JPS63258896A - 修飾インタ−ロイキン−２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛産業上の利用分野 本発明は、生体内にて安定性の高い、修飾インターロイ
キン−２（Ｉ　Ｌ−２）に関する。

従来の技術 ＩＬ−２は、レクチン又は抗原で活性化されたＴ細胞に
よりて生成され、リンパ球の活性を調節し、抗原％異的
エフェクターＴリンパ球のインビトロにおける長期培養
を促進しうる可溶性蛋白質である。！Ｌ−２は又胸腺細
胞の分裂を促進し、細胞毒性を有する７９７２球を活性
化することも知られている。そこで、このリン／臂球詞
節物質は、液性及び細胞性免疫を強化し、免疫の欠如す
る状態を正常に戻すのに有用である。！Ｌ−２のこれら
の免疫活性は、癌、細菌またはウィルス感染、自己免疫
疾患、免疫不全等に対する治療に有用である。

ＩＬ−２に限らず、この様な蛋白性因子を治療の目的で
用いる場合、その体内での安定性がしばしば問題となる
。その主たる要因としては、１）体内のプロテアーゼに
よる分解 ２）腎臓の糸球体を介する排除 ３）抗原抗体反応による異物排除 等が考えられる。宿主由来の蛋白性因子を用いる場合、
抗原性は示さないので、１）及び２）が主となるが、特
に２）は、蛋白性因子の分子量に依存する為に、分子量
の小さいものでは、特に致命的に働く。実際に、遺伝子
組み換え法によってつくられ次リコンビナントヒトＩＬ
−２を人に投与した投与後、急速に血中から消失するも
のと考えられる。このような場合、本来、標的部位に充
分な量が存在すれば効果が期待されるようなものでも、
充分な効果を発揮しないことや、効果を発揮する為に、
大量の投与を必要とすることが予想される。

そこで、何らかの方法で蛋白性因子の血中内の安定性を
増大させることが出来ればより有効に、その効果を発揮
させたり大量投与による副作用を減少させることが可能
でらる。

蛋白性因子の安定性を増大させる方法の１つとして、非
免疫原性の水溶性高分子を蛋白性因子に結合させる方法
が知られている。この方法は、蛋白性因子の分子表面を
水溶性高分子で−覆うことにより、グ四テアーゼによる
被分解性を低下させる、１蛋白性因子の分子量を増大さ
せることによシ、腎臓の糸球体からの排除を防ぐ、また
は抗原性のある蛋白性因子の場合、抗原部位を覆うこと
により抗原性を軽減するものでおる。

ＩＬ−２については、Ｎａｎｄｉｎｉ　Ｖ、　Ｋａｔｒ
ｓら（Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ
、　８４．１４８７　（１９８７））が、平均分子量５
０００の七ノメトキシポリエチレングリコールを、無水
グルタル酸を介してインターロイキン２に結合させた修
飾インターロイキン２ｔ−調製し、その制ガン効果の増
強、クリアランスの減少を報告している。

発明が解決しようとする問題点 蛋白性因子と非免疫原性水溶性高分子との結合体は、い
くつかの酵素やインシュリンなどで、その有用性が証明
されている（例えばＦ、ＦｅＤａマ！＄ら特開昭５Ｏ−
４２０８７）が、その際に蛋白性因子が本来の生理活性
を有するように結合させることが重要な点である。蛋白
性因子が、その生理活性を発現する次めには、その蛋白
質が本来の高次構造を保っていることに加えて、その基
質やレセプターに対する結合部位が開かれていることが
必要である。仮に、前者が保持されていても、後者は、
蛋白性因子の分子界面を覆うという修飾の目的と相反す
るものであり、困難が予想される。基質が小さな酵素の
場合には、比較的容易に困難を乗シ越えることが可能で
あるが、レセグ！−と結合することによってその生理活
性を発現する蛋白性因子の場合その生理活性を保りたま
まで修飾することは、かなり困難である。ＩＬ−２はＴ
細胞上のレセプターに結合することによってその活性を
発現することが知られているが、レセグター分子も高分
子でおりレセプターとの結合を妨げずかつ、ＩＬ−２に
安定性を付与するように修飾を施すことは困難であろう
と予想された。

ＩＬ−２にポリエチレングリコールを結合させた例とし
ては先に述べたＮａｎｄｌｎｉらの報告があるが、第３
表に示した様に、結合しているポリエチレングリコール
の分子量が合計して１００００以下の場合には、その半
減期の延長は充分でなかった。

問題点を解決するための手段 本発明者は、ＩＬ−２活性が維持され、かつ体内におけ
る安定性が増大する修飾ＩＬ−２″４ｃ開−２″く鋭意
検討を重ねた結果、ＩＬ−２と平均分子量ｅｏｏｏ以上
のポリエチレングリコールとの結合体がその目的に適う
ものであることを見出し、この知見に基いて本発明を完
成するに到りた。

即ち、本発明の修飾ＩＬ−２は、ＩＬ−２活性を保持す
る次のａ）またはｂ）の結合体である。

ａ）ＩＬ−２のアミノ基と末端のヒドロキメチル基がカ
ルボキシル基に変換されているポリエチレングリコール
のカルボキシル基トの間がアミド結合されている結合体
。

ｂ）ＩＬ−２のアミノ基とポリエチレングリコ−ル末端
のヒドロキシメチル基とが架橋剤を介して結合されてい
る結合体。

ＩＬ−２と結合するポリエチレングリコールは、ＩＬ−
２の半減期を延長し、生体内の安定性を向上させるうえ
で、その分子量が６×１０〜２　Ｘ　１０’の範囲にあ
シ、とくに１０４〜２×１０４の範囲にあるのが好まし
い。また、ＩＬ−２活性の保持のうえから、ＩＬ−２の
１分子歯シのポリエチレングリコールの結合数は１〜２
分子が適当である。ここで用いられるポリエチレングリ
コールとは、エチレンオキシドの共重合体はもちろんで
あるが、そのモノアルキルエーテルやモノアシル化体等
の誘導体を含み、また、後述するように、！Ｌ−２との
結合の目的でその一方または両方の末端が修飾されたも
のも含んでいる。

ＩＬ−２とポリエチレングリコールを結合させる方法と
しては、ＩＬ−２活性を損なわない方法を選ばねばなら
ないが、！Ｌ−２のアミノ基とポリエチレングリコール
を結合させる方法が有効であることが証明された。

七の１つの方法は、ポリエチレングリコールの末端のヒ
ドロキシメチル基をカルボキシル基に変換し、これを活
性エステルとしてＩＬ−２のアミノ基と反応させ、アミ
ド結合を生じさせる方法である。／リエチレングリコー
ルの末端をカル♂キシル基に変換する方法としては、 １）酸化により とする方法（特開昭５３−１４１２１９号公報）、２）
二価脂肪酸の無水物と縮合させる方法、（Ｅｕｒｓ　Ｐ
ｏｌｙｍ−Ｊ％旦１１７７（１９８３）　）３）ハロダ
ン化カルビン酸訪導体によりてアルキル化する方法（Ｍ
ａｋｒｏｍＯＬ　Ｃｈ＠ｍ、ｓ　１８２　ｔ１３７９、
　（１９８１）　）、 などがある、また、活性エステルとしては、通常ペグチ
ド合成に用いられるものが好適に使用でき、たとえばＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシ
フタルイミドエステル（Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、。

８６．１８３９（１９６４））、ｐ−ニトロフェニルエ
ステルなどが挙げられる。

もう１つの方法は架橋剤を介する方法であり、この場合
の架橋剤としては、ノやラニドロフェニルル、フッ化シ
アヌ＃　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５２．３
５７８）られる、この場合の反応は、ポリエチレングリ
コールとこれらの試薬を予め反応させることによりて得
られる活性化ポリエチレングリコールを、ＩＬ−２と反
応させることにより目的は達成され゛る。

反応に際しては、ｐＨ６〜１０、好ましくは６．５〜８
．５になるように調製した緩衝液にＩＬ−２を０．０１
〜１％好ましくは０．０５〜０．５％の濃度で溶解した
後、活性化したポリエチレングリコールをＩＬ−２の１
モルに対し０．５〜２０倍モル、好ましくは１〜１０倍
モル反応せしめる。この際、ＩＬ−２の分子量をコント
ロールすることが可能である。

このようにして製造した修飾ＩＬ−２は単一分子ではな
く、ポリエチレングリコールのＩＬ−２１分子当シの結
合数が異なるもの、およびポリエチレングリコールによ
りて２個以上のＩＬ−２が架橋化されたものも含まれる
が、必要に応じて通常の蛋白質の精製に用いられる方法
によって精製して用いることができる。

本発明において、製造原料として使用するヒトＩＬ−２
は、ヒト細胞由来のＩＬ−２、遺伝子工学的手法によっ
て微生物、動物細胞から得られたヒ）ＩＬ−２等、製造
方法に制限はない、また、遺伝子工学的手法によシ一部
のアミノ酸置換を行なったもの、及び、Ｎ末端側、Ｃ末
端側にアミノ酸残基を付加ないし欠損したもの等、本来
のヒトＩＬ−２を基本的な分子骨格とするものも含まれ
る。

実施例 以下、実施例によシ本発明の詳細な説明する。

実施例１ 特開昭５３−１４１２１９号明細書に記載された方法に
従って、白金・９ラジウム炭素触媒によシ両末端を酸化
して得られたカルがキシル基を有するポリエチレングリ
コール誘導体（平均分子量３．４００　）３．４　ＩＩ
（０，００１モル）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０
．４６　Ｎ　（０，００４モル）を３００ｄのＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミドに溶解した後、ジシクロへキシル
カルがシイミド０．８４　Ｊ　（０，００４モル）を添
加し、室温で一夜攪拌した。

生成したジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾液にジエチ
ルエーテル６００ｍ１を加え、生成したサクシイミジル
誘導体の結晶を濾過し、エーテルで洗浄後乾燥して活性
化誘導体の白色結晶３．６Ｉｉを得た。

大腸菌を用いて遺伝子組み換え法によシ製造されたヒト
Ｉ　Ｌ−２（Ｒ−ＩＬ−２）のリン酸ナトリウム緩衝液
（０，１Ｍ、ｐｉ−１７，２）溶液（２ｒｎ９／ｄ）１
ｄ（０，１３μｍｏｂ　）　Ｋ上記で得られた活性化誘
導体水溶液（４ｏ■／ｄ）を６２　ｐｉ　（０，６５ａ
ｒｎｏＬ　）加え、室温で１時間反応させた。

Ｉ　’Ｌ　−２活性はＣＴＬＬ細胞を用い九３Ｈ−チミ
ジン取り込み分析（−襟嘘鴫イＪ　＠　Ｉｍｍｕｎｏ　
１．１２０２０２７（１９７Ｂ））によりて測定した。

その結果、反応剤のＩＬ−２が５　Ｘ　１０’ユニツト
／■蛋白質であったのく対し、反応後は、４　Ｘ　１０
’ユニツト／η蛋白質と、はぼ保たれていた。

反応液のＴＳＫＧ３０００ＳＷ　（東洋曹達■製）カラ
ムを使用し九ＨＰＬＣによる分子量分布、及びＩＬ−２
活性を第１図に示す。

反応液を更に、セファデックスＧ−７５（ファルマシア
社製）または高速ＧＰＣ（東洋曹達社製）によるカラム
クロマトグラフィーによって精製した。クロマトグラム
及び各フラクシッンのＩＬ−２活性を第２図に示した。

３個のピークが得られたが、このうち、ピークＣは、未
反応ＩＬ−２であることが判明した。他の２個のピーク
について、ＳＤＳ　−／リアクリルアミドグル電気泳動
くよる分子量、等電点結合ポリエチレングリコール数（
結合ＰＥＧ数）、比活性を調べた結果を第１表に記した
。

第　　１　　表 比較例Ｉ Ｒ−ＩＬ−２ＯＮ−エチルモルホリン酢酸緩衝液（０，
１Ｍ、ｐＨ８，０）溶液（２１ｊｌｇ／１１１７）０．
５ｍ（０，０６５μｍｏＡ　）に、実施例ＩＫ記した活
性化誘導体２．４ダ（０，６５μｍｏＡ　）を加え、室
温下２時間反応させた０反応液のＴＳＫ−Ｇ−３０００
ＳＷ　Ｋよる分析ノ母ターンは第３図に示した。このと
きのＩＬ−２活性は、反応前の５％であった。

実施例２ 平均分子３１−１４，０００のポリエチレングリコール
１４．９ｔ−１５ＩＩＬｌのジメチルホルムアミドに９
０℃で溶解し、無水コハク酸３００ｒｎ９を加えて、１
００℃で３時間反応させた。反応液を５０ｄのジエチル
エーテル中に加え、生じた沈澱を濾過・洗浄することに
より、ジスクシニル化ポリエチレングリコール１３．９
３ｊｌを得た。

これを３０ｊ１７のジメチルホルムアミドに５０℃で溶
解し、３０℃まで冷却してＮ−ヒドロキシコ）２．２酸
イオ、２８６□、２ッ、。ヘヤ、ヤヵヤ。

ジイミド５１３１℃ｇを加え３０℃で３時間攪拌した。

沈澱を濾別し、濾液を１５０１のジエチルエーテル中に
注ぎ生じた沈澱を濾過・洗浄することによシ、活性化さ
れたぼりエチレングリコール１３．４３τ− ９を得九。

得られた活性化ポリエチレングリコール水溶液（４０〜
／ａｇ）２０μＪｔ−Ｒ−ＩＬ−２のリン酸ナトリウム
緩衝液（０，１Ｍ、ＰＨ７，２）溶液（２■／ｍ１）１
００μｌに加え、室温で１時間反応させた。

反応液をＣＭ−セファロース（ファルマミア社ｆＭ）、
高速ＧＰＣ（東洋１達社製）によるカラムクロマトグラ
フィーによって精製し、ＩＬ−２の１分子に対して、ポ
リエチレングリコールが１個または２個結合した修飾！
Ｌ−２を調製した。

実施例３ て、ポリエチレングリコール（平均分子ｉ　１４０００
）を出発原料として、末端がパラ−ニトロフェニルカル
がニル化された活性化ポリエチレングリコール誘導体を
得た。

得られた活性化ポリエチレングリコール誘導体のアセト
ニトリル溶液（７０ｒＩＩｇ／ゴ）５０μｌをＲ−ＩＬ
−２のリン酸ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ　。

声７．２）溶液（１，７即／ｄ）３３０μｌに加え、室
温で５時間反応させた。　　・ 実施例２と同様にして精製を行い、修飾ＩＬ−２を得た
。

実施例４ 平均分子量１４０００のポリエチレングリコール１０ｊ
’を５０−のｔ＠ｒｔ−ツチルアルコールに７０℃で溶
解し、カリウムブトキサイド７１の存在下でブロモ酢酸
エチル２．４ｇを加えて、８０℃で４時間反応させた。

減圧下溶媒を留去し、クロロホルムによシ抽出し、末端
がエチルカルがキシメチル化されたポリエチレングリコ
ールを得た。これをｐＨ１３の苛性ソーダ水溶中でケン
化し、クロロホルムで抽出し、末端がカルがキシメチル
化されたポリエチレングリコール７５０１ｎｇを得た。

これを実施例１と同様に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドによって、活性化ポリエチレングリコール誘導体を得
、さらに、これとＲ−ＩＬ−２を反応させた。

実施例２と同様にして精製を行い、修飾ＩＬ−２を得た
。

実施例５ 実施例１と同様の方法で、分子量６０００のポリエチレ
ングリコールが結合した修飾！Ｌ−２を得た。

実施例６ 実施例２と同様の方法で、分子量６０００のポリエチレ
ングリコールが結合した修飾ＩＬ−２を得た。

実施例７ 実施例３と同様の方法で、分子量６０００又は、２００
００のポリエチレングリコールが結合した修飾ＩＬ−２
を得た。

実施例８ 実施例４と同様の方法で、分子量２００００のポリエチ
レングリコールが結合した修飾ＩＬ−２を得た。

実施例９ 実施例１〜８で調製した修飾！Ｌ−２の比活性をＣＴＬ
Ｌアッセイによって測定し、その結果を第２表に示した
。

第　　２　　表 １　　３４００　　　１〜２　　　　４×１０３　　　
　８０２〜３　１ＸＩＯ’　　２０ ＃　　　０　　５Ｘ１０　　Ｚｏ。

２１４０００　１　　４×１０３　　８０’　　　２　
　３×１０３　　６０ ３１４０００　１　４．５×１０３　　９０２　２．５
Ｘ１０７　５０ ４１４０００　１　３．７５ｘ１０７　７５’　　２　
　１Ｘ１０７　２０ ５６０００　１　３．２５ｘ１０７　６５１　２　　２
Ｘ１０７　４０ ６　６０００　１　　５ｘ１０７　１００２　　３ｘ１
０７　６０ ７　６０００　１　４．５ｘ１０７　９０２　４ｘ１０
７　　ｓ。

２００００　１　　４Ｘ１０７　８０ ２２．５ｘ１０７　５０ ８２００００　１　２．２５Ｘ１０７　４５’　　　２
１．２５ｘ１０７　２ｒ 実施例１〇 一群４匹で、且つ平均体重約３０３ｊｌのＳＤ系−二 ン 生食水２００μｌ’Ｆｔ：＃＃つ参参轡轡、また嵯実施
例。

１〜８で得られたポリエチレングリコール修飾ＩＬ−２
蛋白１００μＩを含み且つ０．１　Ｍ−食塩を併合する
０、　０５　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の２００μ
Ｅを（ＩＬ−２蛋白換算で１００μ９相当分を含む）１
、それぞれ尾静脈よシ注入し た。ＩＬ−２及び修飾ＩＬ−２を投与してから２．０，
５．０，１０．２０，３０，４０．６０゜１２０．２４
０，４８０分経過後、各個体毎に頚静脈より約０．５−
相当を経時的に採血し、常法に従りて血清画分を採取し
てから、この各血清試料第　　３　　表 実施例　　ＰＥＧの分子量　　ＰＥＧ結合数　　半減期
（ｈｒ）１　　　　３４００　　　　　１〜２　　　　
０．１５１”＜−ＩＬ−Ｚ　　　　　　？０　　　　　
　　０．２．５２　　　　１４０００　　　　　　１　
　　　　１．６２３．９ ３　　　　１４０００　　　　　　１　　　　　０．８
２４．０ ４　　　　１４０００　　　　　　１　　　　　１．４
’　　　　　　　　　　　２　　　　　　３．１５　　
　　６０００　　　　　　１　　　　　０．５２１．１ ６　　　　６０００　　　　　　１　　　　　０．４２
　　　　”　　　　１．０ ７　　　　６０００　　　　　　１　　　　　０．３’
　　　　　　　　　　２　　　　　　１．４２００００
　　　　　　１　　　　　２．１２３．４ ８　　　２００００　　　　　　１　　　　　２．２’
　　　　　　　　　　２　　　　　　５．７実施例１１ 抗腫瘍活性試験は、例えば、以下のように行りた。

マウス骨髄腫細胞Ｘ　５５６３のＩ　Ｘ　１０’個をＣ
３Ｈ／４１・Ｍ　ＩＪン酸緩衝液生理食塩水ＣＰＢＳ）
　（ＰＨ７，２）にて調製し、０．４ダ／ｋＰ１回宛、
３日毎、計４回、動物の腹腔内もしくは皮下に投与した
。投与開始よシ、３週後の腫瘍サイズ（長径×短径）を
測定し、ｍ瘍阻止率を求めた。修飾ＩＬ−２投与群の平
均サイズを人とし、非投与群の平均腫瘍サイズをＢとし
て、腫瘍阻止車を以下の式で算出した。

また、５週後のマウス生存率を計測し、完全治癒率を算
出した。結果を第４表に記した。

第　　４　　表 ０．４塾へ×４回（皮下投与）　　　９２．９％　　５
７８０．４ダ／ゆ×４回（腹内投与）　　　９９．４％
　　４１５非投与群　　　　　　　０％　　０１５発明
の詳細 な説明したようＫ、本発明の修飾インターロイキン−２
は、ＩＬ−２本来の住理活性を保持しながら生体内での
安定性が増大するので、大量投与などによる副作用の心
配がなく、しかも容易に製造できるから、産業上きわめ
て有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、修飾インターロイキン２のＴＳＫ　−Ｇ３０
００ＳＷによる分析クロマトグラムである。ｌｄづつ分
画し、そのインターロイキン−２活性を併記した。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）６×１０＾３〜２×１０＾４の範囲の分子量を有
   するポリエチレングリコールで修飾され、インターロイ
   キン−２活性を保持している以下のａ）またはｂ）の修
   飾インターロイキン−２。 ａ）インターロイキン−２のアミノ基と、末端のヒドロ
   キシメチル基がカルボキシル基に変換されているポリエ
   チレングリコールのカルボキシル基との間がアミド結合
   されている結合体、 ｂ）インターロイキン−２のアミノ基とポリエチレング
   リコールの末端のヒドロキシメチル基が架橋剤を介して
   結合されている結合体。
2. （２）インターロイキン−２の１分子に対してポリエチ
   レングリコールが１〜２分子結合している特許請求の範
   囲第１項記載の修飾インターロイキン−２。
3. （３）架橋剤がカルボニル基を有する特許請求の範囲第
   １項記載の修飾インターロイキン−２。