JPS6324885A - グリコサミノグリカンを分解できる酵素製剤及び該酵素製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、これまで知られていなかったグリコサミノグ
リカン分解酵素であって、オキアミ目旺山」ｎ二組に属
する水生甲殻用、特にＥｕ　ｈａｕｓｉａ　ｓｕ　ｅｒ
ｂａ種（八ｎｔａｒｃｔｉｃ　ｋｒｉｌｌ：オキアミ科
の甲殻類）のごとき７→２属の甲殻鋼の体内に発見され
るような酵素類に係わる。本発明が提供する酵素はヒア
ルロン酸を分解し得るため、以後「ヒアルロニダーゼ」
と称する。「クリル（Ｋｒ　ｉ　ｌ’ｌ　）　Ｊという
名称は前述の目の総ての甲殻綱に対して一般的に使用さ
れている。

Ｌ」１土とＩＡ−針」至ｄリエは通常Ｍ極大陸周辺の大
洋領域に棲恋、するクリル種である。クリルは極めて強
力な消化酵素を有するため、死ぬと極めて急速に自己分
解する。特に洗浄用酵素としての使用が提案されてきた
クリルプロテアーゼに関しては多くのレポートが発表さ
れている（６）。クリルは（タンパク質以外に）種々の
炭水化物を大量に含む植物プランクトンを主食とするた
め、活発な多糖分解酵素も含むのではないかと考えられ
てきた（３．１３）。これに関してはＣｈｅｎ他（３）
が未精製クリル抽出物におけるキチナーゼ活性の存在を
立証している。しかしながら、この活性がヒアルロニダ
ーゼ活性を示す特定酵素によって生じるのではないかと
いう示唆はこれまでのところ１つもなされていない。

グリコサミノグリカン（＝　ＧＡＧ：ｓ）は「ムコ多糖
」とも称し、アミド化形態で存在し得るアミノ化単糖単
位を含む多糖であることを特徴とする。

ＧΔＧａｓは更に、例えば硫酸止車Ｎ構造並びにグルコ
ピラノシルウロン酸単位及びイドピラノシルウロン酸単
位のごときウロン酸構造をも含み得る。

ＧＡＧ；ｓの具体例としては、キチン、コンドロイチン
、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ、Ｃ、ヘパラン硫酸、ヘパ
リン、ヒアルロン酸及びケラタン硫酸が挙げられる。

本発明で最も重要なグリコサミノグリカンはヒアルロン
酸である。このヒアルロン酸は三糖（１→４）Ｏ−ベー
ターＤ−グルコピラノシルウロン酸（１→３）２−アセ
トアミド−２−デオキシ−ベーターＤ−グルコビラノー
ス単位を繰り返し含む。

ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸をより小さ０フラグメ
ン１゛、特に四糖に分解しｔ尋る酵素と定義される。但
し単純な単糖又は二砧羊位も形成され得る。「ヒアルロ
ニダーゼ」という用語は他のＧＡＧ：ｓを好む他のヒア
ルロン酸分裂酵素に対して使用されることもあるが、ヒ
アルロン酸を優先的に使用する酵素に対して使用するの
が最も好ましい。即ち、ヒアルロニダーゼはヒアルロン
酸グリコシド結合の１つを分裂させることができなけれ
ばならない酵素であり、従ってグルクロニダーゼ（例え
ばグルクロニダーゼを離脱させるベーター（１，３）−
グルクロニダーゼ）又はヘキソサミニダーゼ（例えばア
ミド（ヒされたグルコサミニル基を離脱させるベーター
（１，，４）−グルコサミニダーゼ）であるはずである
。グルクロニダーゼ及びヘキソサミニダーゼはエンド又
はエキソタイプであってよい。周知のように、ヒアルロ
ニダーゼは実質的に次の２つの方法のいずれか、即ち加
水分解分裂（例えば翠丸性ヒアルロニダーゼのごとき加
水分解酵素）又は脱離反応形態の分裂プロセスく例えば
別」！１懲りＬセリ−からの細菌性ヒアルロニダーゼの
ごときエリミナーゼ）で作用し得る。

ヒアルロニダーゼの概要についてはＭｅｙｅｒ　Ｋ。

他く９）を参照されたい。

優先権主張の基礎となる先の出願に関してスウェーデン
特許庁により作成された国際タイプの調査報告には参考
文献１５−１９が引例として記載されているが、これら
の文献のいずれにもクリルのヒアルロニダーゼは開示さ
れていない。

ヒアルロニダーゼは多（の分野で実地に使用されてきた
ものであり、多くの製造業者から市販されている。これ
ら種々の用途に共通の特徴の１つは、これらの用途がｉ
ｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎν１ｔｒｏの任意の所定ヒアルロ
ン酸含有システムにおけるヒアルロン酸の修飾反応プロ
セスを利用することである。

この酵素のｉｎ　ｖｉｖｏ使用は種々の治療に関して提
案されてきた。−例として、この酵素を薬剤と共に使用
すべきだという提案がなされた。このようにするとヒア
ルロニダーゼの作用によってその薬剤が組織全体に拡散
するのが増進される（ヒアルロニダーゼは「拡散因子」
とも称することに留意されたい）。治療分野では、この
酵素は更に、ａ〉心筋梗塞（５）、ｂ）網膜機能（１４
）に効果があり、且つＣ）癌治療において細胞増殖抑制
剤と組合わせても効果がある（１）とみなされている。

ｉｎｖ　ｉ　ｔｒｏでは、この酵素は例えば無細胞シス
テムでヒアルロン酸を解重合させるか又は例えば細胞培
養処理でヒアルロン酸シンテターゼを刺激するのに使用
されてきた（１１）。

ヒアルロニダーゼは主としてウシ翠丸、バクテリア及び
ヒルから採収されてきた。これらの材料はヒアルロニダ
ーゼ含旦が比較的低いため、１ｎｖｉｖｏ使用で許容し
得る純度のヒアルロニダーゼ製剤を製造したい場合には
コストが高くなる。そのため、廉価でより良質のヒアル
ロニダーゼ製剤が求められている。

本発明のヒアルロニダーゼ製剤は本明細書の冒頭で述べ
た甲殻綱の体内に存在するヒアルロニダーゼを含むこと
を特徴とする。このヒアルロニダーゼの供給源としては
、クリルヒアルロニダーゼの分離が可能なりリルの他に
、組換え技術によって該酵素を産生するようになった細
胞の培養培地も考えられる。クリルヒアルロニダーゼに
関するこれまでの我々の研究によれば、これらの酵素は
８ｘ１０”、例えば８０，０００±３，０００ダルトン
の分子量と４．５〜６．０の最適ｐｌ＋とを有し得、４
〜６のｐＨ範囲でｐｉ（等電点）を有し得、共存アイソ
ザイムの存在する可能性があることが判明した。これら
のヒアルロニダーゼはＣｏｎ　Ａ結合能力を持つ（即ち
、アルファーＤ−マンノピラノシド又はアルファーＤ−
グリコピラノシド構造の末端単糖残基を有する）糖タン
パク質であり得る。これまでに検出された酵素活性は、
クリルヒアルロニダーゼがエンドグルクロニダーゼ様活
性を有する、即ちエンドグルクロニダーゼの１種である
ことを示しているように思われる。将来の研究において
、クリルヒアルロニダーゼがこれに効果的なヒアルウロ
ン酸分解能力を与える別の特性を有することが発見され
ることは、全く考えられないことではない。

本発明のヒアルロニダーゼ製剤は原料源（通常はクリル
タンパクｆｆ１）からのタンパク質１ｍｇ当たり２．Ｏ
Ｕを超えるヒアルロニダーゼ活性、例えば前記源からの
タンパク質１ｍｇ当たり１００より大きく、２０．５０
又は１００Ｕ／ｍｇを超えるような活性を示す。前記原
料源からのタンパク質ＩＢ当たり２５０Ｕを超える活性
を持つ製剤の製造も可能である。

この活性は後述の実施例で説明する方法に従って測定す
る。

本発明のヒアルロニダーゼはホモジナイズした新鮮クリ
ル又は新鮮凍結クリルを抽出処理することによって製造
できる。この抽出処理は水性媒質、例えば水を用いて実
施すべきである。このようにすれば、クリルヒアルロニ
ダーゼの前述の特性に基づく分離方法によって、得られ
た抽出物から酵素を分離することができる。使用し得る
分間方法としては、アフィニティークロマトグラフィー
、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ＩＩＰＬｃ、　ＦＰＬＣ、クロマトフオーカシン
グ等のクロマＩ・グラフィー法、又は分離用電気泳動が
挙げられる。その他、透析、限外濾過及び膜濾過も使用
可能な方法である。前述の抽出及びホモジナイズは好ま
しくは＋４℃以下又はこの値に近い低温で実施する。ま
た、得られた水性抽出物（未精製（粗製）抽出物）から
は、これを精製処理する前に脂質溶解性溶媒で脂質を抽
出し除去すると有利である。クリルヒアルロニダーゼ分
離操ｆｊは下記の実施例の説明でより明らかにされよう
６本発明のクリルヒアルロニダーゼはヒアルロニダーゼ
に関して通常使用されている前述のごとき方法で使用し
得る。

本発明の製剤では、分離されたクリルヒアルロニダーゼ
は粉末（例えば凍結乾燥又は噴震乾燥したもの）の形態
を有し得る。このヒアルロニダーゼはまた、当該用途に
適した種々のベヒクル例えば水（例えば生理的食塩水）
に溶解又は他の方法で配合した混合物としても存在し得
る。

本発明は本明細書の一部をなす「特許請求の範囲」に明
確に定義されている。

以下、本発明の実際の基礎となった実験の記述を通して
本発明をより詳細に説明する。但し本発明はこの実施例
には限定されず、その範囲内で様々な変形が可能である
と理解されたい。

ウシ事大ヒアルロニダーゼ、５−スルホサリチル酸（Ｓ
−２１３０）　、フェノールフタレイングルクロン酸（
Ｐ−０３７６）　、ラミナリン（Ｌ−９６３４）　、メ
チルアルファーＤ−マンノピラノシド（Ｍ−６８８２）
は５ＩＧＨ八社（米国）から入手した。ヒアルロン酸（
ＩｌｅａｌｏｎＯ）はＰｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ　（ス
ウェーデン）から入手した。限外濾過セル及び膜（ＹＭ
　１０）は八ｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ　（米国）から入手
した。トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩ
Ｓ）　、３．５−ジニトロサリチル酸、酒石酸カリウム
−ナトリウム（Ｃ＜Ｉｆ４０ｓＫＮａ　Ｘ　４Ｈ２０）
　、セチルピリジニウムクロライドモノハイドレートは
Ｍｅｒｃｋ社（米国）から入手した。Ｃｏｎ　へセファ
ローズの、５ｕｐｅｒｏｓｅ”６ｐｒｅｐグレード、ア
ガロースＡ　、ポリアクリルアミ゛ド勾配ゲル（Ｐ＾＾
４／３０）　、ゲル濾過キット、等電点フォーカシング
較正キット（ｐＨ３〜１０）及びＰｈａｒｍａｌｙｔｅ
Φ（ｐＨ３〜１０）はＰｈａｒｍａｃｉａ　八Ｂ　（ス
ウェーデン）のものである、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ａ
Ｂから入手したクロマトグラフィー及び電気泳動装置は
に１６／２０及びＫ　１６／１００カラム、シングルパ
スモニター（ＵＶ−１）、電気泳動？ＣＩ装Ｈ（ＥＰＳ
５００／４００）　、ゲル電気泳動装置（ＧＥ−４＞　
、電気泳動定電源装置（ＥＣＰＳ３，０００／１５０）
、ホルト時積分計（Ｖｌ＋−１）　、脱色電源装置（Ｄ
ＰＳ）　、ゲル脱色装置（ＣＤ−４）、５ｕｐｅｒｏｓ
ｅ■ｌｌＲ１０／３０カラム及びＦＰＬＣシステムに接
続されたＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５１５陰イオン交換カラム
である。

南極の夏季に捕獲し、即座に凍結して約−２０〜−４０
℃で貯蔵したクリル（も」亙すュ逍し１Ｕ猥二ｂａ）を
＋４°Ｃの環境に配置する。はぼ解凍した時点で前記ク
リルのうち１００　ｇを２００ｍ　ｌの脱イオン水と混
合する。この混合物をホモジナイズし、次いでホモジネ
ートが透明になるまで遠心分離にかける。上ｑン一 方相（−抽出物）をデカンテーションにかけ且ｒ過して
、ｒ液をその３倍の容量の脂質溶解性溶媒で処理する。

相分離後、水相を回収して下記のステップＢに従い使用
する。この操作は約＋４℃の低温室内で実施した。

市販のＣｏｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ■をバッファ（
２０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭ　Ｈｎ
”、１ｍＭ　Ｍｇ２°、１ｍＭＣａ”、ＬＭ　ＮａＣ１
）で洗浄し、約３１ｍ１のベッドボリュームに相当する
高さ１５゜５ｃ＋ａまでＫ　１６／２０カラムに詰めた
。次いでこのカラムを前記バッファにより室温で平衡化
した。前記バッファと同じ塩濃度を持つステップＡで得
た未精製抽出物１５〜３０ｍ１を前記カラムに通し、前
記バッファ２００ｍ１　（ベッドボリュームの約６倍）
により１３…ｌ／時の流量で溶離処理した。次いでメチ
ルアルファーＤ−マンノピラノシド５％（Ｗ／Ｖ　）を
含むバッファを用いて脱着処理を行った。溶離状態をＵ
ｖ吸収物質が溶離液に出なくなるまで２８０ｎｍでｍ続
的にモニターした。

回収した種々のフラクション（２ｍｌ／フラクション）
を分析してヒアルロニダーゼ活性を調べた。活性のある
フラクションをプールし、Δｍ１ｃｏｎフィルター　（
ＹＭ　１０）を用いて濃縮した。

Ｃ，グＪ」已沿− ステップＢで得た濃縮物約４ｍ１（ベッドボリュームの
約２％）を＋４℃の低温室内で５ｕｐｅｒｏｓｅ○６ｐ
ｒｅｐグレードカラムＫ　１６／１００　（１，６ｃｍ
ｘ　１００ｃｍ　）に通した。前記カラムは５０ｍＭ　
ＴＲｌＳ−１１ＣＩバツフア（ｐＨ７，５）で平衡化し
ておいた。このカラムを前記バッファにより１２ｍ１／
時で溶離処理した。溶離状態を分光測光により２８０ｎ
ｍでモニターした。得られた種々のフラクション（２ｍ
ｌ／フラクション）を分析してヒアルロニダーゼ活性を
調べ、活性を示したフラクションをプールした。

Ｄ、ＦＰＬＣ ステップＣでプールしたフラクションを、ステップＣと
同じバッファにより室温で平衡化した強力な陰イオン交
換カラム（Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＩＩＲ５１５）で更に精製し
た。ステップＣのプールしたフラクションのうち４ｍｌ
を前記カラムに通し、タンパク質を０〜０．１８Ｍ、０
．１８〜０．３４Ｍ、０．３４〜１．０ＨのＮａＣ１段
階的グラジェントで溶離した。これらのフラクション（
１ｍｌ／フラクション）と分析してヒアルロニダーゼ活
性、ベーターグルクロニダーゼ活性及びエンド（１，３
）−ベーターＤ−グルカナーゼ活性分調べた。各酵素に
対応する活性フラクションを別個にプールした。

Ｅ、ヒアルロニダーゼゞ　の′　− Ｒｉｃｈｍａｎ他の単一プレート法（１２）を用いてヒ
アルロニダーゼ活性を測定した。この測定法は簡単に説
明すると次の操作からなる。先ず、ヒアルロン酸（Ｈｅ
ａｌｏｒ＋Ｏ）を１．５％（ｕｌ／ｖ）アガロースゲル
に導入した。前記ゲルに設けた穴（ウェル）に前記酵素
を入れて３７℃で２０時間拡散させた。次いで、塩化セ
チルピリジニウムを加えることによって未消化ヒアルロ
ン酸を沈澱させると、約３０分後に各穴の回りに透明な
円が形成された。前記円の直径は各穴に加えた酵素溶液
の濃度の対数に比例していた。翠丸ヒアルロニダーゼを
基準として使用し、標準曲線を作成した。この測定を前
述のステップＡ−Ｄでプールしたフラクションについて
実施した。

Ｆ、ベーターグルクロニダーゼの　量 この活性はＦｉｓｈｍａｎ他の方法（４）に従って測定
した。一連の管に０．８ｍｌの０．ＩＭ　ＮａＡｃ、ｐ
ｌｌ４．５と、０．１ｍｌのフェノールフタレインモノ
−ベーターグルクロン酸、ｐＨ７，６とを充填し、３７
℃で５分間インキュベートした。所定時間間隔でステッ
プＤの酵素溶液０．１ｍｌを多管に加え、ブランクにｆ
蒸留水０．１ｍｌを加えた。これらの管を３７℃で３０
分間インキュベートした。５゜Ｏｗｌの０．２Ｍグリシ
ンと０．２ＭＮ　ａ　Ｏｔｌを加えることによりこの酵
素反応を停止させ、管を冷却してＵＶ吸収を室温下５４
０ｎｍ″Ｃ″読み取った。

遊離されたフェノールフタレインのμモル数を標準曲線
を用いて計算した。１単位（ｔｌ）の酵素はｐｌｌ　４
　、５．３７℃で１分当たり１μモルのフェノールフタ
レインモノ−ベーターグルクロン酸を分割（解裂）する
。

この酵素の活性はＴｕｒｋｉｅｗｉｃｚ他の方法（１３
）に従って測定した。使用した基質は、主として１．３
結合を介して接続されたベーターＤ−グルコース残基か
らなるラミナリンである。この酵素活性は１分当なり離
脱（放出）されるグルコースのμモルとして表される。

離脱したグルコースはＢｅｒｎｆｅｌｄ　（２）によっ
て記述されているように３．５−ジニトロサリチル酸を
用いて測定しな。前述のステップＤの酵素溶液０．５ｍ
ｌをリン酸Ｎａ（１０ｍＭ　ｐＨ６，２）で緩衝し、基
質溶液（リン酸バッファ中１　ｍｇ７ｍｌのラミナリン
ン０．５ｍｌと共に５０　’Ｃで１０分間インキュベー
トした。その直後に３，５−ジニトロサリチル酸試薬１
．Ｏｗｌを加え、管を沸騰した水浴中に挿入して５分間
加熱した。最後に、試料を冷却し、８．０ｍｌの蒸留水
を加えた。吸光度を即αｉ５４０ｎｍ７：’読み取った
。逆順したグルコースのμモル数を標準曲線に基づいて
計算し、酵素活性を皐位（μモル／皐位時間）で示した
。

Ｈ−ム乙庄Ｌ１Δ１Ｌ 種々の酵素製剤のタンパク質濃度を、ＢＳＡを基準タン
パク質として用いてＬｏｕ＋ｒｙ池の方法（８）により
測定した。

電気泳動バッファドしテハ４０ｍＭ　ＴＲｌ５−ＨＣＩ
、２０ｍＭ　ＮａＡｃ、２ｍＭＥＤＴＡからなるｐｌ＋
８．４のバッファ３使用した。試料の組成は濃縮タンパ
ク質５６シ１．５０％（ｗ／ｖ）スクロースｉｓ、　ｌ
、０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー５ｐｌで
あった。この試料（タンパク質４０ｕｇ）　１５〜３０
μｍを予め平衡化したゲルにがけな（７０Ｖで１時間）
。電気泳動条件は２０分間（慣らしくｒｕｎ　ｉｎ＞）
　１５０Ｖ　（３５ｍΔ／ゲル）にし、次いで約５時間
１００Ｖ　（２５ｍ＾／ゲル）にした。タンパク質はイ
ソプロパツール及びｊ［（夫々２５ｖ／ｖ％及び１０ｖ
／ｖ％）の溶液中３０分間２４Ｖ″′Ｃ−電気泳動によ
り固定された。ゲルをメタノール及び酢酸く夫々２５Ｖ
／Ｖ％及びＬｏｗ／ｖ％）溶液中で２時間、０．２％（
彎／Ｖ）のＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーによ
り染色処理した。脱色は同じ溶液中で、但し染料を入れ
ずに４５分間処理した。

Ｊ、“−−＝”’　　　ＩＥＦ ゲルのキャスト成形と電気泳動条件とは製造業者の指示
に従った（　１０）　、　ＰｈａｒｍａｌｙｔｅＯ、ｐ
Ｈ３〜１０を含む厚さ１ｍｍのポリアクリルアミドゲル
（アクリルアミド合計ｉ５％ｕ＋／ｖ、架橋剤３％）を
キャストした。電極溶液は０．１Ｍ硫酸（陽極）とＩＭ
ＮａＯＨ（陰極）で構成した。試料を配置する前に、ゲ
ルを３０Ｈの一定電力で５００Ｖｈの間予め泳動（フォ
ーカシング）した。タンパク質ｓｏ、ｇを含むステップ
Ｄの濃縮脱塩最終ブール２０．　Ｉを前記ゲルに加えた
。電気泳動は３０Ｗ（Ｖｍａｘ４，５００Ｖ）ノ一定電
力で５，０００Ｖｈ（３，５時間）実施した。電気泳動
が終了するとタンパク質が固定されていた。５％（ｗ／
ｖ）５−スルホサリチル酸と１０％（ｕ＋／ｖ）ｌ・リ
クロロ酢酸とで６０分間処理してＰｈａｒｍａｌｙｔｅ
Ｏを除去した。次いでゲルをメタノール３０％（ｖ／ｖ
）と酢酸１０％（Ｖ／Ｖ　）とを含む脱色溶液で３０分
間洗浄した。前記脱色溶液中に溶解した０、２％（ｗ／
ｖ）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーを用いてタ
ンパク質の染色を行った。脱色は洗浄水を何回ら取り習
えて実施した。

２ｍｌの１ｌｅａｌｏｎ’Ｅ’（Ｌｏｍｇ／ｍｌ）と、
３ｍｌのクエン酸Ｎａバッファ　（ｐＨ５，３，０，１
５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ５）と５＋ｎｌの２
％アガロースＡとの混合物を用いて基質ゲルをキャスト
した。この混合物は約２分間撹拌しながら加熱し、その
ｆ＆８ｘ８ｃｍ２のＧｅｌ　Ｂｏｎｄ７　イルム上に流
した。　Ｇ−ＰＡＧＥを前述のように行った。電気泳動
処理の終了直後、ゲルをクエン酸バッファと共に１５分
間インキュベートした０次いで電気泳動ゲルと基質ゲル
とを向かい合わせにしてガラス板の上に配置した。この
ようにして形成した３層形サンドイッチ構造体を湿潤チ
ャンバ内に配置し、３７°Ｃで２４時間放置した。その
後塩化セチルピリジニウムで未消化ヒアルロン酸を沈澱
させた。

ＩＥＦを実施すべく基質溶液をエレクトロフォーカシン
グの後でＩＥＦゲル上に直接流した。このプレートを湿
潤チャンバに配置し、３７℃で２４時間放置した。未消
化ヒアルロン酸を前述のごとく沈澱させた。

Ｌ、ボヱＪノ日１ ＦＰＬＣシステムに接続した５ｕｐｅｒｏｓｅの１２１
１Ｒ１０／３０カラムでのゲルｒ過によって分子量を測
定した。二〇カラムは０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む５０
ｍＭ　ＴＲｌ５−ＨＣＩ、ｐ）Ｉ７．５により平衡化し
た。基準タンパク質としてはフェリチン（４４０，００
０）　、アルドラーゼ（１５８，０００）、ＢＳ八（６
７，０００）、オバルブミン（４３，０００）及びキモ
トリプシン（２５，０００）を使用した。溶離容量を１
ｏｇＭｗに対してプロットすると直線が得られた。

Ｍ、退」１１！１１笈− ｐＨを０．０５Ｍクエン酸リン酸溶液により種々の値に
調整した種々の基質ゲル（Ｅ参照）でヒアルロニダーゼ
活性を測定した。

罷１えＬ１色 ステップＢでヒアルロニダーゼをＣｏｎ　八５ｅ−ｐ　
ｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅＯでのアフィニティークロマト
グラフィーにより精製したが、この吸着剤は末端のアル
ファーＤ−グルコピラノシド又はアルファーＤ−マンノ
ピラノ°シト残基を有する糖タンパク質と特異的に相互
作用することが知られている。ヒアルロニダーゼ、ベー
ターグルクロニダーゼ及びエンド（１，３）−ベーター
Ｄ−グルカナーゼがカラムに強く結合されるという事実
は、これらの酵素が前記末端Ｎ残基のうちのどれかを有
しでいること分示唆する。結合したタンパク質は５％メ
チルアルファーＤ−マンノビ・ラノシドによりカラムか
ら雅脱させた。

ステップＣでは前記３種類の酵素を一緒に溶離した。こ
のステップでは別のタンパク質からの効果的な精製が生
起した。

ステップＤでは前記３種類の酵素の活性をＭｏｎ。

Ｑでのイオン交換クロマトグラフィーにより相互に分離
することができた。得られた３つのタンパク質ピークを
Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩで示した（■は最初に溶離されたも
の、ＩＩＩは最後に溶離されたものである）。各ピーク
内のフラクションを前述のごとく分析してそのヒアルロ
ニダーゼ活性、ベーターグルクロニダーゼ活性及びエン
ド（１，３）−ベーター〇−グルカナーゼ活性を調べた
。ピークＩＩＩはピークＩ及びＩＩには示されない大き
なヒアルロニダーゼ活性を示した。ベーターグルクロニ
ダーゼ活性はピーク■に対応し、エンド（１，３）−ベ
ーターＤ−グルカナーゼ活性はピークＩＩで見られ、ピ
ークＩＩＩでもある程度見られた。

次いで単離ヒアルロニダーゼを純度、等電点、最適ｐＨ
及び分子量に関して更に調べた。

＋ｒ−ＰＡＧＥの実施時にはピークＩＩＩが少数の他の
成分によって少し汚染された主要タンパク質を示した。

ゲル分離に関するヒアルロン酸ザイモグラムは主要バン
ドがヒアルロニダーゼ活性に対応していることを示した
。

ヒアルロン酸ザイモグラムと組合わせた等電点電気泳動
パターンは４〜７のｐＨ範囲で大きな酵素活性を示した
。この活性は複数のバンドに対応していた。これはアイ
ソザイムの存在を示唆し得る現象である。

ヒアルロニダーゼ活性にとって最適のｐＨは４，５〜６
の範囲にあることが’ＰＩ明した。

表１：最適ｐＨの測 ３．０　　　　　　　　　　　　　　　　０３．７　　
　　　　　　　　　　　　　　５４．３　　　　　　　
　　　　　　　　　８．０７・０　　　　　　　　　　
　　　　　７．０ヒアルロニダーゼの分子量は８０，０
００ダルトン（ヨ３．０００ダルトン）であることが判
明した。

ベーターグルクロニダーゼ及びエンド（１，３）−ベー
ターＤ−グルカナーゼの分子量は夫々７０　、０００及
び８０，０００ダルトンであることが判明した。

ヒアルロニダーゼの比活性及び収率を個々の精製ステッ
プの間モニターした。

−２＝ヒアルロニダーゼの　１　　 ｍｇ／ｍｌ　　ａｄ　　　　　　　Ｕ／ｍｇ　　　ｆｊ
ｔ　　　　＄抽出物 Ｃｏｎ＾　　１０　　４８　　２５　１，２３０　２６
　７．５クロマト グラフィー ５ｕｐｅｒｏｓｅ’Ｅ’　　１．１　１４　１０２　１
．４４６　３１　３０ゲル濾過 ＦＰＬＣＭＯＮＯＯ，２２３，７２９５１０８５２３８
７Ｑイオン 〜 Ｌｉｎｋｅｒによるエンドへキソサミニダーゼ活性測定
（７）では、遊離したＮ−アセチルグルコサミンは全く
検出されなかった。これは我々の研究対象であるヒアル
ロニダーゼがエンドグルクロニダーゼであり得ることを
示している。

髪Ｊう引にｉＬ １　、　ＢａｕｍｇａｒＬｎｅｒ、Ｇ他Ｊ、Ｅｘｐ、Ｃ
ｌ１ｎ、Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、４．（１９８５）ｐ
、３゜２、Ｂｅｒｎｆｅｌｃｌ、Ｐ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、ｖｏｌ、
１（１９５５）ｐ、１４９〜１５８゜ ３　、　Ｃｈｅｎ、　Ｃ−Ｓ、他 Ｊ、Ｆｏｏｃｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５　　（１９８１
）ｐ、６３−６８゜４　、　Ｆｉｓｈｍａｎ、　Ｈ，他 Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｗ、１７３　　（１９４８）ｐ、
３３９〜５６゜５、　Ｆｌｉｎｔ、　Ｅ、Ｊ、他 Ｌａｎｃｅｔ　、　　＾ｐｒｉｌ　　１７（１９８２）
　、ｐ、８７１〜７４゜６　、Ｈｅｌｌｇｒｅｎ、Ｌ、
、Ｍｏｈｒ、Ｖ、ｏｃｈ　　Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｊ。

ＥＰ−＾−１０７，６３４゜ ７　、Ｌｉｎｋｅｒ、　　＾。

’′、１３６ｒｇｍｅｙｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｏｆ　　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　　ａ
ｎａｌｙｓｉｓ、ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ　　ｖｏｌ
　　ＩＶ、ｅｎｚｙｍｅｓ　　２．ｐ、２５７〜２６１
゜８　、　Ｌｏｗｒｙ、　０．１１．他 Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ、１９３（１９５１）ｐ、
２６５〜２７５゜９　、　Ｍｅｙｅｒ、他 Ｔｈｅ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ（１９６０）ｐ、４４７−４
６０゜１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｆｉｎｅ　　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　　ｆｏｃｕｓ
ｉｎｇ、ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　　ａｎｃｌｍｅｔｈｏ
ｄｓ。

１１、　Ｐｈ１ｌｉｐｓｏｎ、　Ｌ、Ｉｌ、他Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４　　（１９８５）　　ｐ、７８
９９〜７９０６゜１２、　Ｆｉｃｈｍａｎ、　Ｐ、Ｇ、
他＾ｎａ１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１０９　　（１
９８０）　　ｐ、３７６〜３８１゜１３、　Ｔｕｒｋｉ
ｅｗｉｃｓ、　Ｍ、他Ｐｏ１ａｒ　８ｉｏ１．　４　　
（１９８５）　　ｐ、２０：３−２１１゜１４、Ｗｉｎ
ｋｌｅｒ、　Ｂ、Ｓ、他 ＾ｒｃｈ、　　０ｐｔｈａｌｉｏ１．　１０３　　（１
９８５＞　　ｐ、１７４：３−４６゜１５、　Ｋｉｔａ
ｍｉｋａｄｏ、　Ｍ、他日本水産学会誌 Ｂｕｌｌ、Ｊａｐ、Ｓｏｃ、Ｓｃｉ、Ｆｉｓｈ、　３５
　（１９６９）　ｐ、４６６〜７０゜ Ｌａ、　　ＹａｍａｍｏＬｏ、　　Ｈ，他日本水産学会
誌 Ｂｕｌｌ、Ｊａｐ、Ｓｏｃ、Ｓｃｉ、Ｆｉｓｈ、　３７
　（１９７１）　ｐ、６２１〜７０゜ １７、　Ｇａ１ａｓ、　Ｅ、他

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）クリル（Ｋｒｉｌｌ）ヒアルロニダーゼを含む生
   体から分離した前記ヒアルロニダーゼを含むことを特徴
   とするグリコサミノグリカン分解酵素製剤。
2. （２）原料源からのタンパク質１ｍｇ当たり１０Ｕを越
   えるヒアルロニダーゼ活性を有することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載のグリコサミノグリカン分解
   酵素製剤。
3. （３）ヒアルロニダーゼ活性を有するグリコサミノグリ
   カン分解酵素製剤の製造方法であつて、￥Ｅｕｐｈａｕ
   ｓｉａｃｅａｅ￥目の生体をホモジナイズし、得られた
   ホモジネートを水性媒質で抽出し、これをヒアルロニダ
   ーゼ活性に関して精製することを特徴とする方法。
4. （４）ヒアルロニダーゼ活性に関する前記精製処理をア
   フィニティークロマトグラフィーによつて実施すること
   を特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。
5. （５）ヒアルロニダーゼ活性に関する前記精製処理をゲ
   ルクロマトグラフィーによって実施することを特徴とす
   る特許請求の範囲第３項に記載の方法。
6. （６）ヒアルロニダーゼ活性に関する前記精製処理をイ
   オン交換クロマトグラフィーによって実施することを特
   徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。