JPS63240783A - 動物細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （お　産業上の利用分野 本発明は、動物細胞の培養方法に関するものである。更
に詳しくは、サスペンジョン状態で動物細胞を培養する
方法に関するものである。

（ｂ）　　従来技術 細胞培養技術は、例えばウイスル、ワクチン。

インターフェロンの如き抗ウィルス創成いはホルモンの
如き生物薬品の製造にとって重要である。

更に近年特定タンパク質などを標的とする七ツクローナ
ル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイブ
リドーマの培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんなど
を用いて実験室的規模で行なわれている。

一方近年細胞の培養法及びそのための装置として、いく
つかの提案がなされている。これらの提案は、大きく分
けて付着培養（ａｎｃｈｏｒａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
　ｃｕｌｔｕｒｅ　）と浮遊培養、つまりサスペンジョ
ン培Ｎ（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　　ｃｕｌｔｕｒｅ　）
との２つの方式に分類されるが、これらの方式は培養さ
れる細胞の特性によっていずれかに決められる。

このうちサスペンジョン培養に関して下記の提案がなさ
れている。例えばマグネティクスターラーもしくは機械
的に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピナー
フラスコの中に調整された撹拌曙能を設けた培養方法が
提案されている（米国特許第２，９５８，５１７号およ
び同第３，６４９，４６５号明細書参照）。

特開昭５７−６５１８０号公報には、回転可能なシャフ
ト上に支持される少くとも１枚の比較的大表面積の屈撓
性シートを撹拌機とし、該撹拌機を回転させて該シート
を波立たせ、それによってヒトの２倍体細胞のような成
る種の虚弱細胞に対し所望のおだやかな撹拌を作り出す
サスペンジョン培養装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、細胞が一
定量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比
較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジョン培養において、細胞の生長増殖が
比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細胞を火消に且つ
高密度で培養するために、一般に新しい培養液を培ｉ槽
中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養
槽外へ排出しながら培養する方式、すなわち通称パーヒ
ユージョン方式と言われる方式が提案されている。（Ａ
　ｎｎｕａｌＲｅｐｏｒｔｓ　Ｏｎ　Ｆ　ｅｒｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ　Ｐ　ｒｏＣｅｓｓｅｓ、ＶＯＩ、６）。

この方式を用いて培養するに当って重要なことの１つは
、サスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養液とを効
率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養
槽内の細胞の生育環境を最適条件下に維持することであ
る。サスペンジョン液から生細胞と古い培養液とを分離
するために種々のフィルターやまた種々の形式が提案さ
れているが、フィルターの口塞りや、装置の構造の煩雑
性などの点で工業的培養装置としてはいずれも満足すべ
きものとは言い難い。

（ｃ）　　発明の目的 そこで、本発明の目的は、簡単な操作でサスペンジョン
培養液から生細胞と培養液を分離し、分離した該生細胞
を培養栖へ完全に戻すことが可能である方法を提供する
ことである。

本発明の他の目的は、フィルターなど使用しなくとも生
細胞と古い培養液とを分離することが可能な方法、従っ
てフィルターの口塞りなどの問題が解消した方法を提供
することにある。

本発明の更に他の目的は、工業的規模のサスペンジョン
培養において大量のサスペンジョン培養液を処即してそ
の中から動物細胞を分離することが可能な方法を提供す
ることにある。

本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ高密度の培養
に適したパーヒユージョン方式による工業的方法を提供
することにある。更に他の目的は、以下の説明から明ら
かとなるであろう。

（山　発明の構成及び効果 すなわち、本発明は、動物細胞をサスペンジョン状態で
培養槽中で培養する方法において、該培養槽より動物細
胞を含むサスペンジョン培養液を取出して遠心分離機へ
供給し、該遠心分離機により該サスペンジョン培養液か
ら動物細胞を分離し分離された動物ＩＩｌ胞を培Ｍ槽へ
戻して培養する方法であって、 該遠心分離装置におけるサスペンジョン培養液からの動
物細胞の分離を、下記性質 （ａ）　　水と実質的に混和しない （ｂ）　　水より密度が大きく、そして（ｅ）　　動物
細胞の生育を実質的に阻害しない、を有する液状キトリ
ヤーを該遠心分離機に供給して該遠心分離機中の培養液
と分離した動物細胞を該液状キャリヤーと共に該遠心分
ｍ機から排出せしめて培養槽へ戻すことを特徴とする動
物細胞の培養方法である。

以下、本発明について説明する。

本発明の動物細胞の培養方法はサスペンジョン型の動物
細胞の培養（サスペンジョン培養）に適用される。サス
ペンジョン培養とは、水性媒体中で細胞それ自体を浮遊
させながら培養する方法をいう。

本発明の培養方法において、培養の対象となる動物細胞
は、サスペンジョン状態にて生育ないし増殖可能なもの
であり天然の動物細胞のみならず、人為的或いは遺伝子
操作により変性された細胞例えばハイブリドーマである
ことができ、またＩＬ−２の如きリンホカインを産生ず
るリンパ球由来の細胞、インターフェロン（ＩＦＮ）の
如き有用な生理活性物質を産生する２倍体細胞、あるい
は種々のモノクローナル抗体を産生ずるｌｌ１Ｉ胞であ
ることができる。本発明は、モノクローナル抗体を高い
濃度で得る目的のためモノクローナル抗体を産生ずる細
胞の培養に対して特に適している。

サスペンジョン培養に用いられる培養液は実質的に水よ
りなる水性媒体である。該水性媒体は、動物細胞の培養
に通常使用される各種添加物例えば種々の無磯塩、ビタ
ミン類、捕酵素、ブドウ等。

アミノ酸、抗生物質、生長促進因子などを含有している
。

また培養液には血清を加えることもできるが、血清を用
いない所謂無血清培地を培養液として使用することもで
さ゛る。無血清培地を使用するのが経済的に有利であり
、望ましい。

培養槽としては、動物細胞の仕込口、新しい培養培地の
仕込口、空気導入管、撹拌機およびサスペンシコン培養
液の抜出し導管を少くとも備えたものが使用される。こ
のような培養槽は通常の培養タンクであることができる
。

サスペンジョン培養液の扱出しは、連続的にあるいは断
続的に（間歇的に）行うことができる。

抜出された動物細胞を含むサスペンジョン培養液の４に
見合う吊で、新しい培養液を培養槽に連続的にあるいは
断続的に導入するのが望ましい。かくして、培養槽内の
サスペンジョン培養液中の主として動物ＭＪＩ１３Ｉの
代謝産物からなる動物細胞の生育を阻害する（良くない
影響を与える）物質の濃度を、常に且つ可成り低水準に
維持できることとなり、その結果該サスペンジョン培養
液中の動物細胞の生育密度を増大させて培養を実施する
ことを可能とする。

このようにして、動物細胞の生育密度が増大した分だけ
、該動物ｍ胞の生育に伴う有用な代謝産物の生産（６）
を増大させることが可能となる。もちろん、上記の如く
動物細胞の生育を阻害する物質の濃度を低水準に十分な
管理の下に、維持することによって、動物細胞の増大し
た生育密度を長期間に亘って保持したまま培養を実痛し
つづけることができ、有用な代謝産物の増大した産生は
を確保できることとなる。

遠心分離装置のサスペンジョン培養液の供給は、該＠置
により処理可能な量を一度に仕込んでもよく、あるいは
連続的に受樋ずつ行ってもよい。分離された動物細胞を
含む成分と古い培養液を遠心分離装置から排出するには
、遠心分離装置を回転させたまま連続的に取り出しても
あるいは遠心分離装置の回転を停止して取出してもよい
。

本発明によれば、例えば遠心分離装置へのサスペンジョ
ン培養液の供給を連続的に少量ずつ行ないそして分離さ
れた動物細胞を含む成分と古い培養液との取出しを、別
々にしかしながらいずれも連続的に少量ずつ行う方法（
以下連続法という）これらの市販の遠心分離機では、遠
心分離されるべき液体が仕込まれる空間は、回転軸を中
心とする円筒状に配置されている。従って、これらの遠
心分離数によれば、遠心分離された動物細胞は円筒状の
沈降面にほぼ均一に沈降せしめられる。

本発明の実施に用いられる遠心分離装置の好適な他の例
は、本発明者の研究によれば、（ａ）　サスペンジョン
培養液の供給口、市〉　沈降した動物綿１抱が遠心力に
よって沈降面に沿って移動しうるような構造を有する該
沈降面、 （ｃ）　　沈降面に沿って移動した動物細胞が集合する
動物細胞集合部。

（ｄ）　　該動物細胞集合部から該動物細胞を取出すた
めの取出口、および （ｅ）　　動物細胞が分離された培養母液を排出するた
めの母液排出口、 を備える遠心分離装置であることが明らかとなった。

上記遠心分離装置の特徴は、上記（ｂ）の沈降面と上記
（ｃ）の動物細胞集合部を有する点にある。上記（ｃ）
の動物細胞集合部を有する点にある。上記（ｂ）で規定
する沈降面の構造は、沈降面上に沈降した動物細胞がそ
の場に止まらず、遠心ノｊによって、沈降面に沿って、
沈降した場所から他の場所へ移動しろるような構造を意
味している。このような構造は、例えば沈降面を有する
回転ロータの回転軸から該沈降面までの距離が等しく無
く、最も距離の短い場所から最も距離の長い場所へ向け
て距離が次第に長くなるようにゆるやかに変化している
ような沈降面によって代表される。沈降面の最も距離の
長い上記場所には、最も大きい遠心力が作用し、沈降面
の最も距離の短い上記場所には最も小さい遠心力が作用
し、その間の区間にはその中間の遠心力が作用するから
、例えば最も距離の短い場所に沈降した動物細胞で１さ
え遠心力の作用により、沈降面に沿って次第に距離の長
い場所へと移動し、やがて距離の最も長い場所に至って
集合するようになる。

上記（ｃ）の動物細胞集合部はこのように沈降した動物
細胞が遠心力によっては最早移動しないような場所に設
けられる。

上記歯）の沈降面は、好ましくは、ロータの回転軸を含
む１ツの断面において、該回転軸から次第に距離が変化
しているような構造を有している。

かしくて、回転軸に垂直な断面において、該回転軸から
最も距離の長い前記場所と、該回転軸を含む１ツの断面
において該回転軸から最も距離の長い上記場所とが一致
した極めて小さい５ｐｏｔに、遠心力によって動物細胞
が極めて効率的に集合するから、その５ｐｏｔに動物細
胞取出口を設ければ、該動物細胞を有利に取出すことが
できる。

上記遠心分離装置が上記（田の培養液供給口、＋ｄ＋の
集合した動物細胞の取出し口および（ｅ）の培養母液排
出口を、ざらに有することは説明を要しないであろう。

上記遠心分離装置を添付した図面により更に説明する。

添付図面の第１図、第２図および第３図には、本発明で
使用する好適な遠心分離装置のロータ（分ｉｉ！ｌ槽）
の概念図が示されている。いずれの図においてもＡ図は
回転軸に直角方向の断面図であり、Ｂ図は回転軸を含む
回転軸に平行な方向の断面図である。

第１図において、１０は分離に供すべきナスペンション
培養液の供給口であり、１１および１１′　は動物細胞
の沈降面であり、１２は動物細胞集合部であり、１３は
該集合部１２に集合した動物細胞を取出す取出し口であ
り、１４は母液排出口である。サスペンジョン培養液の
供給口１０はロータの回転軸から距！ｉｒだけ離れた位
置にあり、母液排出口１４はほぼロータの回転軸の位置
に設けられである。第１図のロータの沈降面は１１′の
部分から１１の部分に向けて回転軸からの距離が次第に
緩やかに大きくなっている。１１′　の部分に沈降した
細胞は遠心力の作用により、１１の部分へ向けて沈降面
に沿って次第に移動する。第１図のＢ図によって、良く
理解されるとおり、沈降面はロータの底部から上部へ向
って聞いており、そして１１′　の部分よりも１１０部
分の開きの方が大きい。沈降面に、このような開きを設
けることによって、例えば１１′の部分のロータの上部
に近い箇所に沈降した動物細胞も１１′　の部分のロー
タの底部に近い箇所に沈降した動物ａＩＩ１２１も、や
がて集合部１２に集合するようになる。動物細胞の取出
し口１３は培養液の供給口１０よりも回転軸から遠い距
ｌ１ＩＲにある。

第２図の遠心分離装置のロータは、第１図の遠心分離装
置のロータと基本的に同じであるが、次の点で相違する
。第２図のＡ図によって良く理解されるように、動物細
胞沈降面は２組の沈降面の粗合せ、１１ａと１１ｂとか
ら成る。これらの２組の沈降面は、沈降面１１ａの上に
沈降した動物細胞が沈降面１１ｂ上に移動することが実
質的になく、その反対らまた成立するような関係にある
。従って、沈降面１１ａの上に沈降した動物ＩＩＩ胞は
沈降面１１ａに沿って移動した集合部１２ａに到達し、
一方沈降面１ｉｂ上に沈降した動物細胞は沈降面１１ｂ
に沿って移動して集合部１２ｂに到達するので、これら
の集合部１２ａおよび１２ｂから分離された動物細胞を
取り出すための取出し口も２ケ所１３ａ　、　１３ｂに
ある。

また、第２図のロータでは、母液取出し口１４は、回転
軸から　ｒｏ　Ｉ）ｉｌｌれた位百にある。ｒｏは回転
軸からサスペンジョン培養液の供給口までの距離ｒより
も小さい。

第３図の遠心分離装置のロータも、第１図の遠心分離装
置のロータと基本的に同じであるが、第３図Ａ図から良
く理解されるとおり、沈降面１１がほぼ円形を有してい
る。しかし、この円の中心はロータの回転軸の中心とず
れているので、動物細胞は集合部１２に集まり、取出し
口１３から取出される。

上記第１図、第２図および第３図のロータは、連続法に
より運転する場合に好適である。本発明で用いられる遠
心分離装置のロータは、さらに分離板を備えることがで
きる。分離板は、回転軸に比較的近い部分、例えば培養
液供給口より回転軸に近い方の部分に存在する動物細胞
を有利に補集し、そして沈降面に供給する。

第４図には、本発明に用いられる他の遠心分離装置のロ
ータの例が記載されている。この遠心分離装置のロータ
は、分離された動物細胞を間歇的に該装置から取出すの
に有利に使用される。

第４図のロータは、第４図Ａ図および第５図から良く理
解されるとおり、はぼ三角形状の分離槽１５を持ってい
る。この分離槽１５内に、ある一定期間、培養液供給口
１０から培養液を供給しつつ、母液取出し口１４から母
液を抜出して、遠心分離装置の運転をつづける。第４図
Ｂ図から良く理解されるどおり、分離槽１５は沈降した
動物細胞が集合部１２に集合するような沈降面構造を有
している。供給口１０は集合部１２の近傍に設けられて
おり、取り出し口１４は分離槽１５の底部に連結してい
る。上記の如くして、一定期間運転をつづけたのち、培
養液の供給と母液の取り出しを停止し、取り出し口１４
から分離槽１５内に逆に母液を通じそして供給口１０か
ら該母液と一緒に分離槽内に蓄積した生きた動物細胞を
取り出す。この動物細胞を取り出す間、遠心分離装置の
回転は行っていても停止していてもよい。

上記の如き間歇運転は、例えば第１図のロータを持つ遠
心分離装置によっても実施できることは当業者は理解で
きるであろう。すなわち、第１図のロータでは、動物細
胞取り出し口１３から培養液を供給しつつ、母液排出口
１４から母液を排出する運転を一定期間実施し、その後
母液排出口からロータ内に逆に母液を供給してロータ内
に蓄積した動物細胞を該母液と一緒に取り出し口１３か
ら取り出すことになる。

あるいは遠心分離装置へのサスペンジョン培養液供給と
分離された古い培養液の取出しを連続的に少看ずつ行な
うが、該培養液の供給をある時間経過した後停止し、し
かるのち分離された動物細胞を含む成分を取出す方法（
以下、断続法という）によって、工業的に特に有利に実
施しうる。

第６図のロータは、第６図Ａ図およびＢ図で良く理解さ
れるとおり、はぼ三角形状の分離槽１６と遠心方向に対
して傾きをもち、内部に分離板１８を有する分離槽１７
かう構成されている。ここで、第６図Ａ図は軸断面図、
Ｂ図は゛（ａ　Ｉ＋　　１１ａ１１平面図である。

サスペンシコン培養液は培養液供給口１０から分離槽１
６に連続的に供給され、分離槽１６および分離槽１７に
て動物細胞が分離される。動物細胞が分離された培養母
液を母液排出口１９から、動物細胞を含む成分を細胞１
１ｆｆｌ取出口２１から別々に、しかしながら連続的に
取出す。

第６図Ａ図から良く理解されるとおり、分離板１８は遠
心方向に対し傾斜をもち、培養液供給口１０よりも回転
軸に近い部分に設けられ、細胞を有利に捕集し、分離槽
１６に供給可能な構造を有している。

分離槽１６は沈降した動物細胞が集合部２０に集合する
ような沈降面構造を有している。

培養液供給口１０は分離槽１６の底部に、細胞取出口２
１は集合部２０の近傍に、培養液母液排出口１９は分離
槽１７の頂部に設けられている。

ロータ本体は、ロータコア２２とロータボディー２３か
ら構成され、軸受２４．２５および軸受固定板２６゜２
７にて支持されている。また、２８．２９はメカニカル
ミール、３０はサスペンジョン培養液供給ノズル。

３１は培養母液取出ノズル、３２は動物細胞を含む成分
の取出ノズル、３３は回転伝達用プーリー、３４はロー
タバランス槽である。

本発明に用いる遠心分離装置としては、市販製品を使用
することができる。例えば、日立二成分同時回収式連続
遠心システム（大容狙冷却遠心改６ＰＲ−５２の本体に
、５ＲＲ５ＣＴ型ロータ又は５ＲＲ３ＣＡ型ロータを組
込んだもの）を使用することができる。

本発明によれば、遠心分離装置は、該動物細胞を、それ
がサスペンドしている培養液から、生きたまましかも効
率的に分離するために下記の運転条件で運転されねばら
ない。一般に、動物細胞は外力によって変形し易く、破
壊され易いため、遠心弁！ｉ装置により、生きたままし
かも効率的に、培養液から分離するのは困難であるが、
本発明者らの研究によって、下記（１）〜（４）の４ツ
運転条件を同時に満足することが臨界的であることが明
らかとされた。

（１）　　　　　　θ≦　３００ （２Ｊ　　　Ｚｘθ≦３　Ｘ　１０４ （３）　　Ｑ／Ｓ−Ｚ≦　０．３および（４）５≦Ｚ≦
２０００ 上記式中、 θは遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（
分）であり、 Ｚは遠心効果であり、 Ｑは遠心分離装置へのサスペンジョン培養液の単位時間
当りの供給ｍ（ｄ／ｍ１ｎ）であり、そして Ｓは遠心力作用時の沈降面積（ｃｉ　）である。

遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（０１
分）は、上記式（１）に示されているとおり、３００分
以下に止めるべきである。３００分を越えると遠心分離
装置内において酸素欠乏などによる原因のため動物細胞
の生存率が顕著に低下する。平均滞留時間（θ）は、好
ましくは１５０分以下、殊に６０分以下である。

遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（θ）
は、例えば連続法すなわち遠心分離装置にサスペンジョ
ン培養液を連続的に仕込み且つ分離された動物細胞を連
続的に取出す方式では、仕込まれたサスペンジョン培養
液中の動物細胞が遠心条件下で存在しつる空間の体積（
ｖ−ｃｄ）を、分離された動物細胞を含む成分の該遠心
分離装置からの取出し速度（Ｑｃ　、　ｃｄ／ｍｉｎ　
）で割った値として求められる。

２は遠心分離操作を行った時の遠心効果であり、回転軸
からの距離をｒ（ｃｍ）２回転角速度をω（ｒａｄｉａ
ｎ／　ｓｅｃ　＞そして重力の加速度を’Ｊ（ｃｍ／ｓ
ｅｃ　２）で表わすと、ｒω２／３で表わされる。

遠心効果は、いわば動物細胞に負荷される遠心力の大き
ざを示しており、従って分離に供すべきサスペンジョン
培養液を遠心装置に供給するための培養液供給口の位＠
（回転軸から距１１ｒ）によって決まる。

Ｚは５〜２，０００の範囲である。５より小さいと細胞
の分離操作を効率よ〈実施することが困難であり、一方
２０００を越えると細胞にかかる遠心力が多き過ぎて細
胞の破壊が著しくなるので望ましくない。遠心効果（Ｚ
）は、好ましくは、１０〜１．０００の範囲、殊に好ま
しくは２０〜３００の範囲にあるのが有利である。

また、Ｚとθとを掛は合せた値（Ｚ・θ）を、３Ｘ１０
’以下に保つ必要がある。この値を越えた条件で遠心操
作を行うと、細胞自体の圧密によって生存率の低下が次
第に大ぎくなり不利である。

Ｚ・θの値は２　Ｘ　１０”以下が特に好ましい。

さらに、Ｓ　（ｃｌｉ＞は遠心力作用時の沈降面積（ａ
ｉ　）である。Ｓ　（ｃｊｄ）は、分離すべきサスペン
ジョン培養液の遠心分離装置への供給口の位置（回転軸
からの距１１１ｒ（ｃＩＲ））における分離に関与する
有効面積として定義される。該有効面積は、回転軸から
ｒの距離にある供給口の位置における仮想円が沈降面と
交差しない場合には、該供給口の位置（ｒ）とその位置
におけるサスペンジョン培養液の液面の高さくｈ）とに
よって、πｒ２ｈの値として求められる。また、上記仮
想円が沈降面と交差する場合には、有効面積は仮想円が
沈降面と交差する迄の部分の面積に減少し、πｒ２ｈに
、交差する迄の角度割合を掛けた値として求められる。

この場合、上記液面の高さくｈ）は、遠心分離装置の分
離層の最も深い位置からの垂直距離を云うものと理解す
べきである。

有効面積Ｓと遠心効果Ｚとの掛は合わせた圃Ｓ・Ｚは、
遠心分離装置の分離能力を示すパラメーターである。本
発明方法では、遠心分離装置へのサスペンジョン培養液
の単位時間当りの供給１Ｑ（ｍｅ／ｍｉｎ　）をこのパ
ラメーターで割った値、すなわちＱ／Ｓ　−Ｚの値を０
．３以上とする必要がある。Ｑ／Ｓ　−Ｚの値は好まし
くは０．２以下、特に好ましくは０．１以下である。

かくして、上記（１）〜（４）の運転条件の確保によっ
て、サスペンジョン培養液から極めて高い生存率で動物
細胞を生きたまま効率的に分離することが可能となる。

更に、本発明者らの研究によれば、遠心分離装置におけ
る、サスペンジョン培養からの動物細胞の分離を、上記
運転条件の確保と共に、下記性質：くω　水と実質的に
混和しない 市〉　水より密度が大きく、そして （ｃ）　　動物細胞の生育を実質的に阻害しない、を有
する液状キャリヤーの存在下で実施することによって、
遠心分離装置から、分離された動物細胞を極めて円滑に
取出すことができ、取り出しの際に動物細胞に損傷を与
える可能性を極めて小さくしうることが明らかとなった
。

その理由として、上記液体キャリヤーは、（イ）水と実
質的に混和せず、且つ（ロ）水より密度が大きいので、
遠心分離装置の運転時に、培養液と動物細胞集合部にお
ける沈降面との間に液体キャリヤーの液相を形成して動
物細胞が沈降面に圧密化されるのを防止し、そのため分
離された動物細胞はこの液相の上にこの液相をクッショ
ンとして存在し、取出しの際にも該液体キャリヤーと分
離して或いは、−緒に移動するためと考えられる。もち
ろん、該液体キャリヤーは（ハ）動物細胞の生育を実質
的に阻害しないから、動物細胞と共存しても何ら問題は
ない。

かかる液体キャリヤーとしては、例えばパーフルオロカ
ーボンが好適に使用される。

かかるフルオロカーボンとしては、常温で液体であるも
のが有利であり、市販されているものが広く利用できる
。例えば各種熱媒体、電気絶縁材料として使用されてい
るフルオロカーボン、人工血液として使用されている種
々のフルオロカーボンが使用できる。その具体例として
は、例えば炭素数８以上のパーフルオロアルカン類、パ
ーフルオロシクロアルカン類（例えば、パーフルオロデ
カリン、パーフルオロメチルデカリン、炭素数３〜５の
アルキル置換基を有するパーフルオロアルキルシクロヘ
キサン）、炭素数５〜７のアルキル置換基を有するパー
フルオロアルキルテトラヒドロフラン類、炭素数４〜６
のアルキル置換基を有するパーフルオロアルキルテトラ
ヒドロビラン類。

パーフルオロアダマンタン（例えばパーフルオロアダマ
ンタン、パーフルオロメチルアダマンタン。

パーフルオロジメチルアダマンタン、パーフルオロメチ
ルエチルアダマンタン、パーフルオロジエチルアダマン
クンなど）が挙げら−れるが、パーフルオロカーボンが
好ましい。

前記フルオロカーボンは、種々の基、例えば第３級アミ
ノ基を含有したものであってもよい。これらは一種でも
二種以上の混合物でも使用される。

本発明の一実施態様を、添付図面の第７図を用いて一層
具体的に説明する。

第７図の装置では、培養層ＡＰ−１は新しい培養培地の
仕込ロＡ、空気（０２）導入管Ｂ、培養槽内の培養液中
の酸素濃度を測定して導入する空気中の酸素濃度を調節
するためのＤＯＣ，撹拌礪ＳＴ、排気管Ｃおよびサスペ
ンジョン培養液の抜出し導管りを備えている。扱出し導
管りはポンプＰ−Ｉを経過して、点Ｐで２つの経路に分
れる。

一方はポンプＰ−ｎを経過して導管Ｇによって古い培養
液の貯槽ＡＰ−３に至り、他方は遠心分離ＩＡＰ−２に
連結され、そこから導管ＦによりバルブＹを通じて該貯
槽ＡＰ−３に至る。遠心分離ＩＡＰ−２からは導管Ｅが
バルブＸを通じて伸びており、導管Ｅは培養ＩＡＰ−１
に連結されている。培養槽ＡＰ−１の底部には、液体キ
ャリヤーの相ＬＱを抜出すための導管Ｈが存在し、また
この導管ＨはポンプＰ−ＩＩＩを経由して点Ｐにおいて
、遠心分離装置ＡＰ−２に向う導管に連結されている。

図の装置は、例えばポンプＰ−Ｉを運転する前に、ポン
プＰ−■を短時間運転して、液体キャリヤーＬＱの一定
量を遠心分離装置ＡＰ−２に導入する。その後、ポンプ
Ｐ−■を停止し、培養槽ＡＰ−１内へ新しい培養培地に
仕込み、空気導入管Ｂがら空気を導入し、撹拌基を回転
し、動物細胞を播種して培養を開始する。所定時間培１
ｉ１、培養槽内の細胞数が飽和状態まで増加した時点で
、ポンプＰ−Ｉの回転を開始し、培養槽内の培養液を導
管りを通じ遠心分離機ＡＰ−２に送液して遠心分離機で
動物細胞から母液を分離し、分離された母液をバルブＹ
を開放した導管Ｆを通じて該貯槽ＡＰ−３に送りつづけ
る。

この間、培養槽ＡＰ−１内の液面が大ぎく変わらないよ
うに、培地仕込み口Ａから連続的にあるいは間歇的に、
新しい培地を培養槽内に導入する。

遠心分離１ｊｌ　Ａ　Ｐ　−２を上記のようにして一定
期間運転させた侵、ポンプＰ−Ｉの運転を停止し、バル
ブＹを閉じ且つバルブＸを開放し、次いでポンプＰ−Ｉ
Ｉの運転を開始する。それによって、該貯槽ＡＰ−３中
の母液は導管Ｇを通じて遠心分Ｉ！！を機ＡＰ−２に導
かれ、ＡＰ−２中に蓄積された生きた動物細胞を伴って
導管Ｅを通じて培養槽へ戻される。この時、液体キャリ
ヤーの一部又は全部が培養層ＡＰ−１中に導入されるの
で、上記のとおり培養槽の底部に液体キャリヤーの相Ｌ
Ｑが形成される。培養槽の底部に、形成される液体キャ
リヤーの相ＬＱの上記の如き循環使用は工業的規模に於
ける培養にとって極めて有利であることが理解されよう
。

また、本発明の好ましい態様によれば、分離された動物
細胞を、遠心分離装置から取り出す際にも、液体キャリ
ヤーを該遠心分離装置に送るのが好ましい。図の装置で
は、ポンプＰ−Ｉ［を運転することによって、液体キャ
リヤーを遠心分離装置から動物細胞を全部取り出すまで
、動物細胞が損傷されるのを完全に排除することが可能
となる。

更にこの装置をこのように運転しつづけることによって
、動物細胞の培養に伴って培養槽内に次第に蓄積される
動物細胞の生育を阻害する物質の濃度を低水準に維持す
ることができる。

更に本発明の別の一実施態様を、添付図面の第８図を用
いて一層具体的に説明する。

第８図の装置では、培養層ＡＰ−１は新しい培養培地の
仕込ロＡ、空気（０２）導入管Ｂ、培養槽内の培養液中
の酸素濃度を測定して導入する空気中の酸素濃度を調節
するためのＤＯＣ，ｌ）１拌礪ＳＴ、排気管Ｃおよびサ
スペンジョン培養液の抜出し導管りを備えている。扱出
し導管りはポンプＰ−Ｉを経過して、遠心分離機ＡＰ−
２に連結され、そこから導管ＦによりポンプＰ−ＩＩ［
を通じて該貯槽ＡＰ−３に至る。遠心分離機ＡＰ−２か
らは導管Ｅが伸びており、導管Ｅは培養槽ＡＰ−１に連
結されている。培１Ｍ３ＡＰ−１の底部には、液体キャ
リヤーの相ＬＱを扱出すための導管Ｈが存在し、またこ
の導管ｌ」はポンプＰ−Ｉ［を経由して点Ｐにおいて、
遠心分離装置ＡＰ−２に向う導管に連結されている。

図の装置は、例えばポンプＰ−Ｉを運転する前に、ポン
プＰ−■を短時間運転して、液体キャリヤーＬＱの一定
量を遠心分ｌＩ！を装置ＡＰ−２に導入する。その後、
ポンプＰ−ｎを停止し、培養槽ＡＰ−１内へ新しい培養
培地に仕込み、空気導入管Ｂから空気を導入し、撹拌機
ＳＴを回転し、動物細胞を播種して培養を開始する。所
定時間項善後、培養槽内の細胞数が飽和状態まで増加し
た時点で、ポンプＰ−Ｉの回転を開始し、培養槽内の培
養液を導管りを通じ遠心分離機ＡＰ−２に送液して遠心
分離機で動物細胞から母液を分離し、分離された母液を
ポンプＰ−■により導管Ｆを通じて該貯ＩｆｆＡＰ−３
に連続して送りつづける。

同時に遠心分離機で分離された動物細胞は導管Ｅを通じ
て連続して培養槽へ戻される。

この間、培養槽ＡＰ−１内の液面が大きく変わらないよ
うに、培地仕込み口Ａから連続的にあるいは間歇的に、
新しい培地を培養槽内に導入する。

この時、液体キャリＶ−の全部が培養層ＡＰ−１中に導
入されるので、上記のとおり培養槽の底部に液体キャリ
ヤーの相ＬＱが形成される。゛培養槽の底部に、形成さ
れる液体キャリＡ７−の相ＬＱの上記の如き循環使用は
工業的規模に於ける培養にとって極めて有利であること
が理解されよう。

また、本発明の好ましい態様によれば、液体キャリヤー
を該遠心分難装置に常に送りつづけるのが好ましい。図
の装置では、ポンプＰ−Ｉを運転することによって、液
体キャリヤーを、該遠心分離機へ送り動物細胞が損傷さ
れるのを完全に排除することが可能となる。

更にこの装置をこのように運転しつづけることによって
、動物細胞の培養に、伴って培養槽内に次第に蓄積され
る動物細胞の生育を阻害する物質の濃度を低水準に維持
することができる。

以下、実施例を掲げて本発明方法を詳述する。

実施例１ （１）　　培養装置 添付第７図に示４す培養システムを使用した。

培養１ｆｆ（ＡＰ−１＞はガラス製の全容積２４１の撹
拌型培養槽であり正味の培養液払込帛は、１．２ρであ
る。

第７図のＡＰ−２は沈降面積５＝３１，４ｏｊ有効容積
１１威のローターを有する遠心分離機である。

ポンプＰ−Ｉ、Ｐ−ｎ、Ｐ−１はべりスタボンブである
。

（２）　　　培　　地 基礎培地として、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地、ハム−１
２培地及びダルベツコ変法イーグル培地を２＝１＝１で
混合したもの（以下ＲＤＦと称する）を用いた。

上記基礎培地にインスリン９μｇ／ｄ、　トランスフェ
リン１０μ９／ｒｄ、エタノールアミン１０μｇ／戒、
亜セレン酸２ｘ　１０′６ｍｏｌｅ／旦添加したものを
培地として使用した。

（３）培養方法および結果 培養システムをあらかじめオートクレーブ滅菌した。し
かるのち濾過滅菌した培地１．２文を培養槽に仕込んだ
。次いでマウスミニローフ１３０１株とヒトＢセルとを
融合して得られたマウス×ヒトハイブリドーマＨ−２株
を５×１０５ｃｅｌｌｓ　／ｍｌｌとなるように播種し
た。この細胞ははＩｇＧを産生するものである。培養槽
では炭酸ガス５％を含む酸素ガスが培養液中の溶存酸素
濃度が３ｐｌ）Ｉｌｌどなるように吹込ノズルＢを通じ
て自動的にコントロールされて送入されている。培養槽
中の培養液は３７°Ｃに保持されている。

培養槽中にはマリン型撹拌翌が取付けられて、１３リ、
撹拌速度は６０ｒｐｎである。

播種後３日間は回分培介を行った。

第１表に示すように培養聞始俊３日目（２４ｈｒ経過後
）に細胞に度は１．Ｏｘ１０６ｇ／ｍ１．：達し、回分
培養では最高密度に到達したと判断し、遠心機を用いた
潅流培養を開始した。すなわち濾過滅菌した培養液を張
込んである遠心機を駆動し、遠心効果が１００ｇと４に
るように回転数を合せた。

次いでバルブＸは閉、ポンプｐ−ｍ、ｐ−ｍは停止、バ
ルブＹは開の状態にしてポンプＰ−■を駆動し２００７
！の培養混合物を２０ｍ　／　ｍの速度で１０分間遠心
分離機に送液した。遠心分離機で細胞と分離された培養
液はラインＦを通じて古い培養液の貯槽△Ｐ−３へ流出
して貯留された。この中の、ｍ胞密度ハ１，８Ｘ１０’
　ｃｅｌｌｓ　／ＩＲ１であった。以上の操作が終了し
５分経過したのちバルブＸは間、バルブＹは閉、ポンプ
Ｐ−Ｉは停止の状態にして、ポンプＰ−ｎを駆動し古い
培養液５０ｍを該貯槽ＡＰ−３から遠心分離機ＡＰ−２
に１０−／ｎ＋ｉｎの速度で送液した。ポンプＰ−１１
と同時にポンプＰ−Ｉ［［も駆動し、培養槽ＡＰ−１の
底部にあるフルオロカーボン（米国スリーエム（３Ｍ）
社製ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ＠　　ＦＣ■−４０）の５ｄ
を１ｍｇ／Ｉｎ１ｎの速度で送液した。この操作により
、遠心ローター中に滞留していた細胞はフルオロカーボ
ンと共に全量遠心分離機から排出され、ラインＥを経由
して、培養ＩＡＰ−１にもどした。培養液５０ｍ１の送
液の終了後ポンプＰ−ＩＩを停止した。またフルオロオ
ーボン５ｄの送液の終了後ポンプＰ−Ｉ［［を停止した
。この操作を第１表に示す時間毎に１回自動的に行って
培養を継続した。培養槽の液位が平均して一定となるよ
うにラインＡから連続的に新培地を培養槽に供給した。

培養開始４日間以降は培養槽中からＩＩＩＩ胞を含む培
養混合物を１日に１２０ｄ系外に抜き取った。

以上の実験でＱ／ＳＺは０．０３２ｃｍ／　ｍｉｎであ
りθは１２，５ｍ１ｎ　Ｚ−θ＝２５０であった。

実験条件の一部及び実験結果を第１表に示した。

第１表 （実施例１の実験結果） 比較例 遠心弁ＩＩＩＩ機にフルオロカーボンを全く送らなかっ
た以外は全て実施例と同じ条件で、Ｈ−２株の培養を行
った。

遠心分離様の中で生細胞がペレット状になり、培養槽へ
完全に戻らず、生細胞密度の増加が認められなかったの
で、７日経過後培養を中止した。

第２表 （比較例の実験結果） 実施例２ （１）培養装置 添付第８図に示す培養システムを使用した。

培ｇ！槽（ＡＰ−１）はガラス製の全容積２文の撹拌型
培養槽であり正味の培養液払込量は、１．２文である。

第８図のＡＰ−２は沈降面積５＝３１５０ｃＩｉ有効容
積１２０ｄの第６図に示した構造のローターを有する遠
心分離機である。ポンプＰ−１，Ｐ−ｍ、ｐ−ｍはペリ
スタポンプである。

（ａ　　培　　地 基礎培地として、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地、ハム−１
２培地及びダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１で
混合したもの（以下ＲＤＦと称する）を用いた。

上記基礎培地にインスリン９μｇ／ｍｆ！、　トランス
フェリン１０μ９７ｔｄ、エタノールアミン１０μｇ／
ｄ、亜セレンｌｌ　２　Ｘ　１０’　ｍｏｌｅ／　、Ｑ
添加したものを培地として使用した。

（３）培養方法および結果 培養システムをあらかじめオートクレーブ滅菌した。し
かるのち濾過滅菌した培地１，２．Ｑを培養槽に仕込ん
だ。次いでマウスミエローマＰ３Ｕ１株とヒトＢセルと
を融合して得られたマウス×ヒトハイブリドーマＨ−２
株を７．Ｏｘ　１０５ｃｅｌｌｓ　／ｄとなるように播
種した。この細胞ははＩ（ＩＧを産生するものである。

培養槽では炭酸ガス５％を含む酸素ガスが培養液中の溶
存酸素濃度が３　ｐｐｍとなるように吹込ノズルＢを通
じて自動的にコントロールされて送入されている。培養
槽中の培養液は３７℃に保持されている。

培養槽中にはマリン型撹拌翌が取付けられてお、　　リ
、撹拌速度は６０ｒｐＨｌである。

播種後２日間は回分培養を行った。

第１表に示すように培養開始後２日目に細胞密度は１．
３×１０６個／ｄに達し、遠心機を用いた潅流培養を開
始した。すなわち濾過滅菌した培養液を張込んである遠
心機を駆動し、遠心効果が１１０ｇとなるように回転数
を合せた。

次に、ポンプＰ−１，Ｐ−Ｉ１．Ｐ−Ｉ［［を駆動し、
培養液と細胞の分離を行った。すなわちポンプＰ−Ｉに
より培養混合物を３ｄ／ｍｉｎの速度で、ポンプＰ−Ｉ
Ｉにより培養槽ＡＰ−１の底部にあるフルオロカーボン
（米国スリーエム（３Ｍ）社製ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ＠
　　ＦＣ■−４０）を１ＩＩｄｌ／ｍｉｎの速度で遠心
分離様に送液した。遠心分離機で細胞と分離された培養
液はラインＦを通じてポンプＰ−■により　１．７ｄ／
ｍｉｎの速度で古い培養液の貯槽ＡＰ−３へ送られ、貯
留された。この中の細胞密度は４．０×１０’　ｃｅｌ
ｌｓ　／−であった。

以上の操作により、遠心ローター中に滞留していた細胞
はフルオロカーボンと共に今市遠心分離機から排出され
、ラインＥを経由して、培養槽ＡＰ−１にもどした。

１日あたりの培養液置換率に応じてポンプＰ−Ｉ、Ｐ−
１［［の流速を調整して培養を継続した。

培養槽の液位が平均して一定となるようにラインＡから
連続的に新培地を培養槽に供給した。

培養開始４日間以降は培養（ｎ中から細胞を含む培養混
合物を１日に１２０ｄ系外に抜き取った。

実験条件の一部及び実験結果を第３表に示した。

第３表 （実施例２の実験結果）

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図、第４図および第６図は本発明
で使用するに好適な遠心分離装置のローター（分１１１
１Ｎｆｆ）の概念図である。第５図は第４図の斜視図で
ある。第７図および第８図は、本発明の一実ＩＭ態様を
示したものである。 拓１品 Ａ日 第２凸 慕３０ Ａ　　　　　　　　　　　　　Ｂ 第４図 八日 第　５１ 誌６０ハ 第′７目 篤８図 Ｐ一旦

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物細胞サスペンジョン状態で培養槽中で培養する
   方法において、該培養槽より動物細胞を含むサスペンジ
   ョン培養液を取出して遠心分離機へ供給し、該遠心分離
   機により該サスペンジョン培養液から動物細胞を分離し
   分離された動物細胞を培養槽へ戻して培養する方法であ
   つて、該遠心分離装置におけるサンスペンジヨン培養液
   からの動物細胞の分離を、下記性質 （ａ）水と実質的に混和しない （ｂ）水より密度が大きく、そして （ｃ）動物細胞の生育を実質的に阻害しない、を有する
   液状キャリヤーを該遠心分離機に供給して該遠心分離機
   中の培養液と分離した動物細胞を該液状キャリヤーと共
   に該遠心分離機から排出せしめて培養槽へ戻すことを特
   徴とする動物細胞の培養方法。 ２、液状キャリヤーがパーフルオロカーボンである第１
   項記載の方法。 ３、該遠心分離装置を下記運転条件 （１）θ≦３００ （２）Ｚ×θ≦３×１０＾４ （３）Ｑ／Ｓ・Ｚ≦０．３および （４）５≦Ｚ≦２０００ ［上記式中、 θは遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（
   分）であり、 Ｚは遠心効果であり、 Ｑは遠心分離装置へのサスペンジョン培養液の単位時間
   当りの供給量（ｍｌ／ｍｉｎ）であり、そして Ｓは遠心力作用時の沈降面積（ｃｍ＾２）である。］で
   運転する第１項記載の方法。 ４、該遠心分離装置として、 （ａ）サスペンジョン培養液の供給口、 （ｂ）沈降した動物細胞が遠心力によつて沈降面に沿つ
   て移動しうるような構造を有する該沈降面、 （ｃ）沈降面に沿って移動した動物細胞が集合する動物
   細胞集合部。 （ｄ）該動物細胞集合部から該動物細胞を取出すための
   取出口、および （ｅ）動物細胞が分離された培養母液を排出するための
   母液排出口、 を備えた遠心分離装置を使用する第１項記載の方法。