JPS63258574A - サフラン柱頭組織の培養方法 - Google Patents

サフラン柱頭組織の培養方法

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JPS63258574A
JPS63258574A JP62137440A JP13744087A JPS63258574A JP S63258574 A JPS63258574 A JP S63258574A JP 62137440 A JP62137440 A JP 62137440A JP 13744087 A JP13744087 A JP 13744087A JP S63258574 A JPS63258574 A JP S63258574A
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saffron
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和男 山崎
Atsuko Koyama
小山　篤子
Hideki Miyagawa
宮川　秀樹
Naomi Fujioka
藤岡　尚美
Yuki Omori
大森　由紀
Yoshiaki Ota
太田　美明
Hiroshi Ito
宏 伊東
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、アヤメ科の植物であるサフランの（Ｃｒｏｃ
ｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ　Ｌｉｎｎｅ）のめしべを組織培
養することによりクロシンなどのサフランの有用成分を
持つ物質を大量に生産する方法に関するものである。
サフランの柱頭部分にはクロシン等のカロチノイド色素
や、苦味配糖体であるビクロクロシン。
芳香成分であるサフラナール等が含有されており、薬用
として、食品の着色料・香辛料として広く利用されてい
る。
現在日本国内の消費量は年々増加の一歩を辿っており、
約１トンにのぼっている。
このサフランのめしべを乾燥したものは非常に高価で１
ｋｇ当り三十万円から百万円もしている。
従　　来　　技　　術 サフランの柱頭の乾燥品の生産方法としては、サフラン
を畑で栽培し、開花中の期間内に柱頭を積み取り、これ
を乾燥する方法が従来より行なわれ−〔いるが、サフラ
ンの柱頭様組織のｍ織培養方法による生産方法は知られ
ていない。
発明が解決しようとする問題点 しかしながら、かかる従来の畑でのサフランの栽培方式
による場合には以下に示すような欠点があった。
ａ、サフランは普通条件がそろった場合でも１ニーカー
当り３．６ｋｇ〜５．４ｋｇ（乾燥サフランとして）し
か得られないために収量が少ないといった不都合がある
。
ｂ、サフランの開花時期は、１０〜１１月であるが、開
花時期に花を積み取らなければいけない。
しかし開花期間が１５日間と短いために、開花したら直
ぐに積み始めないと、積み取り残しが生してしまう。
Ｃ，サフランの成育は、自然環境や天候に左右されるた
めに、天候不純であると収穫量が極端に減少するといっ
た不都合がある。
ｄ、サフランの栽培は主にスペイン、フランス等のヨー
ロッパ各国及び小アジアにおいて行なわれており、日本
国内でも入用地方や中国地方で栽培されている。
しかし連作すると病害が発生しやすいので、５年以上の
連作はすることができない。
そのため収穫量の増大はあまり望めない状況にある。
そこで本発明は、かかる従来の栽培方法の欠点に鑑み収
穫時期に左右されることがなく、いつでもどこでも大量
生産することができるサフランの柱頭組織の培養方法を
発明したものである。
問題点を解決するための手段 すなわち本発明は、 次のａ　−ｃの工程、 ａ、サフランの柱頭、花柱、子房、胚珠、花弁の部分を
摘出し、これを切り分ける工程、ｂ、切り分けた組織を
サイトカイニンとオーキシンを冷加した液体又は固体の
ＬＳ培地若しくはＢ５培地に移植する工程、 ｃ、移植された組織を静置２回転又は振とう培養の下で
継代培養する工程、 からなるサフラン柱頭組織の培養方法により本目的を達
成する。
更により効果的に組ｖ＆＠養するために、次の工程、 ｄ、ＬＳ培地又はＢ５培地で継代培養された組織を異秘
る培地に植え継ぎし継代培養する工程、を追加すること
により効果的に組織培養する。
サイトカイニンとしてはカイネチン（Ｋｉ）　、ゼアチ
ン又は６−ベンジルアデニン（ＢＡ）を使用する。
オーキシンとしてはインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）。
１−ナフタリン酸（ＮＡＡ）又はインドール醋酸（ＩＢ
Ａ）を使用する。
併用できるホルモンとしては、２．４−ジクロロフェノ
キシ酢酸（２，４−Ｄ）　、　４−クロロフェノキシ酢
酸（ＣＰＡ）等のオーキシンやジベレリン＃（ＣＡ、）
、アブシジン＃（ＡＢＡ）等の成長ホルモンを使用して
もよい。
培地の無機成分としては、窒素、リン、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、イ才つ、鉄、マンガン、亜鉛、
ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素
を含む無機塩を挙げることができる。
培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘導
体、脂肪酸等の有機酸及びエタノール等の第１級アルコ
ールなどを例示できる。
培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタ
ミンＢ１）、ピリドキシン〈ビタミンＢ、）、ピリドキ
サール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、ア
スコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン
酸、ニコチン酸アミド及びリボフラビン（ビタミンａｔ
）などを挙げることができる。
培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン。
アラニン、グルタミン酸、システィン、チロシン、アス
パラギン酸、アミドアルギニン及びリジン等を挙げるこ
とができる。
以下に本発明を具体的な実施例に従って詳細に説明する
。
大−Ｕニュ 下記に示すような条件のもとで、各ホルモンの濃度及び
その組合わせ、各培地および各培養方法について、それ
ぞれ数世代にわたって実験を行い黄色の色素を含んだ組
織を培養できるものを検討した。
エニー以」ＬΩ」１！ 球根より６〜１３ｃｍぐらいに伸びた花芽を基部より切
り取り、流水にて洗浄する。
洗浄した花芽をオスパン１００倍液に５分間。
ビューラックス１０倍液に５分間、７０％エチルアルコ
ールに２〜３秒間浸し、域菌水で３回洗浄する。洗浄後
にシャーレ内で無菌の状態でつぼみを取り出し、柱頭を
３裂している部分より僅か下の壜で切り取り、長き約１
〜２．５Ｃとなるように柱頭から子房上部までの部分を
２〜４個に切り分け、植え付は切片とする。
エユ」」頂！ソ１皇 基本培地として、リンスマイヤー・スクーグ培地（ショ
１！　３０ｇ／ｆｆｉ　、ｐＨ５，７〜５．８＞（以下
ＬＳ培地という）、ガンボルダＢ５培地（ショ糖２０ｇ
／ｊ２　、ｐＨ５゜７〜５．８）（以下Ｂ５培地という
）及びホワイト培地（ショ糖　２０ｇ／ｌ　、ｐＨ５，
７〜５．８）で液体又は０．２％ジェランガム雁冷加固
形のものを用いた。
但し、ｐＨ８Ｊ４ｖ！ｉハホルモン添加後＋：０．ＩＮ
（７）　ＫＯＨ及びＯ，ＩＮのＨＣＩを用いて行なった
。
Ｌ工亙ｌユ１ （１）静置培養 培養室内゛を２５±３℃に保って、暗所で行なった。
（２）回転培養 培養室内を２２±１℃に保って暗黒下、２ｒｐｍ　（比
肩鉄工所　ＫＷ−１）の条件で行なった。
（３）振とう培養 培養室内を２２±１℃に保って暗黒下、１２０ｒｐｍ（
ＴＡ／ＩＹＯＲＯＴＡＲＹ　５ＨＡＫＥＲＲ−１１）の
条件で行なった。
ｄ、ホルモン 添加するホルモンはサイトカイニンとして、鮎（６−ベ
ンジルアデニン、　ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン
）ともいう）、ゼアチン及びカイネチン（Ｋｉ）、オー
キシンとしてＩＡＡ　（インドール酸Ｍ）　、ＮＡＡ（
＋７タレン酢＃）　、　ＩＢＡ（インドール酪酸）及び
２．４−ＤＣ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を選択
する。
各培地に対して表−１１表−２及び表−３に示されるよ
うなサイトカイニンとオーキシンの組合わせのものを添
加して継代培養を行なった。
表−Ｉ　　　　　　Ｂ５培地　　　　　　　　　　　単
位：ｍ０１７１表−２Ｌ５培地　　　　　　　　　　　
単位＝（２）１７！表−３　ホワイト　培地　　　　　
　　　　　　単位：ｒｒｏ１／ｊ２（表中の数字は培地
番号を示す） 尚、継代培養としては、５〜８週問おきに、毎回ｒ＝５
〜ｌ　Ｑ　ａｎ　（ｒは組織の直径）のものを植え継い
だ。
Ｃ６結果 そして第４世伏目の組織又はカルスの状態を確認した結
果法の表−４〜６に示すようになった。
表−４Ｂ５培地　（但しオーキシンはＮＡＡ　）特に２
４．２５番地のものには、多数の柱頭様小突起組織がみ
られた。
表−５ＬＳ培地　（但しオーキシンはＮＡＡ　）表−６
ホワイト培地（但しオーキシンはＮＡＡ　）また多数の
柱頭様小突起組織が見られたＢ５培地の１５．１９．２
０．２４．２５番地のものをＬＳ培地の７’、８’、９
°、１２’、１３’、１４’番地のものに移植した結果
は次の表−７に示すようになった。
さらにまた多数の柱頭様小突起組織が見られたＬＳ培地
の１５゛、　１９’　、　２０’　、　２４’　、　２
５’番地のものをＢ５培地の７．８．９．１２．１３．
１４番地のものに移植した結果は次の表−８に示すよう
になった。
但し１２′〜１４゛番地のものより７゛〜９゛番地のも
のの方が赤色が濃くなる傾向がある。
表−８ＬＳ培地の各番地→Ｂ５培地 但し１２〜１４番地のものより７〜９番地のものの方が
赤色が濃くなる傾向がある。
以上の結果より培地としては、ホワイト培地の一部を除
きＬＳ培地、　Ｂ５培地のものが組織培養（黄色の色素
を有する組織が培養できるもの）及びカルスの誘導に優
れていることが判明した。
又培養方法については静置１回転、振とう培養とも培養
に適していることが判明した。
オーキシンとしてＮＡＡ、サイトカイニンとして鮎を添
加したＬＳ培地及びＢ５培地において好結果が得られた
番地の配合について、ＢＡの代わりにゼアチン、カイネ
チンを使用してみたところＢＡの場合と略同じような結
果が得られた。
またＮＡＡの代わりにＩＢＡ　、　２．４−Ｄ　、　Ｉ
ＡＡを使用してみたところ２．４−Ｄの場合は、培養で
きるものがほとんどなく　、ＩＢＡ　、　ＩＡＡの場合
はＮＡＡに比較して落ちるが組織培養することができた
。
このことから添加するホルモンとしてはサイトカイニン
はＢＡが良く、オーキシンとしてはＮＡＡが良いことが
分かった。
そしてＢＡとＮＡＡと添加量との関係を調べたところ表
−１の８５培地では１５．１９．２０．２４．２５番地
のものが１表−２のＬＳ培地では１５’、１９’、２０
’、２４’、２５’番地のものが及び表−３のホワイト
培地では１９”、２０“、２４”番地のものが組織培養
に優れていることを確認した。
このことから、Ｂ５培地及びＬＳ培地ではＢＡが１０−
６〜３×　１０−’でＮＡＡが１０−’　〜５Ｘ　１０
−’　（単位はｍｏｌ／！　）のホルモン量が適当であ
り、ホワイト培地では鮎が１０”＠〜３Ｘ　１０−’で
ＮＡＡが１０−’〜５Ｘ　１０−’　（単位はｍｏｌ／
Ｑ　）のホルモン量が適当であることがわかった。
尚、継代培養の方法として、同一培地で行なわなくても
よく、Ｂ５培地からＬＳ培地のものに受は麿がせたり又
その逆の場合も同じような結果が得られるが、植え継ぎ
する場合にはより前の培地より低い濃度にて培養するの
が望ましい。
更に、高色素生産性の培地としては、Ｂ５培地の１５．
１９．２０．２４．２５番地で培養したものをＬＳ培地
で鮎、　ＮＡＡ添加の７’　、　８’　、　９’　、　
１２’　、　１３’　、　１４’番地に植えかえたもの
、ＬＳ培地の１５’、１９’、２０゛、２４’、２５’
番地で培養したものをＬＳ培地でＢＡ　、　ＮＡＡ添加
の７，８、９．１２．１３．１４番地に植えかえたもの
及びＬＳ培地、　Ｂ５培地でＢＡを１０−’　、　ＩＡ
Ａを１０−’Ｍ添加のものが優れていることを確認した
。
又Ｂ５培地としては、ＢＡ、　ＮＡＡ添加の１５．１９
．２０　。
２４、２５番地のものが優れていることを確認した。
このことから高色素生産にＢ５培地、　ＬＳ培地におい
てＢＡがｔｏ−’　〜ｔｏ−”でＮＡＡが１０−’〜１
０−″（ｍｏｌ／＋１　）のホルモン量が適当であるこ
とがわかった。
培養した組織には、ＴＬＣ分析及びＨＰＬＣ分析の結果
クロシン、ピクロクロシンが原種物と同様に含まれてい
ることを確認した。
え１五ニユ 下記に示すような条件のもとで、各ホルモンの濃度及び
その組合わせ、各培地および各培養方法について、それ
ぞれ数世代にわたって実験を行い黄色の色素を含んだ組
織を培養できるものを検討した。
エエ」Ｌ亙ｌ」１１ 球根より６〜１３ｃｍぐらいに伸びた花芽を基部より切
り取り、流水にて洗浄する。
洗浄した花芽をオスパン１００倍液に５分間、ビューラ
ックス１０倍液に５分間、７０％０％ニブルアルフール
〜３秒間浸し、滅菌水で３回洗浄する。
洗浄後にシャーレ内で無菌の状態でつぼみを取り出し、
図に示すようにａ　−ｒまでの部位に切り分けそれらを
植え付は切片とする。
−りよ」し境！」１１ 基本培地として、リンスマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培
地（ショ糖３０ｇ／ｌ　、ｐＨ５，７〜５．８）　、ガ
ンボルダＢ５培地（ショ糖２０ｇ７１　、ｐＨ５，７〜
５．８）又はホワイト培地（ショ糖２０ｇ／ｊ２．ｐＨ
５，７〜５．８）に０．９％の寒天若しくは０．２％の
ゲルライトを添加した固定培地を作成した。
但し、ｐＨｍ’ｌｌはホルモン添加後に０．ＩＮのＫＯ
Ｈ及び０．ＩＮのＨＣＩを用いて行なった。
Ｌ−１来ユ１ 培養室内を２５°Ｃ±３℃に保った静置培養１回転培養
、振とう培養で暗所で行なった。
ｄ、植　ホルモン 添加する植物ホルモンとしてサイトカイニン及びオーキ
シンを表−９に示すような様々な濃度の下で行なった。
実験に際して使用した各ホルモンは下記の通りである。
サイトカニン＝６−ベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネ
チン（Ｋｉ）、ゼアチン オーキシン：インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）　、　２
．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）。
１−ナフタリン酸（ＮＡＡ）　、インドール酪酸（ＩＢ
Ａ） 表−９単位：　ｍｏｌ／立 （表中の数字は培地の番号を示す） 尚、継代培養としては、５〜８週問おきに、毎回ｒ＝５
〜ＩＱｍｎ（ｒは組織の直径）のものを植え継いだ。
！ そして第４世伏目の組織の状態を確認した結果Ｂ５培地
とＬＳ培地とも次の表−１０〜１２に示すような柱頭様
組織の発現がみられた。
表−１０Ｂ５培地、ｔＳ培地 表−１１Ｂ５培地、３培地 表−１２Ｂ５培地、ＬＬ＠地 尚１〜１０番地のものでは各ホルモンの組合わせのもの
も柱頭様組織が発現しなかった。
表−１０に示される第２５番地の組織の状態は、３ケ月
後にはＢ５培地は第２図、ＬＳ培地は第３図に見られる
ように成長していた。
■　培地としてホワイト培地のものは一つも発現しなか
った。
このことからホワイト培地は、サフランの柱頭様組織の
培養に適さないものと思われる。
Ｂ５培地とＬＳ培地とを比較すると、Ｂ５培地の方が１
０％程発現数が多かった。
■　ＢＡと２．４−Ｄの組合わせのものは、いずれの番
地においても発現を示さなかった。
このことからオーキシン２．４−Ｄは、柱頭様組織の培
養に適さないものと思われる。
次にオーキシンとしてどれが好ましいかについて調べて
みたところ、　ＮＡＡ　、　ＩＡＡ　、　ＩＢＡの順で
あった。
■　植え付は片として、ａ　、ｂ　＊　ｊ！　１ｍ　、
ｎのものはどの培養条件においても柱頭様組織の発現は
みられなかった。
柱頭様組織の発現状況としては、ｑ、ｐ。
０　＋　ｈ　＋　ｄ　ｒ　ｅ　＊　ｇ　＋　ｆ’の順で
良く、ｑ、ｐ。
０が好ましい事がわかった。
■さらにＢＡ−ＮＡＡ　、　ＢＡ−ＩＡＡ　、　ＢＡ−
ＩＢＡの各番地のもので○印又は０印の結果が得られた
ものについて、　ＢＡの代わりにＫｉ又はゼアチンを添
加してみたところ、略同じような結果が得られた。
ただ成長度（組織の伸び具合）については、ＢＡの方が
Ｋｉより５％程良いことが判明した。
従ってナイトカイニンとしては、　ＢＡが好ましい。
しかしサイトカイニンついてあまり差異がみられなかた
。
このことはサイト力インが全てアデニンに属するもので
あるためと考えられる。
■　サイトカニン及びオーキシンの好ましい濃度につい
て検討したところ、植え付は切片により異なるが全体と
してみたときにサイトカイニンについては１０１〜３ｘ
ｌＯ−’ｍｏｌ／立で、オーキシンについては１０１〜
５Ｘ１０−’ｍｏｌ／Ｑがよいことがわかった。
■　固形培地とするために寒天及びゲルライトを用いた
が、０．９ｘ寒天添加したものと０．２ｘゲルライトを
添加したものとでは、５〜１０％程度ゲルライト用いた
方が成長度が良い。
尚、本実施例では、１〜１２番地に示す配合のものは、
柱頭組織の発現を示さなかったが、前記第一実施例のよ
うに、２４．２５番地において発現した組織を７．８．
９．１０．１２．１３．１４．１５番地のものに植え継
ぎしたところ、柱頭様組織は培養きれ色素生産が一層さ
かんになった。
このことから組織が一旦発現した後はホルモンは低濃度
で培養するのが好ましいことが判明した。
この効果は、ジベレリン酸（ＧＡＳ）を１０−’〜ｔｏ
−’Ｍ添加することにより更に増した。
効　　　　　果 以上説明したように本発明にかかる組織培養方法によれ
ば、従来のサフランの栽培方法に比較して、収穫時期及
び地域が限定きれることなく、かつ大量を短期間で生産
することが可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、サフランの花の各部位を示す斜視図、第２図
はＢ５培地（ＢＡとＮＡＡ添加のもの）の２５番地で培
養されたｑの組織の拡大写真、第３図はＬＳ培地（ＢＡ
とＮＡＡ添加のもの）の２５番地で培養されたｑの組織
の拡大写真である。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）次の各工程、 ａ、サフランの柱頭、花柱、子房、胚珠、花弁の部分を
    摘出し、これを切り分ける工程、 ｂ、切り分けた組織をベンジルアミノプリン、カイネチ
    ン、ゼアチンの中から少なくとも一つ選ばれたサイトカ
    イニンと、ＮＡＡ、ＩＢＡ、ＩＡＡの中から少なくとも
    一つ選ばれたオーキシンを主なホルモンとして添加した
    液体又は固体のＬＳ培地若しくはＢ５培地に移植する工
    程、ｃ、移植された組織を静置、回転又は振とう培養の
    下で継代培養する工程、 とからなるサフラン柱頭組織の培養方法。
  2. （２）ホルモンとしてジベレリン酸（ＧＡ＿■）が添加
    されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の柱頭組織の培養方法。
  3. （３）サイトカイニンの濃度が１０＾−＾６〜３×１０
    ＾−＾■で、オーキシンの濃度が１０＾−＾■〜５×１
    ０＾−＾６（ｍｏｌ／ｌ）であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項又は第２項記載のサフラン柱頭組織の
    培養方法。 （３）オーキシンがＮＡＡであることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の
    記載のサフラン柱頭組織の培養方法。
  4. （４）次の各工程、 ａ、サフランの柱頭、花柱、子房、胚珠、花弁の部分を
    摘出し、これを切り分ける工程、 ｂ、切り分けた組織をベンジルアミノプリン、カイネチ
    ン、ゼアチンの中から少なくとも一つ選ばれたサイトカ
    イニンと、ＮＡＡ、ＩＢＡ、ＩＡＡの中から少なくとも
    一つ選ばれたオーキシンを主なホルモンとして添加した
    液体又は固体のＬＳ培地若しくはＢ５培地に移植する工
    程、ｃ、移植された組織を静置、回転又は振とう培養の
    下で継代培養する工程、 ｄ、ＬＳ培地又はＢ５培地で培養された組織を異なる培
    地に植え継ぎし継代培養する工程、 とからなるサフラン柱頭組織の培養方法。
  5. （５）植え継ぎする培地のホルモン添加量を、植え継ぎ
    前の培地のホルモン添加量より薄くしたことを特徴とす
    る特許請求の範囲第４項記載のサフラン柱頭組織の培養
    方法
  6. （６）ホルモンとしてジベレリン酸（ＧＡ＿■）が添加
    されていることを特徴とする特許請求の範囲第４項又は
    第５項記載の柱頭組織の培養方法。
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EP87308155A EP0261862B1 (en) 1986-09-20 1987-09-15 Process for culturing saffron stigma tissues
DE8787308155T DE3785812D1 (de) 1986-09-20 1987-09-15 Verfahren zur zuechtung von safranstigmageweben.
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