JPS6323199B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なアミラーゼ基質に関するもので
ある。ヒト体液中のアミラーゼ活性の測定用基質
として、構造の明確なマルトオリゴ糖例えばマル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘ
キサオースなどが使用される様になりつつある。
これらのうち代表例としてマルトペンタオースを
基質として使用する場合をとりあげて説明する
と、測定様式は次の様に表わすことができる。 (1) マルトペンタオースα−アミラーゼ ――――――――→ マルトー
ス＋マルトトリオース (2) マルトース＋マルトトリオース α−グルコシダーゼ ――――――――――→ グルコース ここに生成したグルコースは、公知の方法、例
えばグルコースオキシダーゼ／パーオキシダー
ゼ／色素系、もしくはヘキソキナーゼ／ホスフオ
グルコムターゼ／グルコース−６−ホスフエート
デヒドロゲナーゼ／NADH系等で検量される。 ところがこの測定系には、基質（マルトオリゴ
糖）に対しわずかではあるがα−グルコシダーゼ
が作用するという欠点がある。この欠点はブラン
ク値の上昇として現われてくるが、このような現
象はレート法あるいはエンドポイント法のどちら
で測定するにしても好ましからざる結果を与える
ものである。 他方マルトオリゴ糖の還元末端にフエニル基、
ナフチル基或はそれらの類似体が結合したものが
合成されつつあり、例えば次の様なものを基質と
するアミラーゼ測定試薬が提案されている。 ｐ−ニトロフエニルマルトペンタオサイド （特公昭57−53079） ｐ−ニトロフエニルマルトヘキサオサイド （特公昭57−53079） ｐ−ニトロフエニルマルトヘプタオサイド （特開昭54−51892） ２，４−ジクロロフエニルマルトペンタオサイド （特開昭56−35998） これらの化合物を基質とするアミラーゼ活性の
測定様式を例示すると、次の様になる。 ｐ−ニトロフエニル−α−マルトペンタサイドの
場合 (1) ｐ−ニトロフエニル−α−マルトペンタオサ
イドα−アミラーゼ ――――――――→ ｐ−ニトロフエニル−α−
マルトサイド＋マルトトリオース (2) ｐ−ニトロフエニル−α−マルトサイド＋マ
ルトトリオースα−グルコシダーゼ ――――――――――→ ｐ−ニトロ
フエノール＋グルコース この系ではレート法でもエンドポイント法でも
測定できるが、この場合もｐ−ニトロフエニル−
α−マルトペンタオサイドにα−グルコシダーゼ
がわずかに作用してブランク値がアツプし、やは
り測定上好ましいことではない。 ２，４−ジクロロフエニル−β−マルトペンタオ
サイドの場合 (1) ２，４−ジクロロフエニル−β−マルトペン
タオサイドα−アミラーゼ ――――――――→ ２，４−ジクロロフ
エニル−β−マルトサイド＋マルトトリオース (2‐a) ２，４−ジクロロフエニル−β−マルトサ
イド＋マルトトリオースα−グルコシダーゼ ――――――――――→
２，４−ジクロロフエニル−β−グルコサイ
ド＋グルコース (2‐b) ２，４−ジクロロフエニル−β−グルコサ
イドβ−グルコシダーゼ ――――――――――→ ２，４−ジクロロフ
エノール＋グルコース (2‐b-1) ２，４−ジクロロフエニル＋４−アミ
ノアンチピリンKIO₄ ―――→ キノン色素 この系はエンドポイント法による測定である
が、この場合も基質である２，４−ジクロロフエ
ニル−β−マルトペンタオサイドにα−グルコシ
ダーゼがわずかに作用してブランク値が上昇する
という望ましくない現象が起こる。結局従来提供
されてきた基質を使用する測定系では試薬を一液
系にすることが困難であるという共通の欠点があ
つた。 そこで本発明者等は種々研究した結果α−グル
コシダーゼやβ−グルコシダーゼの作用を受けな
い基質を見出すに至り、測定系を一液化すること
が可能となつた。 即ち本発明は上記特性を有するアミラーゼ基
質、及びその製造方法、並びに該基質を用いてア
ミラーゼ活性を測定する方法を提供するものであ
り、本発明の要旨を述べると、まずアミラーゼ活
性測定の為の新規な基質とは、 一般式 （式中R¹、R²は同一または異なつて水素原子、
低級アルキル基またはフエニル基を意味し、R¹
とR²が共同してシクロヘキサン環を形成しても
よい。R³、R⁴はいずれか一方はハロゲン原子を
意味し、他方は水素原子、ヒドロキシ基、低級ア
ルキル基、ハロゲン原子またはニトロ基を意味す
る。ｎは０から６の整数を意味する）で示される
α，β−核置換フエニルマルトオリゴサイドの環
状アセタール誘導体であり、上記基質を製造する
方法とは、 一般式 （式中R³、R⁴は前と同じ意味）で示されるα，
β−核置換フエニルマルトオリゴサイドに、 一般式

【式】または

【式】 （式中R¹、R²は前と同じ意味を示し、R⁵、R⁶は
同一または異なつて低級アルキル基を意味する）
で示されるカルボニル化合物またはアセタール化
合物を反応させる点に要旨を有するものであり、
更に上記基質を用いてアミラーゼ活性を測定する
方法とは、 一般式 （式中R¹、R²は同一または異なつて水素原子、
低級アルキル基またはフエニル基を意味し、R¹
とR²が共同してシクロヘキサン環を形成しても
よい。R³、R⁴はいずれか一方はハロゲン原子を
意味し、他方は水素原子、ヒドロキシ基、低級ア
ルキル、ハロゲン原子基またはニトロ基を意味す
る。ｎは０から６の整数を意味する）で示される
α，β−核置換フエニルマルトオリゴサイドの環
状アセタール誘導体にアミラーゼ含有試料を接触
させた後、又は接触させると同時にα−グルコシ
ダーゼおよび／又はβ−グルコシダーゼを作用さ
せ、ここで遊離するフエノール系化合物を測定す
ることにより前記試料中のアミラーゼ活性を知る
ことを特徴とするアミラーゼ活性の測定方法であ
る。 上記化合物（）、（）及び（）において、
R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及びR⁶で示される低級アル
キル基としては、メチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ブチル、sec−ブチル、ｔ−ブチル、
ペンチル、ヘキシル基が例示される。又は化合物
（）及び（）においてR³及びR⁴で示される置
換基は任意の位置に且つ互いにオルト−、メタ
−、パラ−の任意の各相互関係をもつて置換する
ことができる。又R³及びR⁴で示されるハロゲン
原子は弗素、塩素、臭素、沃素のいずれであつて
も良い。化合物（）、（）においてｎは０〜６
の整数を示すが、これらマルトオリゴサイドに用
いるマルトオリゴ糖としてはマルトースからマル
トオクタオースまで全て使用できるが代表的なも
のとしては、例えばマルトース、マルトトリオー
ス、マルテトラース、マルチペンタオース、マル
トヘキサオース、マルトヘプタオース等が挙げら
れる。これらのうち特に好適なのはマルトテトラ
オース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオースである。上記のマルトオ
リゴ糖に対しアグリコンとして結合されるフエノ
ール系化合物は、上記マルトオリゴ糖の還元性末
端に対しα−は又はβ−結合することができると
共にα−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダー
ゼの作用を受けて容易に遊離するものである。そ
して核置換フエノールとしては２，４−ジクロロ
フエノール、２−クロロ−４−ニトロフエノー
ル、４−クロロ−２−ニトロフエノール、４−ク
ロロフエノール、などが使用できるが、勿論これ
らは単なる例示であつて本発明を制限する主旨の
ものではない。ここに例示した様なフエノール系
化合物は、上記マルトオリゴ糖の還元性末端に対
してα−又はβ−結合することができる。 次に本発明の基質（）を更に具体例によつて
説明すると、例えば下記の様なものが挙げられ
る。尚各化物名の後の［ ］には、本明細書で使
用することのある略称を追記した。 (1) イソプロピリデン−２，４−ジクロロフエニ
ル−β−マルトペンタオサイド（２，４−ジク
ロロフエニル ４，６−Ｏ−イソプロピリデン
−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−｛（１→４）
−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−｝₃−Ｏ−β
−Ｄ−グルコピラノシド）［イソプロピリデン
−β−G5DCP］ (2) ベンジリデン−２，４−ジクロロフエニル−
β−マルトペンタオサイド（２，４−ジクロロ
フエニル ４，６−Ｏ−ベンジリデン−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−｛（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル｝₃−Ｏ−β−Ｄ−グル
コピラノシド）［ベンジリデン−β−G5DCP］ (3) イソプロピリデン−２，４−ジクロロフエニ
ル−β−マルトサイド（２，４−ジクロロフエ
ニル ４，６−Ｏ−イソプロピリデン−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−
Ｄ−グルコピラノシド）［イソプロピリデン−
β−G2DCP］ (4) イソプロビリデン−２−クロロ−４−ニトロ
フエニル−β−マルトペンタオサイド（２−ク
ロロ−４−ニトロフエニル ４，６−Ｏ−イソ
プロビリデン−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−｛（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−｝₃−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）［イソ
プロビリデン−β−G5CHP］ (5) シクロヘキシリデン−２−クロロ−４−ニト
ロフエニル−β−マルトペンタオサイド（２−
クロロ−４−ニトロフエニル ４，６−Ｏ−シ
クロヘキシリデン−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−｛（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−｝₃−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）
［シクロヘキシリデン−β−G5CNP］ (6) イソプロピリデン−２−クロロ−４−ニトロ
フエニル−β−マルトヘキサオサイド（２−ク
ロロ−４−ニトロフエニル ４，６−Ｏ−イソ
プロピリデン−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−｛（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−｝₄−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）［イソ
プロピリデン−β−G6−CNP］ (7) ベンジリデン−２−４−ニトロフエニル−α
−マルトヘプタオサイド（２−クロロ−４−ニ
トロフエニル ４，６−Ｏ−ベンジリデン−Ｏ
−α−Ｄ−グルコピラノシル−｛（１→４）−Ｏ
−α−Ｄ−グルコピラノシル｝₅−Ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシド）［ベンジリデン−α−
F7PNP］ 本発明の基質（）は新規な化合物であり、化
合物（）にカルボニル化合物またはそのアセタ
ール（）を反応させることによつて製造するこ
とができる。反応は一般に非反応性溶媒中で行な
われ該非反応性溶媒としては、ジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルホキサイド、エチレングルコ
ールジメチルエーテル等が例示され、必要により
上記化合物（）自体を溶媒として用いる場合も
ある。反応温度は特に制限されないが、通常０℃
から溶媒の沸点までの範囲で行なうことが推漿さ
れ、更に好ましい範囲は40〜100℃である。更に
減圧下還流加熱したり、あるいは副生アルコール
類をを蒸発除去しながら反応させるのも効果的で
ある。反応の促進のために触媒たとえば少量の純
硫酸、塩酸ガス、ｐ−トルエンスルホン酸あるい
は無水塩化亜鉛などが用いられることもある。 本発明における前記製造方法によれば、マルト
オリゴ糖の非還元性末端グルコース残基に環状ア
セタール保護基を選択的に結合させることが可能
である。長谷川らの糖環状アセタールに関する研
究報告［Carbohyd.Res29 209（1973）］及びその
他の研究報告によれば単糖類のグルコースの４、
６位に対し選択的に環状アセタールを結合させる
方法が発表されている。しかしより高分子量の核
置換フエニルマルトオリゴサイドについて非還元
性末端グルコース残基の４、６位OHに環状アセ
タールを選択的に結合させる方法は全く新規ら発
明であつてその有用性は大きい。 原料物質である。核置換フエニルマルトオリゴ
サイド（）は例えばKonig−Knorrの方法
［Angew.Chem.69 438（1957）等］を参照するこ
とによつて製造できる。すなわちたとえば触媒量
の無水塩化亜鉛の存在下、溶媒を兼ねた大過剰の
核置換フエノールにパーアセチルマルトオリゴサ
イドを加え減圧下約100℃に加熱する。生成した
核置換フエニルパーアセチルマルトオリゴサイド
を無水メタノール中でナトリウムメトキサイドを
触媒として室温で脱アセチル化し、オクタデシル
シランまたはセフアデツクスを吸着剤とするクロ
マトグラフイにかけて精製することによつて上記
原料物質（）が得られる。 次に上記基質（）を用いてアミラーゼ活性を
測定する方法について述べる。 当該方法の基本は、基質（）に対してアミラ
ーゼが作用することにより生成する反応混合物
（例えばフエニル系化合物をアグリコンとするグ
ルコシド、マルトシド、マルトトリオキシド等）
にα−グルコシダーゼもしくはβ−グルコシダー
ゼまたはそれらの両者を作用させたフエノール系
化合物を遊離させ、このフエノール系化合物を測
定する点にある。そして該測定に当つては、例え
ば遊離したハロゲン化フエノール系化合物の色を
直接吸光度測定（好ましくはレート法）する方法
がある。また直接吸光度測定できない場合には、
例えば特開昭56−35998号に開示されている様な
４−アミノアンチピリン等の呈色試薬による方
法、臭素溶液による滴定法、２，６−ジブロムキ
ノンクロルイミドによる比色分析法等がある。後
者の場合、還元性末端にハロゲン化フエニル基の
結合したマルトオリゴ糖アミラーゼの基質にして
いるものであるから、試料中に混在しているかも
知れないグルコースやマルトース等の影響を受け
ないという長所を有するが、分析法自体がエンド
ポイントに依存するものであり、臨床分析化学の
進歩に伴うレート法（Rate Assay）に対応する
ことができないという欠点がある。 これに対し本出願人の一人はフエノールオキシ
ダーゼを作用させる工程を付加すればレート法に
よる分析を行なうことが可能であることを知り、
先に特許出願を行なつており（特願昭57−184359
号）、当該方法はそのまま本発明に利用すること
ができる。即ち当該出願で開示された方法の要点
は上記遊離したフエノール系化合物に、必要によ
りカツプラーの存在下、フエノールオキシダーゼ
を作用させて、消費する酸素量または生成する色
素を測定することにより、前記試料中のアミラー
ゼ活性を測定する様に構成した点に存在するもの
である。カツプラーとはフエノール類と酸化縮合
して色素を形成させるものであつて、４−アミノ
アンチピリンの他に、ｐ−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアニリン、ｐ−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン、ｐ−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキ
シエチルアニリン、３−メチル−４−アミノ−
Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンなどがある。カツプラ
ーの不存在下に生成するキノン類も測定可能であ
る。カツプラーとして、例えば４−アミノアンチ
ピリンと酸化結合させると、極めて大きい発色強
度が得られ、アミラーゼ活性の測定にとつて頗る
有利である。 一方本発明に用いるα−グルコシダーゼ及びβ
−グルコシダーゼについては、動物起原、植物起
原或いは微生物起原等の如何を問わないが、特に
好適なものを説明すると、α−グルコシダーゼに
ついては、基質特異性の面から見て酵母起原のも
のが有利である。即ち酵母起原のα−グルコシダ
ーゼは基質特異性が一般に広範囲であり、アグリ
コンの違いによる影響が少ないと共に、マルトト
リオサイド以下のグルコシドには良く作用する
が、マルトテトラオサイド以上のグリコシドには
作用しないという特性があり、アミラーゼ活性の
測定という本発明の趣旨に適合し有利である。一
方β−グルコシダーゼについても、同様の趣旨か
ら見て、例えばアーモンド起源のものがもつとも
強く推奨される。 これらのα−グルコシダーゼ及びβ−グルコシ
ダーゼを併用するときの併用割合は、基質の種
類、基質中におけるα−結合とβ−結合の存在比
率を勘案して定めれば良いが、一般的には、α−
アミラーゼによるエンド加水分解で生成したマル
トトリオース及び核置換フエニルマルトサイドを
非常に速く分解できる比率であれば良く、通常は
α−グルコシダーゼを多めに配合する。 α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼは
アミラーゼ含有試料を作用させた後で作用させる
様にしても良く又同時的に作用させても良い。む
しろ同時的に作用させ得ることは本発明における
もつとも特徴的な効果と言うことができる。こう
してフエノール系化合物が遊離されると、フエノ
ールオキシシダーゼを作用させてフエノール系化
合物の定量を行なうが、ここで用いられるフエノ
ールオキダーゼとしては、必要によりカツプラ
ー、例えば４−アミノアンチピリンの存在下にフ
エノール系化合物を酸化縮合させて発色させ得る
ものであれば全て本発明に適用することができ
る。尚特に好適なものを例示しておくと、例えば
担子菌から得られるラツカーゼやチロシナーゼ等
を挙げることができる。 次にアミラーゼ測定に際して問題となるα−
（又はβ−）グルコシダーゼによる影響の有無を
調べた実験例を掲げて本発明基質（）の優位性
を証明する。 実験例 １ ２，４−ジクロロフエニル−β−マルトペンタ
オサイド（β−G5DCPと略す）とイソプロピリ
デン−２，４−ジクロロフエニル−β−マルトペ
ンタオサイド（イソプロピリデン−β−G5DCP
と略す）を50ｍＭ、PH6.7のグツドバツフアーに
夫々４mg／mlになる様に溶解し、２つの基質溶液
(A)、(B)を調製した。一方上記と同一のバツフアー
にα−グルコシダーゼが150U／ml、β−グルコ
シダーゼが20U／mlになる様に添加溶解して酵素
溶液１種を調製した。 酵素溶液0.5mlに基質溶液(A)、(B)を夫々別々に
0.5mlずつ加えて混合し、37℃に放置した。所定
時間放置後10ｍＭの過ヨウ素酸カリウム水溶液を
添加し、更に４−アミノチンピリン水溶液（アミ
ノアンチピリン0.5ｇを蒸留水10mlに添加、溶解
させたもの）20μを添加し、37℃で５分放置後
500nｍの吸光度を測定した。その結果を第１表
に示す。

【表】 第１表から明らかな如く、β−G5DCPに対し
ては、α−グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼ
がわずかに作用して500nｍ吸光度を１時間で
0.305上昇させたのに対し、イソプロピリデン−
β−G5DCPはα−グルコシダーゼ等の作用を殆
んど受けないので500nｍの吸光度が0.012上昇し
たにすぎない。 実施例 ２ 実施例１に準じ放置温度を４℃とした他は全く
同様に実験し、第２表に示す結果を得た。

【表】 以上の結果から明らかな如く、一般式（）で
示される化合物はα−グルコシダーゼやβ−グル
コシダーゼが殆んど作用しないのでアミラーゼ測
定試薬を一液化することが可能となり、測定操作
上非常に有利であつて、且つ測定精度の向上に大
きく寄与することができた。 次に本発明の実施例を説明する。 実施例 １ PH6.7の50ｍＭグツドバツフアー1.0mlにα−グ
ルコシダーゼ75U／ml、β−グルコシダーゼ
10U／ml、イソプロピリデン−β−G5DCP2mg、
４−アミノアンチピリン1.0mgを夫々添加溶解さ
せたものを20mlの試験管に注入し、37℃で約５分
間放置した。市販管理血清「ヒユーミラーゼＨ」
を50μ添加し、酵素反応を開始した。正確に10
分反応後、10ｍＭ過ヨウ素酸カリウム水溶液2.0
mlを添加し、更に室温で５分放置後500nｍの吸
光度を測定した。またブランクは管理血清のかわ
りに蒸留水を同量使用して求めた。 第３表に示した結果は、「ヒユミラーゼＨ」を
添加したときの吸光度から、ブランクの吸光度を
差引いた数値（ΔOD）で示すものである。なお
比較のため、β−G5DCPを基質として使用し、
まつたく同一の条件で測定を行なつたのでその結
果も併せて第３表に示した。

【表】 この結果によるとイソプロピリデン−β−
G5DCPはイソプロピリデン化しないものに比較
して分析感度が多少減少して80％となるが、イソ
プロピリデン−β−G5DCPを基質として使用す
る場合は本来分析感度が高いので実用上はなんら
差支えなかつた。 実施例 ２ アミラーゼ試料として人血清の希釈系統を使用
した他は実施例１に準じて測定試験を行なつた。 即ち人血清に５％牛血清アルブミン水溶液を添
加して次の希釈系列を調製した。

【表】 これらを試料にして実施例１と同様の反応を行
なつたところ第５表及び第１図に示す結果が得ら
れた。

【表】 この結果に示す如く酵素活性とΔOD500の間に
は比較関係が認められる。従つてイソプロピリデ
ン−β−G5DCPをアミラーゼ活性測定のための
基質として使用することが可能であることが分か
つた。 実施例 ３ １ 試薬 下記第６表に示した基質を用い、下記試薬を
調製した。 PIPES緩衝液（PH7.0） 50ｍＭ α−グルコシダーゼ 150U／ml β−グルコシダーゼ 20U／ml 塩化カルシウム １ｍＭ 基 質 ２ｍＭ

【表】 試薬調製直後、10分後、20分後、30分後にこの
薬の400nｍにおける吸光度を測定し（試薬３
ml：37℃）、その結果を第７表に示した。

【表】

【表】 第７表から、本発明方法に用いられる非還元性
末端が修飾された基質を含有する試薬は、他基質
を含有する試薬に比べてブランク値が低く、その
経時的な上昇の度合も極めて小さいことがわか
る。 実施例 ４ 実施例３と同様の試薬を調製した。次に、上記
試薬３mlを試料血清50μに添加し、37℃にて３
〜４分間加温した後、400nｍにおける１分間あ
たりの吸光度の変化（アミラーゼ活性の指標とな
る）を算出した。試薬ブランクの吸光度変化およ
び試料血清の吸光度変化（ブランクの吸光度変化
を差引いた数値）を第８表に示す。

【表】 以上の結果から明らかな如く、本発明に用いら
れる非還元性末端が修飾された基質を含有する試
薬は、非還元性末端を修飾しない基質を含有する
試薬に比較して試薬ブランクの吸光度変化も小さ
い。 次に本発明に係る基質（）の製造例について
説明する。 製造例 １ 200mlのフラスコにβ−G5DCP10.4ｇ
（11mM）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド100ml、
ｐ−トルエンスルホン酸0.1ｇを仕込み、撹拌し
て均一な溶液とした。20〜25℃に保ちながら２，
２−ジメトキシプロパン3.4ｇ（33ｍＭ）を２時
間かけて滴下した後、さらに1.5時間反応を続け
た。弱塩基性イオン交換樹脂（ダイヤイオンWA
−30）20ｇを加えて30分間撹拌後濾過し濾液を濃
縮乾固して10.0ｇの白色結晶を得た。これを蒸留
水20mlに溶解し、クロマト用活性炭（和光純薬
製）300mlを充填した内径40mmのカラムに負荷し、
20％アセトニトリル水溶液を用いて展開溶出し、
β−G5DCPアセタールの白色結晶2.4ｇを分離し
た。融点190℃ NMR；δ値（分裂型、相対プロトン数）1.5（１
重線、３）、1.6（１重線、３）、2.7〜4.4（多重
線、31）、4.7（１重線、14）、５〜5.4（多重線、
４）、７〜7.5（多重線、３） δ1.5（3H）、1.6（3H）の独立した２本のピーク
はアセタール基にもとづく吸収でありβ−
G5DCPアセタール１分子中に１個存在する。 製造例 ２ 100mlのフラスコの２，４−ジクロロフエニル
−β−マルトサイド（β−G2DCPと略す）５ｇ
（10ｍＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド70ml、
ｐ−トルエンスルホン酸90mgを仕込み、撹拌して
均一な溶解とした。20〜25℃に保ちながら２，２
−ジメトキシプロパン3.1ｇ（30ｍＭ）を２時間
かけて滴下した後さらに１時間反応を続けた。ダ
イヤイオンWA−30を15ｇ加えて30分間撹拌後、
濾過して濃縮乾固し、4.9ｇの白色結晶を得た。
蒸留水15mlに溶解し、クロマト用活性炭200mlを
充填した内径30mmのカラムに負荷し、30％アセト
ニトリル水溶液を展開液として溶出分離し、β−
G2DCPアセタールの白色結晶1.8ｇを得た。融点
108℃ NMR；δ値（分裂型、相対プロトン数） 1.5（１重線、３）、1.6（１重線、３）、3.6〜４
（多重線、10）、4.8（１重線、５）、５〜5.2（多
重線、２）、5.4〜5.5（多重線２）、7.1〜7.6（多
重線） δ1.5（3H）、1.6（3H）の独立した２本のピーク
はアセタール基にもとづく吸収でありβ−
G2DCPアセタール１分子中に１個存在する。 製造例 ３ 製造例１のβ−G5DCPの代りにα−
G5DCP10.4ｇを用い、同様な操作によつてα−
G5DCPアセタールの白色結晶3.8ｇを得た。融点
191℃ 単糖の４、６位OHを選択的に保護する目的で
環状アセタール化することは知られており［H.
M.Flowers、R.W.Jeanlog、J.Org.Chem.28
1277（1963）／A.Hasegawa、H.Fletcher、
Carbohyd.Res.29 209（1973）／A.N.de Belder.
Advance in Carbohydrate Chemistry34 179
（1977）］製造例１、２、３の化合物は非還元性末
端の４、６位が環状アセタール化されていると推
定される。 製造例１、２、３の化合物い対するα，β−グ
ルコシダーゼおよびα−アミラーゼの作用を試験
した結果を第９表に示す。結果は１日後の４−ア
ミノアンチピリンによる発色をみたもので、環状
アセタールで保護された化合物はα−グルコシダ
ーゼの作用を受けず、G5−α，β−DCPアセタ
ールはα−アミラーゼの作用を受けるところから
非還元性末端の４、６位が環状アセタール化され
ている構造が支持される。

【表】 製造例 ４ 200mlのフラスコに２−クロロ−４−ニトロフ
エニル−βマルトペンタオキサイド（β−
G5CNPと略す）10.8ｇ（11ｍＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド100ml、ｐ−トルエンスルホン
酸0.1ｇを仕込み、攪拌して均一な溶液とした。
20〜25℃に保ちながら２，２−ジメトキシプロパ
ン3.4ｇ（33ｍＭ）を２時間かけて滴下した後、
さらに一夜反応を続けた。弱塩基性イオン交換樹
脂（ダイヤイオンWA−30）20ｇを加えて、１時
間攪拌後、濾過し濾液を濃縮乾固して10.4ｇの淡
黄色結晶を得た。これを蒸溜水20mlに溶解し、ク
ロマト用活性炭（和光純薬製）300mlを充填した
内径40mmのカラムに負荷し、15％アセトニトリル
水溶液を用いて展開溶出し、β−G5CNPアセタ
ールの白色結晶2.1ｇを分離した。 NMR；δ値（分裂型、相対プロトン数） 1.5（１重線、３） 1.6（１重線、３） 2.8〜4.1（多重線、31） 4.8（１重線、14） ５〜5.4（多重線、４） 7.4（２重線、Ｊ＝９Hz、１） 8.18（ダブル２重線、Ｊ＝３Hz、Ｊ＝９Hz、１） 8.24（２重線、Ｊ＝３Hz、１） δ1.5（3H）、1.6（3H）の独立した２本のピーク
はアセタール基の基づく吸収であり、β−
G5CNPアセタール１分子中に１個存在する。 製造例 ５ 200mlのフラスコにβ−G5CNP10.8mg（11ｍ
Ｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド100ml、ｐ−
トルエンスルホン酸0.1ｇを仕込み、攪拌して均
一な溶液とした。20〜25℃に保ちながら、１，１
−ジメトキシクロヘキサン4.8ｇ（33ｍＭ）を２
時間かけて滴下した後、さらに一夜反応を続け
た。弱塩基性イオン交換樹脂（ダイヤイオンWA
−30）20ｇを加えて、１時間攪拌後、濾過し濾液
を濃縮乾固して、13.9ｇの淡黄色結晶を得た。こ
れを蒸溜水30mlに溶解し、クロマト用活性炭（和
光純薬製）300mlを充填した内径40mmのカラムに
負荷し、30％アセトニトリル水溶液を用いて展開
溶出し、β−G5CNPシクロヘキシリデンケター
ルの白色結晶3.8ｇを分離した。 NMR；δ値（分裂型、相対プロトン数） １〜2.1（多重線、10） 2.8〜4.1（多重線、31） 4.8（１重線、14） ５〜5.4（多重線、４） 7.4（２重線、Ｊ＝９Hz、１） 8.18（ダブル２重線、Ｊ＝３Hz、Ｊ＝９Hz、１） 8.24（２重線、Ｊ＝３Hz、１） δ1〜2.1の10H分のピークはシクロヘキサン環
に基づく吸収であり、β−G5CNPシクロヘキシ
リデンケタール１分子中に１個存在する。

【図面の簡単な説明】

第１図はアミラーゼ活性と500nｍの吸光度の
関示を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中R¹、R²は同一または異なつて水素原子、
   低級アルキル基またはフエニル基を意味し、R¹
   とR²が共同してシクロヘキサン環を形成しても
   よい。R³、R⁴はいずれか一方はハロゲン原子を
   意味し、他方は水素原子、ヒドロキシ基、低級ア
   ルキル基、ハロゲン原子またはニトロ基を意味す
   る。ｎは０から６の整数を意味する）で示される
   α，β−核置換フエニルマルトオリゴサイドの環
   状アセタール誘導体。 ２ 一般式 （式中R¹、R²は同一または異なつて水素原子、
   低級アルキル基またはフエニル基を意味し、R¹
   とR²が共同してシクロヘキサン環を形成しても
   よい。R³、R⁴はいずれか一方はハロゲン原子を
   意味し、他方は水素原子、ヒドロキシ基、低級ア
   ルキル基、ハロゲン原子またはニトロ基を意味す
   る。ｎは０から６の整数を意味する）で示される
   α，β−核置換フエニルマルトオリゴサイドの環
   状アセタール誘導体を製造するに当り、 一般式 （式中R³、R⁴は前と同じ意味）で示されるα，
   β−核置換フエニルマルトオリゴサイドに、 一般式 【式】または【式】 （式中R¹、R²は前と同じ意味を示し、R⁵、R⁶は
   同一または異なつて低級アルキル基を意味する）
   で示されるカルボニル化合物またはアセタール化
   合物を反応させることを特徴とするα，β−核置
   換フエニルマルトオリゴサイドの環状アセタール
   誘導体の製造法。 ３ 一般式 （式中R¹、R²は同一または異なつて水素原子、
   低級アルキル基またはフエニル基を意味し、R¹
   とR²が共同してシクロヘキサン環を形成しても
   よい。R³、R⁴はいずれか一方はハロゲン原子を
   意味し、他方は水素原子、ヒドロキシ基、低級ア
   ルキル基、ハロゲン原子またはニトロ基を意味す
   る。ｎは０から６の整数を意味する）で示される
   α，β−核置換フエニルマルトオリゴサイドの環
   状アセタール誘導体にアミラーゼ含有試料を接触
   させた後、又は接触させると同時にα−グルコシ
   ダーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼを作用さ
   せ、ここで遊離するフエノール系化合物を測定す
   ることにより前記試料中のアミラーゼ活性を知る
   ことを特徴とするアミラーゼ活性の測定方法。