JPS6322801A - Ｅｄｔａ不含のヘパリン、ヘパリン分画ならびに断片、それらの製造法及びそれらを含有する医薬品組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、精製ヘパリン、精製ヘパリン分画ならびに断
片、それらに係る調製の工程とそれらを含有する医薬品
組成物に係るものである。

ヘパリンは、種々の動物種の組織から抽出される生体高
分子物質である。たとえば、ウシあるいはブタ、腸粘膜
、肺、等々。

その抽出手順は、物質のより高い活性と関連するより高
い生物学的活性（抗凝固活性、　ＡＰＴＴあるいは抗−
Ｘａ活性）を持つヘパリンに至るように、定常的に改良
されている。

化学的に、ヘパリン、その分画ならびに断片（ＬＭｔｌ
−Ｈｅｐ）　（物理的分画あるいは化学的ならびに酵素
的分解によりヘパリンから得られる）は、硫酸化された
グリコサミノグリカンであり、そこで主たる構造単位は
、Ｌ−イズロン酸２−硫酸、グルコサミン−Ｎ、６−ジ
硫酸である０時としてウロン酸部分はＤ−グルクロン酸
あるいはＬ−ウロン酸（どちらも硫酸化されていない）
からなり、一方アミノ糖はＮ−アセチル化（Ｎ硫酸化よ
りも）、あるいは下方硫酸化（６位の酸素で）、あるい
は上方硫酸化（３位の酸素で）されていることがある。

異なる単位間のグリコシド結合は、常に１→４で、α配
位である。異なる分子は分子量つまり重合する単位の数
において異なっている０分子量（断片と分画の両方を考
慮に入れて）は約ｉ　、　ｏｏｏから約３０，０００Ｄ
の範囲にある。

多分散系の分子量を持つ混合物であるので、化学−物理
的特性は混合物の平均値である。

抽出源（組ｍ＞に関連した若干の差異はあるけれども、
電気泳動パターン、硫黄と窒素の含量のような各種の化
学−物理的特性や、国際単位Ｕ、Ｓ、Ｐ／ｍｇ（Ｕ、１
．／ｍｇ）であられした抗凝固活性のような生物的特性
に関して、異なる市販品の間には一般的な均質性がある
。

１３Ｃあるいは１Ｈ−いずれの核磁気共鳴の使用も、各
種の関与する部分の構造に完全に合致した実質的に均質
なスペクトルが各市販品のバッチで得られる。

２０と１８０ｐｐｍの間で記録した”Ｃ−Ｎ、Ｍ、Ｒ，
スペクトルにおいて、ヘパリンに確実に帰せられる多く
のシグナルがあるが、その他のシグナルについてはまだ
由来が推定されていない。これは、８０と８６ρすの間
のシグナル、ならびに５５と７０ｐｐｍの間の別のシグ
ナルの場合であり、通常利用できる工業的方法により得
られる、もっとも純度の高いものであっても、すべての
ヘパリン試料に（異なる強度で）常に存在する。

陽子スペクトル中の主なヘパリンのシグナルは良く知ら
れているけれども、余分なシグナルのあるもの（例えば
２．５と４　、　ＯＯｐｐｍの間のもの）は、まだはっ
きりと同定されていない。生物学的な見地からみて、ヘ
パリンは興味ある薬理学的活性、すなわち、抗凝固性、
抗脂血性ならびに抗血栓活性を示し、手術後や深部静脈
血栓のような、凝固能充進ならびに血栓の発生し易い危
険性の高い状態にある人間の治療に有用である。

しかしながら、ヘパリン（ナトリウム、カルシウム等、
その種々の塩の形で）あるいはその断片または分画の治
療への応用の制限となることは、患者に投与したヘパリ
ン（あるいは断片または分画）の既知の量に対応する抗
凝固活性とは無関係な（恒常的な）大量の血液の喪失、
つまり、いわゆる「出血」である。この出血は、−回投
与の後ですら、人間やその他の動物の両方で、しばしば
発生する。

現在知られているところによれば、この現象はヘパリン
の性質それ自身に帰せられている。

というのは、ある種の患者では、ヘパリンは一次止血の
未知のメカニズムに干渉するか、あるいは血小板減少症
を誘発すると推定されているからである。

今や、１３Ｃ−ＮＭＲ中の５５と７０ｐｐｍの間、そし
て１Ｈ−ＮＭＲスペクトル中の２．５０から４．００ｐ
ｐｍのヘパリン様構造と無関係のシグナルは、部分的に
相当する量の混入異物によるものであることがわかって
いる。

これは特に’　Ｈ−ＮＭＲでのシグナルにより指適でき
る。

重量で０．２から５％の範囲の量で、今日用いられてい
る方法に従って得られる最高の品質にまで精製したもの
でも、すべての工業的製品に常に存在するこの成分は、
遊離の形の（ナトリウムまたはカルシウム）　ＥＤＴＡ
　（２，６１，３，１６゜３．１８ｐｐｍにシグナル）
とヘパリン様構造と部分的に相互作用したＥＤＴＡ　（
３，２５，３，６４，３，７１゜３．９９ｐｐｍにシグ
ナルがあり、遊離のＥＤＴＡにくらべて０．５３−１．
ｌｐｐｍのシフト、このシフトはそのＥＤＴＡ−ヘパリ
ン相互作用で説明できる）を含む。

種々の形で存在するエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ
）であることが判明した。

その不純物の形態の間の相互の比率（遊離あるいは相互
作用している）は、定量的にはバッチとバッチで異なっ
ている。

さらに驚くべきことには、ＥＤＴＡの除去、したがって
前述のＮＭＲスペクトル中のシグナルの除去は、出血作
用の無いヘパリンあるいはヘパリン分画を生ずることが
判明した。

実際に、　ＥＤＴＡが抗凝固活性を有することは知られ
ているとはいえ、その活性はＥＤＴＡを混入物として最
大濃度で含有しているヘパリンの投与により得られるも
のの、２０から３０倍の投与量でのみその活性は生ずる
。

つまり、一方からみれば、そのヘパリンの出血効果は単
に少量あるいは極めて少量のＥＤＴＡの存在に帰するこ
とはできず、他方からみると、驚くべきことに痕跡のヘ
パリンの除去が出血効果を完全に無くしたヘパリンを生
ずる。

従って１本発明の第１の目的は、１Ｈならびに”Ｃ−Ｎ
ＭＲ中に前述のシグナルを欠く特徴を有するヘパリン、
ヘパリン分画あるいは断片を作ることである。

かかるヘパリンは、０．１％以下の、望ましくは０．０
１％以下のＥＤ’ＴＡを含まないことによって特徴づけ
られ、さらに、単回ならびに繰り返しどちらの投与後に
も出血作用を示さない。

対応するナトリウム、カルシウム、マグネシウム塩ある
いは他の医薬品として許容可能な陽イオンとの塩も本発
明の意図に含まれている。

出血作用が完全に無いために１本発明の化合物は、これ
までに研究された同様の化合物と比較して、治療により
広い安全性を与える。

従って、本発明の次なる対象は、本発明の化合物あるい
はそれに由来する塩を活性主成分として含有する医薬品
組成物を作る。

望ましい投与形態は、ヘパリンならびに誘導体に通常用
いられるものであり、たとえば、静脈内あるいは筋肉内
投与用のバイアル、クリーム１．軟膏、ならびに経口投
与に適した剤形も含まれる。

投与量ならびに治療日程も、出血作用を持っている既知
の化合物にこれまで用いられているものと実質的に同じ
である。

さらに本発明の次の対象は、本発明の化合物の精製なら
びに調製方法により規定される。

第１の方法に従い、０．５から３０％ｗ／ｖの範囲の濃
度のヘパリンあるいは断片あるいは分画の水溶液を、適
切なカットオフ値（一般的には５００から１０，０００
Ｄ、望ましくは５００から１，０００Ｄ）を有する膜上
での、場合によってはＮａＣｌあるいはその他の高度に
イオン化可能な塩の存在中での、透析及び／又は透析濾
過の対象とする。

望ましい膜は、ポリフッ化高分子（テフロン■）、ポリ
スルホンあるいはポリアセテートから成る。

代替法として、各種のヘパリンの水溶液を０．５／１か
ら２７１の範囲の比率の溶媒／水を用いて。

メタノール、エタノール、あるいはアセトンの様な適切
な有機溶媒による沈殿の対象とする。

また各種のヘパリンを、連続撹拌下に、５分から２０分
の範囲の時間にわたって５℃から２０℃の温度で、２３
から３０％（Ｖ／Ｖ）の範囲の水含有量の、メタノール
、エタノール、インプロパツール、アセトン、あるいは
ジオキサンのような有機溶媒の適切な水性混液による抽
出の対象としても良い。

平均分子量の測定はポリアクリルアミドゲルカラム上の
ゲル濾過により実施する（Ｆ、Ａ、Ｊｏｈｎ−ｓｏｎ、
　Ｂ、Ｎｕ１１２ｏｙ−Ｃａｒｂ、Ｒｅｓ、５１．１１
９．１９７６）＋＋生物学的測定はｕ、ｓ、ｐ国際単位
／ｍｇで表現する。

１）　出血時間は、ラットにおいて１尾切断試験（Ｅ、
Ｄｙａｎａら、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、、４８，１０
８．１９８２）により評価する。

かかる試験は、生体内凝固試験と考えられる。それは、
秒で測定する。

２）　テンプレート。かかる試験は、第一次止血を反映
する（Ｊ、Ｐａｎｇｒａｚｚｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ
ｈａｒｍａｃａｌ、、旦、３３０５．１９８５）、それ
は秒で測定する。

第１の試験における出血時間の生じ得る延長は、投与し
た物質の「生体内」の抗凝固活性を反映する。かかる活
性は、アメリカ薬局方にしたがった抗凝固力価により「
試験管内」で表現される。第２の試験における出血時間
の増加は、抗凝固活性とは関係づけ得ない、出血を誘発
し得る第１次止血の調節に対する干渉の可能性のために
、物質は、たとえＵ、１．／ｍｇとして抗凝固活性を持
たなくとも、時としてテンプレート試験で出血時間の増
加を誘発することがあり得る。

いいかえるならば、尾切断における出血時間の増加は主
として抗凝固活性を示し、一方テンプレート試験から得
られるそれは出血活性を示す。

両試験において、体重約２５０ｇの雄Ｓｐｎａｇｕｅ　
−［１ａｖｌｅｙラツトが用いられている。製品は、食
塩水を対照処置に用い、０．７５ｍｇ／Ｋｇの投与量で
。

滅菌ならびに発熱物質不含の生理食塩水溶液として静脈
経由で投与した。出血時間は秒数で報告する。

各試験ならびに各物質の実験群は１０匹の動物−で構成
した。

両方の試験において、生理的食塩水のみの投与（０，１
ｍＱ／１００ｇ体重）により得た標準参照値（対照）は
、平均で次の通りである。

尾切断試験　：２２０±１６秒 テンプレート：１０２±４秒 実施例１ 第１図に報告したＬＨ−ＮＭＲスペクトルの特徴を有し
、その中で２．６１．３．１６．３．１８．３．７１．
３．９９ｐｐｍにシグナルが明瞭にある。平均分子量が
１１゜０００Ｄで抗凝固活性が１６８０．１．／ｍｇの
市販のヘパリンナトリウムの２％溶液（Ｗ／Ｖ）を、カ
ットオフ３゜５００Ｄのセルローズの袋の中で、蒸溜水
に対して２４時間透析にかけた。透析袋の内容は凍結乾
燥により回収した。そして凍結乾燥製品を１トＮＭＲ分
析にかけ、第２図に示すスペクトルを示した。その中で
は前述のシグナルの消失が証明された。拡散物質を含有
する溶液を真空中で濃縮した後に凍結乾燥した。凍結乾
燥物は、　ＨＣＱの添加によりＰＨを約７に調節して後
に’　Ｈ−ＮＭＲ分析に供され、第３図に報告するスペ
クトルを示した。その中で、２．６１．３．１６．３．
１ｇ、　３．９９にあ、るシグナルは、蒸化合物中に存
在するそれらと対応する。　３．６４ｐｐｍのシグナル
は、第１図の３．７１ｐｐｍにおけるシグナルと同等で
ある。さらに、それらはもはやヘパリンのシグナルで陰
ぺいされていないので、３．７１と３．２５ｐｐｍの極
大が明瞭である。

拡散試験の溶液に過剰のＣａＣＱ□の添加によって、第
３図に示した”　Ｈ−ＮＭＲスペクトルは顕著な変化を
受け、３．２５−３．６４−３．７１−３．９９ｐｐｍ
のシグナルは消失する。その記録は第４図に報告する。

このスペクトルのシグナルは、まぎれもなくカルシウム
型のＥＤＴＡに符合する。

従って、上に報告したことに基いて、第３図に報告した
すべてのシグナル（つまり、最初のヘパリン試料中にも
存在する）は、疑いもなくＥＤＴＡに割当てられる。各
種のシグナルにより示されるように、この化合物は最初
の試料中に種々の形で存在している。これらの形は、Ｅ
ＤＴＡナトリウムと、たとえばカルシウムのような種々
の陽イオン（不純物として含有されている）とのＥＤＴ
Ａ錯化合物の両方である。さらに、これらの形は、その
結果としていくつかのシグナルの移動を伴ない、ヘパリ
ン構造と相互作用できる。

最初の試料の中のＥＤＴＡの総量を明らかにするために
、過剰のＣａ（、Ｑ２の存在下に試料それ自身の’Ｈ−
ＮＭＲスペクトルを記録した。２．６１ｐｐｍの信号の
積分とＯ，ＯＬ＄ｔ−ブタノールの内部標準との比較か
ら、　ＥＤＴＡの総量は、重量で４．２％と算出された
。

透析から回収したヘパリン試料は、凍結乾燥後に、１７
０Ｕ、１．／１ｇの抗凝固活性を示したが、−方透析水
の凍結乾燥残渣は、抗凝固活性を実質的に示さなかった
。

一最初のヘパリンナトリウム： 尾切断試験　：４３５ テンプレート：２６５ 生理的状態と比較して、試料の投与によってもたられた
変動の百分率は次の通りである。

尾切断試験　：＋９６％ テンプレート：＋１６０χ 第１の試験の変化は１２６Ｕ、１．／Ｋｇの抗凝固活性
の投与に帰せられるけれども、第２の試験における時間
の異常な増加は、この抗凝固活性とは関係づけられない
（出血効果）。

一透析により純化したヘパリンナトリウム二足切断試験
　＝４２７ テンプレート：　１０９ 生理食塩水との関係における増加百分率は、前者で＋１
１４％、そして後者で＋５％であり、前記は約１２７Ｕ
、１．／Ｋｇの投与と一致しているが、後者は、方法の
誤差内にあるので、有意ではない。

−透析水から回収した試料： どちらの試験においても試料は、食塩水で得た値から有
意に差のある値を与えなかった。

実施例２ 平均分子量１３，０００Ｄと抗凝固活性１６７Ｌ１．１
．／■により特徴づけられた、実施例１のヘパリンと起
源の異なる市販のヘパリンナトリウムの１０％（Ｐ／Ｖ
）溶液を、得られた拡散液と同じ量の蒸溜水の添加によ
り溶液の容量を一定に保持した。

６００　Ｄカットオフのポリアセテート膜上での溶液の
連続溶出からなる透析濾過にかけた。操作は、拡散液の
容量がヘパリン液の最初の容量の５倍以上に達するまで
継続した（他の実験では。

この容量は、初期の容量の１倍から１０倍に達した）、
ヘパリンの回収は凍結乾燥でおこない、拡散液も凍結乾
燥した。

第５図は最初のヘパリンの１８−ＮＭＲスペクトルを示
しており、その中で２．６１−３．１６−３．１８ｐｐ
ｍのシグナルはかろうじて強度が認められるが。

３．３５と３．９９ｐｐｍのシグナルは極めて強いのが
認められる。これは、ＥＤＴＡが主としてナトリウム塩
の形であること（カルシウム不純物あるいはその他の陽
イオンは少ししかない）を示している。精製した試料は
第２図に報告したスペクトルと同じ”　Ｈ−ＮＭＲスペ
クトルを示した。その抗凝固活性は１６５０．１．／ｍ
ｇであった。

拡散液の凍結乾燥残渣は、実施例１における記述と第３
図と第４図に描かれたものに重ね合せ得る１Ｈ−１１１
にＲ行動を示した。

出発時のヘパリンのＥＤＴＡ総含有量は、　２．６１ｐ
ｐｏ＋のシグナルの積分により推定し１重量で１．６％
であった。

２通りの出血試験は次の結果を与えたニー最初のヘパリ
ンナトリウム： 尾切断試験　：　４１２（食塩水に対し＋８７％）テン
プレート：　２２０（食塩水に対し＋１１５〆）−透析
濾過て精製したヘパリン： 尾切断試験　：４２０（食塩水に対し＋９０％）テンプ
レート：　１１０（食塩水に対し＋７％）−拡散液の凍
結乾燥品の残渣：食塩水投与により誘発された効果と変
らない効果、上に報告したすべてのデータに対して、実
施例１のデータに対応しておこなったものと同じ付言が
適用される。１　、０００　Ｄのカットオフのポリアセ
テート、テフロン、あるいはポリスルホンを用いて同様
な結果が得られている。

実施例３ 実施例２に記述したようにして得たヘパリンナトリウム
の１０％溶液を上述の６００Ｄ膜透析濾過にかけた。ヘ
パリン溶液は、ｌ　：　１．５　（ヘパリン：　ＣａＣ
ｆ１ｚ　）の重量比でＣａＣＱ、を加えた。

透析濾過は、一定容量で、拡散液中のナトリウムがほと
んど完全に除去されるまで続けた。

実質的にナトリウムを含まないヘパリンカルシウムを凍
結乾燥により溶液から回収した。そしてそれは、乾燥後
に、第６図に報告する’Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有し、
２．６１−３．１６−３．１８ｐｐｍの信号がその中で
は欠けている。これらの信号はＥＤＴＡカルシウムに典
型的である（ＥＤＴＡが無く、ナトリウムが実質的にな
いのでＥＤＴＡナトリウムのシグナルは無い）。

生物学的な見地からは、二つの試験における抗凝固活性
と出血データは、透析濾過により精製したヘパリンナト
リウムに関する、実施例２で記述されたものと類似して
いる。

実施例４ 第７図に報告した、その中で２．６１と３．１７ｐｐｍ
のシグナルが明白にある１Ｈ−ＮＭＲスペクトルで特徴
づけられ、ＥＤＴＡ含量が２．１％（前述のようにして
算出）であって、抗凝固活性が１７２υ、１．７ｍｇの
ヘパリンカルシウムの１０％溶液（Ｗ／Ｖ）に、ＮａＣ
ｌが０．５ＭになるまでＮａＣｎを添加した（他の試験
においては、０．１から１、Ｍの範囲のモル濃度を用い
た）。

次にこの溶液を、実施例２に記述したのと同様にして、
しかし同じモル濃度のＮａＣｌ容液を用いて、６００Ｄ
の膜上で透析濾過した。操作は逐次的に採取したヘパリ
ン溶液試料のＥＤＴＡのシグナルが１Ｈ−ＮＭＲスペク
トル中で消失するまで続けた。

それから溶液を水に対してＮａＣｌが消失するまで透析
濾過し、ＣａＣΩ２を添加して、実施例３に記述したよ
うに処理した。最終的にヘパリンカルシウム（回収率〉
８５％）は、第６図に報告したものと同様な１Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを有し、１７ＱＵ、１．／ｌ１ｇの抗凝固
活性があった。

二種の出血試験は次のデータを与えたニー最初のヘパリ
ンカルシウム： 尾切断試験　：　４４０（食塩水に対して＋１００％）
テンプレート：　２５５（食塩水に対して＋１５０％）
−精製ヘバリンカルシウム： 尾切断試験　：４３Ｓ（食塩水に対して＋９７％）テン
プレート：　１０７（食塩水に対して＋４％）この実施
例についても実施例１に報告した付言を参照されたい。

実施例５ これまでの実施例に用いたものとは異なる起源の、第８
図に報告した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより特徴づけら
れる。総ＥＤＴＡ含有量が３゜０％に等しい市販のヘパ
リンナトリウムの試料を、７％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ溶液
で容量を一定に保ちながら、実施例２で記述したように
処理した。処理の終りにＮａＣａを水に対する透析濾過
で除去し、エチルアルールでの沈殿によりヘパリンナト
リウムを回収した。乾燥後の製品は、第２図に報告した
ものと同様な１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。

実施例６ 先に記述したものとは起源の異なる。カルシウム型のＥ
ＤＴＡを少ししか含まずより多くのＥＤＴＡをナトリウ
ム型で、総重量で２．５％含有する特徴を有する市販の
ヘパリンナトリウムを、先の実施例中に記述したように
、透析ならびに水または塩化ナトリウムに対する透析濾
過の両方で精製し−た。凍結乾燥あるいはエタノールに
よる沈殿によりヘパリンナトリウムを回収したそれぞれ
の試料は、第２図のスペクトルと同様な１Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示した。

透析により処理ｑた試料は出血試験において次のデータ
を示した。

尾切断試験　：４２０（食塩水に対して＋９０％）テン
プレート：　１１１（食塩水に対して＋９％）これらの
データに関して、実施例１について報告した生物学的デ
ータに関するコメントを参照されたい。

実施例７ 先に記述したものとは起源の異なる市販のヘパリンナト
リウムは、第９図に報告した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルに
より特徴づけられる。このスペクトルの中では各種のＥ
ＤＴＡシグナルが明白であり、特にカルシウム型（２，
６２−３，１６−３，１８ｐｐｍのシグナル）に関する
シグナルが目立つ、この事実は、ヘパリンナトリウムの
不純物としてカルシウムが著るしく存在することを示す
、ＥＤＴＡの総合有量は、重量が約１．５％であった。

実施例２において記述した方法に従った精製にかけて、
第２図に報告したものと完全に同様なその１Ｈ−ＮＭＲ
スペクトルにより示されるように、ＥＤＴＡを除去した
ヘパリンを得た。さらに、テンプレート試験では、最初
のヘパリンでは２０２秒（食塩水に対して＋９８％）で
あった出血時間が１０６（食塩水に対して＋３％、有意
差なし）にまで減少した。

実施例８ 平均分子量が約４　、０００　Ｄの低分子量ヘパリンナ
トリウムは、第１０図に報告した１Ｈ−ＮＭＲスペクト
ル（２，６２−３，１６−３，１８ｐｐｍにＥＤＴＡカ
ルシウムの３．５６と３．８６ＰＰＯ１にＥＤＴＡナト
リウムのシグナル）により１重量で２．５％のＥＤＴＡ
の総量により（先述のように２．６２ｐｐｍのシグナル
に基き算出）、９８Ｕ、１．／ｍｇの抗凝固活性により
特徴づけられ、２％の水溶液で、２４時間にわたり、６
００Ｄカツトオフセルローズ透析中で、蒸溜水に対する
透析にかけた。

この期間の終りに製品は凍結乾燥により回収し、第２図
のものと同様な’Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示し、そこで
はＥＤＴＡに帰せられるシグナルの欠如が明らかであっ
た。

生物学的な見地から、次のデータを得た。

−最初の低分子ヘパリン： 尾切断試験　：３７９（食塩水に対して＋７２％）テン
プレート：　２２９（食塩水に対して＋１２４％）−透
析による精製後の低分子量ヘパリン：尾切断試験　：　
３９６（食塩水に対して＋８０％）テンプレート：　１
１５（食塩水に対して＋１２％）これらのデータに関し
ては、実施例１を参照されたい。

実施例９ 実施例８のヘパリンと同じバッチからの低分子量ヘパリ
ン試料を先に言及した同じ条件で、ただしＮａＣｎを０
．５Ｍ濃度まで添加して透析にかけた。そして０．５Ｍ
ＮａＣｌに対して１２時間透析し、続いてＮａＣｌが除
去されるまで蒸溜水に対して透析した。凍結乾燥により
回収した製品は、実施例８に従った精製試料のそれらと
同じ化学−物理的ならびに生物学的特性であった。

実施例１０ ＥＤＴＡナトリウムシグナルが特に明瞭であり（３，５
６と３．８６ｐｐｍ）、一方力ルシウム型が実質的にな
い１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを持ち、抗凝固活性が１００
０．Ｉ／ｍｇである低分子量ヘパリン試料（平均分子量
６，０００Ｄ）を、　５００Ｄカツトオフ膜上の限外濾
過にかけた。溶液の容量は、蒸溜水の添加によって、定
期的に最初の容積にもどした。初期の容積の約５倍の容
積に等しい限外濾過の後に（他の実験では、容積は１倍
から１０倍）、ヘパリンを凍結乾燥により回収した。別
の一連の実験において、蒸溜水のかわりにＮａＣｌ　Ｏ
，５Ｍ溶液を用いた（それは、別の実験では０．１がら
１．０モル濃度）、実験の終りに、水の添加による限外
濾過で塩を除去した。しがしてこのようにして精製した
製品は、凍結乾燥により回収した。

それらの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＥＤＴＡに帰せら
れるシグナルを示さなかった一方、抗凝固活性は実質的
に変化しなかった。

二種類の試験における出血時間はニ ー出発時の低分子量ヘパリン： 尾切断試験　：　４９７（食塩水に対して＋１２３％）
テンプレート：　２００（食塩水に対して＋８６％）−
精製後の低分子量ヘパリン： 尾切断試験　：　４６０（食塩水に対して＋１０９％）
テンプレート：　１１３（食塩水に対して＋１０％）実
施例１１ Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａナトリウムに帰せられる３、５６と３．
８６ｐｐｍにシグナルが顕著にある市販のヘパリンナト
リウムの試料を、５から１５％（Ｗ／Ｖ）の範囲の濃度
の溶液を得るように、Ｈ，Ｏ中に溶解した。ヘパリンの
沈殿を得るために、その水溶液に等容積のエタノールを
添加した０回収した沈殿物を、その濃度が約１０％のヘ
パリン溶液を得るように水に再溶解した。その溶液を第
２のヘパリン沈殿を得るために等容積のエタノールで処
理した。

処理を３回繰り返しく別の試験では５回）、最終エタノ
ール沈殿と乾燥後にＮＭＲスペクトル中にＥＤＴＡのシ
グナルの無いヘパリンを得る。

実施例１２ 硫酸／カルボン酸比２．０で、平均分子量が１１゜５０
０Ｄ、そして抗凝固活性が１７２Ｕ、１．／ｍｇのヘノ
（リンナトリウムの試料は、８０と８６の間にシグナル
のある”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。二種の出血試
験は次の結果を与えたニ ー尾切断試験　：　４５３（＋　１０６％）−テンプレ
ート：　２５４（＋１４９％）そのヘパリン試料を０．
３％の抗菌性フェノールナトリウム塩を含有する蒸溜水
に溶解して、０．５−１．０−５．０−１０．０％（Ｗ
／Ｖ）（７）濃度を有する同じ透明な溶液を作り１種々
の時間（８から４８時間）室温に放置した。遠心分離に
よって白色沈殿物を集め、かかる溶液から分離した。ヘ
パリンナトリウムは澄明な上澄液から、エタノールの添
加により回収した。

真空中で乾燥後に２種の固体を分析した。

上澄からの固体 一硫酸／カルボン酸比：　２．０　ニ ー平均分子量　　　　：　１１，５００Ｄ−１３Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトル＝８０と８６ｐｐｍの間のシグナル無し
；　６２．５ｐｐｍのシグナルの消失：　６４ｐｐｍの
それの減少； −抗凝固活性　：　１６６Ｕ、１．／ｍｇ−尾切断試験
　：　４６０（＋　１０９％）−テンプレート＝１１フ
（＋１４％） 生理的食塩水溶液との差は有意でなかった。

゛心゛′殿　からの固体 ”Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ヘパリンに帰せられる明確
なシグナルを示した（上澄による沈殿混入による；　８
８０−８６ｐｐ領域のそれらは強く増強され、６２．５
と６４ｐｐｍの両方の極太があった。

抗凝固活性は２５Ｕ、Ｉ／ｍｇであった。出血試験は次
の結果を与えたニ ー尾切断試験　：　２３４（＋６％） −テンプレート：　２１０（＋　１０６％）実施例１３ 市販のヘパリンナトリウムの試料（硫酸／カルボン酸比
は２．Ｌ６．平均分子量は１５，０００Ｄ、そして抗凝
固活性は１７６Ｕ、１．／ｍｇ）は、第１図に示す試料
のように、’Ｈ−ＮＭＲスペクトル中に２゜５０ｐｐｍ
と４．ＯＯｐｐｍの間にＥＤＴＡに帰せられる明確なシ
グナルを示した。出血試験はこれらの値を示した（秒）
。

一尾切断試験　；４２３ 一テンプレート：２３５ これらの値は、生理的食塩水で得たデータと比較して下
記の増加を示した。

一尾切断試験　：＋９４％ 一テンプレート：＋ｔＳＯ％ 固形の試料に５または１０または１５または２０または
２５または３０部の純エタノールを添加した。

系の中の水が２３または２５または２８または３０％　
−セントに達するまで充分な水を加えた。

懸濁液は、温度を５またはｌＯまたは１５または２０℃
に調節し、５または１５または２０分にわたって攪拌し
た。

その結果得られる懸濁液を濾過して、残余の水を除去す
るために純エタノールで処理した。

その処理を３または４または５または６または７回繰り
返した。

最終段階の後で、試料は真空中で乾燥した。

処理した試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ヘノ（リン
に帰せられる主シグナルを示した。　２．５−４゜ｏｐ
ｐｍ領域内にＥＤＴＡに帰せられる余分のシグナルは認
められなかった。このスペクトルは、第２図のものと似
ていた。

硫酸／カルボン酸比：　２．１５ 平均分子量：　１５，０００Ｄ 抗　　凝　　固　　活　　性：　１７４Ｕ、Ｉ／ｍｇ出
血試験（秒） 尾　　切　　断　　試　験＝２１５ テンプレート：１０５ これらの値は、未処理の試料と比較して、低下しており
、生理的食塩水と比較した増加分は有意でなかった（尾
切断試験で＋１１０％、そしてテンプレートで＋４％）
、エタノールの代りにアセトン、イソプロパノールある
いはジオキサンを用いて同様な結果を得た。

【図面の簡単な説明】

第１〜第１０図は種々の状態のヘパリンの核磁気共鳴ス
ペクトル図である。 特許出願人　イタルファルマコ　ニス、ピー、エイ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、＾２Ｈ−ＮＭＲスペクトル中に２．５０と４．００
   ｐｐｍの間のＥＤＴＡによるシグナルが無く、かつ実質
   的に出血作用が無いことにより特徴づけられる、１，０
   ００から３０，０００Ｄまでの範囲の分子量を有し医薬
   的に容認可能な陽イオンで適宜塩化したヘパリン、ヘパ
   リン分画あるいは断片、 ２、＾１Ｈ−ＮＭＲスペクトル中に２．６１、３．１６
   ならびに３．１８ｐｐｍならびに３．２５、３．６４、
   ３．７１ならびに３．９９ｐｐｍのシグナルを欠くこと
   により特徴づけられる特許請求の範囲第１項記載のヘパ
   リン、ヘパリン分画あるいは断片。 ３、実質的にＥＤＴＡを含まない特許請求の範囲第１項
   記載のヘパリン、ヘパリン分画あるいは断片。 ４、１，０００から９，０００Ｄの範囲の多重分散した
   分子量を有する特許請求の範囲第１項記載のヘパリン分
   画あるいは断片。 ５、＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル中に８０と８６ｐｐ
   ｍの間のシグナルを欠くことにより特徴づけられる、前
   記特許請求の範囲のいずれかに記載のヘパリン、ヘパリ
   ン分画あるいは断片。 ６、ＮａＣｌあるいはその他の高度にイオン化可能な塩
   の随意の存在中で、５００から１０，０００Ｄまでの範
   囲のカットオフ値を有する膜上での一連の透析及び／又
   は透析ろ過に、かかるヘパリン、ヘパリン分画あるいは
   断片の水性溶液をかけることを特徴とする、特許請求の
   範囲第１〜５項のいずれかに記載の化合物の製造法。 ７、ヘパリン、ヘパリン分画あるいは断片を。 ０．５／１〜２／１の溶媒／水比でメタノール、エタノ
   ールあるいはアセトンを加えて沈殿させることを特徴と
   する特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の化合
   物の製造法。 ８、ヘパリン、ヘパリン分画または断片を、２３から３
   ０容積／容積％の水を含有するメタノール、エタノール
   、イソプロパノール、アセトンまたはジオキサンで、５
   ℃から２０℃の温度で抽出させることを特徴とする特許
   請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の化合物の製造
   法。 ９、医薬的に容認可能な担体あるいは補助薬との混合中
   に特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の化合物
   を活性成分として含有する、出血作用のない、抗脂血性
   、抗凝固性ならびに抗血栓性を有する医薬品組成物。 １０、経口、非経口あるいは局所投与に適した特許請求
   の範囲第９項記載の医薬品組成物。