JPS63258596A - ａｒｔヌクレオチドセグメント、ベクタ−、細胞系、及びその製法と使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、四遺伝子を含むベクター、形質転換細胞及び
細胞系の使用、更にはａｒｔｊｆｉ伝子生成物の発現、
診断及び治療手段用としての使用に係る。より特定的に
は、ビニ遺伝子生成物はヘテロ遺伝子生成物の発現率を
調節するために使用され得る。

ウィルスの作用形式、特にレトロウィルスの作用形式を
解明するために、数年来甚大な努力が払われている。解
明の必要な問題を挙げると、これらのウィルスには他の
型の細胞に比較して所定の型の細胞に優先的に感染及び
／又はこの細胞内で実装するものがあるが、それはどの
ような理由によるのか、またどのようにしてウィルスが
その生活環を調節するのかといった問題がある。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、及びＡＩＤＳ関連
症候群は科学研究の対象及び大衆の関心事としてまずま
す問題になっている。ヒトＴ！胞白血病ウィルスＩＩＩ
　（ｔｌＴＬＶ−Ｉ［［）／ＬＡＶハ、後天性免疫不全
疾患、ＡＩＤＳ関連症候群及び他のウィルス関連障害（
中枢神経系の変性、リンパ介在肺炎（ＬＩＰ）、高頻度
で発生ずるカポジ肉腫、Ｂｕｒｋｅｔｔ型のＤｉ胞リン
パ腫、１１ｏｄ）（ｋｉｎのリンパ腫及び出血性紫はん
を含み、集合的にＨＴＩ、Ｖ−Ｉ［［／ＬΔＶ関連障害
と呼称される）の病因剤である［Ｆ、Ｂａｒｒｅ’−５
ｉｎｏｕｓｓｉ他、５ｃｉｅｎｃｅ　ＺＯＯ：８６８（
１９８３）；　Ｒ，Ｇ、Ｇａ１ｌｏ他、同ｍ　、２２４
：５００（１９８４）　；Ｊ、Ｓｃｌ＋ｕｐｂａｃｋ他
、同３　：５０３；　Ｍ、Ｇ、Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａ
ｎ他、同書：５０６；　Ｊ、Ａ、Ｌｅｖｙ他、同書：２
２５，８４０（１９８４）　。

Ｄ、ＫｌａＬｚｍａｎｎイ也　、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）３１３ニア６７（１９８４）；Ｍ、ＧｏＬｔ
ｌｉｅｂ他、７±ａｎｄ　Ｊ　、　Ｍａｄ　、　３０５
　：１４２５（１９８１）：　１１．Ｍａｓｕｒ他、同
書：１４３１　Ｆ、Ｓｉｅｇａｌ他、同’３　：１４３
９；　１１．Ｌａｎｅ他、同書：３０９，４５３（１９
８３）；　Ｊ。

Ｚｉｅｇｌｅｒ他、同害：Ｕ上、５６５（１９８４）　
；　Ｇ、Ｓｂａｗ他、５ｃｉｅｎｃｃ　２２７：１７７
（１９８５）、　Ｄ、ＫｌａＬＺＩｏａｎ他、５ｃｉｅ
ｎｃｅ２２５：５４（１９８４）；　　Ｍ、Ｓｅｌｉｇ
ｎｎｎ他、Ｎｅｕ＋　Ｅｎ　　１ａｎｄＪ、Ｍｃｄ、　
３１上：１２８６（１９８４）］。ΔＩＤｓは臨床的に
はＴ４’（ヘルパー）サブセラ１〜のＴＲＩ胞の欠失に
より特徴付けられ、Ｔ４’Ｍ胞に対するウィルスの細胞
毒性がインビトロで発効することにより生じる現象であ
る。

ウィルス感染に感受性であるが細胞変性に対して部分的
に耐性であるようなＴ４”！［１１胞系を増殖すること
により、ウィルスの大規模産生が可能になった［Ｍ、Ｐ
ｏｐｏｖｉｃ他、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：４９７（１
９８４）コ。

ＨＴＬＶ−１ゲノムは他のレトロウィルスのゲノムと同
様に、キャプシドタンパク質（■ｌ遺伝子）、エンベロ
ープタンパク質（υｖ遺伝子）、及び複製に必要な非椙
造タンパク貫（凹１遺伝子）をコードする読み取り枠を
含んでいる［Ｒａｔｎｅｒ、Ｌ他、Ｎａｔｕｒｅ３１３
：２２７−２８４（１９８５）；　Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓ
ｏｎ、Ｓ他、Ｃｅ１ｌ　４０：９−１９（１９８５）；
　５ａｎｃｈｅｚ−１’ｃｓｃａｄｏｒ、Ｒ，他、Ｓｃ
　１ｅｎｃｅ２２７：４８４−４５１（１９８５）；　
Ｍｕｅｓｉｎｇ、Ｍ、＾、他、Ｎａｔｕｒｅ３］３：４
５０−４５８（１９８５）；　ＲｏｂｃｙＪ、Ｇ、他、
５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：５９３−５９６（１９８５）
　；　　Ｖｅｒｏｎｅ　ｓ（４，Ｆ、　他、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　　２２９：１４０２−１４０５（１９８５）；
　Ｋｉｔｃｈｅｎ、Ｌ、他、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：３
６７−３７０（１９８４）　；　５ｃｂｕｐｂａｃｂ、
Ｊ、池、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：５０３−５０５（１
９８４）　；及び＾１ｌａｎ、Ｊ、Ｓ、他、５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２２８：１０９１−１０９３（１９８５）］。

このゲノムは更に、はとんどのレトロウィルスに共通し
ない少なくとも３種類の別のタンパク買をコードする他
の読み取り枠を含んでいる［Ｒａｔ−ｎｅｒ　Ｌ、他、
Ｎａｔｕｒｅ、前掲頁：　　Ｍａｉｎ−１１ｏｂｓｏｎ
、Ｓ、他、Ｃｅ１ｌ前掲頁；　５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓ
ｃａｄｏｒ、Ｒ，他、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ工前掲頁；　Ｍ
ｕｅｓｉｎｇ、Ｍ、＾、他、Ｎａｔｕｒｅ前掲頁；＾ｒ
ｙａ　。

Ｓ他、５ｃｉｅｎｃｅ　２２旦：　６９−７４（１９８
５）；　５ｏｄｒｏｓｋｉ、Ｊ、他、５ｃｉｅｎｃｅ　
２２９：　７４−７７（１９８５）］。これらの読み取
り枠の２種（２３ｋＤタンパクをコードするＳＯｒｍ伝
子［５ｏｄｒｏｓｋｉ、Ｊ、他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３
１：１５４９−１５５３（１９８６）；Ｌｅｅ、Ｔ、１
１．他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３上：１５４６−１５４９
（１９８６）　］及び２７ｋＤのタンパクをコードする
３“ｏｒｆ３ｉ伝子［Δ！−ｆａｎ　Ｊ、Ｓ、他、５ｃ
ｉｅｎｃｅ　　２３立：　　８１０−８１２（１９８５
）］／に突然変異があった場合、ウィルスがＴリンパ球
内で複製され、Ｔリンパ球を殺す能力は失われない［５
ｏｄｒｏｓｋ　ｉ　、　Ｊ　、他、５ｃｉｅｎｃｅ　２
３に前掲頁］。トランスアクチベータ（ｔａｔｍ）ｆｆ
ｉ伝子は１４ｋＤのタンパクをコードし、転写後、ウィ
ルスメツセージのリーダー［Ｒｏｓｃｎ、Ｃ，＾９他、
Ｃｅ１ｌ　４１ｔｌ：　８１３−８２３（１９８５）］
で特異的標的配列（１゛＾Ｒと呼称する）と相互作用す
ることにより、　ＨＴＬＶ−Ｉ［［の長い末端反復（Ｌ
ＴＲ）に関連する遺伝子発現を導＜［１，９８５年１２
月６日付米国特許出願第８０６，２６３号；　Ｒｏｓｅ
ｎ、Ｃ，Ａ、他、Ｎａｔｕｒｅ　３１９：５５５−５５
９（１９８６）；　５ｏｄｒｏｓｋｉ、Ｊ、Ｇ、他、５
ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１７１−１７３（１９８５）　
；＾ｒｙａ、Ｓ、他、５ｃｉｅｎｃｅ　２２旦前掲頁；
及び５ｏｄｒｏｓｋ　ｉ　、　Ｊ　、他、５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２２９前掲頁、以上文献は本願の参考資料である］
、２分節系Ｕ↓■遺伝子の第１のコーディングエキソン
の５′部分で突然変異があると、ウィルスが構造タンパ
ク質を有効に合成し複製する能力は損なわれる［米国特
許出願第８０６，２６３号；　Ｄａｙｔｏｎ、八、他、
Ｃｅ１ｌ　４４：９４１−９４７（１９８（ｉ）］。こ
れらの突然変異は、Ｕ↓Ｉタンパク質ｆ！：構造的に発
現する細胞系ではトランス位で相補されマｉ）る。

発明者らは、ｔａＬｔ３ｆｔ伝子及び遺伝子生成物を使
用してヘテロ遺伝子生成物を高いレベルで産生できるこ
とを以前に発見している。しかしながら、エンベロープ
タンパク質のような所定の遺伝子生成物の産生は細胞の
溶解を伴い得る。従って、細胞は大量の所望のタンパク
質を産生する以前に死んでしまう。

更に、ある種の細胞はヘテロタンパク質を分解し、大量
のヘテロタンパク質の蓄積を妨げるようなタンパク質分
解酵素を有する細胞もある。

所望のタンパク質の産生が開始される以前に該所望のタ
ンパク質の大量の［ビルディングブロックＪ、即ち特異
タンパク質に対応するメツセンジャーＲＮΔ（＋ｎ　Ｒ
ＮΔ）種を細胞内に蓄積できるようなシステムを実現す
ること、従って新規産生法を実現することが望ましい。

ＨＴＬＶ−１［／ｌ＾■ウィルスを保有する個体を同定
する付加手段を実現することも望ましい。

更に、ＨＴＬＶ−Ｉ［／ＬＡＶＬィルスの細胞変性動片
が個体から個体に感染、複製、繁殖及びまん延するのを
阻止する化合物を新規に発見できれば有益である。

更に、３断及び予防用として非致死ＨＴＬＶ−Ｉ［１／
Ｌ八八ツウィルス産生できるのであれば有益である。

九皿ＩＪｕ叛 さて、発明者らはＨＴＬＶ−Ｉ［［／ＬＡＶのキャプシ
ドエンベローブ遺伝子の発現を調節し、更にペテロ（非
ウィルス）遺伝子の発現を調節するために使用可能な遺
伝子及び遺伝子生成物を発見するに至った。

この（工逍伝子は２つのエキソンから成り、ヌクレオヂ
ドセグメント、ベクター及び細胞系の作成に使用できる
。更に発明者らは、この遺伝子及び遺伝子生成物が１（
ＴＬ’Ｖ−ＩＩＩ　／ＬＡＶの特徴的複製に必要である
ことを発見した。こうして発明者らは、ＨＴＬＶ−■の
復製を阻害する化合物をスクリーニングするための新規
方法を発見した。この方法は、（１）Ｔ細胞系を！（Ｔ
［、Ｖ−ｍ　ａｒｔ及びりリー遺伝子でトランスフエフ
Ｉ・する段階と、 （２）その後、形せ転換した細胞系に予め選択された化
合物を濃度を増加しながら加える段階と、（３）化合物
が細胞に対して毒性を示すことなく匹Ｍに影響を及ぼす
か否かを決定する段階とを含んでいる。

この方法の変形は、細胞ＤＮＡに組み込まれたｄ配列を
含んでおり、構造的に虹±活性を発現する細胞系の確立
を含んでいる。その後、段階１−３が実施され得る。

この遺伝子及び遺伝子生成物は、所望のヘテロ遺伝子生
成物の産生を制御する際にも使用され得る。この方法は
、 （１）シス作用性阻害因子を放出することの可能なシス
作用性負の配列に融合された所望のヘテロ遺伝子の上流
のトランス活性ｒヒタンパク賞に反応性の十分な量のＨ
ＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲを含むベクターにより、予め選択さ
れた細胞系をトランスフェクｉ・する段階と、 （２）所定の時期に、シス作用性阻害因子を抑制し且つ
所望のヘテロ遺伝子生成物の発現を可能にするために十
分な量の四遺伝子生成物と、シス作用性阻害因子とを接
触させる段階とを含んでいる。

更ニ、ＨＴＬＶ−Ｉ　／ＬＡＶニ関連する約１１６７１
７）７’ミ／酸から成るこの新規に発見されたタンパク
質は、疾患の診断に使用するための付加的パラメータを
構成する。更に、史遺伝子及び遺伝子生成物はＡＩＤＳ
の治療に使用できる。この目的のためには、精製した喰
タンパク質又は、該タンパク質から誘導され、細菌、酵
母もしくは１庸乳動物細胞内で産生されるかあるいは化
学的に合成されたベプ千Ｆを使用して、体液内の四タン
パク質に対する抗体を検出することができる。あるいは
、鉄タンパクτ丁又は該タンパク質から誘導されたペプ
チドに対して形成された抗体を使用し、組織又は体液内
のｃｒｔタンパク質を検出することができる。

以下、添付図面に関して本発明をより詳細に説明する。

１帆立Ｊ１食」Ｕｌ さて、発明者らはＬａｔｅ遺伝子生成物以外に有効な１
１°ｒＬＶ−Ｉ［）（ａ呈及びυヱタンパク質合成に必
要なタンパク質を産生する遺伝子を発見した。この遺伝
子のコーディングエキソンは、ｔａｔ４遺伝子の第１及
び第２のコーディングエキソンの別の読み取り枠を使用
する（第１図）。約ヌクレオチド５５５０の約メチオニ
ンコドンから１１４始して、この遺伝子の第１のコーデ
ィングエキソンは約５６２５の位置の既知のスプライス
０（与体まで延びている。約ヌクレオチド７９５６に配
置された対応するスプライス受容体は、約８２２７の位
置の終止コドンで終止する枠内読み取り枠に先立つ。こ
の別の読み取り枠生成物を産生ずるために必要なスプラ
イシングは、を−Ｉユ蓋遺伝子に使用されると同一であ
り、ＨＴＬＶ−１［感染細胞のメッセンジャーＲＮＡで
生じる。

この別の読み収り枠の生成物は、約１１６のアミノ酸長
であり、口↓Ｉ遺伝子生成物及び核酸結合タンパク質に
見出だされると同様の高度に塩基性の疎水性範囲を含ん
でいる。

ＨＴＬＶ−Ｉ［１構造遺伝子の発現は、正の調節因子と
して作用するり↓■生成物、及び」及びリヱ遺伝子内又
はその近値に配置されたシス作用する負の調節配列を妨
害するａｒｔ生成物により支配される。

この複合調節ａ　Ｊｔｌについて２つの可能な役割が考
えられる。ＨＴＬＶ−ＩＩＩは活性化されないＴｉ胞で
潜伏状憩の感染に達すると報告されている［Ｚａｇｕｒ
ｙ他、５ｃｉｅｎｃｅ２３１：８５０−８５３（１９８
６）］、　ｔａｔｍ又はａｒｔ機能か欠けると、ウィル
ス構造タンパク質の合成を伴わないウィルスＲＮへの蓄
積により特徴付けられる感染状態に陥る。い工、又は計
重機能が再現された性が細胞分化の状態に依存すること
から、ＨＴＬＶ−■潜伏期とＴ細胞活性化との関係が説
明できる。

あるいは、転写後調節剤はウィルスの溶菌サイクルに関
与し得る。ピリオンタンパク質でなくウィルスＲＮへの
蓄積により特徴付けられる初期の段階の感染は、Ｔ４細
胞に対して毒性のウィルスタンパク質が産生される後期
相に先行する。初期から後期段階への転換は、い↓Ｉ及
び匹遺伝子機能の一方又は両方の活性化をもたらす、こ
のような初期−後期転換は、毒性ピリオン成分自体が産
生される以前に該成分にｍＲＮΔの蓄積を可能にする。

変調されたＵ↓菖活性により感染性ウィルスの産生が増
長し得ることは、ある程度証明されている。感染の細胞
変性効果がＪｕｒｋａｔ　ｔａｔＨ細胞に蓄積されるこ
とが観察されるにも拘わらず、高レベルのｔａｔ■遺伝
子を構造的に産生するＪｕｒｋａｔ細胞系の溶菌感染に
観察されるウィルス粒子の産生率は、Ｊｕｒｋａｔ細胞
系自体の感染に観察される産生率よりも著しく低い。高
い構成レベルの鴨１１遺伝子をもたらす細胞の早発死は
、ウィルス力値の減少を説明し得る。ウィルス遺伝子の
発現の一時的調節は、他の溶菌ウィルスの生活環で重要
である。ＨＴＬＶ−■感染潜伏在及び溶菌サイクルにお
いて仮定されるｔａｔＨ及びａｒｔ遺伝子の役割は、必
ずしも排他的ではない。

宿主細胞分化及び増殖に関連する柔軟な多重調節経路は
、ＨＴＬＶ−１１［感染に伴う疾患に観察される多くの
変異性を説明するものである［Ｓｅｌｉｇｍａｎ、Ｍ。

他、Ｎ、ｈＬム肚虹、咀：１２８１３−１２９２（１９
８４）］。正及び負両方の成分を含むこのような多重調
節経路を使用すると、所望のヘテロ遺伝子が高いレベル
で産生される。

有効なＨＴＬＶ−１ｇａｇ及びｅｎシタンパク質合成を
得るためにｔａ１４タンパク質以外に圧−転子生成物が
必要であることは、ＩＩ、３１！伝子の２つのコーディ
ングエキソンの一部を欠失するようなプラスミドを調製
した場合、ウィルスが世及び幻す−タンパク質を発現す
る能力は失われないまでも著しく低下するという事実に
より立証される。更に、これらの突然変異はりす、Ｉ遺
伝子生成物のみを加えても相補されないので、ウィルス
のこの弱毒化は欠陥切り、鳳遺転子生成物の結果ではな
い。従って、第２の転写後制御経路がＨＴＬＶ−ＩＩＩ
発現に関与することは明白である。

これらの欠失を含むプラスミド（ｐΔ（８０５３−８４
７４及びｐＦｓ８０５３）でトランスフエフ１〜された
Ｒａｊｉ細胞は、ＨＴＬＶ−１［［」又はシリ−遺伝子
生成物を発現しなかったが、ｐ　ｔｌ　Ｘ　Ｂ　ｃ　２
プラスミドによるトランスフェクション後に観察される
量に匹敵する量のレベルの１４ｋＤ　ｔａ↓璽道伝子転
子物を合成した。放射線免疫沈降により判断した処、ｐ
ＨＸＢｃ２は胡ヱ、むｌ及びｉ人ｌＩｉ転子生成物を発
現するが、完全な３゛吐４伝子生成物は合成しない。従
って、ヌクレオチド位置８０５３又はその近傍における
突然変異は、プロウィルスがｇａｇ及びυｙタンパク質
を合成する能力を減衰させるが、１１゜タンパク質の合
成には影響しない、このことは第２図にも示されており
、この図面に示すように４１伝子の３°部分に突然変異
を含むプロウィルスは、元のｐＨＸＢｃ２プロウィルス
に観察されるとほぼ同一レベルまでＨＴＬＶ−Ｉ［［Ｌ
ＴＲに関連する遺伝子発現をも−たらすことが可能であ
る。

従って、μを及びｅｎＶ遺伝子タンパク質の発現をもた
らす突然変異は口１璽遺伝子の発現にはあまり効果がな
い。

重要な点として、鉄道転子生成物を発現するプラスミド
は、欠失変異体の欠陥を相補し、むｌ及びｅ　ｎ　ｖ　
ｍ転子生成物の合成をもならず。−１６７〜＋８０のＨ
ＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲ配列を、四遺転子読み取り枠の推定
上の開始コドンに関して各種の位置に配置した。ウィル
スタンパク質発現はトランスフェクションから４８時間
後であると判断された。

第３図は、虹±ＡＣＧコドン（及びｔａＵ、開始コドン
ノ下’ｔ＊　）　ノ５’位ニＨＴＬＶ−ＩＩ　ＬＴ１１
５１クレ、ｔ　チトを配置した場合、突然変異プラスミ
ドのひとつ（ｐＦＳ８０５３）によるむ工発現に必要な
機能をトランス位に提供するようなプラスミド＜ｐＥｘ
５４９６）が形成されることを示している。ｇｐ１６０
／１２０ｅｎｖｆｉ伝子タンパク賞は、Ｊｕｒｋａｔ−
ｔａ±、′ｍ胞にトランスフェクション後にｐＥｘ５４
９６プラスミド自体により産生される。

ｐＥｘ５４９Ｂプラスミドが、ＦＳ８０５３突然変異を
相補しエンベロープタンパク質を合成する能力は、別の
読み取り枠（プラスミドｐＥｘ５４９６ＦＳ）における
フレームシフト突然変異により排除される。　ＨＴＬＶ
−ＩＩＩ　ＬＴＲがｑｒｊＡＴＧコドンの３′位に配置
されているようなプラスミドは、ｐＦｓ８０５３の突然
変異を相補ぜず、興ヱ遺伝子生成物を合成することもな
い（第４図のプラスミドｐＥｘ５６０７及びｐＥｘ５７
０２参照）、これに対して、プラスミドｐＥｘ５４９６
のｅｎｖ又は３’ｏｒｆ３ｉ伝子内に欠失があると、ｐ
Ｆｓ８０５３プラスミドがトエ遺伝子発現を活性化する
能力は失われない（プラスミドｐＥｘ５４９６−Δｅｎ
Ｖ及びｐＥｘ（５４９６−８４７４）（第３図及び第４
図）、更に、ｐΔ（８０５３−８４７４＞により導かれ
るＨＴＬＶ−ｈ旦逍転子発現もまた、ｐＥｘ５４９６プ
ラスミドにより活性１ヒされ得る。このことから明らか
なように、鉄道転子生成物を発現することの可能なプラ
スミドは、鉄道転子生成物の発現を阻止する突然変異を
含むプロウィルスによりｇＡＬ’ｌｉ伝子発現を転子ン
ス配置で活性化し得る。

発明者らは更に、ｐＦｓ８０５３プラスミドによる１ｌ
ｕ−遺伝子発現がＩ上■遺伝子の開始コドンの５“位に
配置されたＨＴＬＶ−Ｉｌｌ配列を含むプラスミドによ
りＪｕｒｋａｔ−リリエ、細胞内で活性化され得ること
を発見した。ｐＥｘ５３６５プラスミドは機能的農工夏
活性を産生ずると共に、ｇ　ａ　ｇ　遺伝子発現に必要
な機能をトランス配置キ この実験で観察された１ＬＬｌｒ道伝子発現転子度は、
ｐＥｘ５４９６ブラスミドを使用した実験で観察される
程度よりも低かった。

遍−ロ、遺伝子生成物を発現するがヴリーｊδ転子を発
現しないように形成されたプラスミドについて、ｌ−遺
伝子の突然変異を含むＨＴＬＶ−ＩＩＩプロウィルスに
よりｑｎｖＭ伝子産転子産生にする能力を試験した。プ
ラスミドｐＥｘ５４９６−Δリヱは、外部の糖タンパク
ｇｐ１２０をコードするｅｎｖｆｆｉ伝子の部分転子失
フレームシフト突然変異を含んでいる。第３図は、ｐＥ
ｘ５４９６ΔｅｎｖプラスミドがＪｕｒｋａｔ−ｔａ±
ｙｉｈｌｌＩ胞にトランスフェクション後に検出可能な
レベルの！タンパク質を産生しないことを示している。

このプラスミドをｐΔ（５３６５−５５５１）プラスミ
ドでＪｕｒｋａｔ−ｔａ±１細胞に同時）・ランスフェ
クションすると、ｐΔ（５３６５−５５５１）プラスミ
ドはｇａｇ及びｅｎｖタンパク質の両方を産生し得る（
第３図参照）。ｐΔ（５３（ｉ５−５５５１）プラスミ
ド単独又はｐΔ（５３６５−５５５１）とｐＥｘ５４９
６ＦＳプラスミドとの両方のいずれかでトランスフエフ
１〜したＪｕｒｋａｔ−ｔａｔｇ細胞には、ウィルスタ
ンパク質は検出できなかった。ｐＥｘ５４９６Δ引リー
プラスミドリープラスミド５４９６ＦＳ及びｐＥｘ５７
０２プラスミドによりこのｇｐ１６０／１２０ｅｎｖ生
成物の合成を活性化する。　ｐｌＥｘ５４９６Ｆｓ及び
ｐＥｘ５７０２プラスミド単独でＪｕｒｋａｔ−ｔ＋リ
エ璽細胞を゛トランスフェクションしても、リヱ道転子
生成物は検出されなかった。このことから明らかなよう
に、これらのプラスミドがエンベロープタンパク質を合
成できないことはエンベロープタンパク質を産生ずるの
に必要なシス作用配列よりもむしろａ　ｒ　ｔ、ｆｆｉ
伝子転子壊に起因している。従って、別の読み取り枠に
より発現される生成物である已遺転子生成物は、鉄道転
子で突然変異したプロウィルスにより導かれる吐４転子
発現及び／又はｇａｇ３１を転子発現に関してトランス
活性ｊヒ機能を有することがわかる。

理論的に説明するには及ばないが、鉄道転子生成物によ
り抑制されるむ工及びリヱ遺伝子生成物をコードするウ
ィルスメツセージ上にシス作用性負の調節配列が存在し
ていることは発明者らが確信する処である。この配列は
、興ヱ及びｍ遺伝子生成物の発現を阻止するシス作用性
阻害因子をもなラス、発明者らは、ＨＴＩ、Ｖ−ＩＩＩ
　ＬＴＲ配列（−１６７〜＋８０）が細菌クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ及びマウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼのようなヘテ゛口遺伝子生成物を高
レベルで合成するには、ｕ±夏遺伝子生成物単独で十分
であることと以前に発見している［（１９８５年１２月
６日付米国特許出願第８０６，２６３号；　ＲＯ８（！
ＩＩ、Ｃ，＾、、　Ｎａｔｕｒｅ、前掲具；　５ｏｄｒ
ｏｓｋｉ、Ｊ、Ｇ、他、５ｃｉｅｎｃｅηｇ７：　１７
１−４７３（１９８５）］。しかしながら、ＨＴＬＶ−
１リヱ遺伝子の５′位に配置されたこれらの同一のＨＴ
ＬＶ−■ＬＴＲ配列を含むプラスミド（ｐＥｘ５４９８
Ｆｓ又はｐＥｘ５７０２）は、活性リリ、■道転子生成
物の存在下であっても［」１遺転子生成物の不在下では
検出可能なエンベロープタンパク質を産生しない。Ｊｕ
ｒｋａｔ−りり１、細胞でＨＴＬＶ、　ＩＬＴＲの制御
下に得られるヘテロ遺伝子のエンベロープ産生レベルに
近付くのは、ａｒｔ遺伝子生成物がトランス配置に供給
されてからに限られる。以上から判断すると、ｐＥｘ５
４９６ＦＳ及びｐＥｘ５７０２プラスミド３′〜＋８０
の配列はりヱ遺転子発現を阻害し、このような阻害は虹
↓遺伝子のトランス括性化機能により緩和され得る。■
■遺伝子発現にこの第２のｌ・ランスアクチベータが必
要であることがらわかるように、ＦＬａｇ逍伝子メ転子
−ジはセリ−遺伝子メツセージに見出だされる以外のリ
プレッサー配列も３んでいると予想される。以上の理由
により、発明者らは第２のトランスアクチベータをコー
ドする遺伝子にリー、即ちＨＴＬＶ−Ｉ１１椙造タンパ
ク質をコートするウィルスメツセージに存在しているシ
ス作用性リプレッサー配列の機能を無効にするという意
味でこの遺伝子の提案された役割に一致する抗すブレッ
ザートランスアクチベータ（ａｎｔｉ−ｒｅｐｒ（！Ｉ
；Ｓｏｒ　Ｔｒａｎ：＋ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を表す名
称をｉＺ択した。

ウィルスゲノムにおける特異的リプレッサー配列の存在
を試験するために、次の組換体プラスミドを構成した（
第８図参照）。ＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲの制御下の細菌ク
ロラムフエニコールアセチルトランスフェラーセ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子は、ポリアデニル化信号を欠失しており、Ｈ
’ｒＬＶ−１１１ゲノムの３′末端に結合していた。こ
のプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクション後、
ＣＡＴ活性は実買的に検出できない。

一方、！ユ発現プラスミドで同時トランスフェクション
すると抑制は緩和され、ＣＡＴ活性は増加する。これら
の実験から判断すると、ＨＴＬＶ−１［ゲノムは活性を
制御するためにペテロ遺伝子に結合し得るリプレッサー
配列を含んでいる。第８図は上記のように、す」転子活
性がＨＴＬＶ−Ｉ［［のシス作用性負の調節配列の負の
効果を緩和し１５ることを示している。転写開始に使用
される配列はこの実験）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ＬＴＲカら
誘導し、ＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ　ＬＴＲ配列トｇａＨ−及び
基土遺伝子の配列との間には、Ｍ１能により特異的に緩
和される負の調節効果に必要な特異的反応が形成され得
る。

トエ及びφ旺遺転子生成物でな（ｔａｔＨ道伝子の転子
可能なレベルは、四機能に欠陥のあるプロウィルス突然
変異位体により合成される。■呈及びｅｌｌＶ遺伝子生
成物を阻害しても、ロエＩ遺伝子発現には影響がない。

む■遺伝子全体及び■遺伝子の大部分を含む配列は、Ｕ
±■メツセンジャーＲＮＡがちスプライシングにより除
去されることが知られている［Ｍｕｅｓｉｎｇ、Ｍ、Δ
、他、Ｎａｔｕｒｅ　３１３．前掲頁、Ａｙｒａ、Ｓ、
、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９．前掲頁、５ｏｄｒｏｓｋｉ
　、５ｃｉｅｎｃｅｕ則、０η掲頁コ。Ｉ↓Ｉメツセー
ジからスプライシンクされた領域に配置された１１２反
応性のシス作用性抑制配列の除去は、ｔａｔＨの発現が
匹生成物からの要求に無関係であることを説明している
。

す人生酸物は、同様にこれらのＦｉａ−ｇ及びυヱ配列
を欠失しているメツセージから合成されるので、このよ
うな負の調節配列からも独立しているはずである。潜在
的り↓ｌ及びａｒｔ−メツセージの非コーディングリー
ダー配列に観察される異種性は、実際にｔａ１４及び咳
Ｖンバク質の相対レベルを変調するＡＴＧ使用を決定し
得る。

さて、発明者らはＨＴＬＶ−■／ＬΔ■ウィルスの細胞
変性効果を緩和する化合物をスクリーニングするための
新規方法を発見した。この方法は、ａｒｔ逍転子生成物
を不活性化する薬剤のスクリーニングを含んでいる。上
述のように、発明者らはＨＴＬＶ−１１１／ＬＡＹウィ
ルスが任意の有効なレベルでキャプシドエンベローブタ
ンパク質を発現するためには、鉄道転子生成物が必要で
あることを知見している。ウィルスの複製にはエンベロ
ープ構造タンパク質が必要であるので、鉄道転子生成物
を非活性化し、従ってエンベロープタンパク質の複製を
阻止することにより、ウィルスの増殖及び細胞変性効果
を完全に除去するには至らなくともこれを緩和すること
が可能である。

エンベロープタンパク質はＴ細胞を非常に特異的に殺す
。このタンパク質はＴ４細胞のＴ４レセプターにくっつ
き、細胞を相互に融合させる。その後、融合した細胞は
死滅する。従って、鉄道転子及びｅｎｖ−遺伝子を含む
ベクターをＨＴＬＶ−１［［ＬＴＲの制御下でＴ細胞系
に導入することにより、鉄道転子を不活性化し、従って
エンベロープ遺伝子生成物の発現を阻止し、融合を停止
させるような化合物を検定することができる。好ましく
は、エンベロープタンパク質の細胞変性効果に特に感受
性のＴ細胞が使用される。より好ましくは、Ｔ４細胞が
使用される。

任意のＴ４細胞を使用することができるが、好ましくは
ＩＩ　Ｕ　Ｔ　７８１１ａｌ胞、Ｃ８１６１Ｍ胞及びＪ
　ｕ　ｒ　ｋ　ａ　ｔ　Ｊ（ＩＩ胞から誘導された細胞
系が使用される。より好ましくは、米国特許出願筒８０
６，２０３号に開示されているようにｔａｔ４細胞系が
使用される。最も好ましくは、ｃｓｉａｔ細胞から誘導
されなり０．１細胞系が使用される。

例えば、Ｃ８１６１Ｔ４“リンパ球系は活性化されたＴ
細胞の典型的なマーカーを発現し、ＨＴＬＶ−１［［感
染及び細胞変性に対して著しく感受性であるので、アッ
セイ用の容器としてこれを選択することができる。Ｃ８
１６１細胞がＨＴＬＶ−ＩＩＩに対して特異的な正の膜
蛍光及び細胞外逆転写酵素（ＲＴ）活性を最大限に示す
直前に、融合細胞形成、細胞拡大及び細胞膜の突出を含
む細胞変性変化が生じる。その後、ウィルス細胞の数は
急速に減少する。ＨＴｌ、Ｖ−１１１ウイルスυヱ遺伝
子を発現しないベクターでトランスフエフ１〜したＣ８
１６１培養株にはこのような変化は生じなかった。

好ましくは、細胞系は細胞の死後に放出されるマーカー
を更に含んでいる。このマーカーは試験材料の細胞変性
効果を決定するために使用され９１′ｆる。従って、細
胞が死ぬとマーカーは培地に放出され、培地の反応が視
覚的に観察される。このようなマーカーは当業者により
容易に選択１１１能であり、例えばクロムを含んでいる
。

アッセイシステムは、Ｔ４細胞系を上記Ｕ工−ロヱベク
ターでトランスフェクトする段階を含んでいる。その後
、鉄道転子生成物を不活性化すると予想される細胞に、
添加量を増加しながら所定の化合物を加える。このベク
ターの導入は正常では細胞に対して細胞変性効果をもつ
ので、トランスフェクトした細胞が死んだか否かを調べ
るだけで、化合物がａｒｔ遺伝子生成物を不活性化する
が否かを判断できる。

典型的には、これらのベクターによるトランスフェクシ
ョン後、細胞は細胞変性変化を示す。一般に、トランス
フェクションから６日後に培養株の生存力が著しく低下
する。このような培養株の細胞を含まない上清には細胞
外ＲＴ活性が検出される。細胞は膜蛍光を示し、死滅す
る。一般に、これはＩ・ランスフェクションから２週後
に生じる。

従って、細胞が死滅しないならば、薬剤は鉄道転子生成
物の不活性化に有効であったと仮定できる。更に、被試
験化合物が薬剤に対して細胞変性を示さないならば、化
合物は細胞を殺し、細胞中にマーカーを放出する。対照
実験として、疑似ｊ〜ランスフェクトされるＴ４．［胞
を使用する実験を並行して実施することが好ましい。こ
のような細胞系はエンベロープタンパク質の発現により
殺され得す、被試験化合物及び／又は被試験化合物の濃
度が細胞の生存力に有害であるが否かを容易に決定する
ことができる。

好ましくは、トランスフェクションはＴ４１！ｌｌ胞培
養株を虹↓細胞系と同時培養することにより実施される
。この細胞系は、例えばＲａｊｉ細胞のような１（リン
パ球細胞系をトランスフェクトすることにより調製され
る。これらのビ圭細胞が）ＩＴＬＶ−ＩＩ　ａｒ±及び
嗟生成物を構造的に発現する能力は、当業者に周知の方
法により同時培養以前に容易に決定され得る。好ましく
は、この細胞系はいよ璽タンパク質を発現することも可
能である。これらの遺伝子を発現する安定細胞系を確立
することが可能であり、従って、新薬を試験したい場合
にはいつでも簡単で且つ信頼性の高い方法でＴ４Ｍｌ胞
をトランスフェクトすることができる。例えば、単にこ
れらの四細胞をマイＩ・マイシンＣで処理し、０８１６
６細胞のようなＴ　４　ｔ（１１胞と共に細胞を培養ず
ればよい。

１１細胞と１４細胞との割きは広い範囲であり得る。

典型的にはこの割合は５：１〜１：５、好ましくは約１
＝３である。その１裔、ａｒ↓細胞と共に同時培養され
た゛１′４細胞は、Ｔ４細胞のトランスフェクション後
に観察されるとは区別できないような細胞変性変化を示
す。

！、四遺伝子生成物を発現する好適な細胞系は、Ｒａｊ
ｉ、　Ｈｅ１ａ、　Ｎ１１ｌ　３Ｔ３、Ｊｕｋａｔ、Ｔ
細胞、Ｉ１４［胞及びＣｌｌ０を含む。

！！旦、タンパク質とＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ＬＴＲ中の虹
↓タンパク質に対して反応性の配列との間の反応を阻止
するか又は四タンパク質がＨＴＬＶ−１［［ＬＴＲをト
ランス活性化させる能力を阻止するような化合物をスク
リーニングすることが好ましい、転写後１（ＴＩ、Ｖ−
１ｍ造道伝転子発現は、正の調節因子として作用する国
う生成物及び、む工及びリヱ遺転子内又はその近傍に配
置されたシス作用性質の配列に由来するシス作用性阻害
因子を妨害する［工生成物により支配される。ｂ′Ｃっ
で、翻訳を阻害する化合物、例えば翻訳開始複合体の形
成に影響するがあるいはウィルスｍＲＮへに対するりボ
ソームの結合を変化させるような物質を使用することが
最も好ましい。

このスクリーニング工程で使用され得る化合物の例は、
コンペティター、訪訳を阻害する化合物、及び所定の１
ヒ金物の結合能力を変化させる化合物を含む。このスク
リーニング工程で使用できる化合物としては、門すュ１
１」工ｓ’　Ｄ旦り＜　Ｒｅ色迂旦厖猛−１３８巻、Ｍ
ｅｄｉｃａｌ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｃｏ、、　Ｄｒｏ
ｄｅｎ、　Ｎ、Ｊ、（１９８４）に記載されているよう
な化合物があり、当業者であればこの開示に基づいて容
易に化合物を決定することができる。

好適なコンペティタ一群としては、核酸に結合する能力
を保持しながら且つシス作用性因子の阻害効果を克服す
る能力を欠失している突然変異リエタンパク質がある。

このようなタンパク賛は、機能的！」タンパク貫の有効
なコンペティターとしてａ　１ｍするはずである。例え
ば化学的修飾による任意の突然変異誘発を使用して、特
定の標的領域を含まない多数のａｒｔ突然変異体を発生
させることができる。−具体例によると、適当な制限エ
ン１ζヌクレアーゼ部位を使用して単＃ｉｉＴ能なａｒ
ｔの第１のコーディングエキソンを使用する。この領域
はファージ旧３の複製形態にクローン化される。

いずれかの方位の四インサートを含む一重鎖ＤＮＡは、
メトキシアラミンを使用して突然変異誘発される。この
結果、５０％より大きい頻度で一重鎖及び二重鎖ヌクレ
オチド置換が生じ得る［（Ｋａ−ｄｏｎａ）（ａ及びＫ
ｎｏｗｌｃ３．１社］旦ｈＲ（４！（ａ、−１３：　１
７８３（１９８５）　］。ある方位のクローンの一重鎖
ＤＮＡは、二重鎖インサートが再現されるように別の方
位のクローンの一重鎖ＤＮＡにアニールされる。化学的
に修飾されたインサートは制限消化によりベクターＮ１
３ＤＮ八から除去され、カットアルカリホスファターゼ
で処理したＮ１３複製型ＤＮＡに再クローニングされる
。インサートを含んでいるクローンは、８１３ベクター
内に存在しているβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をインサ
ートが破壊する時に発生した無色プラークにより同定さ
れる。次にインサートフラグメント ジデオキシ法を使用して配列決定され得る。

上記方法によりＮ１３で１工突然変異体を発生及び配列
決定後、インサートフラグメントはＨＴＬＶ−１１１　
１、ＴＲを含むＨＴＬＶ−１１１発現ベクターに再クロ
ーニングされ、真核細胞にトランスフェクトされる。突
然変異体ムーリ，タンパク質の活性は、μ１遺転子を不
活性化する突然変異以外は元のままのＩＩＴｌ．Ｖ−１
１１プロウイルス、例えば同時トランスフェクションア
ッセイのプラスミドｐＦｓ８０５３のプロウィルスをも
含む細胞中で、ＨＴＬＶ−　Ｉ［［　ＬＴＲに関連ずる
ＩＩＴＩ、Ｖ　−　Ｉｆｆ　Ｌｌｌ又はｃｏｗｌ伝子タ
転子ク質き成を活性化する能力を試験することにより決
定される。未修飾野生型ａｒｔ遺伝ｊ′−でなくむ工及
びリヱ、及び好ましくは切り、■遺伝子でトランスフェ
クトされたＴ４ｍ胞を使用すると、１週間に１００もの
プラスミドクローンの活性を試験することができる。更
に、則胞死の程度及び速度を調べることにより、突然変
異ａｒ’を遺伝子生成物のトランス活性１ヒ能力を増加
又は減少させる突然変異を定量的に検出することができ
る。

最早！・ランス活性化することができないこれらの突然
変異体は、上記のようなスクリーニング法で：Ｊｃ＠さ
れる。活性形態に有効に対抗し得る突然変異ｌ！良−タ
ンパク質が見出だされるならば、突然変異ａｒｊ３ｉ伝
子はレトロウィルスベクターにサブクローニングされる
。

１１１’ＬＶ−１［１／ＬΔＶの存在を試験するために
吐（タンパク質を使用してもよい０例えば、ａｒｔタン
パク質を逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃで精製し、抗体を誘導す
るために使用してもよい。次に、このタンパク質を使用
して当業乙に周知の方法によりウサギに免疫感作する。

次に潜在的にＨＴＬＶ−１［１／Ｌ八へ感染した細胞で
免疫沈降分析するために、ａｒｔｓンバク質にウサギ抗
血清を使用する。細胞を代謝標識し、細胞抽出物をウサ
ギ抗血清で免疫沈降させる。典型的にはウェスタンプロ
ットアッセイが使用される［Ｓｕｍｕｃ　ｌ　、　Ｄ　
。

Ｐ、他、＄−０−堕吐４赳：１０９４（１９８４）参照
］。例えば放射線標識したタンパク質を使用する既知の
方法により抗原−抗体複合物を検出してもよい。第７図
は、ａｒｔタンパク質が約１９〜２０キロドルトンの分
子−量を存しており、感染患者の免疫反応を引き出すこ
とを示している。細菌によって産生されたａ、−１り〉
・バク質を使用てきるので、疾患の過程で抗体の罹患率
を血清学的に調査することが可１ｍになる。診断用試薬
としての使用以外に、精製したφＦ↓タンパク質は該試
薬の生化学特性を十分に調査するためにも使用できる。

本発明で使用されるベクターは、１９８４年５月２４日
付けで出願されたＰＣＴ／ＩＪＳ８５１００９８６に記
載されているようなプラスミド又はウィルスベクターの
形！ぶであり得る。例えば、面出のＣｅｐｋｏ他により
記載されている欠陥レトロウィルスベクターｐＺＴＰＮ
ＥＯＳＶ（Ｘ）１は、ＲＮＡの逆転写及びキャプシド形
成に必要な配列であるＭｏ１ｏｎｅｙマウス白血病ウイ
ルスＬＴＲのポリアデニル化信号、並びに一般にサブゲ
ノムｅ　ｎ　ｖ　３ｆｉ伝子、メッセンジャーＲＮＡを
産生ずる５゛及び３゜スプライシング信号を含んでいる
。このベクターは更に、ａｒｔユトランスフエクト細胞
を容易に同定できるように、真核細胞内に抗生物質Ｇ４
１８に対する主要なｊπ択可能な耐性を付与するネオマ
イシン耐性（店、ｅｏ）のための細菌遺伝子も含んでい
る（Ｓｏｕ−ｔｈＣｒｎ、Ｆ’、Ｊ、他、Ｊ、Ｎｏ−Ｌ
人■ｊ　、Ｃｅリ−ｔ、１：３２７−３４１（１９８２
））。好ましくは、ベクターは抗生物質耐性のような何
らかの要素を含み得るので、Ｉ・ランスフエフＩ・され
た細胞を容易に検出することが可能になる。

本発明で使ＪＴＪ　Ｌ　ｆ、、：　ＩＩ’ｒＬＶ−ＩＩ
Ｉ　／ＬＡＶａｒｔ逍ｆｉ　−Ｆ　ハ、感染プロウィル
スクローンＩＩ　Ｘ　Ｂ　ｃ　２がら得られ、）ＩＴＬ
Ｖ−１１１／ＬＡＳＶに関連するトランス作用性因子を
コードするが、他のＨＴＬＶ−ＩＩ　／ＬＡＶソースが
らでも容易に得ることができる。

四速転子を安定的に発現するＭｌ胞系は、す土ｊ貨転子
を含むベクターを使用する感染により作成され得る。

リン酸カルシウム共沈降法（Ｗｉ）７１ｅｒ他、むユ比
咀ニア７７−７８５（１９７９）により、ＤＮ八をψ／
２（エコｌ−ロピ・ンク）及びψΔＭ（アンフォＩ・ロ
ピック）細胞系に導入される。これらの系はマウス白血
病ウィルスタンパク質を構造的に産生するが、ウィルス
転写をパッケージすることはできない（Ｃｏｎｅ他、Ｐ
、Ｎ、Δ、Ｓ。

８１：６３４９−６３弓３（１９８４）；　　Ｍａｎ＋
＋他、（佳↓３３：１５３−１５９（１９８３））。ト
ランスフェクションから２日後、抗生物質Ｇ４１８（フ
ィブロプラスト系には４００ｇ／７及びリンパ球には７
００９／ｌｄｌ　）で細胞を選択する。Ｇ４１８耐性ク
ローンは７〜１０日で判明する。証±エキソンの挿入は
、肚△遺伝了の転写に必要なスプライシングと抵触しな
い、。Ｇ４１８耐性ψ２及びψ静りローンを単画し、１
０：ｌ感染単位／ｄより多く産生するクローンからのウ
ィルスを使用して試験Ｒ・１胞に感染させる（ＫｉＢ他
、５ｃｉｃｎｃｅ２２８：５５４−５５８（１９８５）
）。試験細胞系の感染後、Ｇ４１８に対する細胞耐性を
観察する。

Ｍｏ１ｏｎｃｙ　ＬＴＲを他の修飾ＬＴＲに置き換える
ことにより、組織特異的発現ベクターか得られる。ベク
ターは、該当ポリペプチドに対応するヘテロＤＮ＾セク
メントと同一の配列、並びにその遺伝子の下流（３゛）
の終止コドン及びポリアデニル化配列に作動的に配置さ
れた組織特異エンハンサ−を使用して構成される。ベク
ターは複製起源も含んでいるべきである。

ベクターは、少なくともエンハンサ−の組織特異性を決
定するエンハンサ−セグメントを含んでおり、このセグ
メントを以下の文中では「組織時５ｆ性決定基ｊとＯｆ
称する。ベクターは好ましくはこのようなエンハンサ−
からの組織特異性決定基よりもむしろ完全なウィルスエ
ンハンサ−を含んでおり、好ましくは組織特異性決定基
は完全エンハンサ−の一部である。

ベクターに含まれるプロモーターは、選択宿主に所望の
生成物を発現させるべく機能する既知のプロモーターの
いずれかであり得る。好ましくはプロモーターは、エン
ハンサ−と同一クラスのウィルスからのウィルスプロモ
ーターである。好適なりラスのウィルスはしｌ・ロウイ
ルスであり、本発明に関連して使用される好適なウィル
スは八ｋｖ、５Ｌ３−３及びＦｒ１ｅｎｄウイルスであ
る。

明相ど及び特許請求の範囲で使用されている「組織特異
性」なる用語は、ベクターが正常培養条件下で標的組織
内において他の組織におけるよりも大量の所望の生成物
を産生するように機能することを意味する。組織特異性
ベクターは、標的組織内では池の組織における場合と比
較して１．５〜１０００倍以上の発現生成物を産止し得
る。これらのｆｆｉ織特異性発現ベクターは、本願の参
考資料であるＰＣＴ／ＵＳ８５１００９８６により詳細
に説明されている。

組織特異性決定基はホモ、即ちプロモーターと同一ウィ
ルスに由来してもよいし、あるいはヘテロ、即ちプロモ
ーターと同一のウィルスから山来しなくてもよい。ヘテ
ロ組織特異性決定基は他のウィルス系から切り出しても
よいし、あるいは既知の方法を使用して合成してらよい
。標的組織に特異的な組織特異性決定基は検定法により
同定され１（）、例えばクロランフェニコールアセチル
１ヘランスフエラーゼ（ＣへＴ）のようなインジケータ
又はマーカー化合物、下記のように容易に定量され得る
インジケータをコードするベクターのうちでどのベクタ
ーか組織に有効であるかを決定することができる。

所望に応じて、ＤＮＡ配列中で組織特異性ベクターから
のエンハンサ−を標的組織に非特異的なエンハンサ−と
比較し、組織特異性決定基のＤＮＡ配列を決定すること
もできる。その後、ａｒｔ遺伝子を含む所望のベクター
で少なくとも組織特異性決定基、好ましくは完全エンハ
ンサ−を使用し、形成されたａｍ特異性ベクターを利用
して選択組織中にこの遺伝子生成物を発現させてもよい
。

トランスフェクトされたａｒｔＤＮＡを取り込み、これ
を発現する能力は、細胞系の種類により種々多様である
６例えば、Ｒａｊｉ細胞、ＨＵ　Ｔ７８細胞、Ｊｕｒｋ
ａｔ相胞、Ｉｆ　ｃ　ｌ、ａ細胞及びＮＩＧ：’ｌＴ３
細胞が有効である。

ヒトＴ細胞及びＢ細胞が一般には非常に有効である。

ａｒＬＤＮＡでトランスフェクションを実施する別の有
効す方法トシテハ、ＨＴＬＶ−１又ハ１ＩＴＬＶ−ｎ　
ノイずれかに感染した細胞を使用する方法がある。

本発明は、多重遺伝子発現システムの開発も可能にする
。例えば、ＨＴＬＶ−１１［ＬＴＩ’ｔの反応配列、及
びｇａｔｒ又はｅｎｖ３ｆ！伝子のいずれかの中又は近
値に配置されたシス作用性質の配列の制御下で、所望の
ヘテロ遺伝子を配置−することにより、シス作用性阻害
効果が鉄道転子生成物により「相殺」されるまで所望の
ヘテロ遺伝子の発現を阻止することができる。完全な１
１几Ｖ−１１１ＬＴＲ領域をベクターで使用する必要は
なく　、ＨＴＬＶ−１１１ＬＴＲ起源又はヘテロ起源の
いずれかの機能的プロモーター及びエンハンサ−配列に
加えテＨＴＬＶ−Ｉ［［ＴＡＢ　＋　１〜＋８０配列（
例エバ他のレトロウィルス、ＤＮＡウィルス又は細胞遺
伝子のエンハンサー−プロモーター）を使用すれば十分
である。シス作用性負の配列は、ｅｎｖ−及び／又は」
遺伝子のシス作用性負の配列を所望のヘテロ遺伝子に融
合させ、これを少なくともＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ＴＡＲ配
列の下流に配置することにより得られる。シス作用性負
の配列は、ＨＴＬＶ−ｍ　５３ｇ−遺伝子配列を使用す
ることにより得られる。あるいは、ｇｌＪＩＬ遺伝子か
らの配列の代わりに、又はこの配列に加えて、ｃ−ｎｖ
−遺伝子からのシス作用性負の配列を使用することもで
きる。最も好ましくは、シス作用阻害領域をコードする
ヌクレオチド配列を使用する。

例えばＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲ配列を含む上記型の発現ベ
クターを使用することができ、この配列の下流にはポリ
アデニル化配列を欠失する所望のヘテロ遺伝子が配置さ
れている。この領域は、シス作用性阻害効果をｚ、Ｑ　
＜に十分なＩ＋Ｔ１．Ｖ−１１１目＜３ｒｉ伝子及び／
又は１１几■川［［ｃｎｖ３Ｑ　（天子のヌクレオチド
を含んでおり、且つ１浅能遺伝子牛成才勿を発現するに
十分な！ユ遺転子のヌクレオチドを含まないＨＴＬＶ−
１１配列に制限される。好ましくは、機能的鴫ｙＨ遺伝
子生成物及び／又はウィルスポリアデニル化配列を発現
するに十分なＬａｔｍ遺伝子のヌクレオチドも存在して
いる。このようなベクターは当業者には容易に構成可能
である（例えば第８図参照）。

その後、このベクターを使用して細胞をトランスフェク
トする。使用されるベクターがｔａｔ４配列を含んでい
ない場合、好ましくはこの細胞を９１厘遺伝子生成物と
接触させる。このい±■遺伝子生成物との接触は種々の
方法で実施できる。例えば、このベクターをｔａｔｌ細
胞系で使用してもよいし、あるいはその後、形質転換し
たシス負の配列を含むＬａｔｚ遺伝子でトランスフェク
トしてもよいし、又はこの細胞に使用可能な（畦璽遺伝
子生成物を加えてもよい。シス作用性配列が存在してい
る結果として、所望のヘテロ遺伝子のためのｍＲＮＡを
大量に得ることができるが、シス作用性阻害因子を抑制
するに十分な量のυ±ｊホ伝子止子生成物ｄ胞がさらさ
れるまでヘテロ遺伝子は発現されない。

このようにす圭遺転子生成物にさらすには、種々のメカ
ニズムと使用できる。例えば、所望の予め選択された時
ＩＵ１に細胞培地にａｒｔ遺伝子生成物を直接加えるこ
とができる。あるいは似−遺伝子生成物の発現か二次因
子の制御下にあるような虹↓Ｊ、ｌｌＩ胞系を作成して
もよい。例えば、４ｒｔ遺伝子の産生が温度に依存する
ような細胞系を作成することができる。この場合、該細
胞は温度が所定点に上昇するまでシス作用性阻害因子を
妨害するに十分な量の、ｔ′ｉｉ伝子生成子生成物しな
い。このようなリコ、細胞系を使用する場合には、細胞
の温度上昇以面の所定の時期まで待機する。こうして特
定の細胞系が所与の培地で所与の温度でヘテロ遺伝子生
成物の特異量のｍＲＮＡと産生ずるのに要する時間を容
易に決定することができる。

ホルモンのような所定の化合物の添加により影響を受け
る所定の化学因子の制御下に別の方法でａｒｔ遺伝子を
得ることもできる。これらの型の細胞系は標準技術を使
用して当業者により容易に発生させ得る。例えば、夫々
デキサメタシン及び重金罵に反応するマウス乳房腫瘍Ｌ
ＴＲ又は金属チオネインプロモーターの３′位に咳−Ｌ
ｒを配置してもよい。

あるいは所定の時期に、吐（遺伝子を含んでいるベクタ
ーで細胞をトランスフェクト くは、トランスフェクト−した細胞を其工細胞系と共に
同時培養してもよい。この場合も細胞は弘道転子生成物
にさらされる。

十分な量のａｒｔｆｆｉ伝子生成物転子らされると、シ
ス作用性質の配列の阻害効果は克服され、所望のタンパ
ク質が急速に発現される。発現開始以前に既に高レベル
のｍＲＮ八に達しているので、随時間で高レベルの所望
の逍（天子生成物を容易に発現させることかできる。（
１ユ．遺伝子生成１勿の存在下でこの発現が行なわれる
と、非常に高レベルのタンパク質が産生される。ｆｆｅ
って、細胞死又はヘテロタンパク質に対する酵素侵食の
ようなヘテロ遺伝子発現に伴う問題を最小にすることが
できる。例えば、非常に大量の所望のタンパク質の産生
時期を知ることができ、既知の技術を使用して酵素を不
活性化でき、この不活性化には細胞を殺したりその後所
望のタンパク質を収集することも含まれる。

Δ旦（及び／又はリエ）の所望のヘテロ遺伝子生成物融
合タンパク質が形成されるならば、融合ポリペプチドを
開裂させ、例えば遠心分離、クロマトグラフィといった
当業者に周知の技術を使用して他の構成成分から所望の
遺伝子生成物と分離することにより、所望のタンパク質
を得ることができる。

エンベロープ遺伝子をかむ融合ポリペブチ１でか形成さ
れる場合、トランスフェクト細胞系は好ましくはＴ細胞
系以外の細胞系である。例えば、Ｂ細胞系が最も好まし
い。

このシステムを使用すると、単一遺伝子か細胞に及ぼす
効果に関して調査することもできる。シス作用性阻害因
子の制御下で調査ずべき所望の遺伝子を細胞に導入する
ことにより、所望に応じて四タンパク質を導入すること
により遺伝子を「オン」及び［オフＪに転換できる。

このシステムは、例えば突然変異マウスと共に多細胞生
物で使用する場合にも適合し得る。標帛技術企使用する
ことによりシス作用性質の配列の制御下に調査すべき予
め選択された遺伝子を含む所定のマウス系を形成するこ
とができる。このマウス系において、遺伝子は永久的に
遮断される。

ω−道伝転子有しておりＩｆつａｒｔタンパク質を発現
するような別の突然変異系も形成できる。ハイブリッド
子孫は予め選択された遺伝子とｄ遺伝子との両方を象む
ので、これらの２種類のマウス系を交配し、遺伝子の効
果を調査することができる。

本発明は、弱毒化された生体ワクチンを製造するために
も使用できる。（領域の機能的部分を欠失しているよう
なプロウィルスを使用することにより、ウィルスは細胞
に感染できるにも拘わらずエンヘローブタンパク賃を発
現することができず、従って、疾患を生じ得ない。２つ
の魁エキソンは小寸法であるので、使用されるこの弱毒
化されたウィルスは完全ウィルスに著しく類似する。

以下の実施例により本発明を更に説明する。これらの実
施側は本発明を説明するためのものであ１て限定する意
図はない。

１へ先え Ｍｕ　ｌ　ｌ　ｉｇａｎ他により形成された欠陥しＩ・
ロウイルスベクターｐＺｒＰＮＥＯｓＶ（Ｘ）［Ｃｅｐ
ｋｏ他、Ｃｅ１１３７：１０５３−１０６２（１９８４
）］を使用して、安定ａｒＬ細胞系ひ確立するためのベ
クターを構成した。このベクターはＭｏｌｏｎｅｙマウ
ス白血病ウィルスＬＴつ、ポリアデニル１ヒ信号、ＩＩ
ＮＡの逆転■及びキャプシド形成に必要な配列、並びに
一般にサブゲノムＲＮへを産生するイｌ及び５゛スブ・
ライジングを含んでいる。更に、ベク々−は真核細胞内
で抗生物質Ｇ４１８に主要な選択可能な耐性を付与する
細菌イ・オマイシン（旧シｏ）耐性遺伝子を含んでいる
［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅｒＨ，　Ｊ．Ｍｏｌ。

ｉ」Ｉｎ、ＧｅｎｅＬ　、１：３２７−３４１（１９８
２）］。ＨＴＬＶ−１１１の虹↓遺１云子は感染プロウ
ィルスクローンＩＩＸＢｃ２から得たものであり、ＨＴ
ＬＶ−Ｉ　／ＬＡＶに関連するトランス作用性因子をコ
ードする［へｙｒａ他、１ｃｉｃｎｃｅ婬且：６９−７
３（１９８５）　；　５ｏｄｏｒｏｓｋｉ１［！！、＄
五Ｕ匹■且ニア４−７７（１９８５）；　５ｏｄｒｏｓ
ｋｉ、Ｊ、他、鎖国１凹翻上：１５４６−１５４９＜１
９８６）　；　Ｆｉｓｂｅｒ他、Ｎａ＋、ｕｒｅ　′３
±Ｇ、　２６２−２０５（１，９８５）］。

調製した全グラスミド（第４図参！ＫＯにおいて、プラ
スミド中に示したヌクレオチドに−１６７〜＋８０）ｌ
１１’１．Ｖ−Ｉｌｌ　Ｉ、Ｔｌｌ配列が配置されティ
る。第４図は、Ｒａｔｎｅｒ他、Ｎ４−ｔｕｒｅ　３１
３．前掲頁の配列に基づ（Ｈ几ｖ−■ゲノムの３°半分
の構造を示しており、ｅｎヱ逍伝転子ＬＴＲ１３′ａｒ
ｔ遺伝子、２つのＬａＬ璽コーディングエキソン、２つ
のす土コーディングエキソン（同図面では中実の黒いボ
ックスで表す）の位置を含んでいる。使用される親のｐ
　ＨＸ　Ｂ　ｃ　２の３’　ｏｒｆ−遺伝子における終
止コドンの位置は、り）直方向の破線により示しである
。ジグザグ線はウィルス４０初期領域から誘導されたポ
リアデニル化及びスプライシンクのための信号を表して
いる［Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ，（ｌｊｌ、Ｎａｔｕ
ｒｅ　２７７：１０８−１１４（１９７９）９照］。

全プラスミドは、製′ｆｉ業者の提案に従って制限及び
修飾酵素を使用する標準手順により作成した。

プロウィルス欠失変異株についていうと、プラスミド名
中の数字は欠失の終決点に対応する。これらの欠失変異
株は当業者により容易に作成可能である。三リン酸ヌク
レオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩの大きいフラ
グメントでＢａｍ１ｌＩ消化プロウイルスを処理し、大
腸菌のトランスフェクション以前に再連結反応させるこ
とにより、プラスミドｐＥｘ５４９６ＦＳ内の４個のヌ
クレオチド挿入（４塩基対）を＋ｉ４成した。ｐＥｘ　
（５４９６−８４７４）プラスミドを酵素Ｓｔｕ　［で
消化させ、８塩基対Ｋｐｎ　Ｉリンカ−に連結反応させ
、Ｋｐｎ　ｌで完全に消化させ、大腸菌１〜ランスフエ
クシヨン以＋ｉｆｆに連結反応させることにより、ｐＥ
ｘ５４９６Ｚｅｎシブラスミドを構成した。

第１図は、ＨＴＬＶ−ｍ　ａｒｔ３ｊ！ｉ伝子最終生成
物子最終生成物ている。上部の図面（１＾）は、Ｒａｔ
ｎｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ　川、前掲頁の配列に基づ＜ｌ
ｌＴｌ、Ｖ−Ｉ［ゲノムにおける読み取り枠を示してい
る。鉛直線は終止コドンの位置を表している。切り−■
、すＭ及びりづ工に読み収り枠が認められる。既知のス
プライス受容体（Ｓ八）及び供与体（ＳＤ）（Ｍｕｅｓ
ｉｎｇ、Ｍ、＾、他、Ｎａｔｕｒｅ夫１−亀前掲頁）の
位置、並びに突然変異誘発に使用されるＢａ　ｍ　Ｉｔ
　１位（位置８０５３）か認められる。いｔｕｇ逍伝子
転子ａμの推定上の・ｆニシェークーメチオニンコドン
は図面の下側に示されている。

真中の図面（＋、　Ｂ　）はａ　ｒ−ｔ　３ｉｔ伝子を
構成する２つの読み収り枠のＤＮＡ配列を示しており、
予想されるスプライス供与体（ＳＤ）及び受容体（Ｓ八
）配列の位置が認められる。読み収り枠の潜在生成物の
予想されるアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の下に配置され
ている。このスプライス供与体及び受容体が使用される
場合、スプライス部位の近傍の配列によりコードされる
アミノ酸配列はＬＹＱＳＮＰＰＰＮＰである。

下側の図面（１Ｃ）は、ｔｌ　’ｏ　ｐ　ｐ及び１１Ｉ
００ｄＳのプログラム［Ｈｏｐｐ、ｉ’、Ｐ、他、Ｐ、
Ｎ、Ａ、Ｓ、　７８：３８２４−３８２５（１９８１）
］に基づいて予想されるａｒｔ生成物の親水性（上）−
疎水性（下）曲線を示している。第１のコーディングエ
キソン（１）により特定されるタンパク質領域は、第２
のコーディングエキソン（ＩＩ）により特定される領域
から鉛直線により分離されている。親水性が強い塩基領
域のアミノ酸配列は曲線の下に示されている。

ン一 相補すべきプロウィルス変異株１０■と、突然変異を相
補する能力を試験すべきプラスミド１０〃屏とを使用し
て、ＤＥＡＥ−’デキストラン手順によりＪｕｒ−ｋａ
ｔ−ｔａｔ−ｔ＋ｆ（Ｈ胞をトランスフェクトした。ト
ランスフェクションから４８時間後、Ｒ細胞を３５Ｓ−
システインで標識し、細胞溶解物をＡＩＤＳ患者血清Ｒ
Ｖ１１９で！？ｐ１２０ｅｎｖタンパク貫、並びにｐ５
５、ｐ２４及びｐ　１７Ｂ３Ｌ遺伝子生成物の位１４か
示しである。第３Δ図に示すトランスフェクトされたプ
ラスミドは、ｐΔ（５３６５−５４９６）（を列）、ｐ
Ｅｘ５３６５（２列）、ｐＥｘ５４９６　（３列）、ｐ
Ｅｘ５６０７（４列）、ｐＥｘ５７０２（５列）及びｐ
Ｉ［βグロブリジ（６列）であった。第３Ｂ図に示ａｒ
ｔ〜ランスフエクトされたプラスミドは、ｐΔ（５３６
５−５４９６）　（１列）、ｐＦｓ８０５３　＋　ｐＥ
ｘ５３６５　（２列）、ｐＦｓ８０５３　＋　ｐＥｘ５
４９Ｇ　（３列）、ｐＦｓ８０５３　＋　ｐＥｘ５６０
７（４列）、ｐＦｓ８０５３　＋　ｐＥに５７０２（５
列）、及びｐ　Ｆ　Ｓ　８０５３単独（６列）であった
。第３Ｃ図に示すＩ・ランスフェクトされたプラスミド
は、ｐＥｘ（５４９６−８４７４）　（１列）、ｐＥｘ
５４９６Δｅｎｖ（２列）、ｐＥｘ５４９６Ｆｓ（３列
）、ｐＦｓ８０５３　＋ｐＥｘ５４９６　（４列）、ｐ
Ｆｓ８０５３＋ｐＥｘ（５４９６−８４７４）　（５列
）、ｐＦｓ８０５３＋　ｐＥｘ５４９６Δｃｎｖ（６列
）、ｐＦｓ８０５３＋ｐＥｘ５４９６ＦＳ（７列）、ｐ
Δ（５３６５−５５５１）　＋ｐ１ｉｘ５４９６ｅｎｖ
（８タリ）、ｐΔ（５３６５−５５５１）　十ｐＥｘ５
４９６ＦＳ（９列）、ｐΔ（５３６５−５５３９）　＋
　ｐＥｘ５４９６Δｅｎｖ（１０列）、及びｐΔ（５３
６５−５５３９）−トｐＥｘ５４９６ＦＳ　（１１列）
であった。

第３Ｄ図に示すトランスフェクトされたプラスミドは１
．ｐＥｘ（５４９６−８４７４）　（１列）、ｐＥｘ５
４９６Δｅｎｖ（２列）、ｐＥｘ５４９６ＦＳ（３列）
、ｐＥｘ５４９６Δｅｎｖ　＋　ｐＥｘ５４９６ＦＳ（
４列）、及びｐＥｘ５４９６Δｅｎｖ＋　ｐＦｓ８０５
３であった。　ＩＩＦ、Ｘ５４９６ＦＳによりき成され
た予想されるりリー遺伝子生成物は、フレームシフト突
然変異により野生型１１ＴＬＶ−１１１エンベロープよ
りも４７のアミノ酸だけ短い。

及ｈ１殊−β− へ人工】１μｍ叉 製造業者の提案に従って制限及び修飾酵素を使用する標
準手順により全欠失変異株プラスミドを作成した。ｐＦ
ｓ８０５３プラスミドｌ＼の４塩基対（４ｂｐ）の挿入
は、三リン酸ヌクレオチドの存在下でＤＮ＾ポリメラー
ゼ■の大きいフラグメントで８ＣｍＨｒ消化プロウィル
スを処理し、大腸菌のトランスフェクション萌に再連結
反応させることにより行った。

第２図は、ＨＴＬＶ−Ｉ［［プロウィルス変異株の構造
及び特性を示している。左上図面（２Ａ）にはプラスミ
ドｐ　ｌｌ　Ｘ　Ｂ　ｃ　２上の完全ＨＴＬＶ−ＩＨプ
ロウィルスを既知の遺伝子と共に示しである［Ｆｉｓｌ
＋ｅｒ、＾、Ｃ１他、Ｎａ田Ａ３１６．前掲頁］。黒い
ボックスはい±！道遺伝子２つのコーディングエキソン
を表している。

３’ｏｒｆＪ伝子中の鉛直方向破線は、ｐＨＸＢｃ２１
０ウィルス中に存在している終止コドン［５ｏｄｒｏｓ
ｋｉ、Ｊ。

他、階道１ぜ工前掲真（１９８６）］を表している。ウ
ィルス遺伝子の下の目盛りはキロベースを表す。数値は
ＲａＬｎｅｒによる数値に対応し、ＲＮ八へャップ部位
を＋１とする。プロウィルス欠失変異株についていうな
ら、プラスミド泡中の数字は欠失の終了点に対応する。

ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｑｕｅｅｎ他、Ｃｅ１１．
３３．前掲頁］を使用してＣｓＣｌバンドＤＮＡを、Ｉ
ｕｒｋｎｔ−ｔａ±−■胞にトランスフェクションする
ことにより［Ｒｏｓｃｎ、Ｃ。

＾、他、シュＶｉ工９↓０．１’　５ス：３７９−３８
４（１９８Ｂ）］、プロウィルスの複製ポテンシャルを
試験した。旧Ｆ及びＣＰＥ列の値はトランスフェクショ
ン後の日数を表しており、典型的な実験では夫々９５％
を越えるＨＴＬＶ−■特異膜免疫蛍光と、９５％を越え
る細胞変性とが認められた。これらの値を５ｏｄｒｏｓ
ｋ　ｉ　、　、、Ｉ　、他［５ｃｉ−ｅｎｃｅ（１９８
６）前掲頁］により従来記載されているように査定した
。「〉３０口」の値は、ｌ・ランスフェクション後３０
日まででも培地に２％以下のＨＴＬＶ−１関連１１り免
疫蛍光又は細胞変性効果が観察されたことを示している
。これらの場合細胞上清の逆転写酵素アッセイ［旧＋ｏ
、Ｒ，Ｍ、他、Ｖｉｒｏ上ｏＢｚ　１１２：３３５−３
４２（１９８１）］は観観察間の間バックグラウンドを
越えなかった。ＮＤは実施せずの意味であるく第２Ｂ図
）。

以下に記載するようにウィルスＲＮΔ産生を査定した。

ウィルスタンパク質産生は、ＤＥＡＥ−デキスｈラン手
順を使用して１０〜のプラスミドＤＮ＾で細胞をトラン
スフェクトし、トランスフエクション７Ｑ４８〜７２時
間に３５８−システィンで標識することにより査定した
。標識した細胞溶解物を患者抗血清（Ｊｕｒｋａｔ−ｔ
ａｔＨ＋１１１胞にはＲＶ１１９、Ｒａｊｉ４［１胞に
は３Ｂ−１）で沈降させ、５ＤＳ−アクリルアミドゲル
上でｆｆｌ、リリー及びＩ±璽タンパク買産生を査定し
た［Ｌｅｅ、Ｔ、Ｊ。

他、ししし旺８１　：３８５６−３８６０（１９８４）
］。正＜＋）の値は検出可能なビＡ−亀（ｐ５５　、　
ｐ３８　、　ｐ２４及び／又はｐｌ７）、虫０−４（ｇ
ｏ−４（／１２０）又は匡ｍ（ｐｌ４）ハンドを示して
おり、負（−）の値はバックグラウンドを越える検出可
能なレベルのこれらのタンパク質が存在しないことを示
している。

トランス活性化能力（Ｔ八）は、クロランフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）Ｊ物子の５’位
ニ配置１ルター４５７〜＋８０ノＨＴＬＶ−１［ＩＬＴ
Ｒ配列を含む１．　ＯｙｇのプラスミドｐＵ３Ｒ−ｍと
共に、ｌＯへのプロウィルスプラスミドをＲａ、１ｉａ
ｌ胞に同時トランスフエフＩ・することにより査定した
［５ｏｄｒｏＳｋ　ｉ　、　Ｊ　。

他、５ｃｉｅ、ｎｃｅ−２２−５：　３８１−３８４（
１９８４）；　Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｍ。

他、Ｍｏ１．Ｃｃｌｌ、Ｂｉｏｌ　２：　１０４４−１
０５１（１９８２）］。］ｌ−ランスフエクショから４
８時間後、細胞溶解物のＣＡＴ酵素活性を記載されてい
るように査定した。

数値は、典型的な実験で等量のタンパク質溶解物を使用
して１時間にクロランフェニコールがアセチル化形態に
変換する百分率を表している。ＣΔ゛［遺伝子の５°位
にＳＶ４０初期領域プロモーターを含むｐＳＶ２ＣＡＴ
プラスミドにより導かれたＣＡＴ活性に対する効果は、
試験したどの突然変Ｗ株プロウィルスにも観察されなか
った。

先［ ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｑｕｅｅｎ他、Ｃｅ１ｌ　
３３ニア４ｌ−７４８（１９８３）］を使用して、１０
■の試験プラスミドＤＮＡと１０ｎｇのｐＳＶ２β−グ
ロブリンＤＮＡとにより約５×１０７のＲａｊｉｓ胞を
トランスフェクトした。１〜ランスフエクシヨンから４
８時間後、細胞の半分を３５８−システィンで標識し、
記載されているように［Ｌｅｅ　。

Ｔ、Ｊ、他、Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、（１９８６）前掲頁］、
３８−１患者抗血清で免疫沈降させた。細胞の残りの半
分はグアニンチオシアネ−１・−Ｃｓ：Ｃ１法［Ｃｂｉ
ｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ、他、Ｂｉｏｃｈｅ；セ佳ｕ−１８
：５２９４−５２９９（１９７９）］により全ＲＮ＾単
離に使用した。５■のＲＮＡを二重ニトロセルロースフ
ィルターにスロットプロットし、１０■をホルムアルデ
ヒド上で分級し、ニトロセルロースに移した［Ｔｈｏｍ
ａｓ、Ｐ、、　　Ｐ、Ｎ、八、３．７７：５２０１−５
２０２（１９８０）コ（第５Ａ図参照）。一方のスロッ
トプロットを完全なβ−グロブリンｃＤＮ八へ列から誘
導したプローブにハイブリダイズした（カラムａ）。他
方のスロットプロット（カラムｂ）及びノーザンプロッ
ト（下部図面）は、ｐＨＸＢｃ２プラスミドから誘導し
たり、１　［１内部プロウィルスフラグメントのプール
から作成したプローブにハイブリダイズした。オートラ
ジオグラフィに先立ってＴｈｏｍａｓ、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ
、前掲頁の記載に従ってフィルターを洗浄した。第５Ｂ
図は、Ｒａｊｉｌ−ランスファクタントから免疫沈降し
たタンパク質を示している。ノーザンプロット、スロッ
トプロット及びタンパク質ゲルで用いたトランスフエフ
ｌ−した試験プラスミドは、１）ｐＨＸＢｃ２．２）ｐ
Δ（８０５３−８４７４＞、３）ｐＦＳ８０５３．４）
ｐΔ（５３６５−５４９６）及び５）不完全１１ＴＬＶ
−１プロウイルスを３むプラスミドｐＣＦ１１である。

この図面の対照列（１及び４列）は従来記載されている
［Ｒｏｓｅｎ　、　Ｃ、Δ、他、Ｎ　ａ　ｔ　ｕ　ｒ　
ｅ　（１９８６）　−ｉｉ？ｉ掲頁１゜第５Ｃ図は、従
来公表されているように愚行抗血清ＲＶ１１９を使用し
てプロウィルスプラスミドでトランスフェクトされたＪ
　ｕ　ｒ　ｋ　ａ　ｔ　−（！ＬＬ１１　ｍ胞の免疫沈
降物を示している。トランスフェクトしたプラスミドは
、ｐＨＸＢｃ２（１及ヒｌ１列）、ｐΔ（５３６５−５
４９６）（２列）、ｐΔ（５３６５−５７０２）　（３
列）、ｐΔ（８０５３−８４７４）（４列）、ｐＦＳ８
０５３（５列）、ウサキβクロプリンｃＤＮ＾配列の５
゛位に１ｌＴ１．Ｖ、−ＩＩＩ　１．ＴＲを古むｐｌ［
Ｉβグロブリン（６及び７列）、ｐ△（６６１７−７１
９８＞（８列）、ｐΔ（５３６５−５５５１）（９列）
、及び１】△（５３６５−５５３９）　（１，０列）で
あった。

１１Ｔ１．Ｖ−１１Ｔ　ｃＤＮＡ　りｏ　−７（ｐＣＶ
４．３１１ＴＬＶ−ｍ　ｃＤＮＡりＯ−ンｌ−Δｙｒｕ
他、針１邦！も、前掲真］から誘導した）がらのり」−
のコーディング領域を、上述のように過剰発現ベクター
のＢａｍ１１１部位に挿入した。このようなベクターは
当業者に容すに人手可能である。

第６図は、悴−拮コーディング領域を発現するべく構成
された２つのプラスミド（クローン１．１０及び６１）
のフレームを示している。発現はバクテリオファージ＾
Ｐｒ、プロモーターから助長される。ＰＬｌｌつモータ
ーは一般にλｃｌリプレッサー道伝遺物子り抑制され、
クローニング中にタンパク質の過剰発現による致死の問
題を回避する。ＰＬプロモーターからの発現を監視する
ために、λｃ１３＄！伝子内で温度感受性突然変異をも
たらすプロファージを有する４１１ｆｆｉ株（Ｎ９９ｃ
ｌ　　”’）に再導入する０次に温度感受性株を４２°
Ｃにし、匹タンパク質を過剰発現させる。

第７Ａ図は、約１９〜２０キロドルトンのタンパク質が
１】じす２２により４２℃で菌株に誘導されることを示
している（２列、１列は３０℃）。これが四生成物であ
ることは、枠外のａｒｔ配列を有するプラスミドを含む
菌株（クローン１２　、１’）を使用することにより碑
認される。第７八図の３（３０℃）′及び４（４２°Ｃ
）列は、このクローンが同一分子量のタンパクπを誘導
しないこと、従って、誘導されたタンパク貰は１１　、
、−ａｒｔ厘プラプラスミド発現されることを示してい
る。

第７Ｂ図は、細菌によって産生されるａｒｔ生成物がＡ
ＩＤＳ患者血清により認識されることを示している。従
って、タンパク質は感染患者で生成され、免疫原性であ
る。

標準技術（例えばＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、他、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　　＾　１．ａｂｏｒａｔ
ｏ＠、　　Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　１
．ａｂｏｒａＬｏｒｙ　１９８２参照）を使用して発現
ベクターを調製した。このベクターはＨＴＬＶ−ＩＩＩ
ＬＴＲを含んでおり、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ＬＴＲの下流
にはクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）遺伝子分含んでいた。川−厘遺転子から出発
し、ビニ遺伝子で切り出し、ウィルスポリアデニル化配
列を経てＨＴＬＶ−ＩＩＴ遺伝子から誘導したヌクレオ
チド配列にＣΔＴ’　３１ｉ伝子を融合した。このヌク
レオチド配列は、実施例３に記載したと同一の手順で調
製した。１０■のベクターを使用してＤＥＡＥ−デキス
トラン法により、Ｉｕｒｋａｔ　ｔａ↓［細胞をトラン
スフェクトした。トランスフェクションから４８時間後
、細胞溶解物を調製し、ＣＡＴタンパク質の存在を試験
した。ＣＡＴの発現は検出されなかった。次に、これら
の肺１胞をｌ０ＷｌｆＩのＬ　Ｔ　Ｒ−ＣＡ　Ｔプラス
ミド及び１０■の計上発現プラスミドで上述のように同
時トランスフェクトした。その後、ＣΔ丁発現が検出さ
れたので、ジ」遺伝子がウィルスゲノムから誘導された
シス作用性負の配列の制御下でヘテロ遺伝子の細胞発現
をｒオン」にする能力をもっていることが確認された。

以上の開示により、当業者であれば本発明の趣旨から離
れることなく本発明の他の多くの使用及び変形を実現で
きるし、また発展できることも自明であり、本発明は特
許請求の範囲に記載された趣旨のみに限定されるべきで
ある。

【図面の簡単な説明】

第１八図は、ａｒｔ遺伝子のエキランを古むＨＴＬＶ−
１［１／１、ＡＶの構造を示し、第１Ｂ図はリエｊΔ転
子を構成する２つの読み取り枠のＤＮＡ配列と、ａｒＬ
ｊｉ伝子生成物子生成物れるアミノ酸配列とを示し、第
１Ｃ図はａ−ｚ　Ｌ遺伝子生成物の親水性（上）−疎水
性（下）曲線を示し、第２八図はＨＴ、Ｉ、Ｖ−［［［
プロウィルス欠失変異株の構造を示し、第２Ｂ図はＪｕ
ｒｋａｔ−ｔａｔｘ細胞にトランスフェクトすることに
よるプロウィルス欠失変異株の複製ポテンシャルを示し
、第３（Ａ−Ｄ）図はａｒｔ遺伝子生成物を発現するよ
うに１１０４成されたプラスミドによるＨＴＬＶ−［１
プロウイルスにおける突然変ｎ：の相補を示し、第４図
は二ュ遺伝了を含むプラスミドの概略図、第騒図はＩ・
ランスフェクトされた射■胞からのＲＮ八へロットプロ
ットを示し、第５１（図はトランスフェクトされた細胞
から免疫沈降したタンパク質を示し、第５Ｃ図は患者抗
血清を使用してプロウィルスプラスミドでトランスフェ
クトシた細胞の免疫沈降物を示し、第６図は細菌中にリ
リ、タンパク質を産生することが可能なプラスミドを示
し、第７Ａ図は菌株で誘導される４ｒｔ生成物を示し、
第７Ｂ図は患者抗血清を使用して細菌により自戒された
とユタンパク質の免疫沈降物を示し、第８１７１は、非
ウィルス（ヘテロ）遺伝子、この場合クロランフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣΔＴ）力筒ＩＴＩ
、Ｖ−１［ゲノムの３′末端部分に存在しているシス作
用性負の調節配列により負に調節されるようなプラスミ
ドを示している。 代理人弁理士　中　　　村　　　　至 第２Ａ図 ｐΔ（５３６５−５４９６） ｐ△（５３６５−５５３９１ ｐ△（５３６５−５５５１） ｐΔ１５３６５−５７０２１ ｂｐ ｐＦｓ８０５３ ｐ△（８０５３−８４７４１）−１ ｐ△（８２４１−８６３５１よ ｐ△（６６１７−７１９［］）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　］←−−−め１８図 Ｈ工ＦＣＰＥＣＩＡ５Ｌ　　巨■　　　　　　史虚　思
■座　黙４　　６＋＋　　　　　　＋　　　＋　　　＋
　　　＋　　　４１．２４　　６　　　　＋　　　＋　
　　　　　＋　　　−−−０，２ＮＤＮＤ＋　　　＋　
　　　　　ＮＤ−−−０，２）３０ｄａｙｓ　　−−Ｎ
Ｄ　　−−−０，２）３０ｄａｙｓ　　−−ＮＤ　　−
−−０，２）３Ｑｄａｙｓ−−＋　　　−−＋　　３９
．３）３０ｄａｙｓ　　−−＋　　　−−＋　　３５．
６７　　９　　　＋　　　＋　　　　　　ＮＤ　　　Ｎ
Ｄ　　　ＮＤ　　　ＮＤ２７．１）３０ｄａｙｓ　　＋
　　　−ＮＤ　　ＮＤ　　ＮＤ　　ＮＤ　　４３．５第
６図 ヶロー４１−７０　−　ＡＴＧ　　ＧＡＴ　ＣＴＧ　　
ＧＣＡ　　ＧＧＡ　　ＡＧＡ−ａｒ　ｆＮ　７Ｌ　−ム クｒｏ−，６−１−ＡＴＧ　　ＯＡＴ　ＣＴＧＡＧＡ　
　ＡＧＣＧＯＡ　　−ｒｔ Ｉフレーム クローン７３−１　−　　ＡＴＧ　　ＧＡＴ　ＣＴＧ　
Ａ　　ＧＴＣＡＧＡ　　−（フレームクド） ；；ニー　・

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. （１）￥ａｒｔ￥遺伝子の発現から誘導される約１１６
   のアミノ酸から成り、トランス活性化活性を示す実質的
   に純粋なタンパク質。
2. （２）第１図に示したアミノ酸配列中のトランス活性化
   活性を示すに十分な数のアミノ酸を含んでいるポリペプ
   チド。
3. （３）感染細胞による￥ａｒｔ￥タンパク質の産生をコ
   ードするヌクレオチド配列から成るＤＮＡセグメント。
4. （４）第１図の配列中のトランス活性化機能を有するポ
   リペプチドを発現するに十分なヌクレオチド塩基対を含
   んでいる特許請求の範囲第３項に記載のＤＮＡセグメン
   ト。
5. （５）第１図に示したヌクレオチド配列を有する特許請
   求の範囲第３項に記載のＤＮＡセグメント。
6. （６）ＨＴＬＶ−III￥ａｒｔ￥遺伝子のコーディング
   配列を含む非ＨＴＬＶ−III配列から主に構成されるベ
   クター。
7. （７）トランス活性化活性を示す￥ａｒｔ￥遺伝子生成
   物を発現し得るに十分な量の￥ａｒｔ￥と、トランス活
   性化のための￥ａｒｔ￥遺伝子生成物に反応性の十分な
   量のＨＴＬＶ−IIIＬＴＲと、￥ａｒｔ￥反応性セグメ
   ントの上流のエンハンサーとを含んでいるベクター。
8. （８）十分な量のＨＴＬＶ−IIIＬＴＲがＨＴＬＶ−II
   IＴＡＲ成分である特許請求の範囲第７項に記載のベク
   ター。
9. （９）￥ａｒｔ￥遺伝子を含んでおり且つこれを発現す
   る安定細胞系。
10. （１０）予め選択された細胞系を特許請求の範囲第７項
    に記載のベクターでトランスフェクトすることから成る
    ￥ａｒｔ￥遺伝子生成物の産生方法。
11. （１１）トランス活性化のための￥ａｒｔ￥遺伝子生成
    物に反応性の十分な量のＨＴＬＶ−IIIＬＴＲと、￥ａ
    ｒｔ￥反応性セグメントの上流のエンハンサーとを含む
    ベクターにより、特許請求の範囲第９項に記載の細胞系
    をトランスフェクトすることから成る￥ａｒｔ￥遺伝子
    生成物の産生方法。
12. （１２）ベクターが予め選択されたヘテロ遺伝子を更に
    含んでいる特許請求の範囲第１０項に記載の方法。
13. （１３）細胞を￥ｔａｔ￥＿■遺伝子生成物と接触させ
    る段階を更に含んでいる特許請求の範囲第１１項に記載
    の方法。
14. （１４）細胞自体が￥ｔａｔ￥＿■遺伝子を含んでいる
    特許請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. （１５）所望のヘテロ遺伝子生成物の産生を制御するた
    めの方法であって、 （ａ）ＨＴＬＶ−IIIから誘導されたシス作用性負の調
    節配列に融合した所望のヘテロ遺伝子の上流のトランス
    活性化タンパク質に反応性の十分な量のＨＴＬＶ−III
    ＬＴＲを含むベクターにより、予め選択された細胞系を
    トランスフェクトし、 （ｂ）所定の時期に、シス作用性負の調節の効果を緩和
    するために十分な量の￥ａｒｔ￥遺伝子生成物によりシ
    ス作用性調節配列を打消すことから成る方法。
16. （１６）予め選択された細胞系が￥ｔａｔ￥＿■細胞系
    である特許請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. （１７）シス作用性の負の配列が、機能的シス作用性阻
    害因子を発現するに十分な￥ｅｎｖ￥遺伝子及び￥ｇａ
    ｇ￥遺伝子のヌクレオチドを含んでおり、且つ機能的遺
    伝子生成物を発現するに十分な￥ａｒｔ￥遺伝子から誘
    導されたヌクレオチド、機能的￥ｔａｔ￥＿■遺伝子生
    成物を発現するに十分な￥ｔａｔ￥遺伝子のヌクレオチ
    ド及びＨＴＬＶ−IIIウィルスポリアデニル化配列を含
    まないヌクレオチド配列に含まれている特許請求の範囲
    第１５項に記載の方法。
18. （１８）ベクターが、シス作用性阻害因子を含むＨＴＬ
    Ｖ−III￥ｇａｇ￥遺伝子を含んでいる特許請求の範囲
    第１６項に記載の方法。
19. （１９）ベクターが、シス作用性阻害因子を含むＨＴＬ
    Ｖ−III￥ｅｎｖ￥遺伝子を含んでいる特許請求の範囲
    第１５項に記載の方法。
20. （２０）細胞が修飾されたＲａｊｉ細胞系である特許請
    求の範囲第９項に記載の￥ａｒｔ￥細胞系。
21. （２１）細胞が修飾されたＨｅＬａ細胞系である特許請
    求の範囲第９項に記載の￥ａｒｔ￥細胞系。
22. （２２）細胞が修飾されたＮＴＨ３Ｔ３細胞系である特
    許請求の範囲第９項に記載の￥ａｒｔ￥細胞系。
23. （２３）細胞が修飾されたＪｕｒｋａｔ細胞系である特
    許請求の範囲第９項に記載の￥ａｒｔ￥細胞系。
24. （２４）細胞が修飾されたヒトＴ細胞系である特許請求
    の範囲第９項に記載の￥ａｒｔ￥細胞系。
25. （２５）細胞が修飾されたヒトＢ細胞系である特許請求
    の範囲第９項に記載の￥ａｒｔ￥細胞系。
26. （２６）個体中のＨＴＬＶ−III／ＬＡＶの存在を検出
    する方法であって、 （ａ）試験個体からの組織又は体液を￥ａｒｔ￥の抗血
    清と共にインキュベートし、 （ｂ）免疫反応をスクリーニングすることから成る方法
    。
27. （２７）ＨＴＬＶ−IIIの複製を阻害する化合物をスク
    リーニングするための方法であって、 （ａ）予め選択されたＴ細胞系をＨＴＬＶ−III￥ａｒ
    ｔ￥及び￥ｅｎｖ￥遺伝子でトランスフェクトし、 （ｂ）その後、形質転換した細胞系に予め選択された化
    合物を濃度を増加しながら加え、 （ｃ）化合物が細胞に対して毒性を示すことなく￥ａｒ
    ｔ￥機能に影響を及ぼすか否かを決定することから成る
    方法。
28. （２８）Ｔ細胞を特許請求の範囲第９項に記載の￥ａｒ
    ｔ￥細胞と共に同時培養することによりＴ細胞をトラン
    スフェクトし、￥ａｒｔ￥細胞は更にＨＴＬＶ−III￥
    ｅｎｖ￥遺伝子を含んでいる特許請求の範囲第２７項に
    記載の方法。
29. （２９）Ｔ細胞が、ＨＴＬＶ−III／ＬＡＶウィルスの
    細胞変性効果に対して特に感受性を有する細胞系から選
    択される特許請求の範囲第２７項に記載の方法。
30. （３０）細胞系がＴ４細胞系である特許請求の範囲第２
    ９項に記載の方法。
31. （３１）細胞系がＪＵＲＫＡＴ細胞系である特許請求の
    範囲第２７項に記載の方法。
32. （３２）細胞系がＨＵＴ７８である特許請求の範囲第２
    ７項に記載の方法。
33. （３３）細胞系が、細胞の死後培地に放出されるマーカ
    ーを含んでいる特許請求の範囲第２７項に記載の方法。
34. （３４）マーカーがクロムである特許請求の範囲第３３
    項に記載の方法。
35. （３５）細胞系が細胞の死後培地に放出されるマーカー
    を含んでいる特許請求の範囲第２７項に記載の方法。
36. （３６）マーカーがクロムである特許請求の範囲第３５
    項に記載の方法。
37. （３７）予め選択された化合物が翻訳に影響を及ぼす化
    合物である特許請求の範囲第２７項に記載の方法。
38. （３８）予め選択された化合物は、￥ａｒｔ￥タンパク
    質がシス作用性阻害因子中の該タンパク質に対して反応
    性を有する配列と反応するのを阻止する化合物である特
    許請求の範囲第２７項に記載の方法。
39. （３９）予め選択された化合物が、コンペティター、翻
    訳を阻害する化合物、及び所定の化合物の結合能力を変
    化させる化合物から成る群から選択される特許請求の範
    囲第２７項に記載の方法。
40. （４０）予め選択された化合物がコンペティターである
    特許請求の範囲第２７項に記載の方法。
41. （４１）予め選択された化合物がトランス活性化機能を
    欠失する突然変異￥ａｒｔ￥タンパク質である特許請求
    の範囲第４０項に記載の方法。
42. （４２）予め選択された化合物が￥ａｒｔ￥タンパク質
    の抗血清である特許請求の範囲第２７項に記載の方法。
43. （４３）細胞を￥ｔａｔ￥＿■遺伝子生成物と接触させ
    る段階を更に含んでいる特許請求の範囲第２７項に記載
    の方法。
44. （４４）ＨＴＬＶ−IIIの複製を阻害する化合物をスク
    リーニングするための方法であって、 （ａ）特許請求の範囲第２４項に記載の予め選択された
    ￥ａｒｔ￥細胞系をＨＴＬＶ−III￥ｅｎｖ￥遺伝子で
    トランスフェクトし、 （ｂ）その後、形質転換した細胞系に予め選択された化
    合物を濃度を増加しながら加え、 （ｃ）化合物が細胞に対して毒性を示すことなく￥ａｒ
    ｔ￥機能に影響を及ぼすか否かを決定することから成る
    方法。
45. （４５）個体中のＨＴＬＶ−III／ＬＡＶの存在を検出
    する方法であって、 （ａ）試験個体からの組織又は体液と共に特許請求の範
    囲第１項に記載の￥ａｒｔ￥タンパク質をインキュベー
    トすることにより該タンパク質に対する抗体を誘導し、 （ｂ）免疫反応をスクリーニングすることから成る方法
    。
46. （４６）試験個体からの全血液又はリンパ球を抗血清と
    共にインキュベートする特許請求の範囲第２６項に記載
    の方法。
47. （４７）￥ａｒｔ￥細胞がＣＨＯ細胞系である特許請求
    の範囲第９項に記載の￥ａｒｔ￥細胞系。
48. （４８）特許請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ配列から
    感染細胞により産生される約１９〜２０キロドルトンの
    分子量を有する実質的に純粋なタンパク質。