JPS63226285A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は線維系溶解酵素、特に修飾された組織型プラス
ミノーゲン活性化因子、その製法、それを含有する薬剤
組成物、および血栓症の治療におけるその使用に関する
。

〔従来の技術〕

組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡと略記す
る）酵素を構成するアミノ酸の配列、およびｔ−ＰＡを
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列はすでに知られ
ている〔ペニカ（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）ら、１９８３　；
Ｎａｔｕｒｅ　＊　３０１　、２１４　を参照されたい
〕。

ｔ−ＰＡ酵累の一部はヒトおよびネズミの上皮成長因子
と構造上相同であることが判明した〔バニャイ（Ｂａｎ
ｙａＬＬ、　　）ら、１９８３；ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、
。

１６３　、３７を参照されたい〕。アミノ酸残基４４か
ら９１マでのこの領域は１成長因子ドメイン１と名づけ
られた。このドメインの主要部である残基５１〜８６を
コードし且つ残基間および８７を部分的にコードする遺
伝情報は単一のエクソン上に存在する（−−（Ｎｙ、Ｔ
、）ら、１９８４　；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　、　８１　、５３５５を参照されたい〕
。

欧州特許出願第０２０７５８９号明細書は、成長因子ド
メインの領域が、特に天然ｔ−ＰＡのアミノ酸残基５１
〜８７の欠失により、修飾されたｔ−ＰＡを開示してい
る。欧州特許出願第０２３３０１３号明細書は、２７５
位がアルギニン！！、たけリジン以外のアミノ酸（特に
グルタミン）から成るｔ−ＰＡを開示している。

〔発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段〕

本発明者らは合や線維紫浴解作用を保持する修飾された
形のｔ−ＰＡ酵累を同足した。

本発明によれば、（ａ）成長因子ドメインの領域におい
て修飾され、且つ（ｂ）２７５位にアルギニンまたはり
ノン以外のアミノ酸を与えるよう修飾された線維素溶解
作用を有するプラスミノーゲン活性化因子が提供される
。

適当な成長因子ドメインの修飾（修飾（ａ））にはいく
つかのアミノ酸残基の除去または欠失、もしくは１個以
上のアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置換が含
まれる。

好適な面において、修飾（ａ）は成長因子ドメインの全
部または一部の欠失から成る。他の好適な面において、
修飾（ａ）はアミノ酸残基５１から８７までの領域で行
われ、特にこの領域が欠失される。

２７５位での１ｆｆｉ換（修飾（ｂ））に適したアミノ
酸は親水性および太ささの点でアルギニンに類似したも
のである。こうしてヒスチジン、トレオニン、セリン、
アスパラキン、アスパラギン酸、グルタミンおよびグル
タミン酸が好適である。その他の適当なアミノ酸にはア
ラニンおよびグリシンが含まれる。

さらに好適な面において、修飾（ｂ）は２７５位のアミ
ノ酸がグルタミンであるようなものである。

不明細舎中で用いる１組織型プラスミノーゲン活性化因
子１なる月給は、１９８２年７月２７日にイタリー国ベ
ルガモで開催された、血栓症およびうつ血に関する国際
委員会の第Ｘ罵ミーティングでｔ−ＰＡについて定義さ
れた免疫学的性質を有するグループのプラスミノーゲン
活性化因子を意味する。

いろいろな形のｔ−ＰＡのアミノ酸配列が知られている
。前記文献Ｎａｔｕｒｅ　１９８３　　はｔ−ＰＡのＬ
鎖および成熟Ｓ鏡影のアミノ酸配列を開示しておル、ま
たベー７−（Ｖｅｈａｒ　）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙｓ１９８４．２，１０５１〜７　にも論じられ、
そこには初めに形成されたｔ−ＰＡをプロ配列の除去に
よシプロセツシングしてＳ鏡影を得ることが報告されて
いる。ボーｋ　（Ｐｏｈｌ　）ら、ＦＥＢＳ　１ｅｔｔ
ｅｒｓ＊１９８４ｔｖｏｌ、１６８　Ｎａ　１　、２９
〜３２はｔ−ＰＡのＮ末端多様性について言及しており
、Ｕ鏡影を開示している。本明細書で使用するｔ−ＰＡ
のアミノ酸配列のナンバリング方式は、前記文献Ｎａｔ
ｕｒｅ１９８３で成熟（Ｓ鎖）　ｔ−ＰＡについて記載
されたものであシ、Ｎ末端セリンに１の番号が付けられ
る。この方式によれば、Ｌ鎖ｔ−ＰＡは一３位にＮ末端
グリシン残基を有し、そしてＵ鎖ｔ−ＰＡは４位にＮ末
端バリンを有する。本発明に従って修飾された組織型プ
ラ本発明の修飾ｔ−ＰＡは、既知のｔ−ＰＡ含有複合体
（例えば以下の（ａ）〜（ａ））に類似した薬学的に有
用な複合体を与えるように誘導される：（ａ）　　欧州
特許出願第０１５５３８８号明細書に記載されるような
酵素−タンパク質複合体であって、繊維素溶解作用に関
与する酵素の触媒部位が可逆的な結合基を介してそれに
結合されたヒトタンパク質によシ遮断された複合体； （ｂ）　　欧州特許出願第０１５２７３６号明細書に記
載されるような酵素−タンパク質複合体°であって、少
なくとも１つの任意に遮断された線維素溶解酵累が繊維
素溶解作用に関与する触媒部位以外の部位によって、少
なくとも１つのヒトタンパク質に結合された複合体； （ｃ）　　欧州特許出願第０１８３５０３号明細書に記
載されるようなタンパク質−ポリマー複合体であって、
少なくとも１つの水溶性ポリマーに可逆的結合基を介し
て薬学的に有用なタンパク質が結合された複合体；また
は （ｄ）　　欧州特許出願第０１８４３６３号明細書に記
載されるような酵素複合体であって、複数の線維素溶解
酵素がその活性中心を介して除去可能な遮断基により一
緒に結合された複合体。

本発明の修飾ｔ−ＰＡは上記複合体のいずれかの、適宜
に、酵素または（ヒト）タンパク質としてｔ−ＰＡＱ代
わりに使用される。

本発明の修飾ｔ−ＰＡまたはその複合体は、繊維素溶解
作用にとって不可欠の触媒部位が除去可能な遮断基で任
意に遮断されるようにさらに誘導される。

修飾ｔ−ＰＡの上記誘導体は、修飾ｔ−ＰＡそれ自体に
ついて以後に記載する方法および組成物において使用し
うる。

本明細書中で用いる１除去可能な遮断基１なる表現は、
加水分解の擬−次速度定数が等張水性媒体（ｐＨ７，４
）中３７℃で１０〜６／秒〜１０１／秒の範囲であるよ
うな速度で加水分解により除去できる基を包含する。こ
のような遮断基は欧州特許第０００９８７９号明細書に
開示されておシ、任意に置換されたベンゾイルまたは任
意に置換されたアクリロイルのよりなアシル基を含む。

ベンゾイル遮断基のための適当な任意置換基はノ・ロゲ
ン、Ｃト。

アルキル、Ｃトロアルコキシ、Ｃト、アルカノイルオキ
シｓ　Ｃ１−ＩＩアルカノイルアミノ、アミノまたはｐ
−グアニジノである。アクリロイル遮断基のための適当
な任意置換基はＣ１−８アルキル、フリル、フェニルま
たハＣｔ−ＩＩアルキルフェニルテアル。

さらに別の面において、本発明は修飾された組織型プラ
スミノーゲン活性化因子をコードするＤＮＡを組換え宿
主細胞内で発現させ、その後修飾された組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子産物を回収することから成る。本発
明の修飾された組織型プラスミノーゲン活性化因子の製
法を提供する。

従って％　ｔ−ＰＡの修飾は、ｔ−ＰＡをコードするｃ
ＤＮＡが修飾されて、その修飾ｃＤＮＡが原核または真
核細胞宿主内で発現される慣例的な遺伝子工学の手法を
用いて実施される。

修飾ｔ−ＰＡをコードするヌクレオチド配列から成るＤ
ＮＡポリマーも本発明の一部を構成する。

本発明方法はマニアチス（Ｍａｎｌａｔｉａ　）　Ｇ：
ｒ　ｓモレキュア５−クローニンク：実験室マニュアル
、コールド・スフリング・ハーバ−、１９８２ＫＨｅｌ
ｉＲすれるような慣用の遺伝子組換え技術を用いて行わ
れる。

詳細には、本方法は次の諸工程： １）修飾された組織型プラスミノーゲン活性化因子なコ
ードするヌクレオチド配列から成るＤＮＡポリマーを、
宿主細胞内で発現しうる複製可能な発現ペクターを作製
する工程； １ｉ）　　宿主細胞を前記ペクターで形質転換する工程
；１１１）形質転換した宿主細胞を、前記ＤＮＡポリマ
ーの発現を可能にする条件下で培養して、修飾された組
織型プラスミノーゲン活性化因子を産生せしめる工程；
および ＩＶ）　　その修飾された組織型プラスミノーゲン活性
化因子を回収する工程； から成っている。

本発明はまた適当なモノ−、ジ−またはオリゴマーヌク
レオチド単位を縮合することによるＤＮＡポリマーの製
法を提供する。この方法は化学的に、酵素的に、または
前記２つの方法の組合せにより、適宜にｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで実施される。従って、　ＤＮ
Ａポリマーは適当なりＮＡフラグメントの酵素的連結反
応、例えばロバーツ（Ｄ、Ｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉａｔｒＹ　１９８５　、２４　、５０９
０〜５０９８に記載されるような慣用方法、Ｋより製造
することができる。ＤＮＡフラグメントは必要なヌクレ
オチド゛　配列を含むＤＮＡを適切な制限酵素で消化す
るか、化学的に合成するか、酵素的に重合するか、また
はこれらの方法を組み合わせることにより得られる。制
限酵素による消化は適当な緩衝液中２０″〜７０°Ｃの
温度で一般にはＯ９１〜１０μｇのＤＮＡを含む関μｌ
またはそれ以下の容量で行われる。

ＤＮＡの酵素的重合は必要に応じてヌクレオシド三リン
酸ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ％ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含
む適当な緩衝液中１０″〜３７℃の温度で、一般には（
資）μｌ以下の容量にて、　ＤＮＡポリメラーゼ１（フ
レノウ断片）のようなりＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ
　ｖｉｔｒｏで実施される。ＤＮＡフラグメントの酵素
的連結反応は０．０５Ｍ　）リス（…７．４）、０．０
１ＭＭ１Ｃ１ｘ　、０．０１Ｍジチオトレイトール、１
城スペルミジン、１ｍＭＡＴＰおよび０．１■／就ウシ
血清アルブミンのような適当な緩衝液中４℃から室温ま
での温度で、一般には関μ！以下の容量にて、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼの如きＤＮＡリガーゼを用いて実施される。

ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学的合成は１遺
伝予断片の化学的および酵素的合成−実験室マニヱアル
”　（Ｈ，Ｇ、ガラセンおよびＡ、ラング編集）、フエ
アラーグ・ケミ−・ワインハイム（１９８２）、または
他の科学文献、例えばゲイト（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ　）、
マテス（Ｈ６Ｗ、ＤｏＭａｔｔｈｅａ　）、シン（Ｍ、
Ｓｉｎｇｈ　）、スプμ−）　（Ｂ、Ｓ、５ｐｒｏａｔ
　）およびチトマス（Ｒ０Ｃ６Ｔｉｔｍａｓ　）、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈｓ　１９８２
，１０，６２４３；　Ｘブロード（Ｂ、Ｓ。

５ｐｒｏａｔ　）およびパンワース（Ｗ、Ｂａｎｎｗａ
ｒｔｈ　）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
　ｅ１９８３，２４　ｓ　５７７１；　　マテツテ（Ｍ
、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　）およびカルサースＣＭ、
Ｈ０Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　　）ｓ　　Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓｓ１９８０ｓ２１　ｅ７１９　
；　ｆチッチおよびカルサース、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃ
ｉｅｔ）ｒ、　１９８１　参１０３　＊３１８５　；ア
ダムス（Ｓ、Ｐ、Ａｄａｍｓ　）ら、Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５
ｏｃｉｅｔ７ｓ１９８３＊１０５＊６６１；シンハ（Ｎ
、Ｄ、５１ｎｈａ）、ビアナツト（Ｊ。

Ｂｉｅｒｎａｔ　）、マクマナス（ＪｏＭｃＭａｎｎｕ
ｓ　）、およびコースタ−（Ｈ，Ｋｏｅｓｔｅｒ　）、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈｓ　１９
８４　＊　１２　、４５３９；およびマチＸ　（ＨｏＷ
。

Ｄ、Ｍａｔｔｈｅｓ　）ら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌｓ
　１９８４　ｅ　３　ｅ　８０１に記載されるような固
相法を用いて、慣用のホスホトリエステル、ホスファイ
トまたはホスホルアミダイト化学により実施される。

修飾ｔ−ＦＡをコードするＤＮＡポリマーは、ウィンタ
ー（Ｇ、Ｗｉｎｔｅｒ　）ら、Ｎａｔｕｒｅｓ　１９８
２　＊　２９９　ｅ７５６〜７５８またはシーラー（Ｚ
ｏｌｌｅｒ　）およびスミス（Ｓｍ１ｔｈ　）　ｅ　１
９８２＋Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｇｏ、１０．６４
８７〜６５００に記載されるような慣用方法による組織
型プラスミノーゲン活性化因子をコードするｃＤＮＡの
特定部位突然変異誘発により、あるいはチエン（Ｃｈａ
ｎ　）およびスミス（Ｓｍｆｔｈ　）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ
ｌｄｇＲｅａ、　＝　１９８４　＃　１２　ｓ　２４０
７〜２４１９またはウィンターらＢｉｏｅｈ＠ｍ、Ｓｏ
ｃ、Ｔｒａｎｓ、　＋　１９８４　＋　１２　ｅ　２２
４〜２２５に記載されるような欠失突然変異誘発により
製造しうる。

詳細には、この製法は欧州特許出願第０２０７５８９号
明細書に記載される突然変異誘発法と、欧州特許出願第
０２３３０１３号明細書に記載されるようなアルギニン
−２７５をコードするヌクレオチド１０１２〜１０１４
により形成されるコドンでのｔ−ＰＡコード化ｅ　ＤＮ
Ａの特定部位突然変異誘発と、の同時適用または逐次適
用により実施される。従って、この製法は（修飾（ａ）
を与えるために）成長因子ドメインをコードする領域と
、（修飾（ｂ）を４えるために）アルギニン−２７５を
コードするコドンと、における天然ｔ−ＰＡをコードす
るｃＤＮＡの同時突然変異誘発を包含する。また別法と
して、この製法は修飾（ａ）および（ｂ）の一方をもつ
ｔ−ＰＡをコードするＤＮＡの突然変異誘発を行って、
他方の修飾を与えることを包含する。

また好ましくは、ＤＮＡポリマーは修飾（ａ）を含むｔ
−ＰＡの部分をコードする第１　ＤＮＡフラグメントと
、修飾（ｂ）を含むｔ−ＰＡの部分をコードする第２Ｄ
ＮＡフラグメントと、の酵素的連結反応により製造され
る。ＤＮＡフラグメントはそれぞれ修飾（ａ）　ｔたは
修飾（ｂ）を含むｔ−ＰＡをコードするＤＮＡポリマー
の消化によシ得られることができる。有利には、双方の
ＤＮＡポリマーに対して、両方の修飾部位間または潜在
的修飾部位間に存在する同一の制限部位が選ばれ、それ
により生成したフラグメント同士を連結させてｔ−ＰＡ
ＤＮＡ配列（但し修飾（ａ）および（ｂ）を含む）を再
構成しうる。有利な制限部位はＮａｒ　１部位である。

組換え宿主細胞による修飾ｔ−ＰＡコード化ＤＮＡポリ
マーの発現は、その宿主細胞内でＤＮＡポリマーを発現
しうる複製可能な発現ペクターを用いて行われる。この
発現ペクターは新規でアリ、これも本発明の一部を構成
する。

複製可能な発現ペクターは、本発明に従って、宿主細胞
と適合するペクターを切断して完全なレプリコンをもつ
線状ＤＮＡセグメントを作シ；その線状セグメントと、
修飾された組織型プラスミノーゲン活性化因子をその線
状セグメントと一緒になってコードする１つまたはそれ
以上のＤＮＡ分子（例えば修飾ｔ−ｐＡまたはその断片
をコードするＤＮＡポリマー）とを、連結条件下で連結
させる；ことによシ作製される。従って、ＤＮＡポリマ
ーはペクターの構築に先立って形成されるか、あるいは
ペクターの構築時に形成される。

ペクターの選択は宿主細胞（原核または真核細胞であυ
うる）によってその一部が左右されるであろう。適当な
ペクターにはプラスミド、バクテリオファージ、コスミ
ドおよび組換えウィルスが含まれる。

＃ｊｌ可能な発現ペクターの作製はＤＮＡの制限、重合
および連結反応のための適当な酵素を用いて慣例的に、
例えばマニアテスらの上記文献に記載される方法により
実施される。制限、重合および連結反応はＤＮＡポリマ
ーの製造について上述したように行われる。

組換え宿主細胞は、本発明に従って、宿主細胞を、形質
転換条件下に本発明の複製可能な発現ペクターで形質転
換することによシ作られる。適当な形質転換条件は慣例
的でちり、例えばマニアテスらの上記文献、または’　
ＤＮＡクローニング１Ｖｏ　ｌ　、１１　ｅ　Ｄ、Ｍ、
グローバー編集、ＩＲＬプレス社。

１９８５に記載されている。

形質転換条件の選択は宿主細胞によって決まる。

従って大腸菌のような細菌宿主はＣａＣ１ｔの溶液で処
理される〔コーエン（Ｃｏｈｅｎ　）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、１９７３，６９　、２１１０を参
照〕か、あるいはＲｂＣＪ、　ＭｎＣ１５−酢酸カリウ
ムおよびグリ六ロールの混合物から成る溶液での処理後
に、３−（Ｎ−モルホリノ〕プロパン−スルホン酸、Ｒ
ｈ（Ｊオ！びグリセロールで処理される。呻乳動物の培
養細胞はその細胞上へのペクターＤＮＡのカルシウム共
沈により形質（換される。本発明は本発明の複製可能な
発現ペクターで形質転換された宿主細胞にも及ぶ。

αつ、ポリマーの発現を可能にする条件下での形質転換
宿主細胞の培養は慣例的に、例えば先に引用したマニア
チスらの文献および’　ＤＮＡクローニング１に記載さ
れるように実施される。こうして好ましくは細胞は栄養
素を補給して４５”Ｃ以下の温度で培養する。

修飾ｔ−ＰＡの発現産物は宿主細胞に応じて慣用方法に
より回収される。宿主細胞が大腸菌のような細菌である
場合はその細菌を物理的、化学的または酵素的に溶菌し
、得られた溶菌液からタンパク質産物を単離する。宿主
細胞が哺乳動物細胞である場合は、その産物を一般に栄
養培地から単離する。ＤＮＡポリマーは修飾ｔ−ＰＡを
発現する安定した形質転換哺乳動物細胞株の単離のため
に考案されたペクター（例えば、ウシパピローマウィル
１９８５　；カウフマン（ＫａｕｆｍａｎｓＲｓ　Ｊ、
　）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｓ　５　＃　１７５０″′１７５Ｌ
１９８５　；バプラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ＋Ｇ、Ｎ、
　）およびハマ−（Ｈａｍｅｒ＋Ｄ、Ｈ，）　＊　Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　
Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｓｖ　（ＵＳＡ　
）８０　ｍ３９７〜４０１　、１９８３　；ゴーデル（
Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、　）ら、欧州特許出願第００
９３６１９号明細書、１９８３を参照されたい〕。

本発明に従って生産された修飾ｔ−ＰＡは、宿主細胞に
応じて、いろいろな程度にグリコジル化されることが理
解されるであろう。さらに、ボール（Ｐｏｈｌ　）ら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ７ｓ１９８４，２３　＄　３７
０１〜３７０７に記載されるように、自然界に存在する
非修飾ｔ−ＰＡにもいろいろな程度のグリコジル化が見
られる。本発明の修飾ｔ−ＰＡはこのようなグリコジル
化誘導体をも包含することが理解されるだろう。

本発明の修飾ｔ−ＰＡは適当には薬剤組成物の形で投与
される。従って、本発明はさらに薬学的に許容される担
体と共に本発明の修飾ｔ−ＰＡを含有してなる薬剤組成
物を提供する。

本発明組成物はヒトへの静脈内投与に適した薬剤組成物
として慣用方法に従って配合される。一般に、静脈内投
与用組成物は滅菌等張水性緩衝液中の滅菌酵素の溶液で
ある。必要な場合には、本組成物は修飾ｔ−ＰＡを溶解
状態に保つための可溶化剤、および注射箇所の痛みを和
らげるための局所麻酔剤（例えばリグノカイン）をさら
に含むことができる。総じて、修飾ｔ−ＰＡは活性単位
のタンパク質量を示すアンプルや小袋のような気密封止
容器中に収容された乾燥粉末または水不含濃厚液として
、単位剤形で供給されるであろう。修飾ｔ−ＰＡが除去
可能な遮断基を含む場合には、遊離タンパク質の放出さ
れる時間を表示する。タンパク質が輸液によって投与さ
れる場合は、薬品縁の滅菌１注射用水１．ｊたは食塩水
を含む輸液ボルトが同時に供給されるだろう。タンパク
質が注射によって投与される場合は、注射用滅菌水また
は食塩水のアンプルが同時に供給される。注射または輸
液用組成物は投与前に諸成分を混合することによシ調製
されるだろう。投与する物質のけは必要とされる線維素
溶解量および溶解速度、血栓塞栓症の程度、ならびに血
塊の位置および大きさにより左右されるだろう。正確な
投与量および投与方法社必然的に病気の本質を考慮しな
がら諸般の状況に応じて主治医が決定しなければならな
い。しかしながら、一般に成熟期、初期または発生期の
血栓を治療しようとする患者は０．０１〜１０　ｍ９／
　ｋｇ（体重）の１日分の用量を、例えば５回までの注
射により又は輸液により投与されるであろう。

上記の投与量範囲内では、本発明化合物に関して毒物学
的副作用が全く見られなかった。

従って、本発明の別の面では、患者に無毒かつ有効量の
本発明修飾ｔ−ＰＡを投与することから成る血栓症の治
療方法が提供される。

本発明はまた治療用活性物質として、特に血栓症の治療
に使用するための本発明の修飾ｔ−ＰＡを提供する。

以下の実施例は本発明を例示するためのものである。

実施例１ ５　’　ａ　（ＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧ
　）　３　’上記１８−ｍａｒ（オクタデカマー）はア
プライド・バイオシステムズ３８１　Ａ　ＤＮＡ合成機
を使用して、製造者の推せんする条件下で固相ホスホル
アミダイト法により製造した。生成物は後述するイオン
交換高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し
、生成物のこれ以上の精製は行わなかった。

収蓋はＩＩＲｔ中に溶解したとき２００Ｄ単位（２６゜
ｎｍ）であった。

実施例２および３で使用した方法 ＤＮＡの切断 一般に、約１μｇのプラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラ
グメントの切断は適当な緩衝溶液約２０４中で（１種ま
たはそれ以上の）制限酵素約５単位を用いて行った。

平滑末端が必要な場合は、ＤＮＡ調製物をＤＮＡポリメ
ラーゼ１のフレノウ断片で処理することにょシ形成させ
た（モレキュラー・クローニンク：実験室マニュアル、
コールド０スフリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９
８２を参照されたい）。

オリゴヌクレオチドの５１末端標識 オリゴヌクレオチドへの放射性標識ホスフェート基の付
加はマクサム（Ｍｎｘｈｍ　）およびギルバート（Ｇ１
１ｂｅｒｔ　　）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ＋Ｖｏｌ。

６５　、　ｐ、４９９〜５６０Ｉグロスマンおよびモル
デーブ編集、アカテミックプレス発行、　１９８０に記
載されるように実施した。

ＤＮＡフラグメントの連結 連結反応はマニアチスら、モレキュラー・クローニング
：実験室マニュアル、コールド・スフリング・ハーバ−
・ラボラトリーズ１９８２に記載されるように実施した
。

形質転換 塩化カルシウムでの処理を用いて、Ｍ　１３　ＤＮＡを
細菌細胞に形質転換した（コーエンら、１９７３　。

Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、す、　２１１０を参照）。

プラスミドＤＮＡの大腸菌ＨＢ　１０１細胞への形質転
換はハナハ７　（Ｈａｎａｈａｎ　）　＊　ＤＮＡクロ
ーニング。

Ｖｏｌ、１　ｍチャプター６　、　Ｄ、Ｍ、グ０−７＜
　−編集。

ＩＲＬブレス、　１９８５に記載のプロトコール３（但
しＲＦ’Ｉとのインキュベーションは５分間であった）
を用いて行った。

ＲＮＡはＴＲＢＭ　６細胞株〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎｅ
　）ら、１９８５　ｅＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　
）（ａｅｍｏｓｔａｓｉｓ會５４　ｍ　４２２′４２４
を参照〕から熱フェノール／　ＳＤＳ抽出〔スコツト（
Ｍ、Ｒ，Ｄ、５ｃｏｔｔ　）　、　１９８２．Ｐｈ、Ｄ
、Ｔｈｅｓｉｓ　（博士論文）、ロンドン大学を参照〕
により単離し。

オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーを使用してメ
ツセンジャーＲＮＡを精製した。ＴＲＢＭ　６ｃＤＮＡ
ライブラリーは本質的にスコツト、Ｐｈ、Ｄ。

Ｔｈｅｓｉａｓ１９８２ｓロンドン大学に記載されるよ
うにして、このメツセンジャーＲＮＡかう２　本’ＪＡ
　ｃＤＮＡを合成することにより確立した。とのｃＤＮ
Ａ調製物はＢｆｌｌ　ｎで消化し、バイオゲルＡ　１５
０カラムで大きさに基づいて分画化し、そしてＩ）ＡＴ
　１５３ペクター（Ｎｒｕ　］部位にＢｇｌ　１１リン
カ−を導入して修飾したもの）に連結した。得られたＤ
ＮＡクローンは大腸菌Ｋ　１２　ＤＨＩ細胞細胞層殖さ
せた。ｔ−ＰＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎｅ　）ら、１９８５．Ｇｅｎｅ
　３３　、２７９〜２８４を参照〕を使用して、ｃＤＮ
Ａライブラリー中のｔ−ＰＡｃＤＮＡクローンを同定し
た。このクローンはｐＴｆ（１０８として知られ、そし
て成熟ｔ−ＰＡタンパク質をコードする２ＫｂのＢｇｌ
　ＩＩフラグメントを保有している〔ベニ力（Ｐｅｎｎ
１ｃａ　）ら、１９８３　＋Ｎａｔｕｒｅ＋μ見、２１
４〜２２見金２１４〜 ２２１ＤＮＡクローンλＴＲｌ０は第２のＴＲＢＭ　６
ｃＤＮＡライブラリーから単離された。このｃＤＮＡラ
イブラリーは”　ＤＮＡクローニング”　Ｖｏｌ、　ｌ
　ｍチャプター２および３　（Ｄ、Ｍ。グローバー編集
、　ＩＲＬプレス、　１９８５　）に記載されるように
してλ、！＠ｔｌ。

ペクターを用いて作製された。このライブラリーは前記
方法を使用して適当なｔ−ＰＡ％異的オリゴヌクレオチ
ドプローブおよびプラスミドプローブによりスクリーニ
ングした（ブラウンら、　　１９８５゜Ｇｅｎｅｅ盃、
２７９〜２８４を参照）。このライブラリーから単離さ
れたクローンλＴＲ１０はｐＴＲ１０８中のそれらの５
１側に、プレプロコード領域および５１非翻訳領域の一
部に相当する追加のＤＮＡを保有している（ベニ力らｂ
　　１９８３＋Ｎａｔｕｒｅ　＋３０１　＋　２１４〜
２２１を参照）。

ｍ−のＮ１３ファージプラークを採取して、大腸菌ＢＭ
Ｅ（７１−１８株の新しい一晩培養液と２ＹＴ　（１，
６チバクトトリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣ１
）との１　：　１００希釈物中に加えた〔グローネンボ
ーン（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ　）ら、１９７６　＊Ｍｏ
１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１４Ｌ２４３〜２５０を参照
〕。この培養物を振とうしながら３７℃で５〜６時間増
殖させた。その後細菌を沈殿させ、上清を残しておいた
。これに２００　ｌＬｅの２．５　Ｍ　ＮａＣＡ！　、
　２０　Ｚ　ＰＥＧ　６０００を加え、この混合物を室
温で１５分間インキュベーションした。この混合物はエ
ッペンドルフ微小遠心機で５分遠心し、得られたファー
ジ沈殿物を１００４の１０ｒｒＩＮ１トリス（ｐＨ７，
９）、０　、１　ｎ１ｒｖｉ　ＥＤＴＡに再懸濁した。

フェノール抽出後、ファージＤＮＡをエタノールで沈殿
させた。このＤＮＡ沈殿物を７０％エタノールで洗い、
自然乾燥させ、そして３１１１１Ａｌの１０ｍＭ　）リ
ス（ｐｄ７．９）０　、１　ｍＭ　ＥＤＴＡに再懸濁し
た。

２本鎖Ｍ　１３　ＤＮＡの増殖 ｊｉｉ−のＮ１３ファージプラークを採取して２ＹＴｌ
　ｍｅ中に加え、振とうしながら３７℃で６時間増殖さ
せた。細菌を沈殿させ、Ｎ１３フ了−ジを含む上清を残
しておいた。その間に、大腸菌ｍ　７１−１８株の一晩
培養液の１　：　１００希釈物１１を振とうしながら３
７℃で２時間増殖させた。Ｎ１３ファージ上清５００μ
ｌを加え、この培養物を３７℃でさらに４時間振とうし
た。２本鎖ＤＮＡの調製はマニアチスら、モレキュラー
・クローニング：　実Ａｍ　室マニュアル。

コールド・スフリング・ハーバ−・ラホラトリー、１９
８２に記載されるように行った。

特定部位の突然変異誘発 特定部位の突然変異誘発反応は本質的にカーター（Ｃａ
ｒｔｅｒ　）ら、Ｎ１３におけるオリゴヌクレオチド特
定部位の突然変異誘発：実験マニュアル、アングリアン
・バイオテクノロジ−社％　１９８５にｄ己載されるよ
うに実施した。

次のプライミング混合物：すなわち１〜の鋳型ＤＮＡ　
（ｍＴＲ３０１本鎖形、実施例２参照）；３ｎ９のキナ
ーゼ処理した突然？５異誘発注オリゴヌクレオチドプラ
イマー（先に記載したもの）；１μｌの１０ＸＴＭ援衝
液（１００ｍＭ）　　リ　ス（ｐＨ８，０）、　１００
ｒｒ１００ｒｒＩ＊　）　：　５，５ｔｌｌ　ノＨｚＯ
’ｋ　全容１ｔＩＯ，ｍとしてｌ［した。この混合物を
ガラス毛細管に入れて密封し、３分間沸騰させた後室温
まで冷却した。次いで。

このプライミング混合物にＩＯＸＴＭ緩衝液２μｌ；４
城ずつのｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　
ｄＴＴＰの混合物１１ｔｌ　；　１００　ｍＭ　ＤＴＴ
　１　ｆｉｎ　；　ＨｚＯ１２ｍ　；　ＤＮＡポリメラ
ーゼ１（フレノウ断片）１単位；　Ｔ　４　ＤＮＡリガ
ーゼ７単位を加えて、合計最終容量を３０μｌとした。

この混合物は１４℃で４時間インキュベーションした。

このＤＮＡは３層のアリコートで大腸菌ＢＭｆ（７１−
１８ｍｕｔＬ株に形質転換した〔クラ−ｒ−（Ｋｒａｍ
ｅｒ　）ら、１９８４　、Ｃｅ１ｌ　、　３８　、８７
９〜８８７を参照〕。この形質転換菌を大腸菌ＢＭＨ７
１−１８株から形成した菌叢上Ｋまいた。形質転換から
生ずるプラークのいくつかを採取してまき、２通りの格
子状配列の細萌コロニーヲ形成すセた。これらをニトロ
セルロースに取り上げて、グルンスタイン（Ｇｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ　）およびホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ　）、１
９７５．Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

７２．３９６１に記載されるように溶菌した。

ニトロセルロースフィル９−ハロ　Ｘ　ＳＳＣ（Ｉ　Ｘ
５ＳＣは１５０　ｒｒＭ　ＮａＣＡ！　、　１５　ｍＭ
　クエン酸三ナトリウムである）、０．１　％　ＳＤＳ
　、　１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液は０，０２％ポリビニルピロリドン。

０．０２ｔｓフイコール、０．０２％ＢＳＡ　テある）
、５Ｄａｌｌノ超音波処理した熱変性サケ精子ＤＮＡ中
で３０℃にて３時間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。その後、同じ緩衝液条件下でフィルターと放射注標
識突然変誘発発注プライマーとを混合し、（資）℃で一
晩ハイプリダイゼーションを行った。

フィルターは６　Ｘ　ＳＳＣ＋　０．１％ＳＤＳを用い
て一連の異なる温度で：すなわち別℃で１５分；４５℃
で３分；駒℃で３分洗浄した。それぞれの洗浄後、フィ
ルターを湿ったままで（増感スクリーンを用いて）　Ｆ
ｕｊｉ　ＲＸ　−１００Ｘ線フィルムに感光させた。

塩基配列決定 ＤＮＡ塩基配列決定はジデオキシターミネーション法を
用いて行った〔サンガー（Ｓａ・ｙｒｇｅｒ　）％ニッ
クレン（Ｎ１ｃｋｌｅｎ　）およびコールソン（Ｃｏｕ
ｌａｏｎ）１９７７、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、み、　５４６３
を参照〕。

プラスミドの調製 プラスミドＤＮＡの大規模調製およびプラスミドのミニ
調製はマニアチスラ１．・モレキュラー・クローニング
：実＋ｓ室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−、１９８２に記載されるように行った
。

分離 ＤＮＡフラグメントはマニアチスらの上記文献に記載さ
れるように低融点（ＬＭＰ　）アガロースゲルから分離
した。

制限酵素部位をコードする合成リンカ−はマニアチスら
の上記文献に記載されるようにキナーゼ処理して平滑末
端ＤＮＡに連結させた。

ＤＮＡの脱リン酸化 ペクターＤＮＡはマニアチスらの上記文献に記載される
ように、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理するこ
とにより適宜脱リン酸化した。

ｔ−ＰＡ発現検出用のフィブリン／寒天上層細胞の調製
： 細胞はトリプシン処理し、５，４Ｘ１０Ｓ細胞／　６０
　ｍ培養皿でうえつけ、そして増殖培地（ＲＰＭ１１６
４０培地中の１０　％血清、１チペニシリン／ストレプ
トマイシン原液、１チグルタミン；スコツトランド。

ベーズリー、ギプコ社）中３７℃で５％Ｃｏ、　／９５
チ空気の増湿インキュベーター内に７２時間放置した。

その後細胞を補給し、さらに冴時間後トランスフェクシ
ョンのために使用した。

トランスフェクション法： トランスフェクションはイーグル■Ｍ中で、”　ＤＮＡ
クローニング１、Ｄ、Ｍ、クローバ−編集（チャプター
１５　、　Ｃ，ゴーマン）に６己載されるようなカルシ
ウム共沈を使用した。グリセロールショックおよび５ｍ
Ｍブチレート処理を使用した。

上層： イーグルｍＩ　（ギブコ社）９５ＩＩＬｔ中（７）７ガ
ロース（インデュビオースＡ３７　）　２．４　ｇをブ
ンゼンバーナーで融点まで加熱し、４８℃に保持した水
浴に入れた。フィブリノーゲン（２０ｍ！７／　ｒｎｉ
　）　５．６　ｍｌはイーグルＭＥＭ（追加の７　ＴＶ
ｉ　／　ｍｌ　ＮａＣＡ’を含む）５．６ｍＡで１＝１
に希釈し、氷上に置いた。イーグル■Ｍ（追加なし）３
．３ｍＡを５０　ＮＩＨ単位／厩のウシトロンビン８６
μｌを含むビジヨー（ｂｉｊｏｕ　）　（氷上に保持）
に分配した。細胞はイーグル■■で３回洗って血清を除
去した。トロンビンおよびフィブリノーゲンを水浴中で
３７℃に加温した。アガロースｇ、５ｍｔを予め温めて
おいたユニバーサル（ｕｎｉｖ−ｅｒｓａｌ　）　Ｋ　
分配した。トロンビン、続いてフィブリノーゲンを寒天
に加えた。そのゲルを細胞層上に注入して、溶解ゾーン
が出現するまで３７℃でインキュベーションした。

実施例２Ａ ｔ−ＰＡＤＮＡ配列（１０１２〜１０１４　）の変更新
規な修飾ｔ−ＰＡタンパク質をコードするＤＮＡは次の
配列： ５　’　ｄ　（ＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧ
　）　３　’を有する上記オリゴヌクレオチド（実施例
１）を用すて作られた。このオリゴヌクレチドは１０１
３位および１０１４位における２つの誤対合（ｍ１ｓｒ
ｎ−ａｔｃｈ　）を除いてｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　（ベニ
カら、Ｎａｔｕｒｅ　ｅ１９８３．３０１．２１４〜２
２１を参照）のヌクレオチド１００６〜１０２３に相補
的である。こうして１０１２〜１０１４位のコドンはＣ
ＧＣからＣＡＧに変えられた。

得られたＤＮＡ配列は真核細胞系を用いて発現させて、
線維素溶解作用を有する活性タンパク質を得た。

以下に述べる全てのＤＮＡ操作は１方法１のセクション
で述べたように実施した。

タンパク質ｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡクローンはＴ
ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ
　＊　１９８５　、５４　ｍ　４２２〜４２４に記載の
ＴＲＢＭ　６細胞６株から分離したｍＲＮＡよシ作製し
た。成熟ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡをコードする２ＫｂのＢｇ
ｌ　ＩＩフラグメントは単離し、平滑末端となし、その
後やはり平滑末端としたＭ　１３　ｍｐｌｏ（アマ−ジ
ャム・インターナショナルＰＬＣ製造番号Ｎ、　４５３
６　）のＳａ７１部位にサブクローニングした。クロー
ンは挿入物が両方向にあるものを単離した。これらの２
つのタイプのクローンは以後ｍＴＲ１，０およびｍＴＲ
２０と呼ばれるだろう。これらのうちの１つ、ｍＴＲ２
０はｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ挿入物を１読み枠内に１かつ１
正しい向きで１配置しており、こうしてＭ　１３　ｍＰ
　１０ゲノム中のＡ！ａｃ　Ｚプロモーターからのｔ−
ＰＡ融合タンパク質の発現を可能にした〔スロコンベ（
Ｓｌｏｃｏｍｂｅ　）ら、１９８２．Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

７９．５４５５〜５４５９を参照〕。この構築物は１本
鎖ＤＮＡまたは２本鎖ＤＮＡの良好な収骨を与えなかっ
た。

ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡは酵素Ｂａｍ）（ｌおよびＨｉｎｄ
ｕｌを用−てクローンｍＴＲ１０から２本鎖ＤＮＡを切
断することにより読み枠から外した。切断したペクター
ＤＮＡおよびｔ−ＰＡ挿入物ＤＮＡから成る全ＤＮＡ　
Ｍ合物は平滑末端にして再連結させた。得られた構築物
はＤＮＡの塩基配列決定により捜入個所に次の構造をも
つことが判明し、このことはｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡがＭ１
３Ａ！ａｃ　ｚプロモーターに関して読み枠の外にある
ことを示している。

転写　　　　　　ＢｇｌＩＩＩ このクローンはｍＴＲ３０と呼ばれるだろう。特定部位
の突然変異誘発は１方法１のセクションで述べたように
クローンｍＴＲ３０に対して実施した。スクリーニング
後、５つのポジティブ信号を選択した。ＤＮＡの塩基配
列決定が５つの単離物から１本鎖ＤＮＡ　Ｋ対して行わ
れ、これらの全ては明らかに変化したＤＮＡ配列を示し
た。その配列は５　’　ｄ　（ＣＡＧＴＴＴＣＡＧＡＴ
ＣＡＡＡＧＧＡ　）　３　’　？　アり、ソノクローン
はｍＴＲ６０と呼ばれるであろう。

実施例２Ｂ ペクターｐＲ８■−β−グロビン〔ゴーマン（Ｇｏｒｍ
ａｎ　）らｓ　　５ｃｉｅｎｃｅ　５２２１　＋　５５
１′５５３９１９８３を参照〕はｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの
挿入および発現を可能にするよう修飾した（第１図参照
）。ｐＲ８Ｖ−β−グロビンＤＮＡ１０４を２０単位ず
つのＨｉｎｄｌｎおよびＢｇＡ！　Ｉｔで２時間消化し
１方法１のセクションで述べたように１−低融点アガロ
ースゲルから大きいＤＮＡフラグメントを単離すること
により、β−グロビン配列を除いた。そのβ−グロビン
配列はＴＲＢＭ　６細胞のメツセンジャーＲＮＡ　（Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄ　Ｈａｅｍｏａｔａｓｉｓ　
ｅ　１９８５　、５４　、４２２〜４２４を参照）を使
って作製したλｇｔ　１０　ｃＤＮＡクローン（”ＤＮ
Ａクローニング”　ｅ　ＶｏＡ！、１　、チャプター２
および３゜Ｄ、Ｍ、グローバー編集、　ＩＲＬプレス、
　１９８５を参照）のλＴＲ１０に由来するｃＤＮＡの
５′領域をコードするＤＮＡフラグメントで置き換えた
。λＴＲ１０中のｃ　ＤＮＡ挿入物は５１非翻訳領域、
プレグロ配列および塩基８０１に相当するＥｃｏＲ１部
位までの成熟タンパク質配列をコードする（ベニ力ら、
Ｎａｔｕｒｅｓ１９８３　、３０１　、２１４〜２２１
を参照）。ｃＤＮＡ挿入物はＤＮＡ　５μｇを冴単位の
Ｅｃ　ｏＲＩで１．５時間消化することによシペクター
から切断した。その後、ＤＮＡはフェノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノール沈殿させ、再懸濁し、平滑末
端となし、そして１方法１のセクションで述べたように
キナーゼ処理したＨ１ｎｄｕリンカ−に連結した。リン
カ−の連結反応は室温で７時間、その後４℃で一晩行っ
た。

その後このＤＮＡを２０単位のＨｉ　ｎｄｌｌｌで２時
間消化し、Ｈｌ　ｎ＋ｄｌｌ［リンカ一連結ｔ−ＰＡ　
ｃＤＮＡに相当する８００ｂｐフラグメントを１チ低融
点アガロースゲルによる電気泳動後に単離した。この５
ｏｏｂｐフラグメントは上記のＩ）Ｒ８Ｖ−β−グロビ
ンから誘導された大きいＤＮＡフラグメントと混合し、
エタノール沈殿させた。これらのＤＮＡは再懸濁し、１
０単位ずつのＨｌ　ｎ；ｄＩｌおよびＢｇｌ　ＩＩで１
．７時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出し、エ
タノール沈殿させ、再懸濁し、そして１方法１のセクシ
ョンで述べたように室温で５時間、４℃で一晩連結した
。ＤＮＡ２μ！を使用して大腸菌ＨＢ　１０１を形質転
換し、ベニ力ら、Ｎａｔｕｒｅ　ｓ　１９８３　ｓ　３
０１　＋　２１４〜２２１において１８７と番号付けら
れた位置に相当するＢｇｌ　１１部位までのｔ−ＰＡ　
ｃＤＮＡの５１末端を含むプラスミドを保有スるコロニ
ーを、プラスミドのミニ調製物のＨｉｎｄｌｌｌ　／　
Ｂｇｌ　ＩＩ消化により同定し、そしてこのプラスミド
ｉ　ｐＴＲＥ　１と名づけた。

その後、ラウス肉腫ウィルスのロング・ターミナル・リ
ピート（Ｒ８Ｖ　−ＬＴＲ）をコードする配列。

ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの５１領域、およびンミアンウイル
ス４０　（ＳＶ４０　）　ノ３１配列を、それらが単一
（Ｄ　Ｘｈｏ　ｌ　７ラグメントを形成するような方法
でＰＡＴ　１５３中に再構築した。初めに、　ｐＲ８Ｖ
−β−グロビンＤＮＡＧＩｔ＆を４即位の５ｆａＮＩで
２．５時間消化してＲ８Ｖ　−ＬＴＲを取り出した。次
に、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈殿させ、再懸濁し、そして平滑末端とした。Ｘｈ
ｏ　ｌリンカ−をキナーゼ処理してこのＤＮＡに室温で
８時間、４℃で一晩連結させ、その後７０℃で１５分間
インキュベーションしてリガーゼを不活化し、エタノー
ル沈殿させた。リンカ一連結ＤＮＡは再懸濁し、１５単
位ずつのＨｉｎｄＩ［ｌおよびＸｈｏ　ｌで６時間消化
し、Ｒ８Ｖ　−ＬＴＲに相当する約５００　ｂＰフラグ
メントを１％Ｉアガロースゲルによる電気泳動後に単離
した。このＤＮＡフラグメントは以下のように調製した
ｐＡＴ１５３にクローニングした：　ｐＡ’ｒ　１５３
６１を３０単位のＥｅ　ｏＲＩで２時間消化し、フェノ
ール／クロロホルム抽出してエタノール沈殿させた。こ
のＤＮＡを再懸濁し、平滑末端とし、Ｘｈｏ　Ｉ　’Ｊ
ンカーに連結させ、再懸濁し、そして上記のようにＩ（
ＬｎｄＩ［［とＸｈｏ　１で消化した。約３゜４Ｋｂの
フラグメントを１％凹アガロースゲルによる電気泳動後
に単離し、このフラグメントは上記の約５００　ｂｌ）
フラグメントと共にエタノール沈殿させた。ＤＮＡを連
結させて１）Ｔ旺０を得た。

ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの５１部分をコードする約０，２Ｋ
ｂフラグメントはｐＴＲＥ　Ｉ　１０４を３０単位ずつ
のＨｌｎｄｌｌｌおよびＢｇｌ　ＩＩで２時間消化し、
１％凹アガロースゲルによる電気泳動後に単離した。こ
のフラグメントを以下のように調製したＰＡＴ　１５３
にクローニングした： ｐＡＴ　１５３５４はＢａｍｆ（ｌで完全消化した。フ
ェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後に
、そのＤＮＡを再懸濁し、平滑末端となし、その後キナ
ーゼ処理したＢｇｌ　ＩＩｌリンカに連結した。

このＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出シ、エタノ
ール沈殿さす、再懸濁し、そして３０単位ずつのＨｉｎ
ｄｌｌ［とＢｇｌ　ＩＩで３時間消化した。大きいＤＮ
Ａバンドは１ＳＬＭＰアガロースゲルによる電気泳動後
に単離し、上記の約０二２Ｋｂフラグメントと一緒にエ
タノール沈殿させ、連結させてｐＴＲＥ　８を得た。

１）ＴＲＥ　１由来ＯＳＶ４０配列をコードするＤＮＡ
　７ラグメントは次のようにして単離した：　ｐＴＲＦ
：　１５縛を６０単位のＥｃｏＲｌで２時間消化し、平
滑末端となし、そして上記のようＫＸｈｏｌリンカ−に
連結した。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノ
ール沈殿後、このＤＮＡを再懸濁し、順次Ｂｇｌ　ＩＩ
およびＸｈｏ　ｌで消化した。ＳＶ４０配列をコードす
る約１．６Ｋｂバンドは１ＳＬＭＰアガロースゲルによ
る電気泳動後に単離し、そして次のように調製した。

ｐ’ｒＲｇ　８にクローニングした：　ＰＴＲＥ　８５
Ａ９を１５単位の５ａｌｌで３時間半消化し、平滑末端
となし、そして上記のようにＸｈｏ　ｌリンカ−に連結
した。

フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後
、このＤＮＡは再懸濁し、順次３０単位のＢｙ！■で１
時間および１０単位のＸｈｏ　ｌで２時間消化した。大
キいＤＮＡバンドけ１ｃｌｂＬＭＰアガロースゲルによ
る電気泳動後に単離し、上記の約１，６Ｋｂ　フラグメ
ントと一緒にエタノール沈殿させ、連結させてｐＴＥＲ
１１を得た。

５’ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ配列、ＳＶ４０配列およびｐＡ
Ｔ１５３の一部をコードする約２　Ｋｂ　ＤＮＡフラグ
メントはｐＴＲＥ　１１５４を３０単位のＨｉ　ｎｄｎ
ｌおよび６単位のＸｍａ　ＩＩＩで６時間消化して切断
した。１チ凹アガロースゲルによる電気泳動後、約２Ｋ
ｂバンドを単離しそして次のように調製したＩ）ＴＲＥ
Ｏにクローニングした：　ｐＴＲＥｏ　４．８　Ａ！ｉ
’はＨｌｎｄｌｌｌとＸｍａ　ＩＩＩで上記のように消
化し、大きいＤＮＡフラグメントを１チ■伊アガロース
ゲルによる電気泳動後に単離した。

このフラグメントは上記の約２Ｋｂフラグメントと一緒
にエタノール沈殿させ、連結させてｐＴＲＥ　１２を得
た。

ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントは第２
図に示すようにＩ）ＴＲＥ　１２の唯一のＢｇＡ’　１
１部位へクローニングを含み、このフラグメントＨＴＲ
ＢＭ　６１１（ＩＩ胞（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ
　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　１９８５　＊　５４　ｓ
　４２２〜４２４を参照）から作られたｃＤＮＡライブ
ラリーより誘導された成熟ｔ−ＰＡタンパク質と３′非
翻訳領域の一部をコードしている。ＰＴＲＥ　７５μｓ
はＢｇｌ　［１で完全消化し、約２Ｋｂフラグメントを
１チＩアガロースゲルの電気泳動後に単離した。このフ
ラグメントはエタノール沈殿させ、セして１方法１のセ
クションで述べたようにＢｇｌ　ＩＩで消化後ホスファ
ターゼ処理してお−たｐＴＲＥ　１２と連結させ、それ
によシ野生型ｔ−ＰＡを発現するＰＴＲＥ　１５を得た
ｏ　ｍＴＲ６０はＢｇｌ　ＩＩで消化し、約２袖フラグ
メントを単離し、そして上記のように１）ＴＲＥ　１２
にクローニングして変異型ｔ−ＰＡを発現するＩ）ＴＲ
Ｅ３２を得た。

ｉｌ）フィブリン／寒天上層 トランスフェクションしたヒトＨｅＬａ１ａ　（）　ラ
ンスフエクションの２４時間後）から修飾および非修飾
ｔ−ＰＡの発現は、′方法１のセクションで述べたよう
なフィブリン／アガロース上層検定法を用いて検出した
。溶解ゾーンはＩ）ＴＲＥ　１５　（非修飾ｔ−ＰＡ　
）およびｐＴＲＥ　３２　（修飾ｔ−ＰＡ　）でトラン
スフェクションした細胞から得られたが、　　ｔ−ＰＡ
を含まない親ペクターｐＴＲＥ　１２　（ｔ−ＰＡ”’
　）でトランスフェクションした細胞からは得られなか
った。

実施例３ 成長因子ドメイン（アミノ酸５１〜８７）が欠失された
他のｔ−ＰＡ変異型は以前に開示されている。

（欧州特許出願第０２０７５８９号明細書を参照）。

ここでは上記欧州特許出願明細書に記載された変異と本
実施例２Ｂの変異の両方を合わせもつ別の形のｔ−ＰＡ
を開示する。この修飾ｔ−ＰＡをコードする発現グラス
ミ２ドは次のようにして作製した。

ａｒｇ　２７５→ｇｌｎ　２７５変異を保有する約９０
０ｂｌ）のＮａｒ　１−　Ｓｓｔ　ｌフラグメントを上
記のｐＴＲＥ３２から切り取り、そして約４１０ｂｐの
１（ｉｎｄｎｌ　−Ｎａｒ　ｌフラグメントを欧州特許
出願第０２０７５８９号ＥＩＪＪ細書に記載のプラスミ
ドＰＴＲＥ２４から切シ取った。これらの２つのフラグ
メントはｐＴＲＥ　１５　（上記欧州特許出願明細書を
参照）の約６Ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［−Ｓｓｔ　ｌフラグメ
ントと連結させてプラスミドＰＴＲＥ４８を形成した。

標準技法によシ組換え大腸菌から調製したプラスミドＤ
ＮＡ　’Ｔｈ使用して、ヒトＨｅＬａ細胞をリン酸カル
ンウム共沈法（”　ＤＮＡクローニングＶｏｗ、ＩＩ　
’　＋Ｄ、グローバー編集、　ＩＲＬプレス、１９８５
中〕ｃ、ゴーマンによる１哺乳動物細胞への高効率遺伝
子移入１を参照）によりトランスフェクションした。

トランスフェクションしたヒトＨｅＬａ細胞（トランス
フェクションの２４時間後）からの修飾および非修飾ｔ
−ＰＡの発現は１方法１のセクションで述べたようなフ
ィブリン／アガロース上層検定法を用いて検出した。溶
解ゾーンが得られ、このことはプラスミクーゲン活性化
因子の存在を示す。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図、第１ｂ図および第１ｃ図はｔ−ＰＡ配列の挿
入および発現用のペクター（１）ＴＲＥ１２　　）の作
製を示す模式図であり；そして 第２図は野生型または変異型ｔ−ＰＡを発現するペクタ
ー（それぞれＩ）ＴＲＥ　１５およびＩ）ＴＲＥ　３２
　）の作製を示す模式図である。 但し、略号は以下の通りである。 λＴＲｌ０−　ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの５１部分を含むλ
ｇｔｌｏクローン； ＬＴＲ−ラウス肉腫ウィルスのロング・ターミナル・リ
ピー）　（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅ−ｐｅａ
ｔ）　； β　　−ウサギβグロビンｃＤＮＡ　ｔＳｖ　　　−小
さいｔｖｃ原イフィントロンび初期領域ポリＡ化部位を
含むシミアンウィ ルス４０配列； ５１　　−ベニカら、Ｎａｔｕｒｅ　３０１　＋　２１
４〜２２Ｌ１９８３における配位置１８７のＢｇＡ　１
１部位に相当する３′末端を含むｔ−ＰＡ ｃ　ＤＮＡの５１部分Ｃ約０．２Ｋｂの鎖長）；Ｂ　　
　−ＢａｍＨＩＯｋｍ部位； Ｂｇ　　　−Ｂｇノ■の認識部位； Ｅ　　　−ＥｃｏＲｌの認識部位； Ｈ−Ｈｉｎｄｌｌｌの認識部位； Ｓ　　　−ＳａＡ’　ｌの認識部位； Ｓｆ　　　−８ｆａＮＩのＥｎｆ＆部位；Ｘ　　　−Ｘ
ｈｏ　１の認識部位； Ｘｍ　　　−Ｘｍａｌ［ｌの認識部位；ｔ−ＰＡ野野生
−通常のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡ　； ｔ−ＰＡＡ異型−修飾ｔ−ＰＡ　（ａｒｇ　２７５　→
ｇｌｎ２７５）をコードするｃＤＮん 代理人　弁理士　　秋　沢　政　光 信１名 λＴＲｌ０ 第１ａ図 第１ｂ図 １１ｒ１ １Ｗｒ） 第　１ Ｃ図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）成長因子ドメインの領域において修飾され、
   且つ（ｂ）２７５位にアルギニンまたはリジン以外のア
   ミノ酸を与えるように修飾された、線維素溶解作用を有
   する組織型プラスミノーゲン活性化因子。 ２、修飾（ａ）はアミノ酸残基５１から８７までの領域
   にある、請求項１記載の修飾された組織型プラスミノー
   ゲン活性化因子。 ３、修飾（ａ）は成長因子ドメインの全部または一部の
   欠失から成る、請求項１又は２記載の修飾された組織型
   プラスミノーゲン活性化因子。 ４、修飾（ａ）はアミノ酸残基５１〜８７の欠失から成
   る、請求項３記載の修飾された組織型プラスミノーゲン
   活性化因子。 ５、修飾（ｂ）はヒスチジン、トレオニン、アラニン、
   グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グ
   ルタミンおよびグルタミン酸から選ばれたアミノ酸を２
   ７５位に与える、請求項１、２、３又は４記載の修飾さ
   れた組織型プラスミノーゲン活性化因子。 ６、２７５位のアミノ酸はグルタミンである、請求項１
   、２、３、４又は５記載の修飾された組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子。 ７、実施例３に従つて製造される修飾された組織型プラ
   スミノーゲン活性化因子。 ８、請求項１〜７のいずれかに記載の修飾された組織型
   プラスミノーゲン活性化因子の誘導体。 ９、請求項１〜７のいずれか一つに記載の修飾された組
   織型プラスミノーゲン活性化因子をコードするヌクレオ
   チド配列から成るＤＮＡポリマー。 １０　宿主細胞内で請求項９記載のＤＮＡポリマーを発
   現しうる複製可能な発現ペクター。 １１　請求項１０記載のペクターで形質転換された宿主
   細胞。 １２　薬学的に許容される担体と共に請求項１〜８のい
   ずれか一つに記載の修飾された組織型プラスミノーゲン
   活性化因子を含有する薬剤組成物。 １３　治療用活性物質として使用するための請求項１〜
   ８のいずれか一つに記載の修飾された組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子。 １４　血栓症の治療に使用するための請求項１〜８のい
   ずれか一つに記載の修飾された組織型プラスミノーゲン
   活性化因子。 １５　血栓症治療用の薬剤を製造するための請求項１〜
   ８のいずれか一つに記載の修飾された組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子の使用。 １６　組換え宿主細胞内で修飾された組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子をコードするＤＮＡを発現させ、そし
   て修飾された組織型プラスミノーゲン活性化因子産物を
   回収することから成る、請求項１記載の修飾された組織
   型プラスミノーゲン活性化因子の生産方法。 １７　適当なモノ−、ジ−またはオリゴマーヌクレオチ
   ド単位の縮合による、請求項９記載のＤＮＡポリマーの
   作製方法。 １８　請求項１６記載の方法により得られる修飾された
   組織型プラスミノーゲン活性化因子。