガ
ングリオシドの成分組成比を変えることなく、ガ
ングリオシドを選択的に吸着剤より溶出精製する
ことを特徴とする蛋白質の除去方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17650381A JPS5877894A (ja) | 1981-11-05 | 1981-11-05 | 蛋白質の除去方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17650381A JPS5877894A (ja) | 1981-11-05 | 1981-11-05 | 蛋白質の除去方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5877894A JPS5877894A (ja) | 1983-05-11 |
| JPH0121836B2 true JPH0121836B2 (ja) | 1989-04-24 |
Family
ID=16014775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17650381A Granted JPS5877894A (ja) | 1981-11-05 | 1981-11-05 | 蛋白質の除去方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5877894A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5747330A (en) * | 1996-06-05 | 1998-05-05 | Poli Industria Chimica | Antibiotic producing microbe |
| US7943750B2 (en) | 2007-06-18 | 2011-05-17 | Laboratoire Medidom S.A. | Process for obtaining pure monosialoganglioside GM1 for medical use |
| TW201534613A (zh) * | 2013-06-28 | 2015-09-16 | Daiichi Sankyo Co Ltd | 寡糖胜肽之純化方法 |
-
1981
- 1981-11-05 JP JP17650381A patent/JPS5877894A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5877894A (ja) | 1983-05-11 |
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