JPH078236B2 - 動物細胞の培養方法および遠心分離装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）産業上の利用分野 本発明は、動物細胞の培養方法および動物細胞分離用の
遠心分離装置に関するものである。更に詳しくは、サス
ペンジョン状態で動物細胞を培養するための動物細胞の
培養方法および分離装置に関するものである。

（ｂ）従来技術 細胞のサスペンジョン培養において、細部の成長増殖が
比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細胞を大量にかつ
高密度で培養するために、一般に新しい培養液を培養槽
中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養
槽外へ排出しながら培養する方法、すなわち通称パーヒ
ュージョン方式といわれる方式が提案されている（Annu
al Reports on Fermentation Processes Vol.6）。

この方式を用いて培養するに当って重要なことは、サス
ペンジョン液中の生細胞と前記古い培養液とを効率よく
分離し、古い培養液を培養槽外へ取出し、培養槽内の細
胞の生育環境を最適条件下に維持することである。サス
ペンジョン培養液から生培養と古い培養液とを分離する
ために種々のフィルターやまた種々の形式が提案されて
いるが、フィルター目詰まりや、装置の構造の煩雑性な
どの点で工業的装置としてはいずれも満足すべきものと
は言い難い。

特開昭63-252558号公報には、細胞の大量にかつ高密度
の培養に適したパーフュージョン方式による動物細胞分
離装置および細胞培養方法が本発明者によって提案され
ている。該提案は遠心力を利用してサスペンジョン培養
液から生細胞と古い培養液とを連続的又は間欠的に分離
するための遠心分離装置および分離系にて構成されてい
るが、細胞取出しに用いる密度の大なる該液体内を細胞
が通過する時に生ずる遠心分離装置内での圧力差による
細胞へのダメージが懸念され、あらゆる細胞に対して適
しているとは言い難い。

さらに、遠心分離装置本体の一部しか利用できないた
め、容積効率が低いという欠点がある。

（ｃ）発明の目的 本発明の目的は、遠心分離装置においてサスペンジョン
培養液から動物細胞を生きたまま分離し、次いで分離さ
れ、かつ蓄積された該動物細胞を特定の液体媒体で遠心
分離装置から取出すという、分離と取出しを交互に行う
工業的に有利な培養方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、本発明の上記方法に使用す
るに好適な遠心分離装置を提供することにある。

（ｄ）発明の構成 すなわち、本発明は、 （Ａ）動物細胞を培養槽内でサスペンジョン培養に付
し、 （Ｂ）該培養槽より動物細胞を含むサスペンジョン培養
液の１部分を抜出し、 （Ｃ）抜出した該サスペンジョン培養液を、回転してい
る遠心分離装置の遠心分離空隙へ、遠心力がより大きく
作用する位置に設けられた供給口からある時間連続的に
供給し、かつ遠心力がより小さく作用する位置に設けら
れた排出口から、動物細胞と分離された母液をある時間
連続的に取出して、動物細胞を上記遠心分離空隙内に蓄
積し、 （Ｄ）水と混和せず、動物細胞および培養液のいずれよ
りも密度が大きく、かつ動物細胞の生育を阻害しない液
状媒体を、遠心分離装置を回転させたまま上記供給口か
ら供給して、上記排出口から遠心分離空隙内に蓄積され
た動物細胞を母液とともに該液状媒体で押出して抜出
し、 （Ｅ）該取出された動物細胞の少くとも１部分を上記
（Ａ）工程のため培養槽に戻す、 ことを特徴とする動物細胞の培養方法である。

本発明の動物細胞の培養方法はサスペンジョン型の動物
細胞の培養（サスペンジョン培養）に適用される。サス
ペンジョン培養とは、水性媒体中で細胞それ自体を浮遊
させながら培養する方法をいう。

本発明の培養方法において、培養の対象となる動物細胞
は、サスペンジョン状態にて生育ないし増殖可能なもの
であり、天然の動物細胞のみならず、人為的あるいは遺
伝子操作により変性された細胞例えばハイブリドーマで
であることができ、またIL−−２の如きリンホカインを
産生するリンパ球由来の細胞、インターフェロン（IF
N）の如き有用な生理活性物質を産生する２倍体細胞、
あるいは種々のモノクローナル抗体を産生する細胞であ
ることができる。本発明は、モノクローナル抗体を高い
濃度で得る目的のためモノクローナル抗体を産生する細
胞の培養に対して特に適している。

本発明の上記（Ａ）工程は、上記の如く動物細胞を培養
槽内でサスペンジョン培養に付す工程である、サスペン
ジョン培養に用いられる培養液は実質的に水よりなる水
性媒体である。該水性媒体は、動物細胞の培養に通常使
用される各種添加物、例えば種々の無機塩，ビタミン
類，補酵素，ブドウ糖，アミノ酸，抗生物質，生長促進
因子などを含有している。

また培養液には血清を加えることもできるが、血清を用
いない所謂無血清培地を培養液として使用することもで
きる。無血清培地を使用するのが経済的に有利であり、
望ましい。

培養槽としては、動物細胞の仕込口、新しい培養培地の
仕込口，空気導入管，撹拌機およびサスペンジョン培養
液の抜出し導管を少くとも備えたものが使用される。こ
のような培養槽は通常の培養タンクであることができ
る。

上記（Ｂ）工程は、培養槽より動物細胞を含むサスペン
ジョン培養液の１部分を、例えば培養槽からの培養液抜
出し導管を通じて、抜出す工程である。サスペンジョン
培養液の抜出しは、連続的にあるいは断続的に（間欠的
に）行うことができる。抜出された動物細胞を含むサス
ペンジョン培養液の量に見合う量で、新しい培養液を培
養槽に連続的に導入するのが望ましい。かくして、培養
槽内のサスペンジョン培養液中の主として動物細胞の代
謝産物からなる動物細胞の生育を阻害する（良くない影
響を与える）物質の濃度を、常にかつかなり低水準に維
持できることとなり、その結果、該サスペンジョン培養
液中の動物細胞の生育密度を増大させて培養を実施する
ことを可能とする。

このようにして、動物細胞の生育密度が増大した分だ
け、該動物細胞の生育に伴う有用な代謝産物の産生量を
増大させることが可能となる。

もちろん、上記の如く動物細胞の生育を阻害する物質の
濃度を低水準に、十分な管理の下に維持することによっ
て、動物細胞の増大した生育密度を長期間に亘って保持
したまま培養を実施しつづけることができ、有用な代謝
産物の増大した産生量を確保できることとなる。

上記培養方法は、工程（ｃ）によって遠心分離機の遠心
分離空隙内に生きている動物細胞を蓄積し、次いで工程
（Ｄ）において、この蓄積された生きている動物細胞を
水と混和せず、動物細胞および培養液のいずれよりも密
度が大きくかつ動物細胞の生育を阻害しない液状媒体で
母液とともに押出して抜出すことを特徴とするものであ
る。

工程（Ｃ）において生きている動物細胞を蓄積するため
には、遠心分離装置の遠心分離空隙へ工程（Ｂ）で抜出
したサスペンジョン培養液をある時間連続的に供給し、
かつ生きている動物細胞と分離された母液をある時間連
続的に取出す必要がある。すなわち、工程（Ｂ）で抜出
したサスエンジョン培養液は、動物細胞の濃度が低いた
め所望の量の動物細胞が蓄積されるまで、遠心分離空隙
へ供給される。その際の遠心分離装置の運転条件として
は、 （１）θ≦300 （２）×θ≦３×10⁴ （３）Q/S・≦0.3および （４）５≦≦2000 を採用するのが望ましい。

遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（θ，
分）は、上記式（１）に示されているとおり、300分以
下に止めるべきである。300分を越えると遠心分離装置
内において酸素欠乏などによる原因のために動物細胞の
生存率が顕著に低下する。平均滞留時間（θ）は、好ま
しくは150分以下、殊に60分以下である。

遠心分離装置内における動物細胞の平均滞留時間（θ）
は、例えば連続法すなわち遠心分離装置にサスペンジョ
ン培養液を連続的に仕込みかつ分離された動物細胞を連
続的に取出す方式では、仕込まれたサスペンジョン培養
液中の動物細胞が遠心条件下で存在しうる空間の体積
（Ｖ・cm³）を、分離された動物細胞を含む成分の該遠
心分離装置からの取出し速度（Qc・cm³/min）で割った
値として求められる。

は遠心分離操作を行った時の遠心効果であり、回転軸
からの距離をγ（cm）、回転角速度をω（radian/sec）
そして重力の加速度をｇ（cm/sec²）で表わすと、γω²
/gで表わされる。遠心効果は、いわば動物細胞に負荷さ
れる遠心力の大きさを示しており、従って分離に供すべ
きサスペンジョン培養液を遠心装置に供給するための培
養液供給口の位置（回転軸からの距離γ）によって決ま
る。

は５〜2000の範囲である。５より小さいと細胞の分離
操作を効率よく実施することが困難であり、一方2000を
越えると細胞にかかる遠心力が大き過ぎて細胞の破壊が
著しくなるので望ましくない。遠心効果（）は、好ま
しくは10〜1000の範囲、殊に好ましくは20〜300の範囲
にあるのが有利である。

また、とθとを掛け合わせた値（・θ）を、３×10
⁴以下に保つ必要がある。この値を越えた条件で遠心操
作を行うと、細胞自体の圧密によって生存率の低下が次
第に大きくなり不利である。・θの値は２×10⁴以下
が特に好ましい。

さらに、Ｓ（cm²）は遠心力作用時の沈降面積（cm²）で
ある。Ｓ（cm²）は、分離すべきサスペンジョン培養液
の遠心分離装置への供給口の位置（回転軸からの距離γ
（cm））における分離に関与する有効面積として定義さ
れる。該有効面積は、回転軸からγの距離にある供給口
の位置における仮想円が沈降面と交差しない場合には、
該供給口の位置（γ）とその位置におけるサスペンジョ
ン培養液の液面の高さ（ｈ）とによって、IIγ²hの値と
して求められる。また、上記仮想円が沈降面と交差する
場合には、有効面積は仮想円が沈降面と交差する迄の部
分の面積に減少し、IIγ²hに、交差する迄の角度割合を
掛けた値として求められる。この場合、上記液面の高さ
（ｈ）は、遠心分離装置の分離層の最も深い位置からの
垂直距離をいうものと理解すべきである。

有効面積Ｓと遠心効果Ｚとの掛け合わせた値Ｓ・Ｚは、
遠心分離装置の分離能力を示すパラメーターである。本
発明方法では、遠心分離装置へのサスペンジョン培養液
の単位時間当りの供給量Ｑ（ml/min）をこのパラメータ
ーで割った値、すなわちQ/S・Ｚの値を0.3以下とする必
要がある。Q/S・Ｚの値は好ましくは0.2以下、特に好ま
しくは0.1以下である。

かくして、上記（１）〜（４）の運転条件の確保によっ
て、本発明の上記工程（Ｃ）によれば、サスペンジョン
培養液から極めて高い生存率で動物細胞を生きたまま効
率的に分離することが可能となる。

遠心分離装置としては、上記のとおり、ある時間連続的
にサスペンジョン培養液を供給しかつ母液を抜出しつづ
けるのは好都合であるように、遠心分離空隙に供給口と
排出口とを、供給口は遠心力がより大きく作用する位置
に、そして排出口は遠心力がより小さく作用する位置に
備えたものが使用される。

かかる遠心分離装置として、本発明によれば、遠心分離
空隙が、ローターの中心軸に向かう方向に、ローターの
中心軸に直角方向に対し50〜90゜の角度をもって、傾斜
する外側周縁壁を有する周縁スロットからなり、該周縁
スロットの該外側周縁壁は、ローターの中心軸を横切る
仮想面において、ローターの中心軸に対し螺旋を画いて
おり、そして該周縁スロットはローターの中心軸から最
も遠い位置ないしその近傍に供給口を備えたまたロータ
ーの中心軸から最も近い位置ないしその近傍に排出口を
備えていることを特徴とする遠心分離機が好ましいもの
として提供される。

上記遠心分離機において、サスペンジョン培養液を受入
れるための遠心分離空隙はローターに設けられた周縁ス
ロットからなる。周縁スロットは、ローターの中心軸に
向かう方向に、ローターの中心軸に直角方向に対し50〜
90゜の角度、好ましくは60〜85゜の角度をもって、傾斜
する外側周縁壁を有している。ローターの中心軸方向に
傾斜するかかる外側周縁壁を持つことによって、母液か
ら分離された生きた動物細胞が外側周縁壁上をローター
の中心軸から離れる向に円滑に移動することが可能とな
る。上記角度で傾斜する外側周縁壁は周縁スロットの外
側周縁壁の全体を占めてもよくあるいは一部を占めても
よい。全体を占める場合には、外側周縁壁の角度は全体
が一様であってもよくまた上記範囲の角度値内で２ツ以
上の角度の組み合わせからなっていてもよい。一部を占
める場合には、上記範囲の角度値を有する壁とローター
の中心軸に直角方向に対し50゜よりも小さい角度で傾斜
する壁とからなるのが好ましい。

一方、周縁スロットの内側周縁壁は、外側周縁壁のよう
に、ローターの中心に向かう方向に必ずしも傾斜してい
る必要はない。例えば、内側周縁壁は、ローターの中心
軸に平行であることができあるいは傾斜していることが
できる。内側周縁壁は、好ましくはローターの中心軸に
向かう方向に、ローターの中心軸に直交する方向に対
し、外側周縁壁と同様に、50〜90゜、より好ましくは60
〜85゜で、傾斜している。また、内側周縁壁は、ロータ
ーの中心軸を横切る仮想面において、ローターの中心軸
に対し円弧ないし螺旋、好ましくは螺旋を画くことがで
きる。

また、周縁スロットは、ローターの中心軸の周囲に360
゜以内に存在することができ、また360゜を越えて存在
することができる。360゜を越えて存在する場合には、
周縁スロットは、ローターの中心軸の周囲に、同じ仮想
平面内ですなわちローターの中心軸方向に角度を変えず
に、うず巻き状に存在することができ、また、ローター
の中心軸の周囲に、ローターの中心軸方向にある角度で
傾斜して螺旋状に存在することができる。周縁スロット
の長さは、上記のとおり、ローターの中心軸の周囲に36
0゜を越えて周縁スロットを設けることにより長くする
ことができ、それによって動物細胞の生きたままの分離
を緩慢にかつ円滑に行うことを可能とする。周縁スロッ
ト内には、動物細胞の分離板すなわち動物細胞の沈降距
離を短くして分離を容易にかつ確実に行うことを助ける
分離板を設けることができる。かかる分離板はそれ自体
当該技術分野において知られている。

遠心分離装置は、上記遠心分離空隙、すなわち周縁スロ
ットに、遠心分離装置の運転中すなわちローターの回転
中に、サスペンジョン培養液を供給するための供給口を
動物細胞と分離された母液を抜出すための排出口とを備
えている。該供給口は周縁スロットのローターの中心軸
から最も遠い位置ないしその近傍に設けられ、そして該
排出口は周縁スロットのローターの中心軸から最も近い
位置ないしその近傍に設けられる。

上記の如き遠心分離装置により分離され、遠心分離空隙
内に蓄積された生きたままの動物細胞は、本発明の上記
方法によれば、次いで工程（Ｄ）において、運転中の遠
心分離装置に、上記供給口から、サスペンジョン培養液
に代えて、水と混和せず、動物細胞および培養液のいず
れよりも密度が大きくかつ動物細胞の生育を阻害しない
液状媒体を供給して、上記排出口から母液と共に該液体
媒体で押し出される。

上記液体媒体としては、例えばパーフルオロカーボンが
好適に使用される。

かかるフルオロカーボンとしては、常温で液体であるも
のが有利であり、市販されているものが広く利用でき
る。例えば各種熱媒体，電気絶縁材料として使用されて
いるフルオロカーボン、人工血液として使用されている
各種のフルオロカーボンが使用できる。その具体例とし
ては、例えば炭素数８以上のパーフルオロアルカン類，
パーフルオロシクロアルカン類（例えば、パーフルオロ
デカリン，パーフルオロメチルデカリン，炭素数３〜５
のアルキル置換基を有するパーフルオロアルキルシクロ
ヘキサン），炭素数５〜７のアルキル置換基を有するパ
ーフルオロアルキルテトラヒドロフラン類，炭素数４〜
６のアルキル置換基を有するパーフルオロアルキルテト
ラヒドロピラン類，パーフルオロアダマンタン類（例え
ばパーフルオロアダマンタン，パーフルオロメチルアダ
マンタン，パーフルオロジメチルアダマンタン，パーフ
ルオロメチルエチルアダマンタン，パーフルオロジエチ
ルアダマンタンなど）があげられる。前記フルオロカー
ボンは、種々の基、例えば第３級アミノ基を含有したも
のであってもよい。これらは一種でも二種以上の混合物
でも使用される。

上記工程（Ｃ）と工程（Ｄ）の組合せによって、動物細
胞が生きたまま分離しうるのみならず、たえず遠心分離
空隙内が該液体媒体で洗浄を受けることにもなり、従っ
て遠心分離空隙内を常に生きた動物細胞に適した環境に
維持し、工業的に有利な連続操作に適した状況を作り出
すことを可能とする。

工程（Ｄ）で取出された増殖能力を有する生きたままの
動物細胞の少くとも一部は、本発明の培養方法によれ
ば、次いで工程（Ｅ）において、工程（Ａ）のための培
養槽に戻される。

本発明の上記培養方法は、工程（Ｂ）〜（Ｅ）を繰返し
実施することにより、前記した利点を発揮する工業的に
有利な方法を提供する。

以下具体的に実施態様により、本発明は上記培養方法と
遠心分離装置についてさらに説明する。

図１には、上記本発明の培養方法を実施するに好適な一
連の装置が開示されている。

図１の装置では、培養槽AP−１は新しい培養培地の仕込
口A,空気（O₂）導入管B,培養槽内の培養液中の酸素濃度
を測定して導入する空気中の酸素濃度を調節するための
DOC、撹拌機ST、排気管Ｃおよびサスペンジョン培養液
の抜出し導管Ｄを備えている。抜出し導管ＤはポンプＰ
−Ｉを経過して、遠心分離機AP−２に連結されている。

培養槽AP−１の底部には、液状物質の相LQを抜出すため
の導管Ｈが存在し、またこの導管ＨはポンプＰ−IIを経
由して点Ｐにおいて、遠心分離装置AP−２に向かう導管
に連結されている。

また点Ｐには、バルブＺを通じて培養槽AP−１に至る管
Ｊが連結している。遠心分離機AP−２から伸びた導管に
は点Ｑにおいて導管E,F,Gが連結されている。

導管ＥにはバルブＸを通じて培養槽AP−１に、導管Ｆは
バルブＹを通じて貯槽AP−３に、導管ＧはポンプＰ−II
Iを通じて新培地槽AP−４にそれぞれ連結してている。

培養槽AP−１内へ新しい培養培地に仕込み、空気導入管
Ｂから空気を導入し、撹拌機を回転し、動物細胞を播種
して培養を開始する。所定時間培養後、培養槽内の細胞
数が飽和状態まで増加した時点で、ポンプＰ−Ｉの回転
を開始し、培養槽内の培養液を導管Ｄを通じて遠心分離
機AP−２に送液して遠心分離機で動物細胞から母液を分
離し、分離された母液をバルブＹを解放した導管Ｆを通
じて該貯槽AP−３に送りつづける。

この間、培養槽AP−１内の液面が大きく変わらないよう
に、培地仕込み口Ａから連続的にあるいは間欠的に、新
しい培地を培養槽内に導入する。遠心分離機AP−２を上
記のようにして一定期間運転させた後、ポンプＰ−Ｉの
運転を停止し、バルブＹを閉じかつバルブＸを開放し、
次いでポンプＰ−IIの運転を開始する。それによって、
培養槽内の底部にある液状物質は導管Ｈを通じて遠心分
離機AP−２に導かれ、AP−２中に蓄積された生きた動物
細胞を押出し、該細胞と共に導管Ｅを通じて培養槽へ戻
す。この操作を遠心分離機を運転しながら行うことによ
り液状物質が遠心分離機に滞留し、今まで滞留していた
細胞が比重差によって自然に排出されることとなる。こ
の時液状物質の一部又は全部は培養槽AP−１中に導入さ
れることもあるので、上記のとおり培養槽底部に液状物
質の相LQが形成される。培養槽の底部に、形成される液
体キャリヤーの相LQの上記の如き循環使用は工業的規模
における培養にとって極めて有利であることが理解され
よう。

上記のように一定期間運転した後、ポンプＰ−IIの運転
を停止し、バルブＸを閉じ、かつバルブＺを開し、次い
でポンプＰ−IIIの運転を開始する。それによって遠心
分離装置内の液状物質は培養槽へ戻る。かかる操作によ
り細胞は比重が大である上記液状物質をくぐることがな
いので細胞に不要な圧力がかかるのを避けることがで
き、細胞の損傷を防止することができる。

本発明によれば、液状物質をくぐる時間をなくすか、極
めて小さくすることができる。実質的に細胞にかかる圧
力が0.2kgf/cm²以下なら損傷が少ないのでほぼそれに相
当する液状物質をくぐることは許容される。

さらにこの装置をこのように運転しつづけることによっ
て、動物細胞の培養に伴って培養槽内に次第に蓄積され
る動物細胞の生育を阻害する物質の濃度を低水準に維持
することができる。

図２には、本発明の上記培養方法を実施するに好適な他
の装置の概念図が示されている。

図２において培養槽T1よりポンプP1にて抜出した動物細
胞を含むサスペンジョン培養液を、遠心分離装置Ｓの遠
心力の高い側に設けられた供給口から連続的に供給し、
遠心力により該サスペンジョン培養液から動物細胞を分
離し、動物細胞が分離された培養母液を遠心力の低い側
に設けられた母液排出口から連続的かつ無菌的にタンク
T2に取出す。その後培養槽T1内底部より細胞および培養
液の何れとも親和性を有さずかつ、密度の大なる液体を
ポンプP2にて抜出し遠心分離装置Ｓの遠心力の高い側に
設けられた供給口から一定量供給することにより周縁ス
ロット内の分離された細胞を含む培養液を遠心分離装置
の遠心力の低い側に設けられた動物細胞取出口から無菌
的に取出し培養槽T1に戻す。その後タンクT3より細胞を
含まない培地をポンプP3にて抜出し遠心分離装置Ｓの細
胞取出口から供給することにより遠心分離装置内の密度
の大なる液体を再び培養槽T1に戻すと共に、周縁スロッ
トを培地で置換する。タンクT4は細胞を含まない新しい
培地であり培養槽T1の液面レベルが一定になるようにポ
ンプP4で連続的または断続的にT1に供給される。

上記操作を遠心分離装置を停止することなく連続的また
は断続的に行うことにより動物細胞を効率よく極めて生
存率の高い状態で分離できる。バルブV1〜V6は上記操作
に適した開閉操作が必要であることは説明を要しないで
あろう。

図３には上記方法で用いられる好適な遠心分離装置の概
略一部透視斜視図が示されており、図３において、内側
周縁壁21と外側周縁壁22の両者により周縁スロット23が
形成されている。24はサスペンジョン培養液の供給口お
よび密度の大なる液体の取出口を兼ねたもので、25は細
胞を含まない培養母液および分離された細胞を含む培養
液の取出口、26,27はロータ本体への供給および／また
はロータ本体からの取出しのためのノズルである。

また、図３に示すスロット面と遠心方向の角度αは50〜
90゜の範囲がよい。周縁スロットの深さｄは３〜5mmの
範囲がよい。また、板状周縁スロットの内壁面は細胞の
付着を防止するために疎水処理を施すとよい。

疎水処理とは、例えば、PTFE（四フッ化樹脂）等のフッ
素樹脂を壁面にコーティング加工する式が好適である。

図３に示す周縁スロット23の上辺と遠心方向の角度α′
は５〜10゜の範囲がよい。また、該スロット下辺と遠心
方向の角度α″は０〜５゜の範囲がよい。

図４には、本発明の遠心分離装置の他の実施態様の概略
一部透視斜視図が示されている。

図４において、傾斜を有し、等間隔でうず巻状に巻かれ
た板28および平板29,30にて閉じられることにより周縁
スロット31が形成されている。32はサスペンジョン培養
液の供給口および密度の大なる液体の取出口を兼ねたも
のであり回転軸34に連結される。33は細胞を含まない培
養母液および分離された細胞を培養液の取出口であり、
回転軸35に連結される。36,37はロータ本体への供給お
よび／またはロータ本体からの取出しのためのノズルで
ある。また、図４に示すスロット面と遠心方向の角度α
は50〜90゜の範囲がよい。螺旋状周縁スロットの巾ｄは
３〜5mmの範囲がよい。

また、スロット内壁面は細胞の付着を防止するために疎
水処理を施すとよい。また分離効率をさらに向上させる
ため周縁スロット内に分離板を設けてもよい。

図５には、本発明の遠心分離装置のさらに他の実施態様
の概略一部透視斜視図が示されている。

図５において、内側周縁壁38と外側周縁壁39の両者によ
り周縁スロット40が形成されている。41はサスペンジョ
ン培養液の供給口および密度の大なる液体の取出口を兼
ねたもので、42は細胞を含まない培養母液および分離さ
れた細胞を含む培養液の取出口、43,44はロータ本体へ
の供給および／またはロータ本体からの取出しのための
ノズルである。

また、図５に示すスロット面と遠心方向の角度αは50〜
90゜の範囲がよい。周縁スロットの深さｄは３〜5mmの
範囲がよい。

また、板状周縁スロットの内壁面への疎水処理が有効で
あることは、さらに説明を要しない。

（ｅ）発明の効果 本発明によれば、サスペンジョン液中の生細胞と古い培
養液とを細胞へダメージを得ることなく効率よく分離す
ることができ、工業的に優れた細胞培養が可能になっ
た。

（ｆ）実施例 以下、実施例をあげて本発明を詳述する。

実施例１ （１）培養装置 添付図１に示す培養システムを使用した。培養槽（AP−
１）はガラス製の全容積２の撹拌型培養槽であり正味
の培養液払込量は、1.2である。

培養槽底部にはフルオロカーボン（米国スリーエム社製
FLUORINERT FC-40 ）を300ml入れた。

図１のAP−２は沈降面積Ｓ＝31.4cm²,有効容積11ml,回
転半径10cmのローターを有する遠心分離機である。ポン
プＰ−I,P−II,P−IIIはペリスタルティックポンプであ
る。

（２）培 地 基礎培地として、RPMI1640培地，ハム−12培地およびダ
ルベッコ変法イーグル培地を2:1:1で混合したもの（以
下RDFと称する）を用いた。

上記基礎培地にインスリン９μg/ml,トランスフェリン1
0μg/ml,エタノールアミン10μg/ml,亜セレン２×10^-6m
ole/添加したものを培地として使用した。

（３）培養方法および結果 培養システムをあらかじめオートクレーブ滅菌した。し
かるのち過滅菌した培地1.2を培養槽に仕込んだ。
次いでマウスミエローマP3U1株とヒトＢセルとを融合し
て得られたマウス×ヒトハイブリドーマ×87株を５×10
⁵cells/mlとなるように播種した。この細胞はIgGを産生
するものである。培養槽では炭酸ガス５％を含む酸素ガ
スが培養液中の溶存酸素濃度が3ppmとなるように吹込ノ
ズルＢを通じて自動的にコントロールされて送入されて
いる。培養槽中にはマリン型撹拌翼が取付けられてお
り、撹拌速度は60rpmである。

播種後３日間は回分培養を行った。

表１に示すように培養開始後３日目（24hr経過後）に細
胞密度は1.0×10⁶個/mlに達し、回分培養では最高密度
に到達したと判断し、遠心機を用いた灌流培養を開始し
た。すなわち過滅菌した培養液を張り込んである遠心
機を駆動し、遠心効果が100gとなるように回転数を合せ
た。

次いでバルブX,Zは閉、ポンプＰ−II,P−IIIは停止、バ
ルブＹは開の状態にしてポンプＰ−Ｉを駆動し200mlの
培養混合物を20ml/mmの速度で10分間遠心分離機に送液
した。遠心分離機で細胞と分離された培養液はラインＦ
を通じて古い培養液の貯槽AP−３へ流出して貯留され
た。この中の細胞密度は5.0×10⁴cells/mlであった。

以上の操作が終了した後、バルブＸは開、バルブY,Zは
閉、ポンプＰ−I,P−IIIは停止の状態にしてポンプＰ−
IIを駆動し、培養槽AP−１の底部にあるフルオロカーボ
ンの50mlを5ml/minの速度で送液した。この操作によ
り、遠心ロータ内に滞留していた細胞はフルオロカーボ
ンと共に全量遠心分離機から排出され、ラインＥを経由
して培養槽AP−１に戻った。このとき遠心ロータ内で細
胞にかかる圧力は最大で0.05kgf/cm²であった。

次いでバルブＺは開、バルブX,Yは閉、ポンプＰ−I,P−
IIは停止の状態にしてポンプＰ−IIIを駆動し、新培地
を遠心分離機AP−２へおくり、AP−２内のフルオロカー
ボンを培養槽AP−１へ戻した。

この操作を表１に示す時間毎に１回自動的に行って培養
を継続した。培養槽の液位が平均して一定となようにラ
インＡから連続的に新培地を培養槽に供給した。

以上の実験でQ/（Ｓ・Ｚ）は0.032cm/minでありθは12.
5minZ・θ＝250であった。

実験条件の一部および実験結果を表１に示した。

比較例１ 図１における流路を変更し、遠心ロータから細胞を取出
す際に分離層にフルオロカーボンおよび新培地をロータ
の回転軸に近い開口部から入れ、分離した細胞をロータ
の回転軸から遠い開口部から取出した。

他の条件はすべて同じ条件×87株の培養を行った。

この方法による培養法では、細胞にかかる圧力は0.1kgf
/cm²であり、細胞の最高到達密度は実施例１よりも30％
減少した。また、抗体濃度も30％減少した。

顕微鏡で遠心ロータから取出した細胞を観察すると実施
例の場合と比較して細胞が損傷を受けていることが明ら
かとなった。

実施例２ （１）培養装置 添付図２に示す細胞分離系を有する培養システムを使用
した。培養槽（T1）はガラス製の全容積２の撹拌型培
養槽であり正味の培養液払込量は、1.2である。

培養槽底部にはフルオロカーボン（米国スリーエム社製
FLUORINERT FC-40 ）を300ml入れた。

遠心分離装置は図３および４の沈降面積Ｓ＝130cm²,有
効容積75ml,回転半径10cmのローターを有する遠心分離
装置を使用した。ポンプP1,P2,P3はペリスタルティック
ポンプである。

（２）培地 基礎培地として、RPMI1640培地，ハム−12培地およびダ
ルベッコ変法イーグル培地を2:1:1で混合したもの（以
下RDFと称する）を用いた。

上記基礎培地にインスリン９μg/ml,トランスフェリン1
0μg/ml,エタノールアミン10μg/ml,亜セレン酸２×10
^-6mole/添加したものを培地として使用した。

（３）培養方法および結果 培養システムをあらかじめオートクレーブ滅菌した。し
かるのち過滅菌した培地1.2を培養槽T1に仕込ん
だ。次いでマウスミエローマP3U1株とヒトＢセルとを融
合して得られたマウス×ヒトハイブリドーマ×87株を3.
3×10⁵cells/mlとなるように播種した。この細胞はIgG
を産生するものである。培養槽では炭酸ガス５％を含む
酸素ガスが培養液中の溶存酸素濃度が3ppmとなるように
吹込ノズルを通じて自動的にコントロールされて送入さ
れている。培養槽中の培養液は37℃に保持されている。
培養槽中にはマリン型撹拌翼が取付けられており、撹拌
速度は60rpmである。

播種後３日間は回分培養を行った。

表２に示すように培養開始後３日目（24hr経過後）に細
胞密度は5.8×10⁵個/mlに達し、回分培養では最高密度
に到達したと判断し、遠心機を用いた灌流培養を開始し
た。すなわち過滅菌した培養液を張り込んである遠心
機を駆動し、遠心効果が80gとなるように回転数を合せ
た。

次いで200mlの培養混合物を20ml/mmの速度で10分間遠心
分離装置Ｓに送液した。遠心分離装置で細胞と分離され
た培養母液は、古い培養液の貯槽T2へ流出して貯留し
た。この中の細胞密度は4.0×10⁴cell/mlであった。

以上の操作が終了した後、ポンプP2を駆動し、培養槽T1
の底部にあるフルオロカーボンの120mlを30ml/minの速
度で４分間遠心分離装置Ｓに送液した。この操作によ
り、遠心ロータに滞留していた細胞はフルオロカーボン
と共に全量遠心分離装置から排出され、培養槽T1に戻っ
た。このとき遠心ロータ内で細胞にかかる圧力は最大で
0.05kgf/cm²であった。

次いで、ポンプP1,P2は停止の状態にしてポンプP3を駆
動し、T3中の新培地を遠心分離装置Ｓへおくり、遠心分
離装置内のフルオロカーボンを培養槽T1へ戻した。

この操作を表２に示す時間毎に１回自動的に行って培養
を継続した。培養槽の液位が平均して一定となるように
T4中の新培地を連続的に培養槽に供給した。

実験条件の一部および実験結果を表２に示した。

実施例３ （１）培養装置 添付図２に示す細胞分離系を有する培養システムを使用
した。但し、培養槽（T1）はガラス製の全容積15の撹
拌型培養槽であり正味の培養液払込量は、10である。

培養槽底部にはフルオロカーボン（米国スリーエム社製
FLUORINERT FC-40 ）を900ml入れた。

遠心分離装置は図４の沈降面積Ｓ＝130cm²,有効効容積7
5ml,回転半径10cmのローターを有する遠心分離装置を使
用した。ポンプP1,P2,P3はペリスタルティックポンプで
ある。

（２）培地 基礎培地として、RPMI1640培地，ハム−12培地およびダ
ルベッコ変法イーグル培地を2:1:1で混合したもの（以
下RDFと称する）を用いた。

上記基礎培地にインスリン９μg/ml,トランスフェリン1
0μg/ml,エタノールアミン10μg/ml,亜セレン酸２×10
^-6mole/添加したものを培地として使用した。

（３）培養方法および結果 培養システムをあらかじめオートクレーブ滅菌した。し
かるのち過滅菌した培地10を培養槽T1に仕込んだ。
次いでマウスミエローマP3U1株とヒトＢセルとを融合し
て得られたマウス×ヒトハイブリドーマ×87株を6.2×1
0⁵cells/mlとなるように播種した。この細胞はIgGを産
生するものである。培養槽では炭酸ガス５％を含む酸素
ガスが培養液中の溶存酸素濃度が3ppmとなるように吹込
ノズルを通じて自動的にコントロールされて送入されて
いる。培養槽中の培養液は37℃に保持されている。培養
槽中にはマリン型撹拌翼が取付けられており、撹拌速度
は30rpmである。

播種後３日間は回分培養を行った。

表３に示すように培養開始後１日目（24hr経過後）に細
胞密度は9.8×10⁵個/mlに達し、回分培養では最高密度
に到達したと判断し、遠心機を用いた灌流培養を開始し
た。すなわち過滅菌した培養液を張り込んである遠心
機を駆動し、遠心効果が80gとなるように回転数を合せ
た。

次いで500mlの培養混合物を50ml/minの速度で10分間遠
心分離装置Ｓに送液した。遠心分離装置で細胞と分離さ
れた培養母液は、古い培養液の貯槽T2へ流出して貯留し
た。この中の細胞密度は1.0×10⁴cell/ml以下であっ
た。

以上の操作が終了した後、ポンプP2を駆動し、培養槽T1
の底部にあるフルオロカーボンの120mlを30ml/minの速
度で４分間遠心分離装置Ｓに送液した。この操作によ
り、遠心ロータ内に滞留していた細胞はフルオロカーボ
ンと共に全量遠心分離装置から排出され、培養槽T1に戻
った。このとき遠心ロータ内で細胞にかかる圧力は最大
で0.05kgf/cm²であった。

次いで、ポンプP1,P2は停止の状態にしてポンプP3を駆
動し、T3中の新培地を遠心分離装置Ｓへおくり、遠心分
離装置内のフルオロカーボンを培養槽T1へ戻した。

この操作を表３に示す時間毎に１回自動的に行って培養
を継続した。培養槽の液位が平均して一定となるように
T4中の新培地を連続的に培養槽に供給した。

実験条件の一部および実験結果を表３に示した。

【図面の簡単な説明】

図１および図２は本発明の培養方法を実施するに好適な
一連の装置の概略図である。図３は、本発明の遠心分離
装置の実施態様の概略一部透視斜視図である。図４およ
び図５は、本発明のさらに他の遠心分離装置の概略一部
透視斜視図である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（Ａ） 動物細胞を培養槽内でサスペンジ
   ョン培養に付し、 （Ｂ） 該培養槽より動物細胞を含むサスペンジョン培
   養液の１部分を抜出し、 （Ｃ） 抜出した該サスペンジョン培養液を、回転して
   いる遠心分離装置の遠心分離空隙へ、遠心力がより大き
   く作用する位置に設けられた供給口からある時間連続的
   に供給し、かつ遠心力がより小さく作用する位置に設け
   られた排出口から、動物細胞と分離された母液をある時
   間連続的に取出して、動物細胞を上記遠心分離空隙内に
   蓄積し、 （Ｄ） 水と混和せず、動物細胞および培養液のいずれ
   よりも密度が大きく、かつ動物細胞の生育を阻害しない
   液状媒体を、遠心分離装置を回転させたまま上記供給口
   から供給して、上記排出口から遠心分離空隙内に蓄積さ
   れた動物細胞を母液とともに該液状媒体で押出して抜出
   し、 （Ｅ） 該取出された動物細胞の少くとも１部分を上記
   （Ａ）工程のため培養槽に戻す、 ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
2. 【請求項２】上記工程（Ｂ）〜（Ｅ）を繰返し実施する
   請求項１記載の培養方法。
3. 【請求項３】遠心分離装置が下記運転条件： （１）θ≦300 （２）×θ≦３×10⁴ （３）Q/S・≦0.3および （４）５≦≦2000 で運転される請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】遠心分離空隙が、ローターの中心軸に向う
   方向に、ローターの中心軸に直角方向に対し50〜90゜の
   角度をもって、傾斜する外側周縁壁を有する周縁スロッ
   トからなり、該周縁スロットの該外側周縁壁は、ロータ
   ーの中心軸を横切る仮想面において、ローターの中心軸
   に対し螺旋を画いており、そして該周縁スロットはロー
   ターの中心軸から最も遠い位置ないしその近傍に供給口
   を備えまたローターの中心軸から最も近い位置ないしそ
   の近傍に排出口を備えていることを特徴とする遠心分離
   機。
5. 【請求項５】周縁スロットの外側周縁壁が、ローターの
   中心軸に向う方向にローターの中心軸に直角方法に対し
   50〜90゜の角度をもって傾斜する周縁壁のみからなる請
   求項４記載の遠心分離装置。
6. 【請求項６】周縁スロットがローターの中心軸に向う方
   向に、ローターの中心軸に直角方向に対し50〜90゜の角
   度をもって傾斜する内側周縁壁を有する請求項４記載の
   遠心分離装置。
7. 【請求項７】周縁スロットの該内側周縁壁が、ローター
   の中心軸を横切る仮想面において、ローターの中心軸に
   対し円弧ないし螺旋を画いている請求項６記載の遠心分
   離装置。
8. 【請求項８】周縁スロットが、ローターの中心軸の周囲
   360゜以内に存在する請求項４記載の遠心分離装置。
9. 【請求項９】周縁スロットが、ローターの中心軸の周囲
   360゜以上に、該中心軸の方向に角度を代えずに、うず
   巻状に存在する請求項４記載の遠心分離装置。
10. 【請求項１０】周縁スロットが、ローターの中心軸の周
    囲360゜以上に、該中心軸の方向にある角度で傾斜し
    て、螺旋状に存在する請求項４記載の遠心分離装置。
11. 【請求項１１】周縁スロットが、該スロット内に、動物
    細胞の分離板を有する請求項４記載の遠心分離装置。