JPS63258423A - リポソ−ム／アントラキノン薬剤組成物およびそれを用いた治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、脂質酸化ならびに遊離ラジカル損害の減少を
もたらす改良されたリポソーム／アントラキノン治療組
成物＋　Ｂ’Ａ組成物の調製方法および使用方法に関す
る。

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（従来の技術） リポソーム供給システムが、様々な薬剤、特に非経口的
に投与される薬剤のために提案されている。リポソーム
は、長期間にわたり、投与薬剤の“貯蔵物質（ｄｅｐｏ
ｔ）”の放出を制御しつつ供給する能力、および血流中
の遊離薬剤の濃度を制限することによって、薬剤の中毒
性副作用を減少させる能力を有する。リポソームは、ま
た１組織分布および薬剤の取り込みを変化させ得る。こ
の変化した組織分布く上記の他の利点と合わせて）は。

薬剤の治療効果を著しく増加させ得る。リポソーム／薬
剤組成物もまた。より高レベルで投与しかつ薬剤投与回
数を減らすことによって、治療の利点を増加させ得る。

リポソーム薬剤の供給システムについては、一般に、　
　、Ｐｏｚｎａｎｓｋ５’らによって再検討されている
。

リポソーム供給システムにおける使用について。

広範囲に研究されている薬剤群は、アントラセンキノン
類である。このアントラセンキノン類は。

特に、抗腫瘍薬剤ドキソルビシンまたは“アドリアマイ
シン”、ドキソルビシノール、ダウノルビシン、および
ダウノルビシノール、およびこれらのシアノモルフオリ
ニル誘導体によって例示されるアントラサイクリングリ
コシド抗生物質を含む。

ドキソルビシン（ＤＸＲ）は、新生物の広範囲なスペク
トルに対して有効である強力な化学的治療薬剤である（
Ａｕｂｅｌ−３ａｄｒｏｎらおよびＹｏｕｎｇ）　ｅ　
しかしながら、可溶性型でのこの薬剤の使用は２重大な
副作用によって制限されている。ヒトにおける急性毒性
には、倦怠感、嘔吐感、骨髄抑圧およびひどい脱毛が含
まれる。さらに、投与を繰り返すことによって、蓄積的
かつ不可逆的な心障害が発生し、このことは、長期の治
療において、薬剤の使用を制限する（Ｙｏｕｎｇ）。

従来の動物モデルを用いた研究は２次のことを示してい
る。すなわち、　　ＤＸＲをリポソーム型で投与する場
合、この薬剤は、動物の腫瘍に対するぞの治療的有効性
を保持するが、死亡率の減少から判断すると、その毒性
は著しく少ない（Ｆｏｒｓｓｅｎ＋Ｇａｂｉｚｏｎ　１
９８５）　、リポソームの薬剤保護効果は。

少なくとも一部は、注射された薬剤の組織配列における
変化および薬剤放出率に起因するだろう（Ｇａｂｔｚｏ
ｎ　１９Ｂ２　；　Ｇａｂｉｚｏｎ　１９８２　；　Ｊ
ｕｌｉａｎｏ）。

ＤＸＲ治療において観察される心筋症は、α−トコフェ
ノール（α−Ｔ）欠乏状態下の実験動物において認めら
れる心筋病変と類似している（Ｔｏｍａｓｚ）。

このことは、薬剤誘発性病変が、膜脂質を伴う遊離ラジ
カル反応の増加によってひき起こされることを示唆して
いる。ＤＸＲおよび他のアントラキノン（これは第１図
に示される一般的構造を有する）は、キノンおよびヒド
ロキノンの両方の基を含み。

それゆえ、キノンまたはヒドロキノンへ、またはこれら
からの電子移動を含む過酸化反応を促進すると考えられ
る。さらに、このアントラセン部分を通して薬剤が脂質
に結合すれば、過酸化反応における脂質の取り込みを促
進すると考えられている。例えば２次のことは公知であ
る。ＤＸＲは、カルシオリピン（ミトコンドリア中の腫
瘍脂質成分）に完全に結合し、そして、酵素−触媒電子
移動によれば、薬剤と脂質との間の共有結合が形成され
る（Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈ）。

ＤＸＲに対する心臓毒性の遊離ラジカルメカニズムは、
ビタミンＥのような親油性遊離ラジカルクエンチャ−（
ｑｕｅｎｃｈｅｒ）であれば、薬剤の毒性を減少させる
という点において効果的であることを示唆する。実際、
このことは知られている（Ｍｙｅｒｓ　；Ｈａｎｇ　；
　５ｏｎｎｅｖｅｌｄ）　ａ参照した動物研究でも、ビ
タミンＥは、　　ＤＸＲ投与前に投与されるかまたはＤ
ＸＲと同時に投与される場合、心臓毒性を減少させる点
において効果的であることが示されている。ごく最近の
研究では、　Ｄ’ＸＲおよびビタミンＥをともに導入し
た（ｃｏｅｎ　ｔｒａｐｐｅｄ）リポソーム薬剤システ
ムが、ビタミンＥ　／ＤＸＲまたはリポソーム／ＤＸＲ
の組合せのいずれか一方だけよりは、マウスにおいて毒
性が少なく、心筋症をひき起こす頻度も少ないことが示
されている（Ｏｌｓｏｎ）。ＤＸＲおよびビタミンＥを
ともに導入したリポソームの毒性の減少は、明らかに、
変化した薬剤分布および／または低下した遊離薬剤レベ
ルの組合せ（薬剤のリポソーム導入に起因する）、およ
び減少した遊離ラジカル損害（ビタミンＥの遊離ラジカ
ルクエンチングに起因する）に由来する。

要約すれば、合口までに実施された動物研究では、リポ
ソームがＤＸＲの心臓毒性を減少させ得ること、および
このリポソーム中のビタミンＥの存在により、さらに心
臓毒性副作用が減少し得ることが示されている。しかし
ながら、リポソームが。

悪心、倦怠感、脱毛および骨髄抑制のようなヒトにおけ
る短期的かつ一般的な副作用（これらは。

ＤＸＲ治療に関連して１日常的に存在する）を減少させ
る能力を有するかどうかをこれらの研究は示唆していな
い。ここで、従来技術で記述のように。

ＤＸＲ投与の副作用のうちのいくつか（特に悪心）は、
典型的には２〜４日の期間をかけて薬剤をゆっくりと静
脈内へ点滴投与することによって改善され得ることが注
目される。この方法では、中枢静脈へカテーテルを装入
し、典型的には数日の全投与期間にわたって１選択した
薬剤を供給するべく用いられる詰め替えの可能なポンプ
を備え付けることにより、患者に準備を施す。この方法
は。

一般的には採用されていない。というのは、不便かつ問
題が伴うからである。この方法では、脱毛症の発生頻度
が著しく減少することも起こらない。

さらに、これまで実施された動物研究では、薬剤／リポ
ソーム処方の保存において発生し得る脂質および薬剤の
酸化の程度および影響については検査も認識もされてい
ない。本発明を支持して実施された研究において、この
ような処方の薬剤および脂質は、たとえ酸素欠乏的な保
存条件下においても、保存中に、相当な化学的変化を起
こし得ることが見出された。このような損害は、薬剤処
方の毒性を増加させ、薬剤の治療的作用を危なくすると
思われる。

（発明の要旨） 本発明のアントラキノン／リポソーム組成物は。

少なくとも約０．１モル％の親油性の遊離ラジカル捕集
剤を含有するりポソームであって、該ラジカル捕集剤は
該リポソームの脂質二層部分に導入されているリポソー
ム、隣接するアントラセン環にキノンおよびヒドロキノ
ン官能部分を有するアントラキノン薬剤、および該組成
物中において第二鉄が過剰モル濃度下に存在するトリヒ
ドロキサム酸キレート化剤を含有し、そのことにより上
記目的が達成される。

本発明の原発性もしくは二次性肝腫瘍の治療方法は、→
ノーイズが主として約０．０５〜０．２５ミクロンの範
囲であり、少なくとも約２．５モル％のドキソルビシン
もしくはその薬理学的に許容しうる類似体。

誘導体を含有するリポソームの水性懸濁液を供給するこ
と、および血流を通して薬理学的に許容される量の該組
成物を患者に投与することを包含し。

そのことにより上記目的が達成される。

本発明の副作用の軽減方法は、ヒトにおいて。

治療的存効量の遊離ドキソルビシンの巨丸剤静脈内投与
によりもたらされる悪心および脱毛の発生率を有意に減
少させる方法であって、リポソーム中へのドキソルビシ
ンの導入、および該リポソームの高速点滴による血流へ
の投与を包含し、そのことにより上記目的が達成される
。

本発明は１組成物の脂質成分および薬剤成分の両方に対
し、脂質酸化および遊離ラジカル損害を減少させるべ（
設計された抗酸化性を有するリポソーム／アントラキノ
ン組成物を含む。

本発明によれば１次のことが発見された。すなわち、酸
化メカニズムおよび遊離ラジカルメカニズムに関連した
薬剤および脂質損害は、α−下のような親油遊離ラジカ
ル捕集剤、およびフェリ第キサミンのような水溶性のト
リヒドロキサム酸キレート化剤（これは第二鉄に対する
選択的な結合親和性を有する）をリポソーム処方中に含
有させることにより、かなり減少される。脂質過酸化お
よび遊離ラジカル損失に対する保護の程度は、遊離ラジ
カルクエンチャ−のみ、または、従来用いられてきたエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化
剤によって得られる程度より大きい。このキレート化剤
は、懸濁液中において、過剰モルの第二鉄イオンで存在
する。

あるより好ましいリポソーム組成物は、２０〜５０モル
％のコレステロール、１０〜４０モル％の陰性荷電リン
脂質（例えば、フォスファチジルグリセロール（ＰＧ）
　、フォスファチジルセリン（ＰＳ）またはフォスファ
チジルイノシトール（ＰＩ）およびフォスファチジルコ
リン（ＰＣ）　）からなるリポソーム中に、少なくとも
約２．５モル％のモル比でＤＸＲ（または、薬理学的に
許容し得る類似物、誘導体あるいはそれらの塩）を含有
する。このリポソームの大きさは、主として０．０５〜
０．５ミクロンの範囲にあり、好ましくは約０．０５〜
０．２５ミクロンの間である。懸濁液中の遊離薬剤の量
（すなわち、リポソームと会合していない薬剤の量）は
、好ましくは、懸濁液中の全薬剤の約１５％を越えない
量である。フェリオキサミンは、この懸濁液中に約５０
μ台で含有されており、このリポソーム中のα−Ｔの濃
度は、少なくとも約０．２モル％である。

本発明には、　　ＤＸＲ／リポソーム組成物、好ましく
は上記で形成されたような組成物を用いたヒト新生物に
対する治療方法も含まれる。第１段階の研究の構成にお
けるヒト癌患者に関する臨床試験では、遊離ＤＸＲによ
る治療にしばしば関連した不快感（倦怠感）２頭痛、悪
心、嘔吐、注射部位の局部症および脱毛のような多くの
副作用の著しい減少を示している。肝臓の原発性および
２次性のヒト新生物に対する治療的効果は、他の治療形
態では効果がみられないかまたは反応が終わった患者（
いくつかの場合には、遊離ドキソルビシンによる治療も
含む）において証明されてきた。

より一般的には２本発明のこの局面では、治療的に有効
な用量において、アドリアマイシンをリポソーム導入型
で投与することによって、アドリアマイシン投与に伴う
悪心および脱毛を著しく減少させる方法、およびヒトの
肝臓における原発性および２次性新生物を、リポソーム
型のＤＸＲを血流に投与することによって治療する方法
を包含する。

本発明の一般的な目的は、脂質組成および薬剤組成に対
するこの組成物のインビトロでの過酸化損害が実質的に
減少するようなアントラキノン薬剤を含有するリポソー
ム組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、リポソーム／アントラキノン組成
物において、酸化反応および遊離ラジカル反応に関連す
る脂質および薬剤毒性を減少させる一般的な方法を提供
することにある。

特定の目的は、ヒト新生物の治療のためにこのような組
成物を提供することであり、ここで、この薬剤は、　　
ＤＸＲまたは薬理学的に許容しうる類似物、誘導体もし
くはそれらの塩である。

本発明に関連する目的は、ヒト新生物、特に。

原発性および転移性の肝腫瘍、造血増殖障害および白血
病を、リポソーム導入ＤＸＲを用いて１通常の薬剤副作
用を著しく改善しつつ治療する方法を提供することであ
る。

本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は。

下記の発明の詳細な説明を、添付の図面と共に読むと、
より明らかになるだろう。

（発明の詳細な 説明の組成物を調製する際に用いられるアントラキノン
薬剤は、アントラセン環構造、この環構造にキノン、セ
ミキノンまたはヒドロキノン官能部分を備えた抗新生物
アントラキノン薬剤である。より正確には、この用語が
ここで定義されているように、アントラキノン薬剤は、
アントラセン環構造の隣接環にひとつのキノン基および
ヒドロキノン基を有するアントラキノン構造を包含する
。これらの特徴を備えた抗新生物アントラキノンは、第
１Ａ−ＩＣ図に例示の３つの群に分類され得る。

この第１の群は、第１Ａ図に図示されているクラスＩア
ントラセングリコシドである。この群には、ドキソルビ
シン（ＤＸＲ，一般的にはアドリアマイシンとして知ら
れている）、ダウノマイシン。

カルジノマイシン、Ｎ−アセチルアドリアマイシン、Ｎ
−アセチルダウノマイシン、ルビダゾンおよび５−イミ
ドダウノマイシンのような多くの臨床的に重要な抗新生
物薬剤が含まれる。下記の表１は、第１Ａ図中のＲ１基
、　１７２基およびＲ３基に関し。

これら数種のクラス■薬剤の構造的な変化を示す。

ごく最近、　　ＤＸＩ？のシアノモルホリノ誘導体につ
いて報告されている（Ｓｉｋｉｃ）。このクラスの薬剤
は。

急性白血病、乳癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫お
よび肉腫を含む種々の癌に対する抗新生物効果を示すこ
とが知られている。膜結合（Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇ１
９８４）および酵素−触媒遊離ラジカル形成（Ａｕｂｅ
ｌ−５ａｄｒｏｎ＞も、薬剤作用に寄与し得るメカニズ
ムであると示唆されているが９本薬剤の主要メカニズム
は、　　ＤＮＡおよびＤＮＡ損害への介入であると考え
られる　（Ｙｏｕｎｇ、　Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈ　
１９８４）。

（以下余白） 第２群は、クラス■アントラセングリコシドを含む。こ
れらは、第１Ｂ図に示されているように。

より複雑な（多様な）アミノグリコシド残基によってク
ラスＩ化合物から区別される。これらの化合物は、クラ
ス■の化合物の類似物と同様の治療的特性および毒性を
有している。代表的なりラス■アントラセンアミノグリ
コシドを３表２に示す（Ｒ１基、　Ｒ２基およびＲ３基
は、第１Ｂ図を参照）。

（以下余白） ベ　　　ベ ０　　　　口 八　　　　査　　　さ　　　八 ／／／Ｋ＞−＼ｔ〃 八 八　　　、＼ へ：　・さ　マ【　・＼　→　ムへ 第３群のアントラキノンは、第１Ａ図に示された一般的
な環構造を有するアントラキノンを含む。

例えば、このアントラキノンは、隣接アントラセン環に
キノン基およびヒドロキノン基を有する。

しかし、これらは、アントラサイクリン抗生物質のグリ
コシド基の特性を欠く。この群の重要な薬剤のひとつは
、ミドキサントロンである。この薬剤は、乳癌を含む様
々な癌に対して効果的であることが報告されている抗新
生物薬剤である。さらに、遊離ＤＸＲと比較した場合、
心臓毒性を含む副作用も減少させ得る（Ｓｔｕａｒｔ−
Ｈａｒｒｉｓ）。

本発明者のひとりとの共同研究において実施されたＤＸ
Ｒへの第二鉄の結合に関する研究は、アントラキノン薬
剤、特にアントラサイクリックアミノグリコシドが、第
二鉄との安定した金属錯体を形成することを示している
（Ｓａｍｕｎｉ）。これらの研究では、飽和リン脂質ジ
ミリスチルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）から形
成された少量のユニラメラ小胞（ＳＵＶｓ）の存在下お
よび非存在下の両方におけるＤＸＲの第二鉄への結合が
調べられた。

第２図を参照して、　　４８０ｎｍの励起波長における
ＤＸＩ？の蛍光放射スペクトル（上部破線）は、約５９
０ｎｍおよび５６０ｎｍにおけるピークを示しており、
このスペクトルは、この薬剤が５ＵＶｓと会合する場合
にもほとんど変化しない（上部実線）。ＤＸＲが、　Ａ
ＤＰの存在下で第二鉄と錯体形成する場合には、蛍光放
射スペクトルの型はほとんど同じであるが、その強度は
著しく減少することが観察された（下部破線）。この強
度の減少は、たぶん、鉄の消光効果による結果である。

このＤＸＲ−Ｆｅ　（ＤＩ）錯体をＤＭＰＣ，５ＵＶｓ
へ加えた場合は、消光効果がより少なくなることが認め
られた。このことは、溶液中の遊離薬剤の強度とこのＤ
ＸＲ−Ｆｅ　（Ｉ［［）錯体の強度との中間の強度であ
る蛍光放射スペクトルから明らかである（下部実線）。

リポソームに薬剤を結合させる前または後のいずれに鉄
を加えるとしても、リポソームに関連したＤＸＲ−Ｆｅ
　（Ｉ［［）錯体についての同様の放射スペクトルが観
察されている。

このことは、薬剤−鉄錯体が、脂質結合薬剤によって容
易に形成されることを示す。

本発明に関して興味深いことは、飽和および／または不
飽和リン脂質によって形成された５ＬＩＶｓの存在下で
、　　ＤＸＲが第二鉄と錯体化した場合、　　［ｌＸＩ
？は、比較的速くかつ不可逆的な化学的変化を受けると
いう発見であった。この変化のひとつの尺度は、蛍光ス
ペクトルの５９０／　５６０ｎｍ比の変化である。これ
は、アントラセン環の変化の結果体じるであろう。ＤＭ
ＰＣに関連してＤＳＲ−Ｆｅ　（ＩＩＩ）の５９０１５
６０ｎｍ比は、最初は約１．９である。第二鉄の存在下
では、鉄：薬剤の比が２：１の場合、この比は。

３０℃において５時間にわたり約０．９に減少する。

かなり過剰モルの第二鉄を用いると、　　５９０１５６
０における傾斜は著しく急となり、２時間の間に０．８
より小さい値に減少する。この変化したＤＸＲは。

リポソームから抽出されると、約０．６の５９０１５６
０比を示す。標準二相分割システムにおけるその分割特
性からも明らかなように、変化した薬剤も。

疎水性の増加を示している。この変化は、アントラセン
環構造から、より親水性の糖部分が分離したことによる
だろう。薬剤変異反応は、飽和または不飽和リン脂質の
いずれかからなるリポソーム中において、酸素の存在下
または非存在下に起こることは注目される。すなわち、
薬剤変異に結びつく事象は、不飽和脂質を含む遊離ラジ
カル形成または電子移動に伴う酸素を要しないと思われ
る。

しかしながら、下記に認められるように、酸素および不
飽和脂質の両方が、薬剤／リポソーム処方における薬剤
変異に寄与し、このような状況下では、脂質の著しい過
酸化損害も発生し得る。本発明の処方の重要な局面のひ
とつは、下記に示すように、このような薬剤変異および
脂質変異の著しい減少にある。

Ｂ、蒲ｌ爪分 組成物中のリポソームは、コレステロールのような、中
性リン脂質および陰性荷電リン脂質を含有する標準小胞
形成脂質から形成される。脂質の選択は、（ａ）血清中
の薬剤放出率、（ｂ）薬剤導入効率。

（Ｃ）リポソーム毒性、およびｆｄｌ生体分布特性や標
的特性を考慮して指示される。

インビボにおける薬剤放出率に対する脂質成分の効果を
考慮すると、最も重要な組成因子は、リン脂質における
鎖長、不飽和度および先端基の電荷や側鎖である。脂質
組成物に対する薬剤放出の依存性は、一部は、外部リポ
ソーム二重層を伴う両親媒性薬剤の変化率の差に起因し
、一部は、異なった脂質組成物を有するリポソームの異
なった安定性に起因する。下記の研究から、フォスファ
チジルグリセロール（ＰＧ）およびフォスファチジルセ
リン（ＰＳ）のような陰性荷電リン脂質は、５０％血漿
におけるＤＸＲ放出によって測定した場合、薬剤リポソ
ーム安定性を高める傾向にあり、他方、カルシオリピン
（ＣＬ）は、このリポソームに対する顕著な非安定化効
果を生じることがわかる。この後者の効果は、　　ＤＸ
Ｒとカルシオリビンとの間の顕著に強い相互作用に関係
すると考えられる（Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈ１９８３
）。この相互作用は、インビボにおいてもおこる薬剤と
脂質との交叉結合によって反映される。

中性リン脂質、特にフォスファチジルコリン（ＰＣ）　
。

およびＰＧ、　ＰＳおよびフォスファチジルイノシトー
ル（ＰＩ）のような陰性荷電リン脂質、　（これらは。

選択された鎖長および飽和度のアシル鎖成分を有する）
は、市販品から調達できる。あるいは、これらは、公知
の方法により調製され得る。

リポソーム安定性に対して重要であり、従って。

薬剤放出率に対して重要なもうひとつの脂質成分は、コ
レステロールである。本発明を支持して実施された研究
において１種々の量のコレステロール、ＰＣおよびＰＧ
、　ＰＳまたはＣＬをその脂質成分として含有するリポ
ソームからのインビトロでのＤＸＩ？の放出について検
討された。このリポソームは。

以下の実施例１に記述のように、調製された。しかし、
このリポソームは下記表３に示されたモル％のＰＣ，Ｐ
Ｇおよびコレステロールを含有していた。

各テスト前に９分子ふるいクロマトグラフィーによって
、リポソーム懸濁液を遊離（可溶性）薬剤から分離させ
た。このＤＸＲ／リポソーム組成物をそれぞれ、５０％
ヒト血漿の存在下にて３７℃で１時間培養した後２分子
ふるいクロマトグラフィーまたは超遠心分離のいずれか
を用いて、放出された可溶性薬剤から、リポソーム会合
薬剤を分離させた。このリポソーム中に保持されたＩ）
ＸＲＯ量は。

最初の全薬剤の％として算出された。その結果を。

表３に示す。

（以下余白） 覇：　ミ認富真　＊繁；ミ　麓認　＝麓４： １　： 刈 モ： ｐ： 栴　　　　： Ｌ１′）寸へｏ　８０　り０ 田：　　　　　　・・・・・・・・　・・・・　・・・
・Δ：　寸Ｃ’Ｊ　？　０　　酬トｔ−ｆ−ドロー　　
寸寸′： ｌ＋Ｉ：　　　・・・・・・・・　・・・・・・・・　
・・・・　・・・・表かられかるように、２０モル％の
コレステロールは、ＰＣリポソームにおける薬剤保持に
関し、２倍〜３倍の増加を生しる。しかし、５０％のコ
レステロールモル比までは、それ以上の改善はみられな
い。３０モル％ＰＧで形成されたリポソームでは。

コレステロールがないと、良好な薬剤保持が達成された
。しかし、コレステロール量の増加に伴い。

安定性が次第に増大することが観察される。もうひとつ
の陰性荷電リン脂質であるＰＳは、事実上。

ＰＧの場合と同様な結果を与える。ここには報告されて
いない他の研究でも、薬剤保持の増加は、約１０〜４０
モル％間の範囲の陰性荷電リン脂質において観察される
ことが示される。興味深いことに。

わずか１０モル％のカルシオリピン（ジフォスファチジ
ルグリセロール）（これは、２価の陰性荷電先端基を有
する）の存在は、実質的にコレステロールの効果を除去
し、５０モル％のコレステロールでさえ、わずかな薬剤
保持をもたらすにすぎない。

脂質組成物を選択する際に、考慮されるべきもうひとつ
の要因である薬剤導入効率は、リポソームに負荷され得
る薬剤の総量を示し、リポソーム脂質１モルあたりの薬
剤の比率で表される。調製費用の点から、および投与さ
れたリポソーム量のうち、リポソーム型で供給され得る
薬剤量を最大にするための両方について、高い導入効率
が望まれる。本発明を支持して実施した実験では、多量
および少量の音波破砕リポソームの両方、および多数の
異なった脂質組成物についてのＤＸＲ導入効率について
検討されている。このリポソームおよび脂質組成物の変
化については、以下の表４に示す。この表では、　　Ｍ
ＬＶは、平均して約０．５〜５ミクロンの間の大きさの
不均質なリポソームを典型的に含有しているマルチラメ
ラ小胞を示す。５ＵＶｓは、音波破砕されているが分割
されていない小胞を表す。この最終的な記載は２分割さ
れた小胞に関する。この分割された小胞は、大きい小胞
を取り除くために音波破砕され、　５ＵＶ（Ｆ）と呼ぶ
主として小さいリポソームを生じる。ＤＰＰＧおよびＤ
ＰＰＣは。

それぞれジパルミトイルＰＧおよびジパルミトイルＰＣ
の省略形であり、ＰＣおよびＰＧから区別され、卵脂質
から誘導され、そして、飽和および不飽和リン脂質成分
の両方の混合物を含有する。

（以下余白） 表４ ＭＬＶ−ＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｉ）ＸＲ４：　４　：　１　
　１４　　３５ＭＬＶ−ＰＣ：ＤＸＲ４：　１　　　１
０　　２６ＭＬＶ−Ｃ［、：ＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＸＲ１
：　　４　　：　　５　　：　　１　　　　６４　　　
　　　　　１２８ＭＬＶ−ＣＩ、：ＰＣ：ＤＸＲ１：　
４　：　１　　５８　　１１６ＭＬＶ−ＰＳ：ＰＣ：Ｃ
ＨＯＬ：ＤＸＲ３：　７　：　１０　：　２　５９　　
１２９ＳＵＶ−ＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＸＲ１０：　１０　
：　１　　１５　　１６ＳｕＶ−ＣＬ：ＰＣ：ＣＨＯＩ
、：ＤＸＲ１：　４　：　２　：　１　４７　　９４Ｓ
ＵＶ−ＣＬ：ＰＣ：Ｃ１−１０Ｌ：ＤＸＲ１：　４　：
　５　：　１　４５　　９０ＳＵＶ−ＣＬ：Ｃｌｌ０Ｌ
：ＤＸＲ１０：　５　：　２　　９０　　１８０ＳＵＶ
−ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯｌ、：ＤＸＲ３：　７　：　４　
：　２　５０　　１００ＳＵＶ−ＰＧ：ＰＣ：ＣＨＯＬ
：ＤＸＲ３：　７　：　４　：　２　６１　　１２８Ｓ
ＵＶ−ＤＰＰＧ：ＰＣ：ＣＨＯＩ、：ＤＸＲ３：　７　
：　４　：　２　３９　　７８ＳＩＪＶ−ＤＰＰＧ：Ｄ
ＰＰＣ：Ｃ）ＩＯＬ：ＤＸＲ３：　７　：　４　：　２
　２８　　５６ＳＵＶ（Ｆ）−ＰＳ：ＰＣ：Ｃ１−１０
Ｌ：ＤＸＲ３：　７　：　４　：　２　　２５　　　　
　５０ＭＬＶｓに関するデータは、陰性荷電リン脂質（
ＣＬかＰＳのいずれか）が、良好な導入効率を得るため
に必要であるが、しかし、コレステロールは、薬剤導入
に対して、あるとしても極くわずかな効果しか有しない
ことを示唆している。５ＵＶｓについては、導入効率に
おける同様な増加が、　ＣＬまたはＰＧのいずれか、ま
たはＰＳと共に観察された。さらに。

導入効率は、飽和リン脂質（ＤＰＰＧのみ、またはＤＰ
ｐｃと共に）を、より不飽和な非脂質と置き替えた場合
、および主として非常に小さいＳＵＶ　（Ｆ）リポソー
ムでは、相対約手さい。表３および４（同時に作成）の
データは２次のことを示唆している。すなわち、インビ
トロ（血清血漿中）において、高い導入効率および良好
な薬剤保持を得るための最適なリポソーム組成物では、
１０〜４０モル％の間の陰性荷電リン脂質、特にＰＧを
含有するが、カルシオリビン（ＣＬ）　　７２０〜５０
モル％の間のコレステロール：および少なくとも４０モ
ル％の天然リン脂質（ＰＣのような）が除外される。こ
の範囲の脂質組成において、アシル鎖の飽和の程度およ
び鎖長は。

インビボにおける所望の薬剤放出特性を達成するべく変
えられ得る。しかし、高いパーセントの飽和脂質を含有
する組成物なら、薬剤導入効率を減少させると考えられ
る。

脂質成分の選択において、もう１つの重要な考慮は、生
成される薬剤／リポソーム組成物の毒性である。この可
溶性の薬剤は、一般に、リポソーム導入薬剤よりも毒性
が強いため、リポソームは。

インビボで良好な導入効率および良好な薬剤保持の両方
を有することが望ましい。薬剤保持および薬剤導入に影
響する脂質組成物の要因は、上記に述べられる。さらに
、この脂質のアシル鎖組成物は、このリポソーム中に存
在する薬剤の量とは無関係である毒性効果を生じ得る。

空リポソーム（導入薬剤を含有しない）の毒性を評価す
るため。

本発明を支持して実験室動物に対して実施した実験にお
いて２次のような結果が得られた。すなわち、　（１）
ＤＰＰＧおよびＤＰＰＣのような飽和脂質を主成分とす
るリポソームは、対応する不飽和リン脂質から形成され
たリポソームより毒性が強い。（２）不飽和脂質は毒性
が弱いものの、これらはまた、保存中の脂質過酸化に対
してより敏感でもある。さらに、相当な脂質酸化損害を
伴うリポソームは、　ＬＤ、。

価で示した場合、対応する新しいリポソームよりかなり
毒性が強い。また、脂質酸化損害は、薬剤保持を減少さ
せないが、薬剤／リポソーム組成物の毒性を増加させる
ことが期待される。後でわかるように２本発明の重要な
局面では、保護試薬の併用によって、アントラキノン／
リポソーム組成物の脂質成分および薬剤成分に対する過
酸化損害を減少させることを包含する。従って、不飽和
脂質の酸化損害に対する感受性は、それほど問題ではな
い。すなわち２本発明の組成物は９部分的に。

不飽和脂質（毒性が少なく、より大きな薬剤導入を示す
）を用いることによって、毒性効果を増加させると考え
られる付随的な脂質過酸化損害をもたらすことなく、毒
性の減少に寄与する。

生体分布およびリポソーム標的化は２体内の特異的部位
に対してリポソームを標的化するべく作用する特異的な
表面結合分子の存在、リポソームの大きさ、および表面
電荷により影響され得る。

本発明の成功に関して特に興味深いことは、肝臓や肺臓
のようなある標的臓器における薬剤／リポソームの蓄積
の増加であり、腎臓や心臓のような非標的臓器における
蓄積の減少である（ここでの薬剤毒性は、かなり局在化
されている）。本発明のある局面に従って、最適な生体
分布は、リポソームの大きさに関して下記に述べるよう
に９選択された大きさの範囲内のリポソームにおいて達
成される。

（以下余白） Ｃ０茸ＪＪ期 脂質存在下でのアントラキノン薬剤と第二鉄との相互作
用、およびインビトロでおこり得る薬剤の化学的変異は
、Ａ章に既述されている。ここで既述のように、この薬
剤の変異反応は、酸素欠乏状況下および飽和脂肪酸のみ
の存在下で起こった。

Ｂ章では、多くの理由のため、天然リン脂質（飽和リン
脂質および不飽和リン脂質の両方を含む）が９本発明の
薬剤／脂質組成物において、一般的に有利であることが
わかった。さらに、この組成物の調製および処理には１
分子酸素に対するある程度の暴露が含まれると考えるこ
とは合理的であり、従って、不飽和脂質および酸素を包
含する酸化反応および遊離ラジカル反応も、この組成物
における脂質変異や薬剤変異を生じると考えられ得る。

本章では、このような薬剤および脂質変異をもたらす酸
化メカニズムおよび遊離ラジカルメカニズムについて検
討する。この章は酸化／遊離ラジカル経路の異なる点に
おいて作用する親油性保護剤と水溶性保護剤との組み合
わせを、この組成物中に含有することにより、このよう
な変異反応がどの程度広範囲で制御され得るかについて
述べる。

アントラキノン薬剤、脂質および第二鉄を含有する組成
物における酸化反応および遊離ラジカル反応を示す図を
第３図に表す。ここでは、Ａ章と同様に、このリポソー
ム／アントラキノン処方を。

Ｌｉｐ／ＡｎＱで示す。リポソームを形成するアシル鎖
脂質成分は、飽和、不飽和または両者の混合物であって
もよい。この図の左上部は、Ａ章において述べたＬｉｐ
／ＡｎＱ−Ｆｅ　（ｍ　）錯体の形成を示す。酸素およ
び飽和脂質または不飽和脂質のいずれかの存在下または
非存在下において、薬剤変異に結びつく事象が含まれて
いると思われる。まず、セミキノン−（ＩＩ）Ｆｅ錯体
の形成や、薬剤に対する分子間または分子内の遊離ラジ
カル損害などが考えられる。この変異された薬剤（ＤＸ
Ｒ）は、最初の薬剤よりかなり疎水性であるため、この
変異がアントラセン環からの親水性アミノグリコシド残
基の分離を含んでいてもよい。この反応は、また、この
環構造において、セミキノンから他の官能部分。

特にヒドロキノン基への電子移動も含む。このヒドロキ
ノン基は、このアントラキノン環上のラジカルを非局在
化させるべく作用する。このＡｎＱ−Ｆｅ（ＩＩＩ）錯
体の変異薬剤への転化は、この図の左側に示す。

さらに、この図に示すように、このＡｎＱ−Ｆｅ　（Ｉ
Ｉ　）錯体は１分子酸素との結合が可能であり、過酸化
水素の形成、および最終的にはヒドロキシルラジカルの
生成をひきおこす。次いで、このヒドロキシルラジカル
は、遊離ラジカル反応を伝播し得る。

この酸素介在経路は、インビボ（ここでは、最初のセミ
キノン形成は、酸素−触媒電子移動によって生じる（Ｇ
ｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈ　１９８４））　、およびイン
ビトロ（ここでは直接的な酸素の介入がみられた（Ｇｕ
ｔｔｅｒｉｃｌｇｅ　１９８４ａ））におけるＤＸＲ刺
激性の膜損害の可能なメカニズムに関する初期の研究に
よって示唆される。

このリポソームが、不飽和脂質（ＵＬ）を含有するとこ
ろでは、第３図の右側に図示されているように２酸化お
よび遊離ラジカル損害を含む分離した経路も含まれ得る
。この脂質の分子酸素との最初の反応は、示されるごと
く、第二鉄と錯体化し得る酸化種を生じる。鉄／脂質−
ラジカル錯体を生成するレドックス反応を経た後、この
脂質錯体は、過酸化脂質ラジカルおよび酸化脂質ラジカ
ルの両方を形成し得る。これらラジカルは、　ｌｌｌ１
￥に。

この組成物の脂質成分および薬剤成分における遊離ラジ
カル反応を伝播し、示されるごとく、薬剤変異および脂
質変異をもたらす。脂質酸化および遊離ラジカル伝播を
包含するこの経路は、リポソーム膜における過酸化損害
のメカニズムに関する研究によって示唆される（例えば
、　Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ１９８４ｂおよびＳｕｎａｍ
ｏｔｏ参照）。

従来は、リポソームでの過酸化損害を制限する試みは、
典型的には、リポソーム中に、α−Ｔのような親油性遊
離ラジカル捕集剤を含有させることによる。遊離ラジカ
ル捕集に集中させてきた。

理論的には、このような遊離ラジカル捕集剤は。

脂質や脂質結合薬剤（例えば、アントラキノン）におけ
る遊離ラジカル伝播を阻止する能力を有する。従って、
“初期の”ラジカル形成反応で生成した遊離ラジカル伝
播に対する過酸化に関連した損害を制限する能力を有す
る。このラジカル形成事象が、遊離ラジカル伝播と比較
して、相対的に好都合であると仮定すると、α−Ｔによ
って供給された以上の保護はほとんど得られないと考え
られる。従って２本発明の重要な観点は７次のことの発
見にある。すなわち、アントラキノン／リポソーム組成
物における脂質および薬剤変異の著しい減少は、遊離ラ
ジカルクエンチ＋−と、遊離ラジカル形成の段階におい
て作用する水溶性保護剤との組み合わせによって達成さ
れ得る。

本発明の組成物で用いられる親油性遊離ラジカル捕集剤
とは、好ましくは、α−Ｔ、または薬理学的に許容し得
る類似物あるいは、それらのエステル（例えば、α−Ｔ
コハク酸エステル）である。

他の適当な遊離ラジカル捕集剤には、ブチルヒドロキシ
）・ルエン（ＢＩＴ）、没食子酸プロピル（Ａｕｇｕｓ
ｔｉｎ）およびこれらの薬理学的に許容し得る塩および
類催物が含まれる。ヒトにおける非経口投与のために許
容し得る追加の親油性遊離ラジカルクエンチャ−も、リ
ポソーム中に効果的なレベルで使用され得る。この遊離
ラジカルクエンチャ−は１通常の方法に従って、このリ
ポソームを調製する際に用いられる脂質成分中に典型的
に含有される。この保護化合物のより好ましい濃度は、
このリポソームを構成する全脂質成分の約０．２〜２モ
ル％の間である。しかし、高レベルの化合物、特にα−
Ｔまたはそのコハク酸塩類似物は、リポソームの安定性
と適合しており、薬理学的に許容し得る。

この水溶性の保護剤は、天然および合成のトリヒドロキ
ザム酸のクラスから選択された鉄特異性キレート化剤で
あり、第二鉄に対する極めて高い結合定数（１０”のオ
ーダー）および２価の陽イオン（例えば、カルシウムや
マグネシウム）に対する比較的低い結合定数によって特
徴づけられる。

天然源の種々のトリヒドロキザム酸が記述されている。

これには、フェリクローム、フェリクロームＡおよびア
ルボマイシンのようなフェリクローム類の化合物；フェ
リオキサミンおよびフェリマイシンを含むフェリオキサ
ミン類の化合物；およびフサラミン類の化合物が含まれ
る。これらの化合物の構造および鉄配位特性について再
検討されている（Ｅｍｅｒｙ）。

より好ましいキレートのひとつには、フェリオキサミン
Ｂがあり、これはフェリオキサミン、デフェロキザミン
、デスフェリオキサミンＢ、およびデスフェラールとし
て２様々な名称で知られている。この化合物は１例外的
な鉄結合親和性を示し、鉄貯蔵疾患や鉄中前の治療に際
し、ヒトへの非経口投与の安全性が確認されている（Ｋ
ｅｂｅｒｌｅ）。

鉄配位性デフェロキザミンの構造を第４図に示す。

この図かられかるように、この化合物は、３つのヒドロ
キサム酸基（−Ｃ（０）Ｎ（０）−）を有し、これは、
６つの対称的なＦｅ−酸素リガント結合を形成するべく
、このキレート化鉄付近を、八面体状に配置し得る。鉄
およびｐｅ２＋を含む数種の２価の金属に対するフェリ
オキサミンの結合定数を表５に示す。

表　　　５ このキレート化剤は、このリポソーム懸濁液中で、第二
鉄が過剰モルの濃度において、この組成物中に存在する
。リポソーム調製に用いられる水性媒質は、典型的には
、少なくとも約１〜２μＨの第二鉄を含有し、１００μ
門までまたはそれ以上の第二鉄を含有し得る。約２０μ
Ｎまでの鉄を含有する水性媒質については、キレート化
剤の濃度は。

約５０μＮが好ましい。

このキレート化剤は、好ましくは、リポソーム形成時に
小胞形成脂質へ添加される。その結果。

リポソーム調製中に、この脂質は、薬剤で促進される脂
質酸化損害から保護される。キレート化剤の水溶液を添
加することによりリポソームを調製する方法は下記に述
べる。ここでは、この方法で形成されるリポソーム懸濁
液が、バルク水相中およびカプセル化された状態（すな
わち、水性の内部リポソーム領域内で）の両方に、キレ
ート化剤を含有することのみが注目される。他方、この
キレート化剤は、リポソーム形成後の懸濁液中に含有さ
れ得る。

本発明を支持して実施される実験では、α−下およびフ
ェリオキサミンの両方を含む組成物における脂質成分お
よび薬剤成分の保護の程度について検討した。ひとつの
研究では、実施例１に示すように、５０μＨフエリオキ
サミンの存在下または非存在下のいずれかにおいて、　
ＤＸＲおよびα−下を含有するリポソームが事実上調製
された。次いで、この薬剤／リポソーム組成物を、４℃
、酸素欠乏条件下で１時間保存し、クロロホルム／メタ
ノールを用いて常法によりこの脂質を抽出した。

抽出された脂質をヘプタン中に溶解させ、　ＵＶスペク
トル（１９０−３００ｎｍ）を、複光束分光光度計を用
いて測定した。第５図は、キレートの存在下（スペクト
ルＡ）または非存在下（スペクトルＢ）において、イン
キュベートされた脂質について得られたスペクトルを示
す。第５図Ｂのスペクトルは。

共役ジエンの形成に対応する約２３３ｎｍにおける強い
ピーク、および共役トリエン形成に対応する約２７５ｎ
ｍにおける強いピークを示す。第５図Ａにおける実線ス
ペクトルは、ジエン形成およびトリエン形成がほとんど
、または全くみられない。スペクトルの差し引きは、ジ
エン形成およびトリエン形成が、フェリオキサミン含有
組成物において。

約９９％以上も抑制されたことを示す。

第２の研究では、実施例１に記述のように、窒素雰囲気
または空気中において、α−下およびフェリオキサミン
の存在下または非存在下で、　ＤＸＲ／リポソームが事
実上調製された。このことを下記表６に示す。上記に述
べた実験と同様に、このリポソームは２モル比３ニア：
４のＰＧ　：　ＰＣ：コレステロールから構成された。

α−下が含有されていれば、これは、約１．５モル％の
濃度で存在した。

フェリオキサミンは、含有されている場合、５０μＨの
濃度で存在した。このリポソームを、上記と同様、４℃
において１日間、酸素欠乏条件下で保存した。この薬剤
の化学的変異は、蛍光放射分光学により、および上記の
Ａ章で記述のように、薬剤におけるより親油性の種への
変化を検定することにより、検出された。

（以下余白） 表６の右端の欄は、この５つの組成物乙こ関し２゜ＤＸ
Ｒの親水性ｔｆＨｍ体の５９０１５６０ｎｍ蛍光強度比
を示す。このデータは、上述のように、２つのタイプの
薬剤変異を示す。これは、（１）より親水性のＤＸＲ生
成物を得るための糖部分の実行可能な分割、および（２
）この薬剤の５９０１５６０比に影響を与えるアントラ
セン環に対する損害、である。Ａ章からもわかるように
、この薬剤の５９０１５６０比は、非変異ＤＸＲにおい
て最大を示し、アントラセン環の変異に伴って減少する
。観察された比は、α−下のみおよびフェリオキサミン
のみが、薬剤変異に対する中程度の保護作用を示し、フ
ェリオキサミンとともにより大きな保護効果を有するこ
とを示す。重要なことに、α−下とフェリオキサミンと
の組合せは、いずれかの保護剤のみより、または２つの
個々の薬剤効果の合計から予想されるものより、ずっと
大きな保護効果をもたらした。観察された１、９という
値は、窒素下のリポソーム調製直後に観察された値と実
質的に同じであり、このことは、保存期間を通して、は
とんど完全に薬剤が保護され５ま たことを示す。

今、報告された研究では、フェリオキサミンの保護メカ
ニズムが、α−下の保護メカニズムとは定性的に異なる
ことが示唆される。フェリオキサミンは、主として過酸
化物の発生および他の初期の遊離ラジカル発生現象を抑
制するべく作用とするだろう。他方、α−下は、脂質二
重相中に伝播される遊離−ラジカル反応を抑制する作用
を示す。

トリヒドロキサム酸キレート化剤によって同様に抑制さ
れる箇所は、第３図の二重線で示される。

リポソーム中の過酸化損害に対するトリヒドロキサム酸
キレートの抑制効果も、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）のような通常の四節酸タイプのキレート化剤をリ
ポソームへ添加したとき、観察される過酸化刺激効果と
は対照的である。トリヒドロキサム酸と四節酸キレート
化剤との間に認められた相違（リポソームにおける過酸
化損害に対する保護能力の点において）は、この２薬剤
種の用いろる鉄配位部位の数の違いによると思われる。

トリヒドロキサム酸キレート化剤は、６つの第二鉄配位
部位の全てに対して、八面体リガンド結合を形成し得る
ものの、四節酸キレート化剤では。

４つの部位の結合に限られ、残りの２つの鉄配位部位は
、レドックス反応への関与に対し有用である。この点に
おいて、　ＤＴＰＡ　（五酢酸キレート化剤）も、脂質
および第二鉄の存在下で、インビトロにおけるアントラ
キノン変異に対する保護効果を示す。このことは、５つ
の配位部位も、レドックス反応に関与する鉄を減少させ
るのに効果的であることを示唆する。

（以下余白） Ｄ、韮ノル輩しリ」竪 薬剤含有リポソーム懸濁液を調整する方法は。

５ｚｏｋａ等によって再考慮された様な従来のリポソー
ム網製方法に従うこととする。ひとつの好ましい方法で
は、小胞−形成脂質を、適切な有機溶媒もしくは溶媒シ
ステムから採り出し、真空中あるいは不活性ガス下で乾
燥させて脂質フィルムとする。薬剤は、フィルムを形成
する脂質中に含有されるのが好ましい。脂質溶液中の薬
剤の濃度は。

リポソームにおける最大薬剤導入を得るために。

リポソーム中の最終的最大薬剤濃度のモル過剰であるこ
とが好ましい。実施例１に示されたリポソーム／ＤＸＲ
組成物の調製において、脂質フィルムは。

約２＝１０の最終的薬剤ニリン脂質濃度にて、　ＤＸＲ
の水性懸濁液を用いて水和した。これにより、遊離１）
ＸＲの除去後、約１０モル％のＤＸＲ？ｉ度を有する小
胞が生じた。

乾燥脂質もしくは脂質／薬剤を水和する時に用いられた
水性培地は、非経口的液体置換に用いられる様な生理学
的に適合した培地、好ましくは発熱因子を含まない生理
食塩水である。この溶液をキレート剤の滅菌溶液と混合
して、所望の最終キレート濃度とし、フィルムへ添加し
た後、脂質を。

速く　（振盪させる）もしくはゆっくり（振盪させない
）と水和させる。脂質水和物は、大きさが典型的に約０
．５ミクロンから１０ミクロンの間、もしくはそれ以上
の範囲にある多層板状小胞（ＭＬＶ）の懸濁液を形成す
る。一般的に、上記の方法におけるＭＬＶの大きさ分布
は、振盪しながら脂質フィルムをより速く水和させるこ
とによって小さなサイズへ変えることが可能である。リ
ポソームは、水性相濃度とほとんど等しい濃度の被包性
キレート剤を含有している。

Ｅ、リポソームのサイズ＼ リポソーム懸濁液について、およそ１ミクロンより小さ
いサイズ範囲の小胞の選択的サイズ分布を得るためにサ
イズ分類を実施する。さらにその大きさは、　０．０５
〜０．５　ミクロンが好ましく、０．０５〜０．２５ミ
クロンの範囲がより一層好ましい。このサイズ分類は５
大きなリポソームを取り除き、最適な薬動力学的特性を
備えた特定のサイズ範囲を決めるのに役立つものである
。

リポソームのサイズおよびサイズの不均質性を減少させ
る方法がいくつか存在する。リポソーム懸濁液について
、パスソニケーションもしくはプローブソニケーション
の技法により音波破砕を実施することによって、約０．
０５ミクロンより小さいサイズの小単層板状小胞（ＳＵ
Ｖ）まで、サイズを漸次減少させることができる。約０
．２　ミクロンもしくはそれ以下にまでリポソームのサ
イズを減少するために用いられた音波破砕方法について
は、実施例Ｉにおいて述べる。ホモジナイゼーションは
。

大きなリポソームを小さなリポソームへ分割する剪断エ
ネルギーに依存するもうひとつの方法である。典型的な
ホモジナイゼーションの方法においては１選択的なリポ
ソームのサイズ、典型的にはおよそ０．１〜０．５　ミ
クロンの間の範囲、が観察されるまで、　？ＩＬＶを、
標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して再循環さ
せる。この両方の方法においては１粒子のサイズ分布に
ついて、従来のレーザー光線粒子サイズ識別法を用いて
検査することができる。

小孔ポリカルボネート膜を通してのリポソームの押出は
、リポソームのサイズを、比較的良く特定されたサイズ
分布（膜孔のサイズに依存して。

平均約０．１と１ミクロンの間の範囲にある）にまで減
少させるための効果的な方法である。典型的には、所望
のリポソームのサイズ分布が得られるまで、懸濁液を膜
を通して数回循環させる。リポソームのサイズを段階的
に減少させるために、リポソームを孔が連続的に小さく
なっている膜を通して押出させる。

１ミクロンより小さい選択された闇値以下のサイズの粒
子を有するリポソーム懸濁液を生成するのに用いられる
他の方法として、遠心分離ならびに分子ふるいクロマト
グラフィーがあげられる。

これらの２つの方法は、大きな粒子を小さな粒子へ変化
させるというよりはむしろ、大きなリポソームを優先的
に取り除くというものである。従ってリポソーム収量は
低下する。

ＤＸＲ／リポソームの生体分布ならびに薬剤クリアラン
スをリポソームサイズの関数として、調べることを目的
とした研究が本発明者により実施され。

早期に報告されている（Ｇａｂｉｚｏｎ　１９８２．１
９８３）。

適用を確認するために実施された最近の研究は。

ＤＸＲの投与後１，５．および２４時間におけるＤＸＲ
の器官分布を検討したものであり、　ＤＸＲは遊離型も
しくは、３５±１４ｎｍあるいは１１５　±２５ｎｍの
中央値を示ずサイズを有するリポソーム中に含まれる。

この研究の結果を表７に示す。各時間におけるデータは
、３匹の動物の平均値を表したものである。

（）内に示した器官重量も、３匹の平均値として計算さ
れたものである。

（以下余白） 表　　　７ 表７のデータは２次のことを示している。すなわち、遊
離薬剤と比較した場合、リポソーム、特に１１５　ｎｍ
リポソームでは、肝臓および肺臓において薬剤レベルが
増加していること、心臓、肝臓。

腸、腎臓および骨格筋においては薬剤レベルが減少して
いることを示している。従って、リポソームは肝臓およ
び肺臓に局在した腫瘍の治療に特に有効であり、また非
標的組織、特に心臓、における薬剤レベルに関係する毒
性を減少させるのに効果的である。データに示されてい
る１１５ｎｍリポソームのもうひとつの重要な利点は、
肝臓および肺臓組織におけるゆるやかな薬剤クリアラン
スである。小さな（３５ｎｍ）リポソームを投与した動
物における薬剤クリアランスは、遊離薬剤のそれに良く
類似したものであった。１１５ｎｍ小胞を用いて観察さ
れた。改善された生体分布および長いクリアランス時間
は、約０．０５ミクロンまで低下したサイズ範囲のリポ
ソームにおいて観察される。この範囲以下では、示され
るように、薬剤分布およびクリアランス特性が遊離薬剤
のそれに接近し始める。

薬剤負荷因子（薬剤／リポソーム脂質の量）がＳＵＶ中
において比較的低く、これはおそら＜５ＩＩＶ二重層の
無理な構成のためであること、さらに、　ＳＵＶは、血
漿中において、大きなサイズのリポソームより安定性が
低いこともわかった。

様々な理由のため、リポソームのサイズの最適上限はお
よそ０．５ミクロンであり、好ましくは約０．２５ミク
ロンである。第１に肝臓の洞様毛細血管および実質、肺
臓ならびに骨髄の様な所望の標的組織部位は、約０．２
５ミクロンより小さなリポソームに対してより敏感であ
る。第２に、　０．２５ミクロンのサイズ範囲のリポソ
ームは、深いフィルターを通して濾過することによって
、容易に滅菌し得る。小さな小胞は、また、保存中に凝
集する傾向が少なく、従って、この組成物を非経口的に
投与した場合に起こり得る深刻な問題を減少させること
がわかっている。最後に、サブミクロンの範囲までサイ
ズ分類されたリポソームは、そのサイズの均一性が高い
ため、一定した生体分布および薬剤クリアランス特性を
示す。

Ｆ、逆ＪＬｉ剤１１１友 遊離薬剤、すなわち培地の水性相に存在する薬剤は、遊
離薬剤に対するりポソーム導入の割合を増加させるため
に、取り除くことが好ましい。このことは、リポソーム
中の薬剤／脂質比を最大にするために、リポソームが薬
剤過剰の条件下で調整された場合に特に有益である。例
えば実施例１に述べられた調製条件下において、リポソ
ームは。

最初に添加された全ＤＸＲの約５０から６０％の間を取
り込み、残りの４０〜５０％は遊離ＤＸＲであった。薬
剤の除去は、遊離最終濃度を１組成物中に存在する全薬
剤の約２０％より低く好ましくは、約１０％より低く減
少させるために行うものである。

遊離アントラキノン薬剤をリポソーム懸濁液から取り除
く方法がいくつか存在する。上記の様に。

サイズ分類されたリポソーム懸濁液は、高速遠心分離に
よってペレットにし、上澄液中には遊離薬剤および極め
て小さなリポソームが残存する。または、大きなリポソ
ーム粒子を、溶質（遊離薬剤）分子から分離するために
ゲル濾過も用いられる。

溶出緩衝液中にキレート剤を含めること、もしくは、溶
出されたリポソームへキレート剤を添加することが必要
であることは言うまでもない。というのは、ゲル基質自
体が、最初の懸濁液からキレート剤を取り除くと考えら
れるためである。

遊離薬剤を取り除くためのひとつの好ましい方法は、リ
ポソーム結合型ではなく遊離型の薬剤と結合できるイオ
ン交換樹脂を利用することである。

ＤＸＲを用いる場合、好ましい樹脂は、陽イオン交換樹
脂である。というのは、中性ｐＨにおいて、薬剤は陽性
荷電されるためである。イオン交換によるひとつの利点
は、薬剤投与中、薬剤組成物が容器から注射部位へ流れ
る際に遊離薬剤が連続して取り除かれるということであ
る。このシステムは。

実質的に全ての遊離薬剤を懸濁液から、また、リポソー
ムから水性相への薬剤の漏れが発生する前に投与したリ
ポソームから取り除くことができるという利点を有する
。このシステムはまた。樹脂を適切に選択することによ
って、遊離発熱物質を取り除く点においても効果的であ
る。

２、　　　几　にお番る山　・ 上記で考察したように２本発明による研究は。

次のことを証明している。すなわち、小さな薬剤保有リ
ポソームは、小さなリポソーム（サイズが約０．２ミク
ロンより小さい）に対して敏感である肝臓の洞様毛細血
管および実質、肺臓および骨髄の様な組織部分に、リポ
ソームを伴う薬剤を濃縮させることができる。これらの
発見は、肝臓の転移性疾患、原発性肝臓癌、リンパ球増
殖疾患ならびに白血病（すべてが主要な癌である）を治
療する上で、その数ならびに地理的分布の両方の観点か
ら重要な意味を持つものである。

最も効果的な抗腫瘍薬剤のひとつであり、多くの場合に
おいて選択されている薬剤はＤＸＲ、関連したアントラ
サイクリングリコシド化合物、もしくはミドキサントロ
ンである。これらのアントラキノン薬剤について、改善
された抗腫瘍治療の試みは、薬剤の治療効果を減少させ
ることなく、リポソームの治療的組成物の毒性および副
作用を減少させることにある。ＤＸＩ？に関しては、こ
の薬剤は心筋に対する極めて特異的な毒性を示すが９本
発明者は２次のことを証明している。すなわち。

ＤＸＲ／リポソーム組成物は、適切に処方されれば。

心筋による薬剤の取り込みを有意に減少させることがで
き、さらに同じ用量の遊離ＤＸＲで処理したマウスにお
いてみられる激しい組織病理学的変化を減少させること
ができるということである。

毒性のもうひとつの源は、リポソーム組成物の脂質およ
び薬剤成分に対する酸化的損害である。

第１節で述べたように、アントラキノン薬剤は。

脂質の存在下で過酸化反応を積極的に促進し、これは、
薬剤／リポソーム組成物における脂質成分および薬剤成
分の両方に有意な修飾をもたらすことになる。修飾され
た組成物は毒性が高く、これは、脂質に対する過酸化的
損害および、薬剤の漏れの増加に起因すると考えられる
。さらに、薬剤自体は、修飾によって治療的効果を失う
ものと思われる。

本発明に従って調製されたＤＸＲ／リポソーム組成物（
Ｌ−ＤＸＲ）の毒性ならびに治療効果については。

実施例２−５において検討する。実施例２は、リポソー
ム型で有意に高い用量のＤＸＲが死亡を伴うことなく、
投与できることを証明している。その結果を、第７図に
要約する。段階的用量の遊離薬剤（Ｆ−ＤＸＲ）および
１．−ＤＸＲの繰り返し投与の効果を検討する実施例３
においては、　Ｌ−ＤＸＲ治療をＦ−ＤＸＲと比較した
場合、（ａ）死亡率、（ｈ）体重の減少、（Ｃ）血中コ
レステロールおよびトリグリセリドレベルの変化、およ
びｆｄｌ器官病理学において有意な減少が観察される。

転移性ならびに原発性肝臓癌を含む様々なタイプの癌を
患う症例の治療のために、　Ｌ−ＤＸＲを用いた臨床試
験が実施されてきた。最初のＹ１ｎ床試験については、
実施例４に報告されている。ここでの結果は、全症例に
おける満足すべき有意な改善を示しているが、これは、
胃腸毒性（悪心、嘔吐。

下痢および胃炎）の発生頻度の有意な減少によるものと
思われる。

Ｌ−ＤＸＲの治療的有効用量での薬剤の毒性ならびに副
作用を検討するために長期にわたり実施されてきた臨床
試験については、実施例５にまとめる。

これらの研究においては、悪心および嘔吐の発生頻度の
有意な減少が観察されているが、その値は。

約２０から５５％の間という遊離薬剤レベルから約６％
への減少であった。さらに、全体的および部分的脱毛の
発生頻度においても有意な減少が観察され、約８５から
１００％の間という遊離薬剤レベルから約４６％への減
少であった。本試験において投与されたＬ−ＤＸＲの用
量は、ヒトにおける癌の化学療法において用いられる遊
離薬剤用量に匹敵するものである。従って５本発明は、
１つの観点において、悪心および嘔吐の発生頻度を有意
に減少させる方法を提供するものである。これらの症状
は。

ヒトに対するドキソルビシンの静脈内投与（巨丸剤注射
のかたちで）に伴ってみられるものである。

この方法は、リポソーム中へのドキソルビシンの導入を
伴い、治療的に有効な量のリポソームを“ｆａｓｔ−ｄ
ｒｉｐ　　（高速点滴）”注射を用いて静脈内へ投与す
るものである。ここで、ｆａｓｔ−ｄｒｉｐ　（高速点
滴）”とは、　Ｌ−ＤＸＲ製剤の治療的に有効な用量を
投与するのに、数分から数時間を要する巨丸剤もしくは
点滴の型での静脈内あるいは動脈内投与を意味するもの
とする。

本発明の確認のために実施された薬物動力学的研究では
、　ＤＸＲのリポソーム放出は、ゆるやかな放出パター
ンを示すことが示唆されている６遊離型（実線）および
リポソーム型（破線）で投与されたＤＸＲの典型的な放
出動態については、第９図に示す通りである。このデー
タは、長期臨床試験における症例の血漿標本を分析する
ことによって得られたものである（実施例５）。この図
に描かれた薬剤濃度曲線は、２乗指数曲線に対する適合
度によって分析され、速い分布用およびゆっくりとした
終末相によって描かれている。この図かられかる様に、
＠離およびリポソームＤＸＲの両方が。

分布用を通してほとんど同じ半減期を示しており。

約１０〜１５分と算出された。しかしながら、終末相で
は、遊離薬剤の半減期は約２５時間であるが、一方、リ
ポソーム薬剤のそれは６７時間である（６研究の平均値
）。このデータから、リポソーム製剤は、血流への薬剤
の制御されたゆるやかな放出をもたらす点において効果
的であると考えられる。

実施例５において報告された臨床試験も２次のことを証
明している。すなわち、　ＤＸＲをリポソーム型で投与
するだめの本発明の方法は、肝臓の原発性および二次性
新生物の両方に対して治療的に有効であるということで
ある。原発性もしくは二次性の肝臓新生物を伴う症例の
約％において治療的反応が観察されており、ここでは、
　Ｌ−ＤＸＲば静脈内もしくは、動脈内へ投与されたも
のであった。

試験に参加した症例のすべてが、他の治療方法（数症例
においては、遊離ＤＸＲの静脈内もしくは動脈内投与も
含む）に対して、治療抵抗性を示したか、もしくは示す
ようになった。従って９本発明は、もうひとつの観点に
おいて２次の工程により原発性および二次性肝臓新生物
の治療方法を含むものである。ｆａ）リポソームの大き
さがほとんど約０．０５および０．２５ミクロンの間で
あり、少なくとも約２．５モル％のＤＸＲもしくは薬理
学的に満足すべき類似体や誘導体を含有するリポソーム
の水性懸濁液を提供すること、およびｆｂｌ薬理学的に
満足すべき量の組成物を、血流を通して症例に投与する
こと。

次に述べる実施例は３本発明の数々の方法および組成物
について説明するためのものであるが。

その範囲を制限するものではない。

物質 アドリアマイシン（ドキソルビシンＨＣＩ、ラクトース
を含有）はファーミクリア（ミラノ、イタリア）より、
リン脂質（クロマトグラフィー検査によって９９％を上
まわる純度を有する）はリピドプロダクト（サワー。イ
ギリス）もしくはアバンティ　リピド（バーミンガム、
　ＡＬ）より、コレステロール（クロマトグラフィー検
査により９９％を上まわる純度を有する）、生理的食塩
水はバクスター　トラベノール（アシュドソド、イスラ
エル）より、フェリオキサミン（Ｄｅｓｆｅｒａｌ）は
チバガイギー（バーゼル、スイス）より、また（α−Ｔ
）はシグマ　ケミカルズ（セント　ルイス、ミズーリ）
よりそれぞれ調達されたものである。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

小胞形成脂質溶液は、　　１００ｍｆクロロホルム中。

３６０■のコレステロール、　３３ｍｇのＱ！　　７．
１７５０ｍｇの卵ＰＣおよび７５０■のＰＧ　（卵、ナ
トリウム塩）を含有していた。脂質成分のモル率はＰＣ
：　ＰＧ　：コレステロール（７：　３　：　４）であ
った。この溶液を分割し、２個の５００ｍｆｆ丸底フラ
スコへ入れ、真空下でロータリーエバポレーターを用い
て蒸発させた。さらに、凍結乾燥皿中において、−夜１
５０ｍＴｏｒｒ圧にて凍結乾燥させることによって、有
機溶媒の除去およびフィルムの乾燥を行なった。

薬剤溶液は、フェリオキサミン（〜５０μＭ）を含有す
る食塩水（無菌１発熱物質を含まない生理的ＮａＣ１溶
液）中に溶解させた３００■のＤＸＲ（５０ｎｗのドキ
ソルビシンＨＣＩおよび２５０■のラクトースをそれぞ
れ含有する６本のガラスびん）を含有していた。最終的
な溶液は、全容量６０Ｔｎｊ！中、　ＤＸＲを５　ｍｇ
　／　ｄの割合で、そしてフェリオキサミンを３０μｇ
　／　ｍＡの割合で含有していた。このＤＸＲ溶液を。

脂質フィルムを含む丸底フラスコへ入れた（３０ｍｌ／
フラスコ）。この当初のリン脂質−ＤＸＲモル比は１０
：２であった。混合物を渦状に攪拌し９次に。

１５〜２０℃において２時間、１００ストローク／分で
振盪器を用いて平衡化させた。

得られた多重層小胞（ＭＬＶ）分散物については。

２インチのサファイア付探針（Ｖ２−ｉｎ　５ａｐｐｈ
ｉｒｅ−ｂｏｎｄｅｄ　ｐｒｏｂｅ）を用いた超音波照
射によって音波破砕を行なった。この破砕は最適な出力
状況下で１５分間（６０％、もしくは音波破砕時間９分
）のパルス音波破砕であった。音波破砕は、容器を氷水
に浸しながら、窒素（もしくはアルゴン）気流下で行な
った。音波破砕方法を、　　３８０ｎｍ波長における分
散の光学濃度を測定することにより、標準化した。特に
２食塩水分散液の１：１００希釈液が０．９を下まわる
０、０．値を示すまで、音波破砕を実施した。０．Ｄ、
値が０．９を越える場合には、さらに゛３分間音波破砕
を続けた。ＭＬＶ分散物の当初の０．Ｄ、値は、　Ｌ３
００〜１　、５００の範囲である。音波破砕された分散
物は、ベンチ−トップ（ｂｅｎｃｈ−ｔｏｐ）の遠心分
離器で遠心分離を行い（２，ＯＯＯｒｐｍ、　１０分間
）チタンの大粒子を取り除いた。または、　０．０．値
が０．９を下まわるまで、０．２μｍ孔のポリカーボネ
ート膜を数回通過させることによって、リポソームを排
出させた。遊離薬剤は、超遠心分離によって取り除いた
。サイズによって分類されたリポソームを、０．２ミク
ロンのポリカーボネート濾過器を用いて濾過することに
より滅菌した。

滅菌されたリポソームは、４℃の暗所において。

真空密封滅菌ガラスびんに保存した。このＤＸＲ含有リ
ポソーム（Ｌ−ＤＸＲ）は１次の特性を示していた；（
ａ）リポソーム中の全ＤＸＲは、薬剤の最初の量の５０
％を越える量であった； （ｂｌリン脂質濃度（存在する有機リン酸塩によって測
定）は、１０〜１３μモル／　ｍｌであった；（Ｃ）ｉ
離ＤＸＲの量（セファデックスＧ−５０カラムを通過前
後のＤＸＲ／リン脂質モル比により測定）は、全ＤＸＲ
の５％を下まわった； （ｄ）サイズの分布は、　０．０５〜０．２　ミクロン
であった； （ｅ）脂質酸化〔フレイン（旧ｅｉｎ）の方法の修正法
により測定〕は、全リン脂質の１％以下であった（これ
は、ジエン結合に起因する２３３ｎｍにおける異常スペ
クトル吸収に基づ＜）； （ｆｌヒ１〜血漿における安定性（３７’ｃ、　　１時
間にわたる５０％血漿中のＤＸＲリポソームのＤＸＲ保
持により測定）は、８０％を越えた； （ｇ）リポソームは無菌性であった〔このことは。

リポソーム懸濁液３〜４　ｍｌを、　Ｂｅｃｔｅｃ　７
　ｍｌ、びん（好気性および嫌気性微生物培養）中へ添
加（７日間）することにより決定した）　；そして。

（ｈ）ウサギを用いた発熱性試験は陰性であった。

このリポソーム懸濁液は、冷蔵庫温度において３ケ月間
にわたり上記特性のいずれも有意な変化がみられず、安
定であった。

実施例１と同様に、最終ＤＸＲ儂度が、　　１．１．５
゜２および２．５■／ｍβとなるように、　Ｌ−ＤＸＲ
を調製した。それに相当するリン脂質濃度は、それぞれ
１６、２４．３２および４０μモル／　ｍｅであり、そ
して。

コレステロール濃度は、それぞれ６．４．９．６．１２
．８および１６μモル／成であった。遊離ＤＸＲ（Ｆ−
ＤＸＲ）は。

最終濃度が１．１．５．２および２．５■／　ｍｌとな
るように、無菌性で発熱物質を含有しない生理的食塩水
中で調製された。

ＢＡＬＢ／　Ｃａマウスの静脈内へ、４種の異なった用
量（１０，１５，２０および２５ｍｇ／ｋｇ）のＦ−Ｄ
ＸＲおよびＬ−ＤＸＲを投与した。上記用量は、マウス
の総体重の約１％に相当するＦ−１）Ｘｌｉ’もしくは
１．−りにＲ製剤の量である。９０日間の期間について
記録された生存率曲線を第７図に示す。第７図から明ら
かなように、リポソームカプセル化型においては薬剤の
毒性が顕著に減少する。１５および１０■／　ｋｇのＬ
−ＤＸＲによる処理を行なったマウスにおいては死亡例
は記録されておらず、２０■／　ｋｇの注射を受けたマ
ウスの６０％が９０日間を通して生存した。Ｆ−ＤＸＲ
は。

２５、２０および１５■／　ｋｇの注射群において１０
０％の死亡率をもたらし、　１０■／　ｋｇ注射群にお
いては。

２０％の死亡率であった。

死亡のパターンは種々であり、あるマウス（特に、高用
量処理群のマウス）は、注射後最初の２週間以内（２５
■／ｋｇ　Ｌ−ＤＸＲ処理群の場合は１力月）に死亡し
、そして、他のマウスについては、薬剤投与後６〜７週
間もしくはそれ以上径た有意に遅い時期に死亡した。急
性期に死亡したマウスの剖検は、過剰分泌および腸ルー
プの拡張を伴う重篤な胃腸毒性を示していた。一方、遅
滞期に死亡したマウスにおいては、最も有意な所見は２
体重の減少および腹部器官の無力性であった。

実施例１と同様に、最終ＤＸＲｔＭ度が０．５．０．７
５および１．０■／　ｍｄｌとなるように１．−ＤＸＲ
を調製した。

それに相当するリン脂質濃度器よ、それぞれ８．１２゜
および１．６ｔｔモル／　ｍｌであり、コレステロール
濃度はそれぞれ３．２．４．８および６．４　μモル／
　ｍｆｌである。

遊離ＤＸＲ（Ｆ−ＤＸ）ｌ）　ハ、　（−）最終濃度が
０．５．０．７５および１■／　ｍｄｌとなるように、
無菌性で発熱物質を含有しない生理的食塩水中で調製さ
れた。

５ａｂｒａマウスを１５匹ずつの群に分けた。３種の異
なった用量（５，７，５および１０■／　ｋｇ体重）の
Ｆ−ＤＸＲもしくはＬ−ＤＸＲについて試験を実施した
。

族１５匹ならびに雌１５匹のマウスについて、各用量レ
ベルで試験を行なった。実験０．１４．２８．４２゜５
６、７０．８４および９８日に１尾静脈がらの巨丸剤注
射（ｂｏｌｕｓ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行うことによ
り処理用薬を投与した。パルス（ｐｕｌｓｅｄ）注射方
法は、高蓄積用量を達成するため、薬剤に対する動物の
暴露期間を長くするため、そして、臨床業務において１
）ＸＩ？が一般的に投与されている方法を模倣する目的
のために用いられた。−回の注射後に認められた毒性（
実施例２）を考慮し、急性毒性の発現が減少するもしく
はゼロとなるように、　ＤＸＲを最大１０ｍｇ／ｋｇの
用量で投与した。連続する処理による骨髄の抑制の重な
りを避けるために９次の注射までに１４日間の間隔があ
けられた。このことは、１０■／ｋｇのＤＸＲによる処
理後の肺臓における骨髄様中枢の完全な回復が、薬剤投
与７〜１２日後に起こったという上記観察結果に基づい
たものである。

一連の実験期間中、毎日マウスを観察し生存曲線を記録
した。可能な限り死亡マウスを剖検し。

器官の標本を組織病理学的検査に送った。血球の測定お
よび体重の測定を毎週行なった。血球の測定は、眼窩後
部の血液側から採取した２０μｌのサンプルについて、
コールタ−（Ｃｏｕｌｔｅｒ）分析Ｂヲ用いて実施した
。各群のマウスの１７３を、４２日目（３回目の注射後
）に殺した。次の１７３を、８４日目（６回目の注射後
）に殺し、残りのマウスは１８０８０日目回目（最後）
の注射８２日後）に殺した。

生化学的検査のための血清を得るために、死亡させる前
に、軽いエーテル麻酔下でマウスから採血を行なった。

動物を解剖し、器官を取り出し１重量を測定した後、　
Ｂｏｕｊｎ溶液中に固定した。そして、ヘマトキシリン
ーエオシンーフォスフォモリブデン酸（淡緑色染色）を
用いて光学顕微鏡検査を実施した。

（ａ）生存及対を土苅来 雄および雌マウスの生存曲線を第８図および第９図に示
す。有意の死亡率は、遊離薬剤の注射を受けた群すべて
において観察された。これとは対照的に、１８０日後の
１００％の生存が、中等用量（７，５■／ｋｇ）および
低用量（５■／に＋ｒ）のＬ−ＤＸＲの注射を受けた群
において観察された。高用量（１０■／ｍりのＬ−ＤＸ
Ｒは、かなりの割合の死亡率をもたらしたが、８０■／
　ｋｇのＤＸＲ蓄積用量において低用量群のマウスが生
存した。Ｆ−ＤＸＲの高用量および中等用量を用いた雌
マウスに比べて、雄マウスにおいて高い毒性傾向がわず
かにあった。

（ｂｌ　　　血の血゛　に、するｔ 各注射７日および１４日後に血球を測定した結果では、
白血球数についてのみわずかな減少を示していた。Ｆ−
ＤＸＲおよびＬ−ＤＸＲ処理群間における有意差はなか
った。実験期間中に、ヘモグロビン濃度は容易に評価で
きるほど影響を受けなかった。

（Ｃ）　　重および　への重　に対するｔ１０ｗ／ｋｇ
用量レベルのＦ−ＤＸＲもしくはＬ−ＤＸＲの繰り返し
投与が体重および器官重量におよぼす効果を表８に示す
。重量測定は、最初の薬剤投与後４２、８４および１８
０日後に実施した。体重および器官重量は未処理マウス
に比較して％で示されている。この３回の各測定時にお
ける生存率（％）を表の１番上に示す：ダッシュ（−）
は、生存マウスのないことを示す。

異なった実験群の肝臓、肺臓、腎臓および心臓の重量を
比較した場合、　Ｆ−ＤＸＲが３回の注射（４２日）お
よび６回の注射（８４日）の後にがなりの体重減少をひ
きおこすことが、明らがである。Ｌ−ＤＸＲ処理は、１
８０８０日目マウスを除いて有意な器官重量の減少をひ
きおこすことはなかった。

高用量ＤＸＲの一回注射を受けた動物において観察され
る急性毒性列（実施例２）とは異なり、複数回の注射方
法においてみられる死は、一般的に。

腹部および皮下脂肪の消失に伴う体重減少、器官の収縮
および胃腸毒性の欠如などで特徴づけられた。投与用量
が少なければ少ないほど、死亡マウスの体重および器官
重量の減少が少ないと判断される。７．５もしくは５■
／ｋｇ　　Ｌ−ＤＸＲの複数回投与を受けた雄および雌
マウスのすべてが、１８０日まで生存した。７．５およ
び５■／ｋｇのＦ−ＤＸＲによる処理後に死亡した動物
においては、しばしば。

胸膜および腹膜滲出２心臓肥大、および肺欝血を示した
。１０■／蹟のＦ−ＤＸＲによる処理を受けたマウスに
おいてのみ認められた所見は、後脚の顕著な衰弱であっ
た。これは骨格筋における組織病理学的所見によって説
明できず、神経障害効果に関係するものと考えられる。

（以下余白） 表　　　８ 体重および器官重量（％） １０注射後の日数 （ｄ）血液注化ｊ１し２拌すｊじ弧肢 グルコース、コレステロール、トリグリセリド。

尿素、尿酸、クレアチンおよび総蛋白の血液中のレベル
を、　４２．８４および１８０日目定日定した。アルカ
リフォスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフ
ェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの血
液酵素レベルについても、これらの時点で検定した。

Ｆ−ＤＸＩ？およびＬ−ＤＸＲ投与間の血液化学におけ
る最も重要な差は、血中グルコース、コレステロールな
らびにトリグリセリドレベルにおいて観察された。これ
らの差は下記の表９にみられる。この表は、１０■／　
ｋｇのＦ−ＤＸＲもしくはＬ−ＤＸＲを投与した雌マウ
スのデータについてのものである。グルコース、コレス
テロールおよびトリグリセリドレベルは、対照（未処理
）動物に対する％で表し。

”　ｎｍ”は”　ｎｏｔ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　（測定せ
ず）″を意味する。

この表かられかるように、遊離薬剤による治療を受けた
動物においては、血中グルコース、高コレステロール血
症ならびに高血糖症の低減がみられる。これとは対照的
に、　Ｌ−ＤＸＲ処理については。

血中グルコースの減少は１８０日においてのみ、観察さ
れた。そして、コレステロールおよびトリグリセリドレ
ベルの上昇は、１８０日目定日いてさえも観察されなか
った。

表には示されていないが、低用量（７，５および５ｍｇ
／ｋｇ）の遊離薬剤を投与した動物においては。

１８０日においてクレアチンレヘルの上昇が観察された
。これは１重篤な腎機能障害を示す。クレアチンのレベ
ルの上昇は、　Ｌ−ＤＸＲ処理マウスにおいては、１０
■／　ｋｇ用量においてさえ観察されなかった。

Ｆ−ＤＸＲもしくはＬ−ＤＸＲで処理した動物において
は、肝酵素（アルカリフォスファターゼおよびアミノト
ランスフェラーゼ）の増加は観察されなかった。しかし
、この再実験群において、１８０日においてアラニンア
ミノトランスフェラーゼの低下が起こった。

（以下余白） 表　　　９ 血液化学の変化 組織病理学試験によって、遊離薬剤投与と比較して、　
Ｌ−ＤＸＲを投与した動物の病理学的傷害、特に腎臓、
心臓および卵巣における傷害、が低減することが示され
た。

８例の癌患者について、実施例３のＬ−ＤＸＲ組成物を
用いて治療を実施した。薬剤の投与は１等張性食塩水中
に約０．５ｍｇ／ｍｅの濃度の、“Ｖｏｌ　ｓｅｔ″１
２０ｍｆｆを用い、そして、２〜３ｍ１７分の割合で行
った。動脈内注射については、螺動性ポンプを使用し、
注入割合は〜１．５ｄ／分とした。２患者は。

既にリポソーム薬剤を（動脈内から肝内へ）投与してお
り、このとき副作用は認められていない。

これは、あらかしめとりつけたポンプを利用して行なっ
た。両患者において、ポンプによる肝の還流については
５あらかじめＴｃ−９９標識化巨大凝集アルブミンスキ
ヤンを用いて検査を行った。

白血球に影響をおよぼす一時的な骨髄抑制が２患者にお
いて観察された二つまり、３日目の投与（最高用量投与
、　　１００■ＤＸＲ）後の患者＃３（表１０）および
８０■ＤＸＲ投与後の患者＃６　（Ｘ線照射および５−
フルオロウラシル、およびマイトマイシン−Ｃを用いて
前処置を実施）である。患者＃３における最低点は、　
１９００細胞／　ｎ　’であり。

患者＃６のそれは２３００細胞／１３であった。

脱毛については、患者の５０％のみについて有意であっ
た。発熱物質を含まないバッチからのＬ−ＤＸＲの投与
に関連する熱が２例に観察された。悪寒が体温の上昇に
先立ち、熱は３９℃から４０℃に達した。

これは、治療後数時間後に発症した。両症例共。

自己軽減がみられた。２患者のうち１患者については、
熱は、　Ｆ−ＤＸＲの投与後の一定の特徴であった。急
性（悪心、嘔吐、下痢）および遅延性（胃炎）のどちら
の胃腸毒性も、これら患者のいずれについても観察され
なかった。治療後の心電図の変化は認められなかった。

いずれの患者についても注射部位の局所病が認められな
かった。

肝癌を患い、これまでにいくつかの薬剤（１）ＸＲを含
む）による治療効果が得られなかった患者において、動
脈内に投与（注射）されたＬ−ＤＸＲが肝腫瘍の有意な
収縮をもたらした。この治療を受けた患者の詳細につい
ては、下記の表１０にまとめる。

（以下余白） 診憇　　　　　−Ｌ６　　　呻峙外１１馳　　　旺　　
　 ＄　　　８　　　く １−１−　　髪　　　へ ＋１−区　　　々　　　　・Δ へＩト　　〜　　　　ヤ　。

−Ｘ若　　収　　　トド 自彰　　帥　　　団 公キ　　簗　　　コ杓 訳、　　ぜ。　　！５ 懐　　　懐 悩　　　埋　　　嵩 実１津ｉ 実施例４で用いたのと同様のＬ−ＤＸＲ処方を用いて、
　Ｌ−ＤＸＲの１回および複数回投与治療に対する急性
および遅延性反応を調べるため、１９例の癌患者につい
て、補足臨床実験評価を行なった。

本実験における患者の適性についての基準は。

次のとおりであった。

（ａｌ肝および／または造血部位における顕著な新生物
を有すること； （ｂｌ従来の治療による効果が得られないこと；（Ｃ１
患者がこれまでに遊離ＤＸＲを投与されている場合、　
Ｆ−ＤＸＲプラスＬ−ＤＸＲの全蓄積用量が、５５０■
／鶴２体表面積を越えないこと； （ｄ）心疾患が認められず、正常左心室抽出率（ｅｊｅ
ｃｔｉｏｎ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）を有すること；および
（ｅｌ同意が得られたこと。

患者の特性は、下記の表１１に示す。

（以下余白） 表　　１１ 本実験のひとつの目的は、治療に有効な用量レベルにお
ける急性および遅延性毒性、ならびに副作用を評価する
ことであった。本実験において用いられたコースあたり
の用量、および患者あたりのコースの総数を下記の表１
２に示す。この表かられかるように、　７０■７１体表
面積という高いレベルのＬ−ＤＸＲが投与された。１患
者に対しての最大蓄積用量は２１０■／ｄであった。約
０．５〜１■の範囲のＤＸＲ／−および約１５〜３０■
の範囲のリポソームリン脂質／　ｍｌを含有するＬ−Ｄ
ＸＲ組成物を、高速点滴（ｆａｓｔ　ｄｒｉｐ）　（約
３−７分）で静脈内に投与した。複数のコースを３週間
毎に投与した。

表　　１２ Ａ、　　および−１ 本実験において観察された毒性および副作用は。

表１３に総括される。急性の影響としては、悪心および
嘔吐が、３２コール中２コースにおいて観察された（約
６％）。これは、遊離アドリアマイシンを巨人剤の型で
投与した場合（低用量でさえも）。

約２１〜５５％の悪心および嘔吐の発生率のあることと
比較される。低血圧および悪寒の発生率も低く。

ＥＣＧ変化や注射部位の痛みもなかった。

遅延型副作用については、１５患者中６患者において有
意な脱毛症が観察された。この群の患者のうち２患者は
、３０ｎｖ／ｎ（もしくはそれ以下の用量のＤＸＲ注射
をうけていたため１本実験に算入されていない。なぜな
ら、遊離ＤＸＲをこのレベルで投与する場合には、脱毛
症が常に観察されるわけではないためである。従って、
脱毛症の補正された発生率は、　６／１３もしくは約４
６％である。この値は。

報告されている遊離アドリアマイシン投与による有意な
脱毛症発生率（約８５〜１００％）と比較される。骨髄
抑制の発生率は、遊離薬剤について報告された値よりわ
ずかに低い。蓄積治療用量は、慢性心臓毒性が観察され
るようなレベルではなく。

従って遊離薬剤との比較は明確ではない。

表　　１３ Ｂ、始濡Ｃ碩肢 肝腫瘍（原発性もしくは二次性肝新生物）を有する患者
の、（ａ）腫瘍のサイズの変化（形の上での判断）およ
び（ｂｌ肝機能テストおよび腫瘍マーカについて追加実
験を行った。上述のように、この臨床実験のために選択
した患者は、従来の治療（２症例においては、遊離ＤＸ
Ｒ投与を含む）に失敗もしくは反応を示さなくなった患
者である。実験対象の患者のうち、原発性肝腫瘍を有す
る２患者。

および肝へ転移した軟組織肉腫を有する１患者において
は、　　Ｌ−ＤＸＲの複数回コース治療後に改善が観察
された。これは、２５〜５０％の腫瘍収縮および肝機能
の改善から明らかである。これらの患者のうち２患者は
、これまでに遊離ＤＸＲに対しである反応を示したが、
リポソームＤＸＲによる治療前に遊離薬剤に対する反応
は消失していた。原発性肝新生物を有する４番目の患者
は、　　Ｌ−ＤＸＲ投与に対する安定した反応を示した
。このことは、肝機能の安定性および腫瘍のわずかな収
縮＜２５％未満）によって明らかである。総合すると、
原発性もし（は二次性肝腫瘍を有する実験対象患者の半
数において、若干の改善が観察された（たとえ、これら
の患者が他の治療方法に対して反応を示していたとして
もそうである）。

毒性実験の対象とはしなかったもう１患者は。

遊離ＤＸＲを用いた動脈内注射（肝動脈内へ）による治
療をこれまでに受けており、改善がみられなかった患者
である。この患者が２動脈内に投与されたＬ−ＤＸＲに
よる治療を受けた場合には、腫瘍サイズの有意な減縮を
示した。このことは、その部位に直接投与された場合で
さえも、リポソーム製剤が遊離薬剤より効果的であると
いうことを示す。

ここでは、好適な方法および使用について述べてきたが
１本発明からそれることなく様々な変化および修正を加
えることが可能であると考えられる。

↓−ヌ■−ｑ簡連方４１外 第１Ａ〜ＩＣ図は、クラス■および■のアントラサイク
リンアミノグリコシド（それぞれ第１Ａ図および第１Ｂ
図）およびミドキサントロン（第１Ｃ図）の一般的な構
造を示す。

第２図は、可溶型く上部破線）およびリポソーム結合型
（−に部実線）のＤＸＲの蛍光放射スペクトル、および
可溶型（下部破線）および新たに調製されたリポソーム
結合型（下部実線）のＤＸＲ−Ｆｅ（ＩＩＩ）錯体の蛍
光放射スペクトルを示す。

第３図は、第二鉄、酸素、および不飽和脂質の存在下に
おける。薬剤および脂質の変異に寄与すると思われる酸
化メカニズムおよび遊離ラジカルメカニズムを例示して
いる。

第４図は、トリヒドロキザム酸キレート化剤による第二
鉄のキレート化を例示する。

第５図ＡおよびＢは、フェリオキザミンの存在下（スペ
クトルＡ）または非存在下（スペクトルＢ）においてイ
ンキュへ−１・されたリポソームから単離された脂質の
ＵＶスペクトルを示す。

第６図は９段階的用量の遊離ＤＸＲ（Ｆ−ＤＸＲ）およ
びリポソーム導入ＤＸＲ（Ｌ−ＤＸＲ）を１回注射後の
マウスの生存における効果を図示している。

第７図および第８図は２段階的用量のＦ−ＤＸＲおよび
Ｌ−ＤＸＲを繰り返し投与した後の、族マウスおよび雌
マウスのそれぞれについての生存曲線の図示である。そ
して。

第９図は、遊離薬剤（実線）およびリポソーム導入薬剤
（破線）を投与後の時間の関数として。

アドリアマイシンの血漿モル濃度を示した図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アントラキノン／リポソーム組成物であって、該組
   成物は、 少なくとも約０．１モル％の親油性の遊離ラジカル捕集
   剤を含有するリポソームであって、該ラジカル捕集剤は
   該リポソームの脂質二層部分に導入されているリポソー
   ム、 隣接するアントラセン環にキノンおよびヒドロキノン官
   能部分を有するアントラキノン薬剤、および 該組成物中において第二鉄が過剰モル濃度下に存在する
   トリヒドロキサム酸キレート化剤、を含有するアントラ
   キノン／リポソーム組成物。 ２、前記薬剤が、アントラサイクリングリコシド抗生物
   質である特許請求の範囲第１項に記載の組成物。 ３、前記薬剤がドキソルビシン、またはその薬学的に許
   容しうる類似体、誘導体もしくは塩である特許請求の範
   囲第２項に記載の組成物。 ４、前記遊離ラジカル捕集剤がアルファ−トコフェロー
   ルまたは、その薬理学的に許容しうる類似体、誘導体、
   もしくはエステルである特許請求の範囲第１項に記載の
   組成物。 ５、前記トリヒドロキサム酸がフェリオキサミンである
   特許請求の範囲第１項に記載の組成物。 ６、前記リポソームが水性懸濁液中に存在し、そして、
   前記キレート化剤が、該リポソームの内側および外側に
   おいて実質的に等しい濃度で存在する特許請求の範囲第
   １項に記載の組成物。 ７、前記リポソームのサイズが主として約０．０５〜０
   ．２ミクロンである特許請求の範囲第６項に記載の組成
   物。 ８、前記リポソームが約２０〜５０モル％のコレステロ
   ール、およびフォスファチジルグリセロール、フォスフ
   ァチジルイノシトールおよびフォスファチジルセリンで
   なる群から選択される約１０〜５０モル％の陰性荷電リ
   ン脂質を含有する特許請求の範囲第７項に記載の組成物
   。 ９、前記リポソームが水性懸濁液中に存在し、そして前
   記薬剤が本質的に飽和量のリポソーム中に存在する特許
   請求の範囲第１項に記載の組成物。 １０、リポソームと会合していない遊離薬剤を除去する
   ために処理されている特許請求の範囲第９項に記載の組
   成物。 １１、前記リポソームが凍結乾燥型である特許請求の範
   囲第１０項に記載の組成物。 １２、サイズが主として約０．０５〜０．２５ミクロン
   の範囲であり、少なくとも約２．５モル％のドキソルビ
   シンもしくはその薬理学的に許容しうる類似体、誘導体
   を含有するリポソームの水性懸濁液を供給すること、お
   よび 血流を通して薬理学的に許容される量の該組成物を患者
   に投与すること、 を包含する原発性もしくは二次性肝腫瘍の治療方法。 １３、前記リポソームが少なくとも約０．１モル％の親
   油性の遊離ラジカル捕集剤を含有し、そして、前記水性
   懸濁液が該懸濁液のバルク水性相中にトリヒドロキサム
   酸キレート化剤を、該懸濁液中第二鉄が過剰モル濃度下
   で、含有する特許請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４、前記キレート化剤は、フェリオキサミンまたはそ
   の薬理学的に許容しうる類似体もしくは塩である特許請
   求の範囲第１３項に記載の方法。 １５、前記リポソームが、フォスファチジルグリセロー
   ル、フォスファチジルイノシトールおよびフォスファチ
   ジルセリンでなる群から選択される約１０〜４０モル％
   の陰性荷電リン脂質を含有するように供給される特許請
   求の範囲第１２項に記載の方法。 １６、前記リポソームが約２０〜５０モル％のコレステ
   ロールを含有する特許請求の範囲第１２項に記載の方法
   。 １７、前記供給工程が、前記懸濁液のバルク水性相中に
   、非結合型で存在するドキソルビシンを除去するための
   該懸濁液の処理を包含する特許請求の範囲第１２項に記
   載の方法。 １８、ヒトにおいて、治療的有効量の遊離ドキソルビシ
   ンの巨丸剤静脈内投与によりもたらされる悪心および脱
   毛の発生率を有意に減少させる方法であって、リポソー
   ム中へのドキソルビシンの導入、および該リポソームの
   高速点滴による血流への投与を包含する方法。 １９、前記リポソーム導入アドリアマイシンが肝臓の新
   生物の治療に用いられる特許請求の範囲第１８項に記載
   の方法。