JPH04304897A - 抗イディオタイプモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌診断、癌治療に有用
な抗シアリルルイスＡモノクローナル抗体に特異的に結
合する抗イディオタイプモノクローナル抗体を提供する
。

【０００２】

【従来の技術】シアリルルイスＡ（以下、Ｓｉａｌｙｌ
　Ｌｅ　ａ　と略す）抗原は多くの癌細胞でつくられ、
その細胞膜上に発現し細胞外に分泌され、癌患者の血清
中で検出される糖鎖型の抗原である〔キャンサー・リサ
ーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．）４３，　５４８９−５
４９２（１９８３）〕。

【０００３】Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原に対するモ
ノクローナル抗体としては、ＮＳ１９−９〔ジャーナル
・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．）　２５７，　１４３６５　−１
４３６９（１９８２）　〕、ＣＡ５０〔ブリティッシュ
・メディカル・ジャーナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉ
ｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ）　２８８，　１４７９−１４
８２（１９８４）〕、ＡＭＣ−４６２（以下、ＫＭ２３
１という。）〔特開昭６３−２１５６２　、アンチキャ
ンサー・リサーチ（ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．）８
，　３２９　−３３４（１９８８）　〕などが知られて
いる。また、ＭＳＷ１１３〔ジャーナル・バイオケミス
トリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）　１０４
　，　　８１７−８２１（１９８８）　〕、ＣＣ３Ｃ１
９５〔アーチブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド
・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．
　Ｂｉｏｐｈｙｓ．）　２２５，　　２１４−２１６（
１９８７）　〕、Ｓｐａｎ−１〔キャンサー（Ｃａｎｃ
ｅｒ）６０，　１６３６−１６４３（１９８７）〕など
のモノクローナル抗体もＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原
を認識すると考えられている。

【０００４】これらのモノクローナル抗体は、癌患者の
血清中のＳｉａｌｙｌＬｅ　ａ　抗原レベルを測定する
癌血清診断〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅｓ．）４３，　５４８９−５４９２（１９８３）、ア
ンチ・キャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅｓ．）９，　９９９−１００４（１９８９）〕や癌
治療への応用が考えられている（特願平２−１３４２８
５）　。抗イディオタイプ抗体とは、ある抗原エピトー
プに対して得られた抗体の可変領域を認識するもので、
抗イディオタイプ抗体の可変領域は、抗原エピトープの
三次元構造と非常に似かよっていると考えられている。 このような抗イディオタイプ抗体は免疫測定法に利用で
きる〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２１５　，　１
６３７−１６３９（１９８２）〕ばかりでなく、癌治療
のためのワクチンとしても利用できる〔プログラム・ア
ンド・アブストラクト・イミュニティー・トゥー・キャ
ンサー・ザ・１９８９・ソサイエティー・フォー・バイ
オロジカル・セラピー・アニュアル・ミーティング（Ｐ
ｒｏｇｒａｍ　ａｎｄ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ　ｔｏ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅ　１９８９　Ｓｏ
ｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｈｅｒ
ａｐｙ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ）　〕。

【０００５】したがって抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モ
ノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を得る
ことができれば癌の治療や診断に応用できる。しかしな
がら、Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原のような糖鎖抗原
に対する抗体に特異的に反応する抗イディオタイプ抗体
の作製は難しく、ステージ特異的胎児性抗原（ＳＳＥＡ
−１抗原）の抗イディオタイプモノクローナル抗体の報
告〔第４８回日本癌学会総会記事２９８（１９８９）〕
が知られているにすぎない。

【０００６】Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原に対する抗
体に特異的に反応する抗イディオタイプ抗体については
、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体とも知られ
ていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、癌の
診断や治療に有用な抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノク
ローナル抗体に対する抗イディオタイプモノクローナル
抗体を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、抗Ｓｉ
ａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体とくにＫＭ２
３１に特異的に反応する抗イディオタイプモノクローナ
ル抗体を提供することができる。以下に本発明を詳細に
説明する。抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル
抗体とキャリヤー蛋白との複合体を免疫した動物の脾細
胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ
を作製し、Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原と抗Ｓｉａｌ
ｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体との反応を阻害す
るモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択
する。該ハイブリドーマを培地で培養するか、動物に投
与して該動物を腹水癌化し、該培養液または腹水よりモ
ノクローナル抗体を採取する。得られるモノクローナル
抗体の中から抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナ
ル抗体と反応し、他の抗原に対するモノクローナル抗体
とは反応せず、かつ抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノク
ローナル抗体との結合反応が、Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅａ　
抗原のエピトープであるオリゴ糖で阻害されるものを抗
イディオタイプモノクローナル抗体として選択する。

【０００９】このようにして得られる抗イディオタイプ
モノクローナル抗体は腫瘍細胞の増殖を抑制するワクチ
ン効果を有し、さらにサンドイッチアッセイや、インヒ
ビションアッセイなどによる癌の診断にも利用すること
ができる。以下に、本発明の抗イディオタイプモノクロ
ーナル抗体の製造法を詳細に説明する。

【００１０】（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製３
〜２０週令のマウスまたはラットに抗原（抗Ｓｉａｌｙ
ｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体とヘモシアニン　　
キーホール　　リンペット（Ｈｅｍｏｃｉａｎｉｎ　Ｋ
ｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｎｐｅｔ　；以下ＫＬＨと略す）〔
カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕、牛血清
アルブミン、サイログロブリン、卵白アルブミン、人血
清アルブミンなどのキャリヤー蛋白との複合体を免疫し
て、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞
を採取する。

【００１１】免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるい
は腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインド
の完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）　または、水酸化アルミニウ
ムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与す
ることにより行う。抗原の投与は、１回目の投与の後１
〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に
眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応すること
を酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：
医学書院刊　１９７６　年〕などで調べる。免疫に用い
た抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス
またはラットを脾細胞の供給源として提供する。

【００１２】脾細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあた
って、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマ
ウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する
。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピン
セットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ　、５分）
した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液
（ｐＨ７．６５）　で１〜２分間処理し赤血球を除去し
、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞として提供す
る。

【００１３】（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）〔カレント・トピックス・イン・ミクロ
バイオロジィ・アンド・イムノロジィ−１（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−１）　、ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ（Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）６，　５１１−５１
９（１９７６）　〕、　ＳＰ２／Ｏ　−Ａｇ１４（ＳＰ
−２）〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２７６　，　　
２６９−２７０（１９７８）　〕、Ｐ３−Ｘ６３　−Ａ
ｇ８６５３（６５３）　〔ジャーナル・オブ・イムノロ
ジィ（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１２３　，　１５
４８−１５５０（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３　−Ａｇ
８（Ｘ６３）〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６　
，　　４９５−４９７（１９７５）　〕などが用いられ
る。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）　、２−
メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマ
イシン（１０μｇ／ｍｌ）　および牛胎児血清（ＦＣＳ
）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培
地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／
ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４
日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７　個以上
の細胞数を確保する。

【００１４】（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム
１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６
５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、
細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１に
なるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分）
した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後
、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール
−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍ
ｌおよびジメチルスルホキシド　０．７ｍｌの混液　０
．２〜１ｍｌ／１０８　抗体産生細胞を加え、１〜２分
間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培
地を加えて全量が５０ｍｌになるようにする。遠心分離
（９００ｒｐｍ、５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細
胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しで
ゆるやかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチ
ン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）お
よびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ　）を加えた培地
〕１００ｍｌ　中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養
用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２　
インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。 培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などによ
り、Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原と免疫に用いた抗Ｓ
ｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体との結合反
応を阻害するものを選択する。ついで、限界希釈法によ
りクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（
ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目
は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認め
られたものを抗イディオタイプモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマ株として選択する。

【００１５】（４）モノクローナル抗体の調製プリスタ
ン処理〔２，　６，　１０，　１４−テトラメチルペン
タデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌ　を腹腔内投
与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまた
はヌードマウスに、（３）で得られた抗イディオタイプ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０６
　〜５×１０７　細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２
１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから
腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）し
て固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩
析し、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−
カラムあるいはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学
工業社製）のカラムに通塔し、ＩｇＧあるいは、ＩｇＭ
画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。抗体のサ
ブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピン
グキット（ザイメット社製）あるいはラットモノクロー
ナル抗体タイピングキット（ノルディックイムノロジー
社製）を用いて行う。蛋白量の定量は、ローリー法およ
び２８０ｎｍでの吸光度より算出する。

【００１６】 （５）抗イディオタイプモノクローナル抗体の選択精製
された抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体
やその他の抗原に対するモノクローナル抗体１〜５０μ
ｇ／ｍｌを１０〜１００　μｌ／穴ずつ９６穴プレート
に分注し、４℃で一晩放置してプレートにコートする。 ついで牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液などでブロッキ
ングする。ＰＢＳまたはＰＢＳに０．０５％　Ｔｗｅｅ
ｎ−２０を加えた溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し
た後（４）で得られた精製抗体をビオチン、酵素または
アイソトープなどで標識したものを５０〜１００　μｌ
／穴ずつ分注し、室温で２時間または４℃で一晩反応さ
せる。ついで標識物質に応じた検出操作をおこない、先
きにプレートコートした抗体のうち抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌ
ｅ　ａ　モノクローナル抗体だけに反応したものを抗イ
ディオタイプモノクローナル抗体として選択する。

【００１７】前記したような方法で選択される抗イディ
オタイプモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブ
リドーマ細胞株ＫＭ４６８が生産する抗イディオタイプ
モノクローナル抗体ＫＭ４６８をあげることができる。 ハイブリドーマ細胞株ＫＭ４６８は平成３年３月２８日
付でブダペスト条約に基づき工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第３３３４号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
３３３４）として寄託されている。

【００１８】 （６）抗イディオタイプモノクローナル抗体の特異性の
確認 （５）で選択された抗イディオタイプモノクローナル抗
体１〜５０μｇ／ｍｌを１０〜　１００μｌ／穴ずつ９
６穴プレートに分注し、４℃で一晩放置してプレートに
コートする。ついでＢＳＡ溶液などでブロッキングする
。そこに０．００１　〜１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈した
Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　オリゴ糖溶液５０〜１００　
μｌとビオチン、酵素またはアイソトープなどで標識し
た　０．００１〜１０μｇ／ｍｌ抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ
　ａ　モノクローナル抗体５０〜　１００μｌを入れ、
室温で２時間または４℃で一晩反応させる。ＰＢＳまた
はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　でよく洗浄した後、標識物質に
応じた検出操作をおこない、Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　
オリゴ糖によって抗イディオタイプモノクローナル抗体
と抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体との
結合反応が抑制されるか否かを確認する。

【００１９】 （７）抗イディオタイプモノクローナル抗体のワクチン
効果　　−１− 精製した抗イディオタイプモノクローナル抗体１０〜１
０００μｇ／匹単独あるいは適当なキャリヤー蛋白との
複合体１０〜１０００μｇ／匹をフロインドの完全アジ
ュバントなどの適当なアジュバントとともに、動物に免
疫する。数回の免疫の後、採血し、その血清のＳｉａｌ
ｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原に反応する抗体価を測定する。す
なわち、精製したＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原を９６
穴プレートにコートして、ＢＳＡ溶液などでブロッキン
グする。そこに、適当に希釈した免疫動物由来の血清を
５０〜１００　μｌ／穴ずつ分注し、室温２時間又は、
４℃一晩反応させる。よく洗浄した後、免疫動物のイム
ノグロブリンに対する抗体にビオチン、酵素、化学発光
物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノ
グロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体
１〜５０μｇ／ｍｌを第二抗体として５０〜１００　μ
ｌ／穴ずつ分注し、室温２時間又は、４℃一晩反応させ
る。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応
を行ない、血清中の抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗体価
を測定する。

【００２０】 （８）抗イディオタイプモノクローナル抗体のワクチン
効果　　−２− 無処理動物あるいはＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原を発
現する同系腫瘍を移植した動物に精製した抗イディオタ
イプモノクローナル抗体１０〜１０００μｇ／匹単独あ
るいは適当なキャリヤー蛋白との複合体１０〜１０００
μｇ／匹をフロインドの完全アジュバントなどの適当な
アジュバントとともに数回免疫する。免疫動物が無処理
であったものには、この時点でＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ
　抗原を発現する同系腫瘍を移植する。 腫瘍の成長あるいは、動物の死亡を抗イディオタイプモ
ノクローナル抗体免疫動物群とコントロールモノクロー
ナル抗体免疫動物群とで比較することにより、抗イディ
オタイプモノクローナル抗体の抗腫瘍ワクチン効果を検
討する。

【００２１】 （９）抗イディオタイプモノクローナル抗体の血清診断
への応用 精製した抗イディオタイプモノクローナル抗体１〜５０
μｇ／ｍｌを１０〜１００　μｌ／穴ずつ９６穴プレー
トに分注し、４℃で一晩放置して、第一抗体としてプレ
ートにコートする。次いで、ＢＳＡ溶液などで、ブロッ
キングする。そこに、適当に希釈したヒト血清またはス
タンダード溶液５０〜　１００μｌを入れ、室温で２時
間あるいは４℃で一晩反応させる。ＰＢＳ又はＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎ　でよく洗浄した後、無標識あるいはビオチ
ン、酵素、化学発光物質、放射線化合物等で標識した抗
イディオタイプモノクローナル抗体１〜５０μｇ／ｍｌ
を第二抗体として５０〜１００　μｌ／穴ずつ分注し、
室温２時間又は、４℃一晩反応させる。よく洗浄した後
、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、スタンダ
ード溶液中の抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナ
ル抗体の濃度をもとに、ヒト血清中の抗Ｓｉａｌｙｌ　
Ｌｅ　ａ　抗体量を算出する。

【００２２】

【実施例】実施例１ （１）　　動物の免疫と抗体産生細胞の調製抗　Ｓｉａ
ｌｙｌ　Ｌｅａ　モノクローナル抗体ＫＭ２３１とキャ
リヤー蛋白としてＫＬＨとを１：５の割合で混合し、０
．１Ｍ酢酸アンモニウム存在下で、０．０２Ｍグルター
ルアルデヒドを用いて公知の方法（プロシーディング　
　オブ　　ソサエティー　　オブ　　エクスペリメンタ
ル　　バイオロジカル　　メディシン（Ｐｒｏｃ．　Ｓ
ｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．），　　１４
８　，　７８４−７８９（１９７５）　〕により、複合
体（ＫＭ２３１−ＫＬＨ複合体）　を作り、ＰＢＳで透
析して抗原とした。また、別にｍ−マレイミド−ベンゾ
イル−Ｎ−ハイドロキシサクシル（ｍ−ｍａｌｅｎｉｍ
ｉｄｅ−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃ
ｉｌ，以下ＭＢＳと略す）（ナカライテスク社製）とＫ
ＬＨを反応させた後セファデックスＧ２５カラムで精製
したものとモノクローナル抗体ＫＭ２３１を５：１で混
合し、公知の方法〔セル（Ｃｅｌｌ），　２８　，　４
７７−４８７（１９８２）〕で複合体を作り、ＰＢＳで
透析したものを抗原とした。（どちらの方法で作製され
た抗原でも以下同じように利用できる。）Ｆ１　マウス
（Ｃ５７ＢＬ／ｂ雄×ＢＡＬＢ／ｃ　雌）　に、１００
μｇのＫＭ２３１−ＫＬＨ複合体　（以下ＫＭ２３１−
ＫＬＨと略す）　をアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日
咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９　細胞／
マウスとともに投与し、２週間後１００μｇのＫＭ２３
１−ＫＬＨを１週間に１回、計６回投与した。眼底静脈
叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測
定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫
３日後に脾臓を摘出した。脾臓を　ＭＥＭ培地　（日水
製薬社製）　中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分
離（１２００ｒｐｍ、　５分）　した後、上清を捨て、
トリス−塩化アンモニウム緩衝液　（ｐＨ７．６５）　
で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ　培地で３
回洗浄し、細胞融合に用いた。

【００２３】酵素免疫測定法 ９６穴のＥＩＡ用プレート〔グライナー（Ｇｒｅｉｎｅ
ｒ）　社製〕に実施例１（１）　で作製した抗原１〜５
０μｇ／ｍｌを１０〜１００μｌ／穴ずつ分注し、４℃
で一晩放置して抗原をプレートにコートした。次いで、
１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）　を１
００〜２００μｌ／穴分注し、室温１〜２時間または、
４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質と
の結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、
ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＰＢＳでよく洗浄した後、第一
抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した試料（マウス血
清、ハイブリドーマ培養上清、精製モノクローナル抗体
）を２０〜１００μｌ／穴分注し、室温で２〜３時間ま
たは、４℃で一晩放置した。ＰＢＳまたは、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ　で、よく洗浄した後、第二抗体としてペルオ
キシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体〔ダコ（
ＤＡＫＯ）社製〕、またはペルオキシダーゼ標識抗ラッ
トイムノグロブリン抗体〔ダコ（ＤＡＫＯ）社製〕を５
０〜１００μｌ／穴分注し、室温で２時間放置した。Ｐ
ＢＳでよく洗浄した後、ＡＢＴＳ基質液〔２，２′−ア
ジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）二アンモニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ４．２）１リットルに溶かした溶液に、使用直
前に過酸化水素１μｌ／ｍｌを加えた溶液〕を用い発色
させ、ＯＤ４１５ｎｍ　の吸光度を測定した。

【００２４】（２）マウス骨髄腫細胞の調製８−アザグ
アニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地で
培養し、細胞融合時に２×１０７　以上の細胞を確保し
、細胞融合に親株として供した。

【００２５】（３）ハイブリドーマの作製実施例１（１
）で得られたマウス脾細胞と実施例１（２）で得られた
骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（
１，２００ｒｐｍ、５分）　した後、上清を捨て、沈澱
した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で
、ポリエチレングライコール−１，０００　（ＰＥＧ−
１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルス
ルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／１０８　
マウス脾細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２
ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍ
ｌになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）
　後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メス
ピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡ
Ｔ培地１００ｍｌ中に懸濁した。この懸濁液を９６穴培
養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２
　インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間ＣＯ２
　５％下で培養した。この培養上清を以下に記載するハ
イブリドーマの選択方法で調べ、活性が陽性な穴を選び
、さらにＨＴ培地と正常培地に換え、２回クローニング
を繰り返して、酵素免疫測定法により、ＫＭ２３１と抗
Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原との結合反応を阻害する
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択し
た。

【００２６】ハイブリドーマの選択方法９６穴のＥＩＡ
用プレート〔グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）　社製〕に
ヒト胃癌患者腹水よりゲルクロマトグラフィー（ＧＣＬ
−２０００　　生化学工業）　で精製した抗原１〜５０
μｇ／ｍｌを１０〜１００μｌ　／穴ずつ分注し、４℃
で一晩放置して抗原をプレートにコートした。

【００２７】ついで１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００〜２０
０μｌ／穴分注し、室温１〜２時間又は４℃で１〜２晩
放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基をブ
ロック（ブロッキング）した。その後、ＢＳＡ−ＰＢＳ
を捨て、ＰＢＳでよく洗浄した後、第１抗体として、ハ
イブリドーマ培養上清を２０〜１００μｌ／穴分注し、
室温で２〜３時間又は４℃で１晩放置した。

【００２８】ＰＢＳ又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　でよく洗
浄した後、第二抗体としてビオチンで標識したＫＭ２３
１　　１０μｇ／ｍｌを５０〜１００μｌ／穴分注し、
室温で２時間放置した。ＰＢＳでよく洗浄後、アビジン
−ペルオキシダーゼ複合体〔ベクターラボラトリー社（
Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）
〕５０〜１００μｌ／穴を室温で１〜２時間反応させた
。ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を用い発色させ
、ＯＤ４１５ｎｍ　の吸光度を測定した。

【００２９】第１図に示したようにＫＭ２３１と　Ｓｉ
ａｌｙｌ　Ｌｅａ　抗原との結合を阻害する８個のモノ
クローナル抗体１−４（ＫＭ４６７，ＩｇＧ１　）　、
５−１２（ＩｇＧ１　）、７−１４（ＩｇＧ１　）　、
８−１２（ＩｇＧ１　）　、１５−１１（ＩｇＭ）　、
２０−１３（ＫＭ４６８、ＩｇＧ１　）　、２８−１６
（ＫＭ４６９、ＩｇＧ１　）　、７６−５（ＫＭ４７０
、ＩｇＧ１　）　が選択された。

【００３０】（４）モノクローナル抗体の精製プリスタ
ン処理した８週令ヌード雌マウスに（３）で得られたハ
イブリドーマ株を５〜１０×１０６　細胞／匹それぞれ
腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは
腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取
（１〜８ｍｌ／匹）し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、
５分）して固形分を除去した。モノクローナル抗体がＩ
ｇＭのときは、５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、塩
化ナトリウム０．５Ｍを添加したＰＢＳで透析後、セル
ロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）（ベット
ボリューム７５０ｍｌ）のカラムに流速１５ｍｌ／時で
通塔しＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とし
た。モノクローナル抗体がＩｇＧのときは、５０％硫酸
アンモニウムと４０％硫酸アンモニウムにて、２回塩析
し、０．０３Ｍ　　ＮａＣｌを含む０．０４Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で透析後、ＤＥＡＥセファロース〔
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　社製ＤＥ５２〕に通塔
後溶出しＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体と
した。

【００３１】 （５）抗イディオタイプモノクローナル抗体の選択（３
）で選択した８個のモノクローナル抗体の精製サンプル
１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴ずつ９６穴プレートに分
注し、４℃で一晩放置してコートした。ついで１％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳでブロッキング後、ビオチン化したマウスモ
ノクローナル抗体１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴ずつ分
注して室温で２時間反応した。ビオチン化したマウスモ
ノクローナル抗体としては、抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅａ　
モノクローナル抗体ＫＭ２３０（ＩｇＧ１　）、ＫＭ２
３１（ＩｇＧ１　）、ＫＭ１９１（ＩｇＭ）、ＫＭ２０
６（ＩｇＭ）〔アンチキャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉ
ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．）　８　　，　３２９−３３４
（１９８８）〕、ＮＳ１９−９（富士レビオ社製）と、
ヒト胃癌組織膜成分を免疫して得られたマウスモノクロ
ーナル抗体でＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原以外を認識
するＫＭ２０１（ＩｇＭ）、ＫＭ２２５（ＩｇＧ１　）
　、ＫＭ２３２（ＩｇＧ２ｂ）　、ＫＭ２３５（ＩｇＧ
１　）　、ＫＭ２３７（ＩｇＧ１　）　、ＫＭ３０５（
ＩｇＧ１　）　、ＫＭ３６０（ＩｇＭ）を用いた。

【００３２】ＰＢＳでよく洗浄後、アビジン−ペルオキ
シダーゼ複合体（ベクターラボラトリー社）５０μｌ／
穴を室温で１時間反応させた。ＰＢＳがよく洗浄後、酵
素免疫測定法と同じく、ＡＢＴＳ基質液を用い、発色さ
せＯＤ４１５ｎｍ　の吸光度を測定した。第２図に示し
たようにＫＭ４６７、ＫＭ４６８、ＫＭ４６９、ＫＭ４
７０の４個のモノクローナル抗体が５個の抗Ｓｉａｌｙ
ｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体のみに反応した。

【００３３】 （６）抗イディオタイプモノクローナル抗体の特異性の
検討 （３）で選択した８個のモノクローナル抗体の精製サン
プル１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴ずつ９６穴プレート
分注し、４℃一晩放置してコートした。次いで、１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、０．０５μｇ／ｍｌビ
オチン化ＫＭ２３１５０μｌ　と０．００１〜１０μｇ
／ｍｌ　Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａオリゴ糖（バイオカー
ブケミカルズ（Ｂｉｏｃａｖｂ　ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
５０μｌ　とを同時に加え、４℃で一晩反応させた。Ｐ
ＢＳでよく洗浄後、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体
（ベクターラボラトリー社）５０μｌ／穴を室温で１時
間反応させた。ＰＢＳでよく洗浄後、酵素免疫測定法と
同じくＡＢＴＳ基質液を用い、発色させＯＤ４１５ｎｍ
　の吸光度を測定した。第３図に示したようにＫＭ４６
８、８−１２、７−１４、１−４の順で、ビオチン化Ｋ
Ｍ２３１との反応がＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　オリゴ糖
で抑制された。

【００３４】実施例２ （１）抗イディオタイプモノクローナル抗体のワクチン
効果　　−１− 実施例１（１）に記載のＫＭ２３１−ＫＬＨ複合体の作
製方法に準じて作製したＫＭ４６８−ＫＬＨ複合体５０
μｇ／匹を初回のみフロインドの完全アジュバントとと
もに８匹のラットに計４回免疫した。免疫後３日目に採
血し、その血清のＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗原に反応
する抗体価を以下のように測定した。Ｓｉａｌｙｌ　Ｌ
ｅ　ａ　糖脂質は、ＫＡＴＯ−３細胞から、すでに報告
した方法アンチキャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ．）　　８　，　３２９−３３４（１９
８８）〕で精製した。精製したＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ
　糖脂質２ｎｍｏｌをコレステーロール（２．５ｎｇ）
　とフォスファチジンコリン（５ｎｇ）とを含むエタノ
ール２ｍｌに溶かし、２０μｌ／穴ずつ９６穴プレート
に分注し、ドライヤーで乾燥させ、プレートにコートし
た。次いで、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで、ブロッキング後、
１００倍に希釈した免疫ラットより得た血清を５０μｌ
／穴ずつ分注して、室温で２時間反応させた。よく洗浄
後、ペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン〔
ダコ（ＤＡＫＯ）社製〕５０μｌ／穴を室温で２時間反
応させた。ＰＢＳでよく洗浄後、酵素免疫測定法と同じ
く、ＡＢＴＳ基質液を用い、発色させＯＤ４１５ｎｍ　
の吸光度を測定した。第４（ａ）図に示したように、８
匹中１匹のラット血清（Ｎｏ７）にＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ
　ａ　糖脂質に対する高い抗体価が認められた。

【００３５】次に、ＫＭ４６８　　１０μｇ／ｍｌを５
０μｌ／穴ずつ分注し、４℃一晩放置して９６穴プレー
トにコートした。次いで、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッ
キング後、ビオチン化ＫＭ２３１（０．０５μｇ／ｍｌ
）５０μｌ　と１００倍に希釈した免疫ラットより得た
血清５０μｌ　とを同時に加え、４℃で一晩反応させた
。ＰＢＳでよく洗浄後、アビジン−ペルオキシダーゼ複
合体（ベクターラボラトリー社）５０μｌ／穴を室温で
１時間反応させた。ＰＢＳでよく洗浄後、酵素免疫測定
法と同じく、ＡＢＴＳ基質液を用い、発色させＯＤ４１
５ｎｍ　の吸光度を測定した。第４（ｂ）図に示したよ
うにＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　糖脂質に対し高い抗体価
が認められたのと同一の血清（Ｎｏ７）に、ＫＭ４６８
とＫＭ２３１の結合反応に対する強い抑制が認められた
。

【００３６】さらに、このＮｏ７の血清を２０倍に希釈
し、ヒト胃癌細胞ＫＡＴＯ−３細胞およそ１０６　個と
４℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後ＦＩＴ
Ｃ標識抗ラットイムノグロブリン（ベクターラボラトリ
ー社）を４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄
後フローサイトメトリー〔日本分光（ＪＡＳＣＯ）〕で
解析した。第５図に示したようにＮｏ７の血清は、ＫＡ
ＴＯ−３細胞と反応した。

【００３７】 （２）抗イディオタイプモノクローナル抗体のワクチン
効果　　−２− ＫＭ４６８−ＫＬＨ複合体５０μｇ／匹を初回のみフロ
インドの完全アジュバントとともに１０匹のＤＢＡ／２
マウスに計４回免疫した。免疫後３日目にマウスリンホ
ーマ細胞Ｐ３８８を５×１０６　細胞／匹の割合で皮下
に移植した。コントロールとして、サケ成長ホルモンに
対するマウスモノクローナル抗体（特開昭６２−１４３
６９３）とＫＬＨとの複合体５０μｇ／匹を同様に免疫
し、マウスリンホーマ細胞Ｐ３８８を移植した。その結
果、第６図に示したようにコントロールのマウスに比し
、ＫＭ４６８−ＫＬＨ複合体免疫マウスでは、統計学的
に有意の差をもって（Ｐ＜０．０５）、延命効果が認め
られた。

【００３８】実施例３ 抗イディオタイプモノクローナル抗体の血清診断への応
用　　−抗ＳｉａｌｙｌＬｅ　ａ　モノクローナル抗体
の検出−ＫＭ４６８　　１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴
ずつ９６穴プレートに分注し、４℃で一晩放置して、第
一抗体としてプレートコートする。次いで、１％ＢＳＡ
−ＰＢＳで、ブロッキングする。そこに、１０倍に希釈
したヒト血清５０ｍｌを入れ、４℃で一晩反応させる。 よく洗浄した後、ビオチン化ＫＭ４６８　　１０μｇ／
ｍｌを第二抗体として５０μｌ／穴ずつ分注し、室温２
時間反応させる。 ＰＢＳでよく洗浄後、アビジン−ペルオキシダーゼ複合
体（ベクターラボラトリー社）５０μｌ／穴を室温で１
時間反応させた。ＰＢＳでよく洗浄後、酵素免疫測定法
と同じく、ＡＢＴＳ基質液を用い、発色させＯＤ４１５
ｎｍ　の吸光度を測定した。第７図に示したように、胃
癌患者由来の血清２検体は、健常人由来の血清１１検体
より抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　抗体価が高値を示した
。

【００３９】

【発明の効果】本発明によれば、癌診断、癌治療に有用
な抗Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体に対
する抗イディオタイプモノクローナル抗体を提供するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ハイブリドーマクローンのＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ
　ａ　抗原とＫＭ２３１との結合反応の阻害を示す。１
−４（ＫＭ４６７）、５−１２、７−１４、８−１２、
１５−１１、２０−１３（ＫＭ４６８）、２８−１６（
ＫＭ４６９）、７６−５（ＫＭ４７０）は各クローンを
表わし、Ｂｌはブランクを表わし、ＮＭＳは無処理マウ
ス血清を表わす。抗血清１０−２、１０−３、１０−４
は免疫マウス血清の各１００倍、１０００倍、１０００
０倍希釈溶液を表わす。

【図２】抗イディオタイプモノクローナル抗体と各種モ
ノクローナル抗体との反応を示す。１はＫＭ３０５、２
はＫＭ２３０、３はＫＭ２３１、４はＫＭ２３２、５は
ＫＭ２３５、６はＫＭ２３７、７はＫＭ３６０、８はＫ
Ｍ１９１、９はＫＭ２０１、１０はＫＭ２０６、１１は
ＫＭ２２５、１２はＮＳ１９−９およびＰ３−Ｕ１はミ
エローマ培養細胞Ｐ３−Ｕ１の培養上清を表わす。

【図３】抗イディオタイプモノクローナル抗体のＳｉａ
ｌｙｌ　Ｌｅ　ａ　オリゴ糖に対する反応性の抑制を示
す。○は１−４（ＫＭ４６７）、●は７−１４、△は８
−１２、◇は２０−１３（ＫＭ４６８）、◆は２８−１
６（ＫＭ４６９）、□は７６−５（ＫＭ４７０）を表わ
す。

【図４】抗イディオタイプモノクローナル抗体のワクチ
ン効果　　−抗ＧＭ２抗体の誘導（１）−第４（ａ）図
はＫＭ４６８−ＫＬＨ複合体を８匹のラットに免疫して
得られた抗血清（１００倍希釈）のＳｉａｌｙｌ　Ｌｅ
　ａ　糖脂質に対する反応性を示す。ポジティブコント
コールとしてＫＭ２３１　　１０μｇ／ｍｌ、ネガティ
ブコントロールとして、無処理ラット血清（ＮＲＳ）１
００倍希釈を反応させた。第４（ｂ）図は得られた抗血
清のＫＭ４６８とＫＭ２３１結合反応に対する阻害効果
を示す。ネガティブコントロールとして、無処理ラット
血清（ＮＲＳ）１００倍希釈を反応させた。

【図５】第５（ｂ）図は第４図でＫＭ４６８−ＫＬＨ複
合体を免疫した８匹のラットのうち抗体価が一番高かっ
たＮｏ７ラット由来の血清を２０倍希釈して、ヒト胃癌
細胞ＫＡＴＯ−３細胞と反応させ、フローサイトメトリ
ーで解析した結果を示す（実線）。（ａ）図はポジティ
ブコントロールとして、ＫＭ２３１　　１０μｇ／ｍｌ
の反応パターン（実線）を表わし、（ｃ）図はネガティ
ブコントロールとして、無処理ラット血清（２０倍希釈
）の反応パターン（実線）を表わす。（ａ）、（ｂ）お
よび（ｃ）図中点線は抗体のない状態のＫＡＴＯ−３細
胞の反応パターンを示す。

【図６】マウスリンホーマ細胞に対するＫＭ４６８の延
命効果を表わす。

【図７】胃癌患者および健常人血清の抗Ｓｉａｌｙｌ　
Ｌｅ　ａ　モノクローナル抗体価を示す。ｈＩｇはヒト
イムノグロブリンのコントロールを表わす。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　抗シアリルルイスＡモノクローナル抗
   体に特異的に反応する抗イディオタイプモノクローナル
   抗体。
2. 【請求項２】　　抗シアリルルイスＡモノクローナル抗
   体が抗シアリルルイスＡモノクローナル抗体ＫＭ２３１
   である請求項１記載の抗体イディオタイプモノクローナ
   ル抗体。
3. 【請求項３】　　抗イディオタイプモノクローナル抗体
   が、ＩｇＧ１サブクラスに属するマウスモノクローナル
   抗体である請求項１記載の抗体イディオタイプモノクロ
   ーナル抗体。
4. 【請求項４】　　抗シアリルルイスＡモノクローナル抗
   体に特異的に反応する抗イディオタイプモノクローナル
   抗体ＫＭ４６８。
5. 【請求項５】　　抗シアリルルイスＡモノクローナル抗
   体に特異的に反応する抗イディオタイプモノクローナル
   抗体生産能を有するハイブリドーマ細胞株ＫＭ４６８。
6. 【請求項６】　　抗シアリルルイスＡモノクローナル抗
   体に特異的に反応する抗イディオタイプモノクローナル
   抗体を含んでなる腫瘍細胞増殖抑制剤。
7. 【請求項７】　　抗シリアルルイスＡモノクローナル抗
   体に特異的に反応する抗イディオタイプモノクローナル
   抗体を抗体として用い、抗シアリルルイスＡ抗体を免疫
   学的に定量する方法。
8. 【請求項８】　　固相化したマウスモノクローナル抗体
   ＫＭ４６８に検体中の抗シアリルルイスＡモノクローナ
   ル抗体を結合させ、標識物質で標識されたマウスモノク
   ローナル抗体ＫＭ４６８を該結合した抗シアリルルイス
   Ａモノクローナル抗体に結合させ、結合したマウスモノ
   クローナル抗体ＫＭ４６８の標識物質の量を測定するこ
   とを特徴とする抗シアリルルイスＡモノクローナル抗体
   の定量法。