JPH04211389A - ３−ケトブチリデン ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペンタオシドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はα−アミラーゼ活性測定
用基質として使用されている３−ケトブチリデン　　２
−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペンタオシ
ドの新規な製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】膵液や尿などの体液に含有されるα−ア
ミラーゼの活性を測定することにより、各種疾患の診断
が行なわれている。α−アミラーゼの活性測定法には、
たとえばマルトオリゴ糖（マルトペンタオースやマルト
テトラオース）を基質とする方法がある。この方法では
α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα−グル
コシダーゼとを作用させて、基質からグルコースを遊離
させグルコースの量を測定することによりα−アミラー
ゼの活性値を知る。生成したグルコースは酵素反応を共
役させた測定法、たとえばグルコースオキシダーゼ／パ
ーオキシダーゼ／色素系を利用する方法などにより定量
される。α−グルコシダーゼは三糖以下のオリゴ糖には
作用しやすく、四糖以上のオリゴ糖には作用しにくいた
め、マルトペンタオースやマルトテトラオースを基質と
して使用してグルコースを定量することにより、α−ア
ミラーゼの活性を測定することができる。

【０００３】しかしながら、α−グルコシダーゼはわず
かではあるが、マルトペンタオースやマルトテトラオー
スにも作用するため、それにより測定のブランク値が上
昇し、測定誤差を生ずるという欠点がある。したがって
、これらのオリゴ糖を基質としてα−グルコシダーゼと
ともに一液化して使用することは、測定誤差を招くこと
になり好ましくない。

【０００４】また、マルトオリゴ糖の還元性末端にｐ−
ニトロフェノール等の色原体をアグリコンとして結合さ
せた基質を用いる方法も提案されている。たとえば、特
開昭５４−５１８９２号公報によるｐ−ニトロフェニル
マルトヘプタオシドを基質に用いる方法、特公昭５７−
５３０７９号公報によるｐ−ニトロフェニルマルトペン
タオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシドを基
質に用いる方法などである。これらの基質を用いると最
終的には共存酵素の作用によりアグリコンが遊離し、遊
離したアグリコン、たとえばｐ−ニトロフェノールを光
学的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を容
易に測定することができる。しかし、上記基質にたいし
てもα−グルコシダーゼがわずかながら作用するためブ
ランク値上昇を招くので、これらの基質とα−グルコシ
ダーゼを一液化して使用することは困難である。

【０００５】このような一液化が困難であるという欠点
を解消するため、マルトオリゴ糖の非還元性末端のグル
コースの６位のヒドロキシル基が修飾されたタイプの基
質を用いる方法が提案されている。たとえば、特開昭６
０−２３７９９８号公報には、非還元性末端のグルコー
スの６位のＯＨ基を、たとえばハロゲン原子、−ＯＲ，
−ＯＣＯＲ，−ＯＳＯ２　Ｒ，−ＮＨＲ（Ｒはアルキル
基、フェニル基、ピリジル基など）で置換し、還元性末
端のグルコースに置換または未置換のフェニル基がアグ
リコンとして結合したマルトオリゴシドが基質として開
示されている。非還元性末端グルコースの６位のＯＨが
置換されているとα−グルコシダーゼの分解を受けにく
い。 しかしこのように６位のみに置換基が導入された基質は
合成が困難であり、収率も悪いという欠点がある。また
、特開昭６０−５４３９５号公報には非還元性末端のグ
ルコースの４位および６位のＯＨ基をアルキル基、アル
カノイル基またはフェニル基で置換し、還元性末端のグ
ルコースにアグリコンを結合させたマルトオリゴシドを
基質として用いることが開示されている。非還元性末端
グルコースの４位および６位のＯＨ基が置換されている
とα−グルコシダーゼによる作用を非常に受けにくくな
る。しかしこのような基質は２つのＯＨ基が置換されて
いるため、水溶性が悪く高濃度溶液の調整が不可能であ
り、α−アミラーゼ活性測定に十分な濃度まで基質を溶
解することができないという欠点がある。

【０００６】そこで最近、これらの欠点を解消した新し
いαーアミラーゼ活性測定用基質として３−ケトブチリ
デン　　２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルト
ペンタオシドなどのマルトオリゴ糖誘導体が開発された
（特開平１−１５７９９６号公報）。３−ケトブチリデ
ン　　２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペ
ンタオシドは合成が容易で、水への溶解性に優れ、α−
グルコシダーゼなどの追随酵素の作用を受けず一液化が
可能で、かつ高感度な基質として高い評価を受け使用さ
れている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】この３−ケトブチリデ
ン２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペンタ
オシドは現在、β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル
）−マルトペンタオシドと１，１−ジメトキシ−３−ブ
タノンとのアセタール交換反応により製造されているが
、さらに効率よく経済的に製造できる方法が望まれてい
る。

【０００８】その解決策としてサイクロデキストリング
ルカノトランスフェラーゼの分子間転位作用を利用する
酵素法による製造が考えられる。その１例として特開平
１−１０１８９４号公報により、フェノール骨格残基を
有するグルコシドとマルトオリゴ糖またはアミロースに
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作
用させ、糖鎖再配列反応を行ない、還元末端にフェノー
ル骨格残基を有するマルトオリゴシドを製造する方法が
知られている。その実施例２によれば、β−（２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドを合成
する場合、リン酸緩衝液中、２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−β−グルコシドとマルトヘキサオースにサイク
ロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させ
ているが、効率が非常に悪く、工業的でない。この原因
としては、モノグリコシド体である２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−β−グルコシドの水に対する溶解度が２
５℃で１％未満と極めて低いためと考えられる。

【０００９】したがって、同公報の方法を３−ケトブチ
リデン　　２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マル
トペンタオシドの製造にそのまま適用することは問題が
あると思われていた。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、α−アミラ
ーゼ活性測定用基質として有用な３−ケトブチリデン２
−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペンタオシ
ドの経済的な製造法を開発することを目的として、サイ
クロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用いる
生化学的合成法について鋭意研究を行なったところ、ア
クセプターとして２−クロロ−４−ニトロフェニル−β
−マルトシドを用い、水と水可溶性有機溶媒との混合溶
媒中で３−ケトブチリデン−マルトペンタオースと反応
させると効率よく目的物が得られることを見出し、本発
明を完成した。

【００１１】すなわち、本発明は（１）式

【化４】 で表わされる３−ケトブチリデン−マルトペンタオース
と式

【化５】 で表わされる２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マ
ルトシドとに、サイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼを作用させることを特徴とする式

【化６】 で表わされる３−ケトブチリデン　　２−クロロ−４−
ニトロフェニル−β−マルトペンタオシドの製造法、

【
００１２】（２）サイクロデキストリングルカノトラン
スフェラーゼによる糖転位反応を水と水可溶性有機溶媒
との混合溶媒中で行なうことを特徴とする前記（１）記
載の製造方法、および

【００１３】（３）水可溶性有機溶媒が低級アルコール
、極性非水溶媒、エチレングリコールエーテル類または
グリコール類であることを特徴とする前記（１）または
（２）記載の製造法に関する。

【００１４】本発明で使用されるサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼは起源、由来に特に限定は
なく、バチルス　　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍ
ａｃｅｒａｎｓ　）、バチルス　　メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　、バチルス　
　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）等を由来とする酵素
を用いることができる。

【００１５】本発明で用いられる水と水可溶性有機溶媒
との混合溶媒とは、ｐＨ５〜８の緩衝液と水可溶性有機
溶媒との混合液のことであり、緩衝液の種類については
特に指定はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの
緩衝液等があげられる。水可溶性有機溶媒とはメタノー
ル、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコー
ル等の低級アルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド
等の極性非水溶媒、β−オキシエチルメチルエーテル、
β−オキシエチルエーテル等のエチレングリコールエー
テル類、エチレングリコール、プロピレングリコール等
のグリコール類であり、中でも低級アルコールが望まし
い。混合液中でのこれら水可溶性有機溶媒の濃度は３０
〜７０％が望ましい。

【００１６】本反応中での３−ケトブチリデン−マルト
ペンタオースと２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−
マルトシドのモル比率は前者１に対し後者１．１〜５が
望ましく、サイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼの使用量は３−ケトブチリデン−マルトペンタオ
ース１モルに対し、１２００００ユニット〜２００００
ユニットが好ましい。また、反応は３０〜５０℃の温度
で行なわれる。

【００１７】反応終了後は、反応液を酢酸でｐＨ４．０
以下に調整して酵素を失活させ、逆相クロマトグラフィ
ーにより精製を行なうことによって目的物を得ることが
できる。

【００１８】なお、本発明で用いられる３−ケトブチリ
デン−マルトペンタオースは特開平１−１５７９９６号
公報に記載の方法に準じ、マルトペンタオースと１，１
−ジメトキシ−３−ブタノンとのアセタール交換反応に
より合成することができる。原料のマルトペンタオース
は安価な市販品を用いることができる。

【００１９】また、アクセプターとしての２−クロロ−
４−ニトロフェニル−β−マルトシドはＢ．Ｈｅｌｆｅ
ｒｉｃｈ　によるβ−Ｄ−グリコシド（β−　Ｄ−ｇｌ
ｙｃｏｓｉｄｅｓ）　の合成報告〔Ｂｅｒ．，　７７　
，　１９４（１９４４），Ｚ．ｐｈｙｓｉｏｌ．ｃｈｅ
ｍ．，２８３，１７９（１９４８）　〕を参考に、それ
に改良を加えて安価に入手可能なマルトースより合成す
ることができる。マルトースのアセチル化工程、２−ク
ロロ−４−ニトロフェノールとの結合工程、それに引き
続く脱アセチル化工程は経なくてはならないが、２回の
再結晶操作で効率よく純品が得られる。これら原料化合
物の製造方法は後述の参考例により説明する。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を参考例、実施例によって詳し
く説明するが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。

【００２１】 参考例１：３−ケトブチリデン−マルトペンタオースの
合成 マルトペンタオース７５ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド６００ｍｌに溶解し、均一溶液とし、１，１−ジメ
トキシ−３−ブタノン２６．６ｍｌ、メタンスルホン酸
４．９５ｇを加え、室温で１００時間攪拌する。弱塩基
性イオン交換樹脂１０５ｇを加えて６時間攪拌後、濾過
し濾液を濃縮する。メタノールで十分デカントしたオク
タデシルシリル化シリカゲル１８００ｇ相当分を内径８
．５ｃｍのカラム（約３６００ｍｌ容）に充填し、カラ
ムを蒸留水で置換したのち、濃縮物約１２０ｇを蒸留水
３００ｍｌに溶解したものを負荷する。蒸留水１１リッ
トルにて溶出後、５％アセトニトリル水１２リットルで
溶出する。３−ケトブチリデン−マルトペンタオース富
含有画分を集めて減圧濃縮すると、３−ケトブチリデン
−マルトペンタオースの薄橙色結晶６０．７ｇを得た（
融点１６４〜１６９℃）。ＨＰＬＣ分析により純度は９
９％であった。

【００２２】 参考例２：２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マル
トシドの合成 マルトース５６ｇ、無水酢酸５９０ｍｌおよび無水酢酸
ナトリウム４５．８ｇの混合物を１２５〜１３０℃で２
時間攪拌する。次いで、トルエン１リットル、１０％食
塩水を加え、分液操作を行なう。トルエン層を１０％食
塩水６００ｍｌで５回、さらに蒸留水６００ｍｌで１回
洗浄する。トルエン層を濃縮乾固すると、オクタアセチ
ルマルトース１０８．９ｇを得た（ＨＰＬＣ分析により
α体：β体＝１２：８８）。（このものはこのままで次
工程に進むが、一部とり含水エタノールから再結晶を行
なうと、融点１５９〜１６０℃のβ体の純品が得られる
。）オクタアセチルマルトース１０８．９ｇ、２−クロ
ロ−４−ニトロフェノール１００ｇを酢酸３００ｍｌに
溶解後、塩化亜鉛液（塩化亜鉛５．７５ｇ、酢酸４５ｍ
ｌ、無水酢酸２．５ｍｌを混合して密栓し、一夜静置後
、塩化亜鉛より水分を除去し、溶解させた液）１１ｍｌ
を添加し、減圧下７５℃で酢酸を留去する。１２０℃に
昇温し、１０〜７ｍｍＨｇの減圧下で４時間反応を行な
う。終了後、スラリーを酢酸エチル９００ｍｌに溶解し
、１０％食塩水５００ｍｌを加え分液を行なう。酢酸エ
チル層を２．５％水酸化ナトリウム水６７０ｍｌで４回
、１０％食塩水５００ｍｌで３回、蒸留水で１回洗浄す
る（なお、１回の分液操作につき、酢酸エチル層に酢酸
エチル１００ｍｌを追加していく）。酢酸エチル層を濃
縮乾固すると、粗α，β−（２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル）−ヘプタアセチルマルトシド１２４ｇを得た（
ＨＰＬＣ分析によりフェニル化率は８５％）。（本品は
このままで次工程に進むが、一部とりトルエンから再結
晶すると、融点１６５〜１６７℃、白色のβ体の純品が
得られる。）

【００２３】粗α，β−（２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル）ヘプタアセチルマルトシド１２４ｇを４５℃で無
水メタノール５００ｍｌに溶解し、２８％ナトリウムメ
トキシド１２．１ｍｌを加え、４５℃で３時間反応を行
なう。次いで酢酸６ｍｌを加え中和後、濃縮乾固すると
α，β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルト
シド７９．７ｇを得た。これを蒸留水２４０ｍｌに加熱
溶解し、室温にもどるまで静置する。析出した結晶を氷
冷下に濾過し、冷水１０ｍｌで２回洗浄後、乾燥させる
と、薄黄色の精製α，β−（２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル）−マルトシド６０．３ｇを得た（ＨＰＬＣ分析
により、α体：β体＝４：９６）。得られたα，β−（
２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトシド６０．
３ｇをメタノール１８０ｍｌに加熱溶解後、室温にもど
るまで静置する。析出した結晶を氷冷下に濾過を行ない
、冷却メタノール１０ｍｌで２回洗浄後、乾燥すると白
色の２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシド
の純品４１．２ｇを得た（融点２０３〜２０７℃）。本
品がβ体であることは、α−グルコシダーゼおよびβ−
グルコシダーゼの両酵素を作用させることにより確認し
た。

【００２４】 実施例１ プロパノール１７０ｍｌと５ｍＭ塩化カルシウム含有１
００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１７０ｍｌとを混合
し、均一溶液とする。これに３−ケトブチリデン−マル
トペンタオース６０ｇ、２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル−β−マルトシド３８．６ｇを溶解し、サイクロデキ
ストリングルカノトランスフェラーゼ４５３０ユニット
を加え、３７℃で８時間攪拌する。反応液を酢酸でｐＨ
４．０とし、１時間静置後、活性炭８ｇを加え、２時間
攪拌する。濾過後、濾液を外浴４５℃で約２００ｍｌま
で減圧濃縮する。

【００２５】メタノールで十分デカントしたオクタデシ
ルシリル化シリカゲル６００ｇ相当分を内径６．５ｃｍ
のカラム（約１２００ｍｌ容）に充填し、蒸留水で置換
した後、濃縮液を負荷する。蒸留水５リットルを一定流
速で流して無機塩類、非フェニル化糖を除去した後、１
０％アセトニトリル水１５リットルにて溶出し、黄色を
完全に除去する（ここでは、３−ケトブチリデン　　２
−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトヘキサオシ
ドが少量溶出される）。さらに、１５％アセトニトリル
水１１リットルを一定流速で溶出する。１５％アセトニ
トリル水を２．４リットル流したあたりから３−ケトブ
チリデン　　２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マ
ルトペンタオシドが溶出し始め、８リットル流したあた
りから３−ケトブチリデン　　２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−β−マルトテトラオシドが極微量溶出される
。過剰の２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルト
シドはカラム内に留まったままである。３−ケトブチリ
デン　　２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルト
ペンタオシドに富む画分を集めて減圧濃縮すると、ＨＰ
ＬＣで純度９９％の３−ケトブチリデン　　２−クロロ
−４−ニトロフェニル−β−マルトペンタオシドの白色
結晶２１．１ｇを得た（融点１８８〜１９２℃）。

【００２６】 ＨＰＬＣ分析条件； カラム：ＩＮＥＲＴＳＩＬ　ＯＤＳ−２，　４．６　×
１５０ｍｍ　移動相：アセトニトリル／水＝１８／８２
温度：４０℃ 流速：０．８ｍｌ／分 検出器：ＵＶ検出器（２８０ｎｍ） ＮＭＲ；δ値（分裂型、相対プロトン数）２．２（１重
線、３） ２．９（２重線、２） ３．２〜４．２（多重線、３１） ４．７（１重線、１４） ５〜５．６（多重線、５） ７．３（２重線、Ｊ＝９Ｈｚ　、１） ８．１５（ダブル２重線、Ｊ＝３Ｈｚ　、Ｊ＝９Ｈｚ　
、１）８．２１（２重線、Ｊ＝３Ｈｚ　、１）δ２．２
（３Ｈ）のシングルピークおよびδ２．９（２Ｈ）ダブ
レットピークはそれぞれＣＨ３　ＣＯ基および−ＣＯＣ
Ｈ２　−基にもとづく吸収であり、３−ケトブチリデン
　　２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペン
タオシド１分子中に１個存在する。なお、この３−ケト
ブチリデン　　２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−
マルトペンタオシドの性能評価は特開平１−１５７９９
６号公報の実施例２、３と同様の実験方法で行ない、同
等の結果が得られた。

【００２７】

【発明の効果】本発明方法においては、水と低級アルコ
ール等の水可溶性有機溶媒との混合液を用いることによ
り、アクセプターの２−クロロ−４−ニトロフェニル−
β−マルトシドを１０％以上の濃度で完全に溶解させる
ことができるため、効率のよい高濃度反応が可能となり
、さらに、原料化合物の加水分解反応が抑制され、サイ
クロデキストリングルカノトランスフェラーゼによる糖
転位反応が著しく促進される。従って、本方法によれば
、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用な３−ケト
ブチリデン　　２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−
マルトペンタオシドをサイクロデキストリングルカノト
ランスフェラーゼの糖転位反応により効率よく、かつ経
済的に合成することができるので、本方法によって大幅
なコストダウンが可能となる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　式 【化１】 で表わされる３−ケトブチリデン−マルトペンタオース
   と式 【化２】 で表わされる２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マ
   ルトシドとに、サイクロデキストリングルカノトランス
   フェラーゼを作用させることを特徴とする式【化３】 で表わされる３−ケトブチリデン　　２−クロロ−４−
   ニトロフェニル−β−マルトペンタオシドの製造法。
2. 【請求項２】　　サイクロデキストリングルカノトラン
   スフェラーゼによる糖転位反応を水と水可溶性有機溶媒
   との混合溶媒中で行なうことを特徴とする請求項１記載
   の製造法。
3. 【請求項３】　　水可溶性有機溶媒が低級アルコール、
   極性非水溶媒、エチレングリコールエーテル類またはグ
   リコール類であることを特徴とする請求項１または２記
   載の製造法。