JPS63253096A - 無水強化結合 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物活性分子を結合させること、特にタンパ
クを結合させることに関する。より特定すれば、非水溶
媒中で結合反応を行い、それによって結合の効率を向上
させることに関する。

（従来の技術） 過去１０年の間に２次のことが明らかとなった。

つまり、患者のある特定の標的部位に供給すべき物質に
誘導能力を与えるために、免疫系またはそのフラグメン
トにより産生される抗体の特異的相互作用と利用するこ
とが有利であるということが明らかとなった。一般的な
適用は、免疫毒素（抗毒素）の利用である。この免疫毒
素は、リジン（ｒｉｃｉｎ）やアブリン（ａｂｒｉｎ）
のような毒性物質と毒素が反応を示すと思われる組織に
対して特異的である抗体調製物との結合体である。他の
例としては、ある標的組織の位置を確認するために、免
疫グロブリンに蛍光標識のような有機標識物を結合する
ことが包含される。

類似の複合体も、エビ［・−プを有する物質に免疫原性
、を与えるために形成されている。この物質に対して抗
体が産生されるが、この物質は免疫原性となるほど十分
な大きさではない。例えば、短いアミノ酸配列をキャリ
アタンパクへ結合することによるペプチドワクチンの調
製に関して充分な量の研究が実施されてきた。これによ
って、適切なエピトープが大量に使用されることが可能
となり、化学的に合成されることも可能となる。

これらの例のそれぞれにおいて、変性を受けるタンパク
、すなわち誘導薬剤またはキャリアタンパクを、興味あ
る°“活性°゛物質結合させる有効かつ非破壊的方法を
見つける必要がある。タンパクの構造を維持すると同時
に、十分な量の生成物を提供し得る条件が見い出されな
ければならない゛。

２つの基本的な方法が実施されている６最初の方法は、
複合体の一部となるリンカ−を用いる。

これらのリンカ−は、同種二官能性または異種５官能性
であり２例えば、基質タンパクにおけるシスティン部分
のチオール基でのジスルフィド結合を形成するもの、ま
たは９Ｎ−末端アミノ基またはりジン残基のアミノ側鎖
およびスクシンイミジルエステルのような活性化された
アシル基の間のアミド結合の形成が可能なものを包含す
る。一般的に、この方法は、リンカ−上にある非常に反
応性のある官能基を含んでおり、基質と結合するのが容
易である。しかしながら、ヒドラゾン形成が可能である
ような反応性の低い官能基を用いることは、しばしば有
効である。

二番目の方法は、２つのタンパク成分を結合させるのに
特に有効であり、カルボジイミドのような脱水剤を用い
る。この脱水剤は、例えば、複合体のひとつの構成成分
であるカルボキシル基と他の構成成分である遊離のアミ
ノ基との反応による新しいペプチド結合の形成に効果を
及ぼす。この場合、この試薬は、複合体の一部とはなら
ない。

この反応はカルボキシル基が活性化されていないため、
特に容易ではない。つまり、カルボシイ襖ドは、活性な
中間体を提供し、ペプチド結合を形成するために、水成
分を除去することによって平衡状態をシフトさせる。

結合に関するどちらの方法も一般的に水性溶媒中におい
て実施される。なぜならば、複合体を形成するタンパク
物質が容易に変性されるためである。タンパクは、水性
環境下で安定であるように設計されており、水性媒体と
かなり似ていると考えられているエタノールのような溶
媒においてさえ変性することが知られている。また、タ
ンパク複合体成分は、非水溶媒中で比較的不溶性となる
（頃向がある。

水の除去、すなわち脱水をさせる機能を用いたタンパク
間の結合の実施は、そのため、しばしば水性溶媒中で行
われる。これは実施可能ではあるが、特に容易でもなく
、また有効でもない。比較的長い反応時間が必要とされ
るため、副反応の可能性も高い。

極性非プロトン溶媒は、生成物の（有用性を損なう）変
性をもたらすことなく反応混合物中に存在し得る。とい
うことがこれまでに開示されている。例えば、　Ｍｅｗ
、　Ｄ、　　ら、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８３）
　１３０　：１４７３−１４７７、に記述されている結
合方法においては。

総容量約２．５ｄ　（このうち０．８ｄはジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）である）の１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノブロピル）−カルボジイミド・ＨＣＩ　
　（ＥＤＣＩ）を用いた最初の反応後に、ヘマトポルフ
ィリンが抗体タンパクへ結合されている。しかしながら
、出願人らは、完全な非水環境では。

いかなる量においても、結合が成功裏に実施された例は
ないことを承知している。本発明は、このような反応媒
体が１反応過程において変性を起こさせないばかりでな
く１反応速度の増加および結合の効率の増加に有利であ
ることも示している。

（発明の要旨） 保存性タンパク成分と可変性成分とを、複合化試薬で遂
行される脱水反応によって結合させる本発明の方法は、
該タンパク成分、可変性成分、および複合化試薬を、実
質的に極性非プロトン溶媒から成る媒体中で混合するこ
とを包含する。

本発明の反応混合物は、保存性タンパク成分。

可変性成分、複合化試薬、および実質的に極性非プロト
ン溶媒から成る媒体、を含有する。

本発明は、複合化試薬の存在下で非水反応媒体を用いて
、生物活性部分を、変性させることなく結合させる方法
を提供する。この非水媒体は、極性非プロトン溶媒を含
み、複合体の成分の少なくとも１つは、生物学的な機能
性タンパク、典型的には１例えば免疫グロブリンである
。他方の成分もまたタンパク、あるいは種々の有用な化
合物であり得る。

従って、ある局面では２本発明は、複合化試薬の存在下
で、生物学的な機能性物質を結合させる方法に関する。

この方法は、非水媒体中で結合を実施することによって
、高められ、改良される。

他の局面では１本発明は、少なくとも２つの結合される
べき成分と複合化試薬、および非水溶媒を含む組成物に
関する。

（発明の構成） 本発明は、ペプチド結合、エステル結合、ヒドラゾン形
成、アセタール形成、または、水の脱離を伴う縮合反応
の結果である他の特定の結合の形成によって、結合し得
る物質を複合化する方法における特定の改良に関する。

“脱水”は、タンパク成分のコンフォーメーションを維
持するために必要であると思われる水溶液中で、比較的
ゆっくりではあるが、一般的に起こり得る。

複金止抜１ 縮合は、“複合化試薬”によりて引き起こされる。複合
化試薬という用語は、ここでは次のどの試薬をも含むた
めに使用する。すなわち、少なくともその機能の一部と
して、水が脱離して化合物間に新しい共有結合を形成す
る試薬であって、その反応が、得られた複合体の２つの
所望するメンバーを結合させる試薬である。特に、“複
合化試薬”は、゛脱水剤“′と゛結合剤°°の両方を含
む。

“脱水剤”は、ここでは９次のような物質として定義す
る。すなわち、カルボジイミドのように。

それ自体は複合体の一部とはならないが、複合体の２つ
の成分間の新しい結合を形成するために水の脱離に関与
する物質である０種々の有機基と置換される一連のカル
ボジイミドが存在する。基本的なカルボジイミド構造は
、−Ｎ、Ｃ，Ｎであり、ここで各Ｎｉよ、有機基によっ
て任意に置換され得る。

この官能基は、　−ＮＩＣＯＮＨ−の構造式を有する相
当する尿素への変換によって、化学量論的に水を除去す
るように機能する。この反応の改良法に有用である典型
的なカルボジイミドは、ジエチルカルボジイミド、ジシ
クロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）。

および１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＨＤＣＩ）を包含する。

他方、“複合化試薬”は、それ自体が、生成複合体の一
部となり、最終生成物の各成分と反応し得る官能基を含
む試薬である。これらは一般に。

“リンカ−″として、あるいは商標である“二重試薬（
Ｄｏｕｂｌｅ　Ａｇｅｎｔｓ）”として知られている。

このリンカ−上に存在する種々の官能基は、適用範囲に
応じて使用され、多数のこのような“複合化試薬”は入
手可能である。概念的には、非常に簡単なもの（例えば
、ジアルデヒド２特にグルタルアルデヒド）がある。こ
れらの場合、２つの同等な官能基は、標的成分と同じよ
うに反応する。グルタルアルデヒドの場合には１例えば
２つのカルボニル基がタンパクのアミン側鎖と反応し、
イミン結合を形成する。このイミン結合は、水分子が新
しいＣ−Ｎ結合から取り除かれる場合に生じる。

他のリンカ−は１例えば活性化されたエステルおよび反
応性スルフヒドリル基を有する化合物のように、極めて
複雑である。しかしながら９本発明の範囲内で゛結合剤
”として定義されるためには、水が脱離する反応によっ
て、２つの官能基のうち少なくとも１つが、上記成分に
結合しなければならない。グルタルアルデヒドは、もち
ろん、この範晴に属する。

しかしながら、異種二官能性結合剤に関しては。

２つの官能基のうちのひとつが脱水によって反応するこ
とだけが必要である。そのため、一方の官能基が脱水を
伴わないジスルフィドのような他のタイプの結合を形成
する異種二官能性結合剤を用いた結合反応は１本発明内
に含まれる。しかしながら、他方の官能基は、“ヒドラ
ジン型”の官能基が糖タンパクのｓ鎖におけるカルボニ
ル基と反応してヒドラゾンを与えるよ・うに、水の脱離
を伴わなければならない。゛ヒドラジン型パの官能基に
よって、カルボニル基と反応するよ・うな試薬のいずれ
もが、ヒドラジン（式Ｒ−ＮＨＮ１１２の有機ヒドラジ
ン、および官能基ＮＨＣＯＮＨＮＨ□を有する有機セミ
カルバジドを含む）と同様に機能することを表す。この
ような形態の数多くのものは、当該分野に公知であって
９本発明に用いられ得る。

さらに、もちろん、結合剤は、脱水剤が行う反応によっ
て、成分の１つと結合を形成し得る。従って、結合剤は
、１種またはそれ以上の官能基として、簡単なアミンま
たはカルボキシル基を含む。

これらの官能基は、この後、水を除去するための別の試
薬（例えば、カルボジイミド）の媒介によって２ペプチ
ド成分とペプチド結合を形成するように誘導され得る。

リンカ−上のカルボニル基またはアルコール基と、相手
方である該成分のアルコールまたはカルボニル基の間の
結合も利用し得る。該結合は、脱水剤によって媒介され
、アセタールを与える。

虞立 Ａ０課１ｊぴ５会位久 本発明の方法によって形成されるすべての複合体は、そ
の工程において変性を受けてはならないタンパク、すな
わち“保存性タンパク”を包含する。“保存性′”タン
パク成分とは、変性されるか。

あるいはその機能を果たす能力を破壊するのに十分なコ
ンフォメーション変化を伴うことなく、複合体のメンバ
ーとなるタンパクを表す。

複合体の少なくとも１つの成分は、このようなタンパク
である。最も一般的には、これは免疫グロブリン、また
はその免疫学的に活性なフラグメント（例えば、　Ｆａ
ｂ、　Ｆａｂ’　またはＦ　（ａｂ）　ｚフラグメント
）である。このような免疫特異性タンパクは、所望の標
的組織に対して特異的に結合する能力、または検定シス
テムにおける特異的反応性を。

複合体に与えるのに有用である。従って２例えば腫瘍に
対して毒性を示す物質が、特殊なタイプの腫瘍組繊また
は種々のモノクローナル抗体に特異的なイムノグロブリ
ン部分に架橋する。上記特殊なタイプの腫瘍組織とはＣ
ＥＡ抗原を示す（癌腫のような）ＩＩ！瘍組織組織し、
そして、モノクローナル抗体とは、入手可能な抗乳癌モ
ノクローナル抗体を指す、このタイプの複合体を用いて
白血病の治療を行う際に有用な、リンパ組織に対して特
異的な多数のモノクローナル抗体が、一連の米国特許に
見られる：第４．３４０．５３５号；第４．３６３，７
９９号；および第４．３６１，５４９号、　Ｔｌ０１．
　ＬＩＣＩＩＴ　１　、およびＴへ１を含む多数の同様
な抗体が、入手可能である。もちろん２種々様々な抗体
（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）が、
免疫検定において有効に使用され得る。このような抗体
は３本発明の方法を用いて、蛍光標識、放射標識、また
は酵素標識のような標識化合物に結合される。

もうひとつの一般的にみられる°“保存性”タンパク成
分は、“キャリアパタンバクである。これは、所望の抗
原に免疫原性を与えるために、より小さく典型的な抗原
性ペプチド（これは、しばしば合成のペプチドである）
に結合されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）またはキ
ーホールリンペットヘモジアニン（ＫＬＨ）のような比
較的、抗原的に中性なタンパクである。例えば、中和抗
体の識別の責務を担うウィルス関連タンパク部分を推定
し、ワクチンの抗原性成分としてこのような小さな部分
を使用することに関して、かなりの努力が払われてきた
。これらのエピトープは、典型的には、その長さが８〜
工Ｏ個のアミノ酸のみであり、単独投与された場合には
、抗体の形成を刺激するには不充分である。従って、こ
れらエピトープは、抗原性を与えられるために、上述の
キャリアタンパクに結合される。同様な一般的アプロー
チは、より大きなキャリアタンパクへ結合させることに
よって、薬剤またはステロイドホルモンのようなより小
さな非ペプチド分子に免疫原性を与えるために使用され
る。

従って、上述の結合に関する例は、複合体対の１つのメ
ンバーとして、その機能を果たすために。

結合工程における変性に抵抗する必要があるタンパク物
質を包含する。抗体は、標的組織を識別する能力を保持
しなければならない；キャリアタンパクは、その抗原的
に中性な特性を破壊するコンフォーメーションを有する
ように変性されてはならない。タンパク成分が、その最
初のコンフォーメーションを実質的に保持することを必
要とするような機能を示す他の例は。一般的ではないが
。

本発明の範囲内に含まれる。上述の説明は、単に本発明
の特徴を明確にするためのものであり２本発明を制限す
ることを意図するものではない。

複合体のメンバーを形成するクンバクは、しばしば、ま
たは実際に、免疫グロブリン、または実質的な割合の糖
類部分を含む糖タンパクの場合にみられるということに
注目するべきである。このことは、糖類部分もまた。結
合に関与する官能基を従供するために使用され得ること
、そしてヒドラゾン型縮合およびアセタールを形成する
能力によって、特定の結合（この結合形成は、水の脱離
によってもたらされる）が可能であるという点で重要で
ある。

Ｂ、可変立戒溌 複合体の他方のメンバーは、ペプチドおよびポリペプチ
ドワクチン成分や上述の毒素をはじめとして、かなりの
多様性を示す。このメンバーは。

ここでは、“可変性”成分として表されている。

次のような種々の薬剤も第２のメンバーとして有用であ
るニアドリアマイシン、ヘマトポルフィリン、ステロイ
ドホルモン（例えば、アンドロステロンおよびエストラ
ジオール）、比較的単純な分子（例えば、インドメタシ
ン、ナプロキセン、ニカルドピン、ジアゼパムなど）；
ビタミン（側光ば、ビタミンＤ、ビタミンＡ）、および
ピリドキサール；あるいは、標識化合物（例えば、フル
オレセイン、ダンシル、またはＤ−ダミン類、あるいは
放射性同位元素を含む複合体）。

もちろん、可変性成分自体が、保存性タンパクとなり得
ることは明白である。実際、免疫毒性組成物中に使用さ
れている数多くの毒素は、リジン。

リシンＡ、アブリン、ゲロニン、あるいはジフテリアま
たは他のバクテリア毒素のような糖タンパクである。さ
らに、可変性成分は、酵素活性を有すると思われ、特定
の組繊の標的となり得る。また、酵素媒介免疫検定のた
めの標識にもなり得る。

このような酵素には、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲ
ン活性化体、アルコールデヒドロゲナーゼ。

ペルオキシダーゼ、カタラーゼが含まれ２種々のエステ
ラーゼは、治療および診断の両方に利用され得る。

可変性成分として作用するタンパク成分には。

次のホルモンまたは成長因子も含まれる：成長ホルモン
、腫瘍脈管形成因子２表皮成長因子、神経成長因子、お
よびコルチコトロビン放出因子、黄体ホルモン放出ホル
モンなどのようなより小さなタンパク。このようなタン
パクは、カルシトニン。

パップレシン、レニン、または心房性ペプチドのように
確実な調節能力を有する。種々の他のタンパクも使用さ
れ得る：抗ウィルス剤（α−２β−１およびγ−インタ
ーフェロンを含む）；抗菌性ペプチド；リンフ才力イン
（例えば１種々のコロニー刺激因子、インターロイキン
、およびリンパ性毒素など）。

゛°タンパク”および“ペプチド′°という言葉は。

分子の大きさが、その変性傾向に効果を及ぼすように、
ここでは独特な言葉として使用されている。

従って、　“タンパクパには、５０個より多くのアミノ
酸を有するアミノ酸配列の典型的な定義が与えられる（
糖鎖形成または他の翻訳後の修飾の有無にかかわらず）
；アミノ酸配列が５０個のアミノ酸またはそれ以下の場
合を除いて、ペプチドも同様に定義される。境界線は任
意であるが、意味は明らかである。より大きなタンパク
のエピトープ部分を構成するための典型的なペプチドは
、その長さが８〜１０個のアミノ酸であることが多いが
、はとんどの酵素は、１００個のアミノ酸またはそれ以
上の配列である。この範晴において、グループ間におけ
る“タンパク′”および“ペプチド”への分割は明らか
ではないが、はとんどのホルモンは。

５０個以上のアミノ酸を含有している。

他の可変性成分としては９次のような種々の薬理学的に
有用な薬剤があげられる：エピネフリン。

ストレプトマイシン、カナマイシンまたは他の抗生物質
；デキサメサゾンのような抗炎症剤；５−フルオロウラ
シルおよびメトＩ・レキサートのような抗腫瘍剤；およ
びジフェニルヒドラミンのような抗ヒスタミン剤。

上述のリストは９合理的な長さに関するリストであるの
で、もちろん全く不完全である。脱水反応によってタン
パク成分中の対応する官能基と共有結合し得る官能基を
含む部分、またはこのような官能基を含むように修飾さ
れ得る部分、あるいは結合剤の官能基に結合し得る部分
は２本発明の方法に用いられ得る。

（以下余白） 」ｊ」痕旧刻戊 結合反応は、非水性溶媒中で行われる。非水性溶媒は極
性非プロトン溶媒として特徴づけられる。

ジクロロメタンが使用されうる溶媒として包含されるよ
うに、極性は大きい必要はないが、炭化水素や四塩化炭
素は使用できない。このような溶媒としては２例えば、
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　。

テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　、　Ｎ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）　　；１，２−ジメトキシエタ
ン（ＤＭＢ）　　；へキサメチルリン酸トリアミド（Ｉ
ＩＭＰＡ）　　；アセトニトリル、アセトン、酢酸エチ
ル、ジメトキシエタンのようなグリム類、およびジクロ
ロメタンが含まれる。さらに、このリストは代表的なも
のを示したにすぎず、包含されるすべてを示したわけで
はない。完全に非極性ではない非プロトン溶媒であれば
いずれでもよい。両成分が溶媒に完全に溶解しているこ
とも必要ではない；ここでは２部分的な溶液、または完
全な溶液を示すために°“分散された゛または°゛分散
体゛′という用語が使用されている。

本発明の方法によれば、複合化試薬と反応の成分を非水
性溶媒に入れる。これは、一度に、または連続的にこれ
らを溶媒に混合することにより行い１反応時間は結合を
行うために必要に応じて延長される０代表的な反応時間
は特定のプロトコルに無関係に３０分以下であり２はん
の数分であり得る。反応温度は代表的には室温であるが
、特定の溶媒の場合にはこれより僅かに低い温度または
高い温度も使用し得る。試薬は代表的な反応の場合。

各成分につき１〜１０■／ｄの濃度で用いられるが。

この限度もまた絶対に決まったものでなく、実施者には
一般に理解されているように、試薬の分子量によりかな
りの変更を受けやすい。

反応を実施するためのプロトコルは、もちろん複合化試
薬の性質およびその成分の性質に基づいている。その最
も簡単な実施態様においては、成分および結合剤を非水
性溶媒存在下で単に混合し。

反応を起こし得る。しかしながら、特に、可変性成分が
変性を受けない場合には、まずその可変性成分を複合化
試薬と反応させ２次いで保存性タンバク成分を添加する
のが好ましい。次に示すものは種々提案されたプロトコ
ルである。

ある方決では、可変性成分は結合剤と混合される。該結
合剤は官能基を有しており、この官能基はカルボジイミ
ドのような脱水剤により行われる脱水により２可変性成
分と反応できる。可変性成分、結合剤、および脱水剤を
非水性溶媒中で混合し２反応が本質的に完了するまで撹
拌する。次いで１反応性チオール官能基のような脱水剤
の利点がなくても、結合剤の他の官能基と反応すること
ができるような保存性タンパク成分を添加し、結合の第
２段階が終了する。

代わりに、結合剤の官能基の１つと直接反応するような
可変性成分も使用し得る。この場合は結合剤と可変性成
分を非水溶媒中で混合させ、この」二に保存性タンパク
成分を添加する。もしリンカ−に残存している官能基が
、保存性タンパクと反応するために脱水剤の存在を必要
とするならば。

脱水剤を保存性タンパクと同時に添加するか、または、
保存性タンパクの添加に先立って、脱水剤をリンカ−と
事前に反応させておき、それから保存性タンパクを可変
性成分と結合させる。

上記プロトコルが好ましいが２反応の第１段階として保
存性タンパク成分を結合剤または脱水剤と反応すること
、および第２段階で可変性成分を添加することもこの反
応の範囲内である。もちろん可変性成分それ自身が保存
性タンパクである場合には、順序は比較的問題にならな
い。しかしながら、特定の溶媒におけるこの二種類のタ
ンパク変性に対する相対的安定性は、より都合のよいプ
ロトコルの選択を決定し得る。

好ましいプロトコルで、結合反応をするために。

二種類の成分における脱水剤の直接作用を用いて。

可変性成分を非水溶媒中でまず脱水剤と混合し。

短時間、つまり典型的には数秒から数分まで、そして最
高約１時間までインキエベートする。これは同じ溶媒で
同様の濃度にした抗体または他の保存性タンパク調製物
を添加する前に行う。

反応は、ヘリウムまたは窒素（窒素の方が便利であり好
ましい）のような不活性雰囲気下で行われるのが好まし
いが、これもまた絶対に必要なものではない。

このように、ある代表的なプロトコルでは、可変性成分
と脱水剤各々５■を含有するＤＭＳＯ分散体２　ｍｌを
調製し、窒素下、室温で３０分間撹拌する。

これに免疫グロブリン２■を含有する２ｄのＤＭＳＯ分
散体を加え、得られた混合物をさらに１０分間撹拌する
。次いでこの混合物は、モノエタノールアミン５０μ！
を含有する５倍容のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　
、　ｐＨ７，４の添加によるＰＢＳでの希釈によって調
製される。そして２次いでこれをＰＢＳに対して透析し
、このＰＢＳは３回とりかえて洗浄した。

他の方法では、可変性成分、結合剤、および脱水剤の各
５■を含有する分散体２！Ｒ１を調製し、窒素下、室温
で約１５分間撹拌する。次いでこれに。

キャリアタンパク約２１１１ｇを含有する２滅のテトラ
ヒドロフラン分散体を加え、得られた混合物をさらに１
０分間撹拌した。その後、この混合物を上記と同様に調
製した。

実Ｊ１外 以下の実施例は説明を目的としだものあるが。

本発明を制限するものではない。

ＣＡＭＡＬ−１抗体は、大部分の急性非リンパ球性白血
病患者の細胞に現れる。白血病関連抗原に対し特異的な
抗体である。ＣＡＭＡＬ−１は、　Ｓｈｉｐｍａｎ＋　
Ｒ８ら、　Ｂｒ１ｔ　Ｊ　Ｃｎｅｅｒ　（１９８３）４
７　：　８４９〜８５３による記述に従って調製された
。モノクローナル抗体を示す。ヘマトポルフィリンは広
く知られた物質であり、この物質とこの物質の間車な誘
導体（ＨＰＤ）は。

癌やある種の皮膚疾患に対する光化学的な間接治療に用
いられ、有用性を全厚するので、かなり注目されている
（参照例、　ＤｏｕｇｈｅｒＬｙ、　Ｔ、Ｊ、ら、ムＩ
ｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ（１９８１）７７　：　
１２２〜１２４　　；　Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ。

Ｔ、Ｊ、　　ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　（１９７８
）　３８　：　２６２８−２６３５　　；Ｄｏｕｇｈｅ
ｒｔｙ、　Ｔ、　Ｊ、ら、　Ｊ　Ｎａｔ’ｌ　Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｉｎ５ｔ　（１９７９）熊：　２３１−２３７）
。下記のプロトコルでＣＡＭＡＬ−１抗体およびヘマト
ポルフィリン（Ｈｐ）は、上記の結合剤ＨＤ（、Ｉを使
用して結合される。

Ａ、スペクトル用ＤＭＳＯ２１ｎｊ！に、ヘマトポルフ
ィリン５■およびＨＤＣＩ　５■を分散させ、窒素下、
室温テ３０分間撹拌した。次イテ、　ＤＭＳＯ２ｄニＣ
ＡＭＡＬ−１凍結乾燥品５■を含有するような調製品を
添加し。

得られた混合物を室温で１分間撹拌する。次いで５０μ
ｌのモノエタノールアミンを含有する５倍容のＰＢＳで
希釈し、　ＰＢＳに対して透析し、透析溶媒を３回換え
る。得られた結合化合物を透析物から回収し、　ｌｉｐ
／ＣＡＭＡＬ〜１の化学量論について分析を行った。結
合化合物は２８０μｇ　ｔｉｐ／ａｉｇ　ＣＡＭＡＬ−
Ｉヲ８有することが判明した。

Ｂ、上記Ａ項のプロトコルを、　ＣＡＭＡＬ−１添加後
の最終混合物を５分または１０分間撹拌するという点を
除いて反復した。その他の点では、操作方法は同じであ
った。このように反応時間を長くすると、各々１１０（
ｂｚ　ｇ　ｌｉｐ／［ＣＡＭＡＬ−１および１２００ｕ
ｇＨｐ／ａｇＣＡＭＡＬ−１という化学量論値が得られ
た。

１施±１ ヘマトポルフィリンと［すλＬ４べ久点匁粘−金へマド
ポルフィリン４■およびＥＤＣＩ４１ｇを、２ｍ２のス
ペクトル用ＤＭＳＯ中にとり、窒素下、室温で３０分間
撹拌した。凍結乾燥したビーナツツ凝集素（ＰＮＡ）２
．５■をＤＭＳＯＬ−に含有するものをこの混合物に加
え、この混合物をさらに２分間撹拌した。

この混合物をＰＢＳ中にとり、実施例１と同様透析した
結果、１ｍｇＰＮＡあたり５０μｇのヘマトポルフィリ
ンが得られた。

Ｂ、Ｂｌ剋 ヘマトポルフィリン１１■およびＥＤＣＩ　１１■をス
ペクトル用ＤＭＳＯ４ｄ中にとり、窒素下、室温で３０
分間撹拌したのち、　Ｍａｉｅｒ、　Ｔ、ら、ＪＩ■ｕ
ｎＯＩ（１９８３）　１３１　　：１８４３による記述
に従って調製した。

凍結乾燥した８１６Ｇ抗体２０■をＤＭＳｏ　２　ｄに
加えたものを、上記混合物に添加する。得られた混合物
を室温で４０秒間撹拌し、上記の如く調製する。得られ
た生成物は３７５μｇ　Ｈｐ／■Ｂ１６Ｇを含有してい
た。

Ｃ０Ｒ−ａ二基側 ＨＤＣＩ　４００μｇおよびヘマトポルフィリン４００
ｕｇをＤＭＳＯｌ　ｍ中にとり、上記と同様に窒素下、
室温で３０分間撹拌したのち、　Ｍｅｗ、　Ｄ、　ら、
　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８３）　１４７３〜１４７
７による記述に従って調製された凍結乾燥Ｒ−ａ　Ｍ１
ｇ抗体８０（ｂｚｇをＤＭｓｏＩＩＩｊ１ニ加えたもの
を、上記混合物に添加する。得られた混合物を３０秒間
撹拌し、上記の如く調製して、　　２００Ｈｐ／■μｇ
Ｒ−αＭＩｇを含有する生成物を得た。

Ａ、遊離カルボキシル基１個を含有するホウ素かご状化
合物： ｒ この化合物４■を、ＨＤＣＩ８■およびＤＮＳｏ　２　
ｄと混合し、上記のように窒素下、室温で３０分間撹拌
しながらインキュベートした。この混合物に、　ＤＭＳ
ｏ２戚に凍結乾燥したＣＡＭＡＬ−１１Ｑｍｇを加えた
ものを添加し、得られた混合物を種々の時間で撹拌し。

調製用試料を採り、上記と同様に分析した。これは、透
析溶媒を４回換えて使用したことを除いては、上記と同
様である。しかしながら、ホウ素かご状化合物は不安定
であることが判明した。

Ｂ。遊離カルボキシル基を有する三環式化合物；この化
合物の試料１５■を、　　ＨＤＣＩ　１５■とどもにス
ペクトル用ＤＮＳ０２　ｍに混合し、窒素下、室温で３
０分間撹拌した。ＤＭＳＯ２ｄに、　　ＢＳＡまたはＫ
ＬＨのいずれかを１３ｍｇ加えたものをこの混合物に添
加し。

反応混合物を前記のように調製した。

Ｃ０同様の操作を、ＨＤＣＩ５ｍｇおよびＤＭＳＯ２ｄ
にＢＳＡまたはＫＬＨ５■を加えたものとともに、　Ｃ
ＣＫペプチド５ｍｇを使用して実施した。

Ｄ、５０μキユリーの１４Ｃ標識コハク酸（７■）とＨ
ＤＣＩ　７■をＤＭＳＯ２ＩＲ１中に混合し、上記の如
くインキュベートした。次いで。ＤＭＳＯ２ｄにＢＳＡ
　１０μｇを加えたものを補充した。得られた混合物を
種々の時間で撹拌し１反応生成物を調製して上記のよう
に化学量論を試験した。結果レヨ次のような種々の量の
コハク酸／ｍｇＢＳＡを示したニー轄面工分１　　　　
　　ｚ土五ユニ／亙７．５　　　　　　　　　６６ ２４時間　　　　　　　　５２ Ｅ、同様の操作を、可変性成分として３−ブロモ−４−
メチル安息香酸および２−ブロモフェニル酢酸を用いて
実施した。

Ｆ、凍結乾燥したＲ−αＭＩｇ３■とアルカリフォスフ
ァターゼ１５０μｇとを、　ＨＤＣＩ３ｍｇの存在下。

Ｄ　Ｍ　Ｓ　０２　ｍｌ中で反応させた。反応を１分間
継続させ。

次いで０．１１Ｍアジ化ナトリウムを含有するトリス−
塩酸緩衝液で中和した。ＢＳＡに対する透析により上記
と同様の調製を行い、透析物を凍結乾燥して結合物を回
収した。アルカリフォスファターゼが凍結乾燥に対して
不安定のため、化学量論値は測定できなかった。

（発明の要約） 変性に対して抵抗しなければならないタンパクを、カル
ボジイミド縮合剤を用いることによって可変成分と結合
させる方法における改良点は、縮合媒体として極性非プ
ロトン溶媒を用いることである。このような改良により
１反応時間が短縮され、結合効率が向上する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、保存性タンパク成分と可変性成分とを、複合化試薬
   で遂行される脱水反応によって結合させる方法であって
   、 該タンパク成分、可変性成分、および複合化試薬を、実
   質的に極性非プロトン溶媒から成る媒体中で混合するこ
   とを包含する方法。 ２、前記複合化試薬が、脱水剤および結合試薬から選択
   される、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記脱水剤がカルボジイミドである、特許請求の範
   囲第２項に記載の方法。 ４、前記結合試薬が、同種二官能性リンカーおよび異種
   二官能リンカーから選択される、特許請求の範囲第２項
   に記載の方法。 ５、前記結合試薬が、ヒドラジン型官能基、ジスルフィ
   ド形成基、およびアルデヒドから選択された官能基を有
   する、特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、前記タンパク成分が、免疫グロブリン、またはその
   免疫学的反応性フラグメント、あるいはキャリアタンパ
   クである、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７、前記可変性成分が、標識および生物活性成分から選
   択される、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ８、前記溶媒がＤＭＳＯである、特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ９、前記複合化試薬と可変性成分とを、前記溶媒の一部
   の中で混合、撹拌し、次いで追加の溶媒にタンパク成分
   を添加することにより遂行される、特許請求の範囲第１
   項または第８項に記載の方法。 １０、保存性タンパク成分、可変性成分、複合化試薬、
   および実質的に極性非プロトン溶媒から成る媒体、を含
   有する反応混合物。 １１、前記溶媒がＤＭＳＯである、特許請求の範囲第１
   ０項に記載の反応混合物。