JPS63238559A - 粒子上およびフイルタ−もしくは膜上の結合対員子を用いるアツセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は懸濁可能な粒子上の結合対置子ビ用いる特異的
結合アッセイ、たとえばイムノアッセイのための方法お
よびキットに関する。

懸濁可能な粒子（几とえばポリスチレンラテックス）を
用いろイムノアッセイ法は周知であり。

その際被分析体系結合対員子の存在が粒子相互の結合に
影響を与えろ。手動アッセイ法の場合、凝集した粒子が
観察され、または比重により分離される。米国特許第４
，２０２，６６５号（ウエンッら。

１９８０年）および出願中の米国特許出願第７３３、（
Ｓ　８８号（イエンセンら）の場合、凝集した粒子は遠
心の場で特殊な行動をする。出願中の米国特許出願第７
３３，６８９号（レントリチアら）の場合。

２種の異なる比重をもつ粒子が相互に、被分析体濃度に
より影響を受けた量において結合する。一方の比重７も
つ第１粒子が遠心作用により移動すると、結合されｔ他
方の比重をもつ第２粒子は第１粒子と共に移動する。そ
れぞれが同一被分析体に蛋白質結合する２種の粒子を含
むアッセイ法については米国特許第４，１１５，５３５
号明細書（シアバー。

１９７８年）も参照されたい。

米国特許第４，４５９，３６１号明細書（ゲッター。

１９８４年）には１粒子が被分析体リガンド濃度の関数
として他の粒子と結合またに凝集する粒子イムノアッセ
イ法が示されている。濾過（たとえば細孔寸法０，４μ
ｍのフィルターによる）によって、単一粒子（たとえば
直径０．３μｍのもの）は通過するが、二重粒子（ｄｕ
ｐ　ｌ　ｅｘ　）およびこれよりも高度の粒子凝集体は
フィルターによって捕獲されろ。

フィルターを通過する粒子は可視［じされ、あるいは粒
子の色、光学濃度、螢光その他の特性によって、または
粒子に付着した酵素によって可視性を高めろことができ
ろ（４欄４２行〜５欄４行）。

米国特許第４，４２４，２７９号明細書（ボーンら、１
９８４年）には、結合対置子（たとえば抗体）を保有す
る大型粒子（直径２０〜６０μｍ）が装置コンハートメ
ント内に配置されたアッセイ法およびプランジャー装置
が示されている。被分析体系結合対員子（たとえば抗原
）および可溶性標識付き結合対員子（たとえば第２抗体
−酵素）がそれぞれ反応期間中に装置コンパートメント
に入り、次イで液体は装置コンパートメントから減圧に
より排除され１粒子は粗い（たとえば細孔寸法１５〜１
７μｍ）フィルターにより保持されろ。次いで装置コン
パートメント内に残留する粒子は、たとえば酵素試薬？
添加し、酵素と第２抗体の間の結合を開裂することによ
り、標識につきアッセイされろ。

エル・ニー・ブランクスタインらのアメ、クリニ、プロ
ダ、レビ、　（Ａｍ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐｒｏｄ、　Ｒｅ
ｖ、）３３−４１（１９８５年１１月）および米国特許
第４．２００．６９０号（ルートら、１９８０年）、第
４．２４６．５３９号（コールら、１９８１年）および
第４．４０７．９４３号（１９８３年）を含む幾つかの
文献に、小型の分子が、まｆｌｃは小型の分子および細
菌が膜を通って移動するのに十分な大きさの細孔寸法（
０，６５〜５．０μｍ）をもつ微孔質膜に抗体まｆｃは
抗原７固定１ヒするイムノアッセイ法が記載されている
。

たとえば米国特許第４，２００，６９０号の場合、この
種の膜を被覆した抗体が粗試料由来の被分析体であろ抗
原７捕獲する。洗浄後に酵素に結合し几第２抗体（可溶
性結合体）が導入され、結合した被分析抗原に特異的に
結合する。洗浄後に、酵素による読取す？、′ＥｔＩ分
析体に特異的でない抗体を含む同様な膜から得た値と比
較する。米国特許第４．４０７９４３号明細書（コール
ら、１９８３年）も同様である。

米国特許第４，４８６．５３０号明細書（ディピッドら
）には、特にサンドインチ型のモノクローナル抗体ン用
いるイムノアッセイ法が示されている。しかし１５欄、
６３〜５１行に発色団標識付き抗原およびラテックスに
結合したモノクローナル抗体を用い、これにＪ：！７７
号析抗原が凝集乞抑制し、従って発色団は溶液中に残留
し、ここではその螢光が消光しないアッセイ法について
述べられている。

一方の結合対員子が粒子結合している他の抑制アッセイ
法が米国特許第４，３０８．２０６号明細書（モチダ、
１９８１年）に記載されている。

本発明においては、第１試薬系結合対員子が試料と反応
し、これにより被分析体系結合対員子は第１試薬系結合
対員子に結合する。次いで、粒子ヶ通過させるのに十分
な細孔寸法ンもつフィルターまたは膜ｆ反応混合物を導
通する。第２試薬系結合対員子はフィルターま九は膜に
固定比され、結合した被分析体系結合対員子を含む粒子
まｉＵこれを含まない粒子のいずれかを優先的に捕捉す
る。

他方の種類の粒子はフィルターを通過する状態のままで
あり、抵抗パルス法（ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ　ｐｕｌｓｅ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　）により、光の吸収もしくに散乱
により、酵素による読取りその他により検出される。

従って本発明は （ａ）　　被分析体系結合対員子に相補的な第１試薬系
結合対員子を保有する懸濁粒子ビ、被分析体系結合対員
子が存在する場合これが第１試薬系結合対員子と結合す
る条件下で生物学的試料と接触させ。

そして ｔｂ＋　　粒子がフィルターに結合しない場合はフイル
ターを通過するのに十分なほど大きな細孔寸法７もつフ
ィルターに接触工８（ａ）の反応混合物を導通し；その
際フィルターは被分析体系結合対員子ま几は第１試薬系
結合対員子のいずれかに相補的な第２試薬系結合対員子
を保有し；そして（ｃ）　　フイルターを通過した粒子
を生物学的試料中の被分析体系結合対員子の存在および
量の指示として検出する 工程からなる。生物学的試料中の被分析体系結合対員子
の検出法を提供する。

本発明は、 （ａ）被分析体系結合対員子に相補的な第１試薬系結合
対員子を保有する粒子の懸濁液。

（ｂ）粒子がフィルター疋結合しない場合はフイルター
を通過するのに十分なほど大きな細孔寸法をもつフィル
ター、および ［ｃ）　　被分析体系結合対員子″！！たけ第１試薬系
結合対員子のいずれかに相補的な、該フィルターだ固定
比された第２試薬系結合対員子 からなる、生物学的試料中の被分析体系結合対員子を測
定する（定性的または定量的に）ためのキットをも提供
する。

本発明は種々の結合対員子の定性的まｔは定量的検出に
利用され、これには抗原、・・ブテン、抗体、結合蛋白
質、受容体、および核酸配列が含まれる。提示が容易で
あるため、抗原または抗体に関するアッセイについてま
ず記載する。他の被分析体に関するアッセイについての
解説はその後に記述する。第１および第２結合対員子に
関する”相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”とい
う語は、あるものが一般にイオン性相互作用および／ま
たは水素結合により一方が他方に特異的に結合しうろと
いう意味で用いられろ。第１および第２結合対員子に関
する”競合的（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）　　”という
語はそれぞれが第６結合対員子に対して相補的であり、
第６結合対員子への第１結合対員子の結合によって第２
結合対員子が結合しうろ第３結合対員子上の部位が減少
する（ま友は失われる）か、または他の形で（７ｔとえ
ば立体的に）第２結合対員子と第３結合対員子の結合が
抑制されるという意味で用いられる。“サンドインチ（
ｓａｎｄｗｉｃｈ　）″という語は第６結合対員子が第
１結合対員子および第２結合対員子に同時に結合するこ
とができ、これにより一般に著しい立体障害がない場合
はそれらの間に架橋が形成されろという意味で用いられ
ろ。

本発明に用いられろ２種の試薬は、第１結合対員子？保
有する粒子の懸濁液、および第２結合対員子を保有する
フィルターまたは膜である。粒子は各種の細胞性；合成
″！！たは無機の型のもの、たとえば固定された赤血球
、細菌細胞、ウィルス粒子、ポリスチレンラテックス粒
子、金属ゾル、染色したコレステロール−レシチン粒子
、木炭２粒状色素、およびベントナイト粒子である。好
捷しいものは合成重合体ラテックス粒子、特にポリスチ
レンラテックス粒子である。この種の粒子Ｑま種々の寸
法、たとえば直径０．０５〜５．０　　、？クロンのも
のであり、直径０．１〜１．５ミクロンの粒子が好まし
い。比較的狭い粒度分布の粒子が用いられろ（たとえば
９０％の粒子が中央直径の１０％以内にある）が、これ
よりも若干広い分布も許容できる。

第１結合対員子はこれらの粒子に各種の既知の方法で、
ｔとえは物理的吸着、カルボジイミド［じ単結合、ま几
は単官能性もしくに二官能性アルデヒドによる架橋によ
って吸着ま之は結合させろことができる。これらの粒子
は粒子の非特異的吸着捷たは凝集を防止するために、ア
ルブミンなどの物質であらかじめｔ７′ｊＵ同時に被覆
してもよい。

これらの粒子はさらに標識、ｔとえば螢光分子。

酵素１色素まｔは放射性同位体を含有しているか、ある
いはこれらが吸着または結合していてもよい。

下記に例示され足糸においては、第１結合対員子はジゴ
キシンに特異的な抗体である。

標識（たとえば酵素）を粒子に直接に付着させろほかに
、標識を結合対量子（すなわち抗ジゴキシン抗体）に付
着させろか、あるいは標識（たとえば酵素）をアビジン
もしくはビオチンのうちの一方と結合させ、アビジンも
しくはピオチンのうちの他方を結合対量子（たとえば抗
ジゴキシン抗体）に、まｔは粒子に結合させ（共有結合
または吸着により）、これによってアビジン−ピオチン
架橋を介して間接的に付着８ｅろこともできろ。

第２結合対員子を含む試薬は第２纜合対員子が結合した
膜ま之はフィルターである。この種の膜またはフィルタ
ーはしばしば２種の用途、すなわ′ｃ０）（１）相補的
結合対量子のアフィニティ精製、ま几は（２）残りの試
薬が溶存している相補的結合対量子についての診断用ア
ッセイに用いられるものとして報告されている。特に好
ましいものは米国特許第４，０６６，５１２号、第４，
２００，６９０号、第４．２４６，３３９号および第４
，４０７，９４３号明細書中の微孔質膜である。これら
の場合、高分子膜（たとえばナイロンまｆｔｃＦ１ポリ
（フッ１ヒビリニジン））が第２結合対員子および非特
異的吸着乞遅延させろための不活性蛋白質（たとえばゼ
イン）の双方で被覆されている。本発明について膜の細
孔寸法は粒子の直径よりも大きくなげればならず、好ま
しくは粒子の平均直径の少なくとも約４００％である。

たとえば細孔寸法５．０ミクロンの膜を用いろ場合、５
．０ミクロンよりも小さな平均直径ｔもつ粒子を使用で
きるが、平均直径約１．２５ミクロン以下の粒子が好ま
しい。同様に細孔寸法６．０ミクロンの膜（フィルター
）を用いた場合、粒子は０．７５　ミクロン以下の平均
直径をもつことが好ましい。

−例としてジゴキシン（治療薬としてしばしば監視され
ろ・〜ブテン）のアッセイの場合１粒子は抗ジゴキシシ
ン抗体（動物、たとえば家兎にジコ゛キシン結合体、り
とえばジゴキシン−アルブミン欠接種することにより産
生され友もの）ｌ保有しつる。この場合、膜はジゴキシ
ン−アルブミン結合体乞保有しうる。粒子が試料（たと
えば思考の血清から得たもの）と接触したのち、一部の
粒子は抗体部位が被分析体ジゴキシンでブロックされろ
であろう。この反応はきわめて速やかに平衡に達し、大
部分の場合、平衡に達するがま几は十分な程度に反応す
るのに必要な時間は１分以下である。被分析体ジゴキシ
ンが多量存在するほど、より多くの粒子の抗体部位の一
部またはすべてがこのようにブロックされろであろう。

次いでこの反応混合物を膜に通すと、遊離の抗体部位を
ほとんど、捷たは全くもたない粒子が優先的にフィルタ
ーを通過し；それらの抗体部位が大部分、−またけすべ
て遊離である粒子は膜のジゴキシン−アルブミン部位に
付着し、通過しないであろう。この反応もきわめて速や
かであり、反応混合物ン圧力″？ｉたは真空の作用によ
りフィルターに導通するだけで行われる。粒子上の抗体
の負荷が適切であり、粒子／血清の水準が適切であるな
らば（それぞれルーティン実験によって容易に判定され
ろ）、血清中のジゴキシン水準（目的とする範囲にわた
って）および膜を通過した溶出液中の粒子の間に測定可
能な正の相関関係を与えるアッセイ系が実現されろ。後
記実施例はこのような場合の用量応答曲線を示す。溶出
粒子は酵素による読取り（実施例１）、濁度測定（実施
例２）、または粒子計数法（実施例２に記載したものと
同じラテックス試薬および処理フィルターを用いて実施
）によって測定されたＯ 本発明による他の幾例かの系は、抗体、核酸配列または
マルチエピトープ型抗原（ｍｕｌ　ｔｉｅｐｉ　ｔｏｐ
ｉｃａｎｔｉｇｅｎ）　’ｆ：検出する本発明に用いら
れる。たとえば抗体の検出のためには、相補的抗原７粒
子上に、被分析抗体と競合する抗体を膜（フィルター）
上に施すことができる。標的核酸配列の検出のためには
、相補的核酸配列を粒子上に、競合核酸配列？膜上に施
すことができろ（出願中の米国特許出願第７９０，６７
１　号明細書参照、ダイアモンドおよびコリンズ、１９
８５年１０月２３日出願）。多価抗原（ｆ？：、とえは
エピトープ−１およびエビ）　−プ〜２を含む）の検出
のｔめには、抗エピトープー１抗体を粒子上に、抗エピ
トープー２抗体を膜上に施してサンドインチ乞形成し、
これにより被分析体であるマルチエピトープ型抗原の量
が増加するのに伴って、保有される粒子の量が増加する
。

同様にサンドインチ型捷たは競合型の本発明の実施態様
を下記のものの検出に採用できる。・・ブテン（ジゴキ
シン、テオフィリン、チロキシン。

乱用されろ薬物、およびゲンタマイシンを含む）、抗原
（ＨＣＧ、、ＬＨ，ｈランスフェリン、ＣＲＰおよびＣ
ＥＡＹ含む）、ウィルス性抗原（几とえば一般的な、も
しくは特殊な型のヘルペス、一般的な、もしくは特殊な
型の肝炎、およびＨＴＬＶ−［）、腫瘍抗原、外毒素、
細菌まｔは寄生生物が排出する他の蛋白質、抗体（スト
レプトリジン−〇。

ＤＮ７−ゼーＢ　、ＨＴＬＶ−ＴＩＩ　もＬ＜ＨＭ［［
対ｆろもの、または感染性単核細胞症に伴うものを含む
）、ウィルス性ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、細菌性もし
くは寄生虫性ＤＮＡ、ｍＲＮＡまた１ｒＲＮＡの配列１
葉酸結合蛋白質またはチロキシン結合蛋白質。

一般に、ある粒子上の結合対員子が他の粒子上の結合対
員子に特異的に結合しないことが好ましい。

実施例１ 細孔寸法５．［］ミクロンのイムノアフイニテイ膜”バ
イオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）”　（＋ＢＩＡＯ５０Ｃ
５，ポール・コーボＬ／−ジョン）　９２９ＣｒＩ（５
ｆ　ｔ２）から直径１３龍の円乞切取つｔ０カルボキシ
レート活性比され几フィルターを次いでＰＢＳ中のＢＳ
Ａ１０ｍｙ／ｍ’溶液またはＰＢＳ中のＢＳＡ−ジゴキ
シン結合体’ＩＯｍ／ｒｎｌ溶液に室温で２時間浸漬し
た。

次いでフィルターを同様にＰＢＳ単独中でインキュベー
トすることにより洗浄した。吸湿後にこのＢＳＡおよび
ＢＳＡ−ジゴキシン活性１ヒされたフィルターを風乾し
た。

直径０．６０ミクロンの未改質ポリスチレンラテックス
粒子（日本合成ゴム社、≠０２２０３）にまず抗ジゴキ
シン家兎全血清を蛋白質１８０μｇ／ラテックスｍｇの
量で、０．０５Ｍリン酸塩緩衝ｇ（ｐＨ７、８）中で室
温において緩和な攪拌下に２．５時間インキュベートす
ることにより吸着させた。ラテックスを同じリン酸塩緩
衝液中で１回遠心分離することにより洗浄したのち、部
分吸着し定紋子を次いでリン酸塩緩衝液中の精製グルコ
ースオキシダーゼ（Ｅ（１，１，３，４，）の６４　ｍ
ｇ／ｍｌ溶液中で４℃において１０時間インキュベート
し几。１０ｍｙ／ＢＳＡＴｒＬ／ｙ含むＰＢＳ（ＰＢＳ
／ＢＳＡ）中で遠心分離することによりラテックスを反
復洗浄したのち、粒子を最終的にラテックス２０μに勺
（０，００２％）の濃度になるように同一緩衝液に懸濁
し友。

抗原増感され几フィルターＹ、１ｃｃの注射器を備えた
スウィニー型ホルダーに挿入し几。上記ラテックス試薬
（０，００２％のもの０．２５ｍ７）を、種々の濃度の
被分析体を含有すると思われろＰＢＳ／Ｂ　ＳＡ　Ｏ，
２５ｍｌ　と混和し、混合物全体をフィルターに導通し
、グルコース１．８％、ホースラディツシュパーオキシ
ダーゼ８．７率位／　ｍｌ　、および４−アミノアンチ
ピリン１．２ｍＭＹ含む基質混合物［］、３３０ｍ１乞
れた試験管に導入し几。混合物全体を攪拌し、３７℃で
５分間インキュベートし、５１０ｎｍにおける吸光度を
読取った。

ジゴキシン増感フィルターは検出され念総酵素活性の約
８０％を保持していたが、ＢＳＡ増感フィルターは約２
８％を保持していたにすぎない（表Ｉ）。この差はジゴ
キシン免疫反応性によりフィルターに特異的に結合した
ラテックス粒子の数を反映している。保有さ′ｒＬ九粒
子粒子もフィルター自体を基質混合物と共にインキュベ
ートすることにより検出できろ。

感　　　度 ラテックス粒子（０，４９μｍ）に前記のように抗ジゴ
キシン血清およびグルコースオキシダーゼを吸着させ念
。次いで０．０１３２％（Ｗ／Ｗ　）のラテックス懸濁
液０．２５　ｍｌを、種々の濃度のジゴキシンを含有す
るＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液０．２５１ｍと混和し、次いで
ジゴキシン増感フィルターに導通し、基質溶液０、３０
　ｍｌに導入した（総容積０．８０ｄ）。反応混合物を
混合し、６７℃で５分間インキュベートしたのち、５１
０ｎｍにおげろ光学濃度を記録した０アッセイは少なく
とも５ｎｇ／ｍｌまでの感度を備えていた（表■）。非
特異的相互作用のため総括性のわずか７％が膜に保持さ
れていた（未濾過対照対ＢＳＡ濾過）。

表　　　■ ジゴキシンフィルター　　０．０５１　　　　　８０Ｂ
ＳＡフイルター　　　　０．１６５　　　　　２８非’
濾過０．２３２　　　　０ 表　　■ 膜の感度−ラテックスアッセイ法 ０　　　　　０．０９３　　　　　７８５　　　　　０
．２７９　　　　　３３１０　　　　　０．２８９　　
　　　３１５０　　　　　０．３４６　　　　　１７１
００　　　　　０．３５５　　　　　１５ＢＳＡフイル
ター　　　０．３８７　　　　　　　　　　７非濾過対
照０．４１６　　　　　　０ 実施例２ 直径１．０９ミクロンの未改質ポリスチレンラテックス
粒子（日本合成ゴム社、＋Ｇ２１０１　）に抗ジゴキシ
ン家兎全血清を蛋白質２００μｙ／ラテツクスｍｇにお
いて、実施例１に記載したものと同じ条件下で吸着させ
た。この抗体による粒子増感ののち、これら’＆ＰＢＳ
／ＢＳＡ中で反復遠心分離すろことにより洗浄し、最後
に６５０　ｎｍにおける光学濃度により測定して０．０
０３％（ｗ／ｗ）の濃度に再懸濁した。平均細孔寸法５
．０ミクロンのイムノアフイニテイ膜゛バイオダイン”
（≠ＢＩ　０５０Ｃ５゜ボール・コーポレーション）　
’？：　直径１３　間ノ円形に切断し、実施例１に記載
したと同様にＢＳＡ−ジゴキシン結合体で活性比した。

アッセイを行うためにラテックスの０．００３％懸濁液
１．５　ｍｌをＰＢＳ中のジゴキシン含有溶液Ｑ、５ｍ
Ｊと混合し、混合物’＆５ｃｃの注射器でイムノアフイ
ニティ膜に導通した。次いでＰｔＬの光学濃度を６５　
Ｏｎ’ｍにおいて分光光度計で測定した。

表■に示されろように、被分析体１０ｎｇ／ｗＬｉ！の
存在下ではジゴキシン不在下で認めらｎ＊ＯＤに比べて
７倍大きなＯＤが認められた。さらにフィルターを通過
する粒子の数はジゴキシン濃度の増大に伴って増加し続
げ几。１１００ｎ／ｍＡ：　　において１４倍に及ぶ増
加が認められ九〇これは粒子固定１し結合部位に対する
飽和に近い濃度である。

表　　■ ［］　　　０．０２７ １０　　０．１９７ ５０　　０．２６６ ７５　　０．３５２ １００　　０．３８０ 実施例３ 試薬の調整 イムノアフイニテイフィルター“バイオダイン”（細孔
寸法５．０μｍ）Ｙまず下記の方法でヒト絨毛性ゴナド
トロピン（Ｉ（ｃＧ）により増感した。

直径１６ＩＩＩＩＥのフィルター約３５枚を別個に、ゲ
ルｒ過およびＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーに
より精製しｅＨｃＧ（８４０９ＩＵ　／固体ｍｇ　　）
４．５ｍｇ／ｍｌ　？：　Ｐ　Ｂ　Ｓ中に含有する溶液
２ｒｎｌ！に入れた。室温で１時間ソーキングしたのち
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　１０ｍｇ／ｒｎｌ　
およびナトリウムアジド０．１％を含有するＰＢＳ溶液
２５０ｍ１にフィルターを移し、さらに２０分間ソーキ
ングした。

フィルターを最後に蒸留水に浸漬することによってリン
スし、沢紙上で吸湿し、室温で乾燥させた。

直径０．４９　μｍのラテックス粒子（ＪＳＲ−１Ｉ：
ＵＯ４０３）を下記の方法で抗−β−ＨＣＧモノクロー
ナル抗体おヨヒグルコースオキシダーゼにより増感した
。

すなわち、０．０１ＭＩＪン酸ナトリウム緩衝／ＦＬ（
ｐＨ７、８）中で洗浄した粒子乞同じ緩衝液に懸濁して
最終濃度約１０％となし、　２０ｍｇ（０，２０ｒｎｌ
Ｙ小型のガラス製ねじ込みキャンプ付きびんに移した。

次いで、精製したモノクローナル抗−β−ＨＣＧ抗体（
マリタイム・ケミカル社）０．１０ｍＪ（蛋白質０．５
６ｍｇ）Ｙ添加した。４°Ｃで一夜インキユペートした
のち、ラテックス試料乞リン酸塩緩衝液中での遠心分離
により１回洗浄し、同じ緩衝１０．１０ｔｎｉに再懸濁
し、固体状の精製グルコースオキシダーゼ（ベーリンガ
ー・マンノ・イム）１０ｍｙ’＆添加し、総容量約０．
２０ゴとなした。反応混合物を室温で１時間インキュベ
ートし、ＰＢＳ中のＢ５Ａ１０ｍｇ／ｍｌで遠心分離に
より２回洗浄し、０．１％アジドな含有するＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ中に再忠濁して最終的に０．８８％（ラテックス８
．８ｍｇ／ｍｌ）となした。

二二二工二二 実施例１に記載した新鮮な基質混合物？調製し、０、５
　ｍｌを１２Ｘ７５朋のガラス製試験管５本それぞれに
入れ之。上記のＨＣＧ増感フィルターを、それぞれ１ｃ
ｃのツベルクリン注射器（プランジャーなし）を備えｔ
スウイニー型フィルターホルダーに挿入し几。ラテック
ス−被分析体混合物は。

０．８８％ラテックス０．０１　ｍｌと、表■に示すよ
うにＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中に種々の濃度の精製Ｉ（ｃ
Ｇを含有する溶液０．６９　ｍｌとを混合することによ
り調製された。室温に２〜３分間放置したのち、ラテッ
クス懸濁液を別個に異なるフィルター付き注射器に移し
、基質を入ｎ７ｊ試験管中に送入した。

６７℃の水浴中で５分間インキュベートしたのち試験管
を直接にスペクトロニック２１型分光光度計（バラシュ
・アンド・ロム）に挿入することにより、５１０ｎｍの
波長における各懸濁液の吸光度を測定したｏ 上記方法によるＨＣＧについての標準曲線を表■に示す
。得らｆ”ＩＯＤにおけろ総差の最大部分は５ＩＵ／Ｍ
（８４％）の濃度で認められ、４０ＩＵ／ｍｌまでＯＤ
が徐々に高まつｔｏ 表　　■ ０　　０．１８９ １　　０．１９８ ５０．６７４ １０　　０．３８１ ４０　　０．４１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）被分析体系結合対員子に相補的な第１試薬
   系結合対員子を保有する懸濁粒子を、被分析体系結合対
   員子が存在する場合これが第１試薬系結合対員子と結合
   する条件下で生物学的試料と接触させ、そして （ｂ）粒子がフイルターに結合しない場合はフイルター
   を通過するのに十分なほど大きな細孔寸法をもつフイル
   ターに接触工程（ａ）の反応混合物を導通し；その際フ
   イルターは被分析体系結合対員子または第１試薬系結合
   対員子のいずれかに相補的な第２試薬系結合対員子を保
   有し；そして（ｃ）フイルターを通過した粒子を生物学
   的試料中の被分析体系結合対員子の存在および量の指示
   として検出する 工程からなる、生物学的試料中の被分析体系結合対員子
   の検出法。 （２）第２試薬系結合対員子が第１試薬系結合対員子に
   相補的であり、第１試薬系結合対員子上の結合部位に対
   し被分析体系結合対員子と競合する、特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。 （６）第１試薬系結合対員子が抗体である、特許請求の
   範囲第２項に記載の方法。 （４）第２試薬系結合対員子および被分析体系結合対員
   子がハプテンである、特許請求の範囲第３項に記載の方
   法。 （５）第２試薬系結合対員子および被分析体系結合対員
   子が抗原である、特許請求の範囲第３項に記載の方法。 （６）第２試薬系結合対員子が、第１試薬系結合対員子
   に結合する被分析体系結合対員子の結合部位と異なる被
   分析体系結合対員子の結合部位において被分析体系結合
   対員子に相補的である、特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。 （７）被分析体系結合対員子が少なくとも２個の別個の
   エピトープをもつ抗原であり、第１および第２試薬系結
   合対員子が該抗原の異なるエピトープに特異的な抗体で
   ある、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 （８）被分析体系結合対員子が抗体である、特許請求の
   範囲第６項に記載の方法。 （９）第１試薬系結合対員子は抗原またはハプテンであ
   り、これに対し被分析体系抗体が特異的であり、第２試
   薬系結合対員子は被分析体系抗体に、または被分析体系
   抗体を含む免疫複合体に特異的な抗体である、特許請求
   の範囲第８項に記載の方法。 （１０）粒子が直径０．０５〜５ミクロンであり、フイ
   ルターが粒子の直径の少なくとも２００％の細孔寸法の
   ものである、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （１１）検出工程（ｃ）がフイルターを通過した溶出液
   をオリフイスに導通し、オリフイスを通るインピーダン
   スを測定することよりなる、特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 （１２）検出工程（ｃ）がフイルターを通過した溶出液
   の吸光度を測定することよりなる、特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 （１３）粒子が螢光性であり、検出工程（ｃ）がフイル
   ターを通過した溶出液の螢光を測定することよりなる、
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （１４）粒子が酵素を保有し、検出工程（ｃ）がオリフ
   イスを通過した溶出液を該酵素に対する試薬と混合する
   ことよりなる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （１５）（ａ）被分析体系結合対員子に相補的な第１試
   薬系結合対員子を保有する粒子の懸濁液。 （ｂ）粒子がフイルターに結合しない場合はフイルター
   を通過するのに十分なほど大きな細孔寸法をもつフイル
   ター、および （ｃ）被分析体系結合対員子または第１試薬系結合対員
   子のいずれかに相補的な、該フイルターに固定比された
   第２試薬系結合対員子 からなる、生物学的試料中の被分析体系結合対員子を測
   定するためのキツト。