JPS63254994A - Ｎ置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法 - Google Patents
Ｎ置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法Info
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- JPS63254994A JPS63254994A JP62091289A JP9128987A JPS63254994A JP S63254994 A JPS63254994 A JP S63254994A JP 62091289 A JP62091289 A JP 62091289A JP 9128987 A JP9128987 A JP 9128987A JP S63254994 A JPS63254994 A JP S63254994A
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- alkyl ester
- ester
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野〕
本発明はＮ置換ロイシンエンケファリンアミド、すなわ
ちＮ置換チロシル−グリシル−グリシル−フェニルアラ
ニル−ロイシンアミド（以下、Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｎｌ（２と略記する）の製造方
法に関するものである。更に詳しくは、水に可溶な有機
溶媒を含む水性媒体中でＮ置換チロシン低級アルキルエ
ステル（以下、Ｘ−Ｔｙｒ−ＯＹとする）にグリシンイ
氏級アルキルエステル い）、フェニルアラニン低級アルキルエステル（以下Ｐ
ｈｅ−ＯＹ３とする）、及びロイシンアミド（以下Ｌｅ
ｕ−ＮＨ２とする）を蛋白分解酵素によって順次反応さ
せてペプチド伸長反応を行うことを特徴とするＮ置換ロ
イシンエンケファリンアミドの製造方法に関する。
ちＮ置換チロシル−グリシル−グリシル−フェニルアラ
ニル−ロイシンアミド（以下、Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｎｌ（２と略記する）の製造方
法に関するものである。更に詳しくは、水に可溶な有機
溶媒を含む水性媒体中でＮ置換チロシン低級アルキルエ
ステル（以下、Ｘ−Ｔｙｒ−ＯＹとする）にグリシンイ
氏級アルキルエステル い）、フェニルアラニン低級アルキルエステル（以下Ｐ
ｈｅ−ＯＹ３とする）、及びロイシンアミド（以下Ｌｅ
ｕ−ＮＨ２とする）を蛋白分解酵素によって順次反応さ
せてペプチド伸長反応を行うことを特徴とするＮ置換ロ
イシンエンケファリンアミドの製造方法に関する。
Ｎ置換ロイシンエンケファリンアミドは、そのＮ置換基
及びＣ末端のアミノ基を適当な方法で除去することによ
ってロイシンエンケファリンに変換される。ロイシンエ
ンケファリンはモルフイネ様麻酔作用を示し、薬理活性
はモルフイネと同等かそれ以上といわれている。
及びＣ末端のアミノ基を適当な方法で除去することによ
ってロイシンエンケファリンに変換される。ロイシンエ
ンケファリンはモルフイネ様麻酔作用を示し、薬理活性
はモルフイネと同等かそれ以上といわれている。
［従来の技術］
ペプチド合成の方法に関しては、従来より種々の方法が
提案されているが、その多くは、いわゆる化学法による
ものである。化学的にペプチド結合を形成する方法では
、使用する縮合試薬との反応や脱保護基工程において、
アミノ酸がラセミ化する場合があり、一般的に注意深い
反応設計が要求される。また、アミノ酸の側鎖の水酸基
、縮合させないカルボキシル基またはアミノ基は縮合に
先立って、適当な保護基を導入しておく必要がある。ま
た、固相法と称せられる化学法の一種が知られている。
提案されているが、その多くは、いわゆる化学法による
ものである。化学的にペプチド結合を形成する方法では
、使用する縮合試薬との反応や脱保護基工程において、
アミノ酸がラセミ化する場合があり、一般的に注意深い
反応設計が要求される。また、アミノ酸の側鎖の水酸基
、縮合させないカルボキシル基またはアミノ基は縮合に
先立って、適当な保護基を導入しておく必要がある。ま
た、固相法と称せられる化学法の一種が知られている。
この方法は、中間体の精製を簡略化できるという長所を
もつが、比較的少量のペプチド合成に限定され、工業的
規模での合計法としては不向きである。
もつが、比較的少量のペプチド合成に限定され、工業的
規模での合計法としては不向きである。
これに対し、近年、酵素的にペプチド合成を行う方法が
注目されている。パパインやキモトリプシンの様な蛋白
分解酵素（以下プロテアーゼと称する）が、逆反応であ
るペプチド結合の生成反応に関与し得ることは古くから
知られている。フルトン（Ｆｒｕｔｏｎ）はアミノ基を
ベンゾイル基等で保護したロイシン等のモノアミノカル
ボン酸とカルボキシル基をアミド又はアニリドとして保
護したロイシンあるいはグリシンとを、パパイン又はキ
モトリプシンを用いてペプチド結合させ得ることを明ら
かにしている（”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔａ
ｉｎ Ｃｈｅ＋ｎｉｓｔｒｙ″″，第５巻、３３ページ
（１９４９）、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｉｎ
ｃ， ＮｅｗＹｏｒｋ） 、また、キモトリプシンの場
合は、そのエステラーゼ活性の示適条件で、＾ｃーＴｙ
ｒーＯＥｔ等のＮ置換アミノ酸アルキルエステルとロイ
シンアミドとをペプチド結合させることが可能であるこ
とが森原（Ｍｏｒｉｈａｒａ）等によって明らかにされ
ている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第１６３巻、５３１ベー
ジ、 （１９７７））。
注目されている。パパインやキモトリプシンの様な蛋白
分解酵素（以下プロテアーゼと称する）が、逆反応であ
るペプチド結合の生成反応に関与し得ることは古くから
知られている。フルトン（Ｆｒｕｔｏｎ）はアミノ基を
ベンゾイル基等で保護したロイシン等のモノアミノカル
ボン酸とカルボキシル基をアミド又はアニリドとして保
護したロイシンあるいはグリシンとを、パパイン又はキ
モトリプシンを用いてペプチド結合させ得ることを明ら
かにしている（”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔａ
ｉｎ Ｃｈｅ＋ｎｉｓｔｒｙ″″，第５巻、３３ページ
（１９４９）、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｉｎ
ｃ， ＮｅｗＹｏｒｋ） 、また、キモトリプシンの場
合は、そのエステラーゼ活性の示適条件で、＾ｃーＴｙ
ｒーＯＥｔ等のＮ置換アミノ酸アルキルエステルとロイ
シンアミドとをペプチド結合させることが可能であるこ
とが森原（Ｍｏｒｉｈａｒａ）等によって明らかにされ
ている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第１６３巻、５３１ベー
ジ、 （１９７７））。
これ等の公知の事実を組み合わせて改良することによっ
てエンケファリンを酵素的に合成する方法が知られてい
る。クルマン（にｕｌｌｍａｎｎ）らは、パパイン及び
キモトリプシンを用いてｔ−ブトキシカルボニル−し−
チロシル−グリシルフェニルヒドラジッド（Ｂｏｃ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−ＮｔｌＮＨＰｈ）とｔ−ブトキシカルボ
ニル−グリシル−し−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン
フェニルヒドラジッド（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅ
ｕ−ＮＨＮＨＰｈ）をひとまず合成し、前者の脱Ｎ２Ｎ
ＨＰｈと後者の脱Ｂｏｃを行った後、両者をパパインを
用いて縮合させロイシンエンケファリンを得ている（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ 。
てエンケファリンを酵素的に合成する方法が知られてい
る。クルマン（にｕｌｌｍａｎｎ）らは、パパイン及び
キモトリプシンを用いてｔ−ブトキシカルボニル−し−
チロシル−グリシルフェニルヒドラジッド（Ｂｏｃ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−ＮｔｌＮＨＰｈ）とｔ−ブトキシカルボ
ニル−グリシル−し−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン
フェニルヒドラジッド（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅ
ｕ−ＮＨＮＨＰｈ）をひとまず合成し、前者の脱Ｎ２Ｎ
ＨＰｈと後者の脱Ｂｏｃを行った後、両者をパパインを
用いて縮合させロイシンエンケファリンを得ている（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ 。
Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍ．、第９１（２）
巻．６９３ページ、 （１９７９））。
巻．６９３ページ、 （１９７９））。
またヨハンセン（Ｊｏｈａｎｓｅｎ）等は、エキソプロ
テアーゼの１種であるカルボキシペプチダーゼ−Ｙによ
り、Ｎ端から順番に１アミノ酸ずつ伸長していき、メチ
オニンエンケファリンを得る方法を報告している（Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ １９８０。
テアーゼの１種であるカルボキシペプチダーゼ−Ｙによ
り、Ｎ端から順番に１アミノ酸ずつ伸長していき、メチ
オニンエンケファリンを得る方法を報告している（Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ １９８０。
Ｓｃｒｉｐｔｏｒ． Ｋｏｐｅｎｈａｇｅｎ． ４６ペ
ージ、 （１９８１））。
ージ、 （１９８１））。
［発明が解決しようとする問題点コ
一般にプロテアーゼを用いたペプチド合成であっても、
縮合させないアミノ基およびカルボキシル基には保護基
が要求される。タルマン（にｕｌｌｍａｎｎ）等の行っ
た方法では、パパインによる加水分解の逆反応を利用す
るため、１度保護したアミノ基およびカルボキシル基が
次段階で縮合に関与する場合は、その保護基をはずさね
ばならない。また生成物の溶解度を下げ、パパインによ
る加水分解を防ぐためにあらかじめチロシンの側鎖へ保
護基を導入しておかねばならないが、最終的にはこの保
護基もはずさねばならない。このように脱保護基工程が
避けられず、合成プロセスが複雑になるばかりか、脱保
護基のために使用される過激な試薬によりラセミ化がお
こったり、選択的な脱保護基が難しいという問題点があ
った。
縮合させないアミノ基およびカルボキシル基には保護基
が要求される。タルマン（にｕｌｌｍａｎｎ）等の行っ
た方法では、パパインによる加水分解の逆反応を利用す
るため、１度保護したアミノ基およびカルボキシル基が
次段階で縮合に関与する場合は、その保護基をはずさね
ばならない。また生成物の溶解度を下げ、パパインによ
る加水分解を防ぐためにあらかじめチロシンの側鎖へ保
護基を導入しておかねばならないが、最終的にはこの保
護基もはずさねばならない。このように脱保護基工程が
避けられず、合成プロセスが複雑になるばかりか、脱保
護基のために使用される過激な試薬によりラセミ化がお
こったり、選択的な脱保護基が難しいという問題点があ
った。
またジョハンセン（Ｊｏｈａｎｓｅｎ）等が行った方法
ではプロテアーゼとしてカルボキシペプチダーゼ−Ｙを
用いているが、その広い基質特異性のため、副反応がお
きやすく、反応制御が困難であった。さらにカルボキシ
ペプチダーゼ−Ｙは゛ 人手が容易でないとともに高価
であるので、工業的な観点からは必ずしも満足し得るも
のではなかった。
ではプロテアーゼとしてカルボキシペプチダーゼ−Ｙを
用いているが、その広い基質特異性のため、副反応がお
きやすく、反応制御が困難であった。さらにカルボキシ
ペプチダーゼ−Ｙは゛ 人手が容易でないとともに高価
であるので、工業的な観点からは必ずしも満足し得るも
のではなかった。
［問題点を解決するための手段および作用コかかる現状
に鑑み、本発明者等は、上記の如き問題のない、汎用的
なプロテアーゼを用いた、より単純な合成方法を確立す
べく鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達した。すなわ
ち本発明は、 水に可溶な有機溶媒を含む水性媒体中で、Ａ：セリンプ
ロテアーゼの存在下、Ｎ置換チロシン低級アルキルエス
テルとグリシン低級アルキルエステルを反応させる工程
、 Ｂ：チオールプロテアーゼの存在下、Ａ工程の生成物に
グリシン低級アルキルエステルを反応させ、続いてフェ
ニルアラニン低級アルキルエステルを反応させる工程、 Ｃ：セリンプロテアーゼの存在下、Ｂ工程の生成物にロ
イシンアミドを反応させる工程、の以上ＡないしＣの工
程によりペプチド伸長させてＮ置換ロイシンエンケファ
リンアミドを製造することを特徴とする方法である。
に鑑み、本発明者等は、上記の如き問題のない、汎用的
なプロテアーゼを用いた、より単純な合成方法を確立す
べく鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達した。すなわ
ち本発明は、 水に可溶な有機溶媒を含む水性媒体中で、Ａ：セリンプ
ロテアーゼの存在下、Ｎ置換チロシン低級アルキルエス
テルとグリシン低級アルキルエステルを反応させる工程
、 Ｂ：チオールプロテアーゼの存在下、Ａ工程の生成物に
グリシン低級アルキルエステルを反応させ、続いてフェ
ニルアラニン低級アルキルエステルを反応させる工程、 Ｃ：セリンプロテアーゼの存在下、Ｂ工程の生成物にロ
イシンアミドを反応させる工程、の以上ＡないしＣの工
程によりペプチド伸長させてＮ置換ロイシンエンケファ
リンアミドを製造することを特徴とする方法である。
本発明で用いられるプロテアーゼは、その基質特異性を
考慮することによって選択されるが、チロシンとグリシ
ンとのペプチド結合、及びフェニルアラニンとロイシン
とのペプチド結合の形成に対してはセリンプロテアーゼ
が、またグリシンとグリシンとのペプチド結合、及びグ
リシンとフェニルアラニンとのペプチド結合の形成に対
してはチオールプロテアーゼが使用される。その中でも
セリンプロテアーゼとしてはα−キモトリプシンを、チ
オールプロテアーゼとしてはパパインを使用するのが好
ましい。
考慮することによって選択されるが、チロシンとグリシ
ンとのペプチド結合、及びフェニルアラニンとロイシン
とのペプチド結合の形成に対してはセリンプロテアーゼ
が、またグリシンとグリシンとのペプチド結合、及びグ
リシンとフェニルアラニンとのペプチド結合の形成に対
してはチオールプロテアーゼが使用される。その中でも
セリンプロテアーゼとしてはα−キモトリプシンを、チ
オールプロテアーゼとしてはパパインを使用するのが好
ましい。
本発明では、ペプチド結合の形成にα−キモトリプシン
及びパパインのエステラーゼ活性を利用しているため、
ペプチド結合させようとするＣ末端の保護基であるエス
テル基の除去反応を行うことなく、ペプチド合成を行う
ことができる。
及びパパインのエステラーゼ活性を利用しているため、
ペプチド結合させようとするＣ末端の保護基であるエス
テル基の除去反応を行うことなく、ペプチド合成を行う
ことができる。
これらの酵素の使用濃度は限定的ではないが、使用濃度
が高ければ反応が短時間で完了する。しかし、極端に高
い酵素濃度は酵素の自己消化を招く傾向がある。一般的
には、０．２から０．３ｍＭ程度で充分であり、好まし
くはパパイン及びα−キモトリプシンのいずれについて
も０．２４ｍＭである。
が高ければ反応が短時間で完了する。しかし、極端に高
い酵素濃度は酵素の自己消化を招く傾向がある。一般的
には、０．２から０．３ｍＭ程度で充分であり、好まし
くはパパイン及びα−キモトリプシンのいずれについて
も０．２４ｍＭである。
本発明の方法の出発物質Ｎｆｉ換チロシン低級アルキル
エステル（Ｘ−Ｔｙｒ−ＯＹ）の使用濃度は、溶媒に対
してその溶解度以内の濃度で使用されることと共に、各
中間体すなわちＮ置換チロシルグリシン低級アルキルエ
ステル（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＹ＋）、Ｎ置換チロシ
ルグリシルグリシン低級アルキルエステル（Ｘ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＹ２） 、及びＮ置換チロシルグ
リシルグリシルフェニルアラニン低級アルキルエステル
（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＹ３）の溶
解度及び収率を考慮して決定する必要がある。一般的に
は、０．０５Ｍ〜０．１Ｍが便利である。
エステル（Ｘ−Ｔｙｒ−ＯＹ）の使用濃度は、溶媒に対
してその溶解度以内の濃度で使用されることと共に、各
中間体すなわちＮ置換チロシルグリシン低級アルキルエ
ステル（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＹ＋）、Ｎ置換チロシ
ルグリシルグリシン低級アルキルエステル（Ｘ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＹ２） 、及びＮ置換チロシルグ
リシルグリシルフェニルアラニン低級アルキルエステル
（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＹ３）の溶
解度及び収率を考慮して決定する必要がある。一般的に
は、０．０５Ｍ〜０．１Ｍが便利である。
使用される各基質の濃度はプロテアーゼによって異なり
、パパインを用いる場合はグリシン低級アルキルエステ
ル及びフェニルアラニン低級アルキルエステルの使用１
１度は、生成したＮ置換チロシルグリシン低級アルキル
エステル（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＹ＋）及びＮ置換チ
ロシルグリシルグリシン低級アルキルエステル（Ｘ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＹ２）のそれぞれの濃度の１
０倍量に維持するのが好ましい。このことがペプチド合
成にパパインのエステラーゼ活性を利用する際、重要で
ある。一方、α−キモトリプシンを用いる場合のグリシ
ン低級アルキルエステル及びロイシンアミドの使用濃度
は、使用する溶媒のその溶解度内に設定する以外にはと
りわけ大きな限定はないが、出発物質であるＮ置換チロ
シン低級アルキルエステル（Ｘ−Ｔｙｒ−ＯＹ）及び生
成したＮ置換チロシルグリシルグリシルフェニルアラニ
ン低級アルキルエステル（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−ＯＹｓ）のそれぞれの２倍に設定するのが便
利である。
、パパインを用いる場合はグリシン低級アルキルエステ
ル及びフェニルアラニン低級アルキルエステルの使用１
１度は、生成したＮ置換チロシルグリシン低級アルキル
エステル（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＹ＋）及びＮ置換チ
ロシルグリシルグリシン低級アルキルエステル（Ｘ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＹ２）のそれぞれの濃度の１
０倍量に維持するのが好ましい。このことがペプチド合
成にパパインのエステラーゼ活性を利用する際、重要で
ある。一方、α−キモトリプシンを用いる場合のグリシ
ン低級アルキルエステル及びロイシンアミドの使用濃度
は、使用する溶媒のその溶解度内に設定する以外にはと
りわけ大きな限定はないが、出発物質であるＮ置換チロ
シン低級アルキルエステル（Ｘ−Ｔｙｒ−ＯＹ）及び生
成したＮ置換チロシルグリシルグリシルフェニルアラニ
ン低級アルキルエステル（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−ＯＹｓ）のそれぞれの２倍に設定するのが便
利である。
本発明で使用するプロテアーゼがエステラーゼ活性を示
すｐＨ範囲は、個々のプロテアーゼによって異なるが、
α−キモトリプシンではｐＨ９からｐＨ１１であって、
ｐ）１１０が好ましい。またパパインではｐＨ５からｐ
Ｈ７であって、ｐ）ＩＳが最も望ましい。第１図は、Ｎ
−ベンゾイルチロシルグリシンメチルエステル（Ｂｚ−
Ｔｙｒ−Ｇよｙ−ＯＭｅ）とグリシンメチルエステル（
ＧＩｙ−ＯＭｅ） とのパパインによる反応における
各ｐｌ（での反応液の組成を、高速液体クロマトグラフ
ィーで調べたものである。ｐＨ６にて、目的物ベンゾイ
ルチロシルグリシルグリシンメチルエステル（Ｂｚ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ）が高収率で生成してい
ることがわかる。
すｐＨ範囲は、個々のプロテアーゼによって異なるが、
α−キモトリプシンではｐＨ９からｐＨ１１であって、
ｐ）１１０が好ましい。またパパインではｐＨ５からｐ
Ｈ７であって、ｐ）ＩＳが最も望ましい。第１図は、Ｎ
−ベンゾイルチロシルグリシンメチルエステル（Ｂｚ−
Ｔｙｒ−Ｇよｙ−ＯＭｅ）とグリシンメチルエステル（
ＧＩｙ−ＯＭｅ） とのパパインによる反応における
各ｐｌ（での反応液の組成を、高速液体クロマトグラフ
ィーで調べたものである。ｐＨ６にて、目的物ベンゾイ
ルチロシルグリシルグリシンメチルエステル（Ｂｚ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ）が高収率で生成してい
ることがわかる。
本発明の水に可溶な有機溶媒としては、ジメチルホルム
アミド、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジ
メチルスルホオキシド、グリセリン、及びエチレングリ
コール等が使用できるが、ジメチルホルムアミドが最も
望ましい。本発明で使用される水性媒体は、これらの有
機溶媒を適当な混合比で含み、そのｐｌ＋を調整した水
溶液である。
アミド、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジ
メチルスルホオキシド、グリセリン、及びエチレングリ
コール等が使用できるが、ジメチルホルムアミドが最も
望ましい。本発明で使用される水性媒体は、これらの有
機溶媒を適当な混合比で含み、そのｐｌ＋を調整した水
溶液である。
水性媒体の有機溶媒と水との混合比は、使用される基質
及び生成物の溶解度及び酵素活性を維持する観点から限
定を受けるが、有機溶媒は４０％から８０％が好ましく
パパイン及びα−キモトリプシンを使用する場合は５０
％が最も望ましい。このように有機溶媒と水との混合比
はパパインのエステラーゼ活性を利用するうえで、大き
な影響を与えるものである。
及び生成物の溶解度及び酵素活性を維持する観点から限
定を受けるが、有機溶媒は４０％から８０％が好ましく
パパイン及びα−キモトリプシンを使用する場合は５０
％が最も望ましい。このように有機溶媒と水との混合比
はパパインのエステラーゼ活性を利用するうえで、大き
な影響を与えるものである。
第２図は、（Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ）と（Ｇｌ
ｙ−ＯＭｅ）とのパパインによる反応において、後者を
前者の濃度の２倍でＤＭＦ ４０％の水溶液中で反応さ
せた場合及び１０倍でＤＭＦ ５０％水溶液中で反応さ
せた場合の目的物Ｎ−ベンゾイルチロシルグリシルグリ
シンメチルエステル（Ｂｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
ＯＭｅ）の生成速度を図示したものである。１０倍量Ｄ
ＭＦ５０％水溶液中で反応させた場合は、３時間で７０
％の収率で目的物（Ｂｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｍｅ）が生成する。
ｙ−ＯＭｅ）とのパパインによる反応において、後者を
前者の濃度の２倍でＤＭＦ ４０％の水溶液中で反応さ
せた場合及び１０倍でＤＭＦ ５０％水溶液中で反応さ
せた場合の目的物Ｎ−ベンゾイルチロシルグリシルグリ
シンメチルエステル（Ｂｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
ＯＭｅ）の生成速度を図示したものである。１０倍量Ｄ
ＭＦ５０％水溶液中で反応させた場合は、３時間で７０
％の収率で目的物（Ｂｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｍｅ）が生成する。
反応温度は酵素活性を維持する観点から好ましくは２０
℃から４０℃で行うものである。
℃から４０℃で行うものである。
反応時間は反応温度及び酵素の使用量によって変わるの
で一義的には限定できないが、α−キモトリプシンによ
る（Ｘ−Ｔｙｒ−ＯＹ）＋（Ｇｌｙ−ＯＹ＋）、及び（
Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＹｓ） ＋
（Ｌｅｕ−ＮＨ２）の反応では１分から１時間、パパイ
ンによる（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＹ＋）＋ （Ｇｌｙ
−ＯＹ２）、及び（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＹ
２） ” （Ｐｈｅ−ＯＹ３）の反応では３時間から５
時間が望ましい。
で一義的には限定できないが、α−キモトリプシンによ
る（Ｘ−Ｔｙｒ−ＯＹ）＋（Ｇｌｙ−ＯＹ＋）、及び（
Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＹｓ） ＋
（Ｌｅｕ−ＮＨ２）の反応では１分から１時間、パパイ
ンによる（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＹ＋）＋ （Ｇｌｙ
−ＯＹ２）、及び（Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＹ
２） ” （Ｐｈｅ−ＯＹ３）の反応では３時間から５
時間が望ましい。
以上のような条件下でα−キモトリプシンによフてまず
Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌ ｙ−ＯＹ 、を合成する。続いて
パパインによってＧｔｙ−ｏｙ２を反応させるが、残留
するα−キモトリプシンはあらかじめＩＪＦＩＩ莫を用
いた限外−過等によって除去しておく。α−キモトリプ
シンとパパインが混在すると、パパインの加水分解酵素
としての働きによりα−キモトリプシンが分解され、不
純物の原因となるからである。初段の反応すなわちＸ−
Ｔｙｒ−ＯＹとＧｕｙ−ＯＹ、とのα−キモトリプシン
による反応においてあらかじめＧｌｙ−０’ｈを添加し
ておき、第２段の反応時にＧｔｙ−ｏｙ２の添加を省略
することも可能である。このようにしてＸ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＹ、を合成した後、Ｐｈｅ−ＯＹ、を
添加し、Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＹｓ
を得る。次にα−キモトリプシンによってＬｅｕ−Ｎ）
Ｉ２を反応させるが、先程と同様、あらかじめＯＦ膜を
用いた限外？Ｆ Ａ等によってパパインを除去しておく
。最終生成物Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌ／−Ｇ１ｙ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｎ）Ｉ２は反応液から抽出、精製等常法の処理に
より得られる。また中間体のＸ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−ＯＹ３はそれが生成したところで反応液へ
当量以上の水を添加することによフて不溶化し、析出す
るのでその段階で粗精製することもできる。
Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌ ｙ−ＯＹ 、を合成する。続いて
パパインによってＧｔｙ−ｏｙ２を反応させるが、残留
するα−キモトリプシンはあらかじめＩＪＦＩＩ莫を用
いた限外−過等によって除去しておく。α−キモトリプ
シンとパパインが混在すると、パパインの加水分解酵素
としての働きによりα−キモトリプシンが分解され、不
純物の原因となるからである。初段の反応すなわちＸ−
Ｔｙｒ−ＯＹとＧｕｙ−ＯＹ、とのα−キモトリプシン
による反応においてあらかじめＧｌｙ−０’ｈを添加し
ておき、第２段の反応時にＧｔｙ−ｏｙ２の添加を省略
することも可能である。このようにしてＸ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＹ、を合成した後、Ｐｈｅ−ＯＹ、を
添加し、Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＹｓ
を得る。次にα−キモトリプシンによってＬｅｕ−Ｎ）
Ｉ２を反応させるが、先程と同様、あらかじめＯＦ膜を
用いた限外？Ｆ Ａ等によってパパインを除去しておく
。最終生成物Ｘ−Ｔｙｒ−Ｇｌ／−Ｇ１ｙ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｎ）Ｉ２は反応液から抽出、精製等常法の処理に
より得られる。また中間体のＸ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−ＯＹ３はそれが生成したところで反応液へ
当量以上の水を添加することによフて不溶化し、析出す
るのでその段階で粗精製することもできる。
本発明で用いられる酵素は高度な基質特異性を有してい
るので、前段階の反応基質が残留する反応液中において
も次段階の反応を行うことができ、中間体の精製を非常
に簡略化することができる。
るので、前段階の反応基質が残留する反応液中において
も次段階の反応を行うことができ、中間体の精製を非常
に簡略化することができる。
［実 施 例コ
以下本発明を実施例にもとづいて説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。
これに限定されるものではない。
Ｂｚ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ ６２６ｍｇ及びＧｌｙ−ＯＭｅ
の塩酸塩４９６ｍｇを、２０＋ｎ４の５０％ＤＭＦ／水
混合溶媒中に溶解し、ｐＨ１０に調整した。この反応液
へα−キモトリプシン （和光純薬製、牛すい臓由来力
価１０００１１５Ｐｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇ）１２０ｍｇを添加し、このｐ）Ｉを１０に
再調整した後室温にて攪拌した。１時間後の反応液の組
成分析を高速液抹クロマトグラフィーによって調べた結
果、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＭｅの濃度は０．８Ｍに
達していることがわかった。この反応液のｐ）Ｉを６へ
ずらした後、不溶化した蛋白質などを除くため、Ｍｉｌ
ｌｅｘ−５Ｒ（商品名）５．５μ口、フィルターユニッ
ト（ミリボア社製）を用いて一過した。次いでＩＩＦ膜
（東洋濾紙製Ｕに一１０１分画分子量１００００）に
よって限外？Ａし、と（Ｄ ｆ液へＧｌｙ−ＯＭｅ）塩
酸塩１．７０ｇ、２−メルカプトエタノール０．ＩＪ、
並びにパパイン （シグマ社製、Ｐａｐａｙａ Ｌａｔ
ｅｘ由来、力価２４ｕｎｉｔｓ／ｍｇ） １００＋ｎｇ
を添加し、ｐＨを６に再調整した後攪拌した。３時間後
の反応液の組成分析を、上記と同様の方法で調べた結果
、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇ １ｙ−Ｇ ｌｙ−ＯＭｅの濃度は
、０．０５８Ｍに達していた。
の塩酸塩４９６ｍｇを、２０＋ｎ４の５０％ＤＭＦ／水
混合溶媒中に溶解し、ｐＨ１０に調整した。この反応液
へα−キモトリプシン （和光純薬製、牛すい臓由来力
価１０００１１５Ｐｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇ）１２０ｍｇを添加し、このｐ）Ｉを１０に
再調整した後室温にて攪拌した。１時間後の反応液の組
成分析を高速液抹クロマトグラフィーによって調べた結
果、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＭｅの濃度は０．８Ｍに
達していることがわかった。この反応液のｐ）Ｉを６へ
ずらした後、不溶化した蛋白質などを除くため、Ｍｉｌ
ｌｅｘ−５Ｒ（商品名）５．５μ口、フィルターユニッ
ト（ミリボア社製）を用いて一過した。次いでＩＩＦ膜
（東洋濾紙製Ｕに一１０１分画分子量１００００）に
よって限外？Ａし、と（Ｄ ｆ液へＧｌｙ−ＯＭｅ）塩
酸塩１．７０ｇ、２−メルカプトエタノール０．ＩＪ、
並びにパパイン （シグマ社製、Ｐａｐａｙａ Ｌａｔ
ｅｘ由来、力価２４ｕｎｉｔｓ／ｍｇ） １００＋ｎｇ
を添加し、ｐＨを６に再調整した後攪拌した。３時間後
の反応液の組成分析を、上記と同様の方法で調べた結果
、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇ １ｙ−Ｇ ｌｙ−ＯＭｅの濃度は
、０．０５８Ｍに達していた。
この反応液へ直ちにＰｈｅ−ＯＥｔの塩酸塩２．５５ｇ
を添加し、引き続き攪拌した。５時間後にこの反応液へ
水５０ｍＲを添加すると、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−ＯＥｔが析出した。この生成物を遠心分離
によって回収した。これを水に懸濁して遠心分離によっ
て回収する操作を数回繰り返し、粗精製を行った。Ｂｚ
−Ｔｙｒ−ＯＥｔからの収率は、３９％であった。この
回収物とＬｅｕ−Ｎ）１２の塩酸塩２５７ｍｇを２０＋
Ｊの５０％ＤＭＦ／水混合溶媒に再溶解し、反応液のｐ
ＨをｌＯに調整した。この反応液へα−キモトリプシン
１２０ｍｇを添加し、このｐＨを１０を再調整した後、
室温にて攪拌した。１時間後、２Ｎ−塩酸を添加し、ｐ
Ｈ４にすることによフて、反応を停止した。この反応液
から、メチルイソブチルケトンによってＢｚ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＯ３を抽出し、減
圧濃縮を行った。これをメタノールに溶解し、高速液体
クロマトグラフィーによって分取し、凍結乾燥すること
によって、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−ＮＯ３の粉末を得た。
を添加し、引き続き攪拌した。５時間後にこの反応液へ
水５０ｍＲを添加すると、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−ＯＥｔが析出した。この生成物を遠心分離
によって回収した。これを水に懸濁して遠心分離によっ
て回収する操作を数回繰り返し、粗精製を行った。Ｂｚ
−Ｔｙｒ−ＯＥｔからの収率は、３９％であった。この
回収物とＬｅｕ−Ｎ）１２の塩酸塩２５７ｍｇを２０＋
Ｊの５０％ＤＭＦ／水混合溶媒に再溶解し、反応液のｐ
ＨをｌＯに調整した。この反応液へα−キモトリプシン
１２０ｍｇを添加し、このｐＨを１０を再調整した後、
室温にて攪拌した。１時間後、２Ｎ−塩酸を添加し、ｐ
Ｈ４にすることによフて、反応を停止した。この反応液
から、メチルイソブチルケトンによってＢｚ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＯ３を抽出し、減
圧濃縮を行った。これをメタノールに溶解し、高速液体
クロマトグラフィーによって分取し、凍結乾燥すること
によって、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−ＮＯ３の粉末を得た。
Ｂｚ−Ｔｙｒ−ＯＥｔからの最終収率は、３５％であっ
た。
た。
得られたＢ ｚ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌ ｙ−Ｇ １ｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ２物性値は、液相法によって合成され
た標品のそれと誤差範囲内で一致した。
ｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ２物性値は、液相法によって合成され
た標品のそれと誤差範囲内で一致した。
高速液体クロマトグラフィー分析の測定装置及び測定条
件は下記の通りである。
件は下記の通りである。
ｔｌＶ−８ｍｏｄｅｌｌｌ （検出器）ＧＥ−４（商品
名）（グラジェント装置）（商品名）（分取：φ２１．
５ｍｍ、 ３００＋ｎｍ ）溶離モード：リニアグラジ
ェント モードＣＨ３ＣＮ １０％ｉ、ＩＣ文０．１９
６−〇）Ｉｓ（：Ｎ’ ６０＊：Ｉ（Ｃ又０．１＊２５
分 流速：１ｍ交／分 検出波長： ２１０ｎｍ ［発明の効果］ 本発明の方法によれば、水に可溶な有ＷＡ？＠媒を含む
水性媒体中、使用するプロテアーゼがエステラーゼ活性
を示すｐＨ条件の下で、Ｎ端から逐次１アミノ酸エステ
ルずつ、中間体の脱エステル操作を行うことなしに伸長
していくため、製造工程が大幅に短縮されるとともに、
中間体の脱保護基工程にともなって生じるセラミ化や収
率の低下を避けることかできる。
名）（グラジェント装置）（商品名）（分取：φ２１．
５ｍｍ、 ３００＋ｎｍ ）溶離モード：リニアグラジ
ェント モードＣＨ３ＣＮ １０％ｉ、ＩＣ文０．１９
６−〇）Ｉｓ（：Ｎ’ ６０＊：Ｉ（Ｃ又０．１＊２５
分 流速：１ｍ交／分 検出波長： ２１０ｎｍ ［発明の効果］ 本発明の方法によれば、水に可溶な有ＷＡ？＠媒を含む
水性媒体中、使用するプロテアーゼがエステラーゼ活性
を示すｐＨ条件の下で、Ｎ端から逐次１アミノ酸エステ
ルずつ、中間体の脱エステル操作を行うことなしに伸長
していくため、製造工程が大幅に短縮されるとともに、
中間体の脱保護基工程にともなって生じるセラミ化や収
率の低下を避けることかできる。
また、本発明の方法によれば、ペプチド結合を酵素によ
って形成しその高度な基質選択性を利用していることか
ら、未反応基質の存在する反応液中においても次の反応
ステップを実行することができ、繁雑な中間体の精製を
簡略化することができるばかりか、原料アミノ酸エステ
ルとして０体及び５体の混合物を使用することも可能で
、製造工程に要求される経済性を満足することができる
。
って形成しその高度な基質選択性を利用していることか
ら、未反応基質の存在する反応液中においても次の反応
ステップを実行することができ、繁雑な中間体の精製を
簡略化することができるばかりか、原料アミノ酸エステ
ルとして０体及び５体の混合物を使用することも可能で
、製造工程に要求される経済性を満足することができる
。
第１図は、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＭｅとＧｌｙ−Ｏ
Ｍｅとのパパインによる反応における各ｐＨでの３時間
後の反応液の組成の高速液体クロマトグラフである。 第２図は、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＭｅとＧｌｙ−Ｏ
Ｍｅとのパパインによる反応において、後者を前者の濃
度の２倍及び１０倍に設定した場合の、目的物Ｂｚ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＭｅの生成速度を図示したも
のである。 第１図 保持時間 ｆｍｔｎ、）
Ｍｅとのパパインによる反応における各ｐＨでの３時間
後の反応液の組成の高速液体クロマトグラフである。 第２図は、Ｂｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＭｅとＧｌｙ−Ｏ
Ｍｅとのパパインによる反応において、後者を前者の濃
度の２倍及び１０倍に設定した場合の、目的物Ｂｚ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＭｅの生成速度を図示したも
のである。 第１図 保持時間 ｆｍｔｎ、）
Claims (6)
- （１）水に可溶な有機溶媒を含む水性媒体中で、Ａ：セ
リンプロテアーゼの存在下、Ｎ置換チロシン低級アルキ
ルエステルとグリシン低級アルキルエステルを反応させ
る工程、 Ｂ：チオールプロテアーゼの存在下、Ａ工程の生成物に
グリシン低級アルキルエステルを反応させ、続いてフェ
ニルアラニン低級アルキルエステルを反応させる工程、 Ｃ：セリンプロテアーゼの存在下、Ｂ工程の生成物にロ
イシンアミドを反応させる工程、 のＡないしＣの工程によりペプチド伸長させることを特
徴とするＮ置換ロイシンエンケファリンアミドの製造方
法。 - （２）上記Ｎ置換チロシン低級アルキルエステル、及び
フェニルアラニン低級アルキルエステル、及びロイシン
アミドがＬ−体である特許請求の範囲第（１）項記載の
製造方法。 - （３）上記Ｎ置換チロシン低級アルキルエステルのＮ置
換基が、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、
ｔ−ブトキシカルボニル基である特許請求の範囲第（１
）項又は第（２）項に記載の製造方法。 - （４）上記セリンプロテアーゼがα−キモトリプシンで
ある特許請求の範囲第（１）項ないし第（３）項いずれ
かの項に記載の製造方法。 - （５）上記チオールプロテアーゼがパパインである特許
請求の範囲第（１）項ないし第（４）項いずれかの項に
記載の製造方法。 - （６）上記水に可溶な有機溶媒がジメチルホルムアミド
である特許請求の範囲第（１）項ないし第（５）項いず
れかの項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62091289A JPS63254994A (ja) | 1987-04-14 | 1987-04-14 | Ｎ置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62091289A JPS63254994A (ja) | 1987-04-14 | 1987-04-14 | Ｎ置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63254994A true JPS63254994A (ja) | 1988-10-21 |
Family
ID=14022306
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62091289A Pending JPS63254994A (ja) | 1987-04-14 | 1987-04-14 | Ｎ置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63254994A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030002010A (ko) * | 2001-06-28 | 2003-01-08 | 이영상 | 물-혼합성 유기용매 단일계에서 단백질 가수분해효소를이용한 엔케팔린 제조방법 |
-
1987
- 1987-04-14 JP JP62091289A patent/JPS63254994A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030002010A (ko) * | 2001-06-28 | 2003-01-08 | 이영상 | 물-혼합성 유기용매 단일계에서 단백질 가수분해효소를이용한 엔케팔린 제조방법 |
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