JPH0761999A - 糖修飾蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡便で汎用性のある化学的な方法によって糖
修飾蛋白質を提供することであり、特に生理活性蛋白質
を糖修飾することにより、肝臓集積性および生理活性を
高めた糖修飾蛋白質を提供することである。 【構成】 ラクトースラクトンと蛋白質とを水性溶媒
中、０〜４５℃で反応させることを特徴とする糖修飾蛋
白質の製造法、およびラクトースラクトンと蛋白質（イ
ンターフェロン−αを除く）との結合反応生成物である
ことを特徴とする糖修飾蛋白質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、人工的に合成される糖
修飾蛋白質に関し、特に糖修飾生理活性蛋白質に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、生体由来の生理活性を有する蛋白
質あるいは糖蛋白質を医薬あるいは診断薬として利用す
る試みがなされている。しかし、有効かつ特異的に利用
するために、生体内での安定性を高めたり、代謝におけ
るシグナル作用、細胞内局所でのシグナル作用、レセプ
タ−や標的細胞に対する認識としてのシグナル作用を強
めたり発現させたりすることが必須となってきている。
その方法として、化学的に蛋白質を修飾することによ
り、該蛋白質の血中安定性を高めること、シグナル作用
を高め、標的細胞あるいは標的臓器への取り込みを促進
させること、蛋白質の生理活性を増大させこと、さらに
は新たな生理活性を付与することなどが期待されてい
る。

【０００３】標的臓器としての肝臓への集積性に関連し
て、肝臓とガラクト−スとの親和性が報告されている
（Kawasaki.T ＆ Ashwell.G., J.Biol.Chem., 251,129
6,1976及びLee.Y.C.et al., J.Biol.Chem.,258,199,198
3）。この知見に基づいて肝癌、肝硬変、肝炎などの肝
疾患に有効な生理活性を有する蛋白質に、末端にガラク
ト−スを有する糖を結合させることにより、効率的に肝
臓への蛋白質の取り込みを増大させ、治療効果を高める
ことができる。

【０００４】例えば、β−Ｄ−ガラクトピラノシルポリ
エチレングリコールで修飾された生理活性蛋白質などが
知られている（特開昭６３−１５２３９３）。また、末
端にガラクトース・ガラクトースの結合を有する糖鎖を
多量に含む糖蛋白質を遺伝子操作で製造する技術も知ら
れている（特開平１−１０２０９９）。しかし、従来の
技術は複雑な製造工程、生理活性蛋白質を変性させる可
能性のある反応条件等が必要であったり、特殊な真核細
胞を用いて糖蛋白質として発現させる必要があり、十分
満足な結果は得られていないし、実用化もされていな
い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
で汎用性のある化学的な方法によって糖修飾蛋白質を提
供することであり、特に生理活性蛋白質を糖修飾するこ
とにより、肝臓集積性および生理活性を高めた糖修飾蛋
白質を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上の課
題を解決するために鋭意検討した結果、以下の手段によ
って蛋白質にガラクトースが導入された糖修飾蛋白質を
得ることができ、かつ糖修飾による生理活性蛋白質の活
性の減少を防ぐことができ、得られた糖修飾蛋白質の肝
臓集積性が極めて高いことを見出し、本発明を完成し
た。

【０００７】すなわち、本発明はラクトースラクトンと
蛋白質とを水性溶媒中、０〜４５℃で反応させることを
特徴とする糖修飾蛋白質の製造法である。また、本発明
はラクトースラクトンと蛋白質（インターフェロン−α
を除く）との結合反応生成物であることを特徴とする糖
修飾蛋白質である。以下本発明を詳細に説明する。

【０００８】ラクトースラクトンは公知物質であり、以
下の方法によって製造することができる。ラクトースを
低級アルコール（例、メタノール）中、ヨウ素等の酸化
剤で酸化し、還元末端のグルコピラノースを開環してラ
クタネート（lactanate）とし、次いで強酸性陽イオン
交換樹脂（例、ダウエックス(Dowex) ５０(H⁺)）等を
用いて酸性条件とすることによって脱水閉環し、ラクト
ースラクトンを得ることができる(Polymer Journal,17,
(4),567-575(1985))。

【０００９】ラクトースラクトンと反応させる蛋白質
は、特に制限なくラクトースラクトンと結合反応する官
能基を少なくとも１個有していればよい。また、反応に
用いる蛋白質の構造は、アミノ酸の他、糖鎖、その他の
修飾基を有した蛋白質誘導体でもよい。本発明において
は、反応に使用する蛋白質は、特に生理活性を有する蛋
白質が有用である。

【００１０】該官能基としては、ラクトースラクトンが
開環して生じるガラクトース誘導体に存在するカルボキ
シル基と反応するものであれば特に制限はないが、一般
的には第１級アミノ基等が例示できる。本発明の反応に
よってラクトースラクトンと該官能基が反応し、蛋白質
分子中および／または蛋白質分子末端にガラクトース残
基を有する糖修飾蛋白質を極めて効率よく製造すること
ができる。

【００１１】蛋白質の糖修飾率、即ち、ガラクトース残
基結合率は、蛋白質に対するラクトースラクトンの使用
量、反応時間等の反応条件によって変動するが、本発明
の糖修飾蛋白質は、蛋白質分子中に少なくとも一個以上
該糖が修飾されていればよく、使用目的に応じて種々選
定できる。例えば、糖修飾蛋白質を生理活性物質として
使用する場合は、一般的には、蛋白質分子中の第１級ア
ミノ基の７０％以下、好ましくは１０〜５０％が該糖に
より修飾されることが望ましい。

【００１２】第１級アミノ基としては、リジン残基のε
−アミノ基または蛋白質Ｎ末端のアミノ基が挙げられ
る。例えば、ラクトースラクトンとこの第１級アミノ基
を有した蛋白質とが、アミド結合反応のみにより糖修飾
蛋白質を生成した場合の反応式は以下の通りである。

【００１３】

【化１】

【００１４】式中、（ａ）はラクトースラクトンの構造
を、（ｂ）は蛋白質の一般式を、（ｃ）は生成した糖修
飾蛋白質の一般式を示す。また、ｍは、蛋白質の第１級
アミノ基の数、ｎはアミド結合数、Ｒは、蛋白質骨格、
またｍ≧ｎである。１００ｎ／ｍは、糖修飾率を示す。
本発明の糖修飾蛋白質の合成は、ラクトースラクトンと
蛋白質の反応を水性溶媒中、０〜４５℃で行うことが好
ましい。反応溶媒としては、水または緩衝液（例、ほう
酸塩緩衝液、りん酸塩緩衝液、りん酸緩衝生理食塩水
等）の水性溶媒が使用される。反応温度は蛋白質が変性
または失活しない温度であればよいが、通常約０〜４５
℃の範囲、特に室温付近が好ましい。反応のｐＨは約３
〜１０の広い範囲でありうるが、中性付近が望ましい。
反応時間は約０．５〜１００時間程度、好ましくは２０
〜５０時間であればよい。反応に際して、ラクトースラ
クトンおよび蛋白質それぞれの使用量は、所望の糖修飾
率により適宜選定されるが、蛋白質が生理活性物質の場
合は、生成する糖修飾蛋白質の生理活性を指標として予
備実験によって決定することができる。通常、生理活性
蛋白質中の第１級アミノ基に対して約０．５〜５０倍モ
ルである。

【００１５】上記反応後、反応液を透析、塩析、限外濾
過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ＨＰＬ
Ｃ、電気泳動等通常の蛋白質の精製法で精製し、目的の
糖修飾蛋白質の精製物を得ることができる。本発明の糖
修飾蛋白質には、蛋白質にガラクトース残基が導入され
ているためガラクト−スに親和性を持つ肝実質細胞の特
性を利用して選択的にまた効率的に生理活性蛋白質を肝
組織に到達させることが可能であり、肝癌、肝硬変、肝
炎等の肝疾患の治療または予防に特に有効性を発揮す
る。さらに、本発明の糖修飾蛋白質は生体内での半減期
も延長されており、持続性を有している。

【００１６】本発明の糖修飾蛋白質を、通常自体公知の
担体、希釈剤等を用いて適宜の医薬品組成物（例、注射
剤、錠剤、カプセル剤）として非経口的または経口的に
ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。例えば、
本発明による糖修飾蛋白質の蛋白質としてスーパーオキ
シドジスムターゼ（以下「ＳＯＤ」と略す）を使用した
糖修飾ＳＯＤを抗炎症剤として用いるには、例えば注射
剤、錠剤等の形態で、ＳＯＤの量として約０．１〜５ｍ
ｇ／ｋｇ／１日の投与量で患者に投与することができ
る。

【００１７】その他、本発明の糖修飾蛋白質に使用でき
る蛋白質としては、ヒトを含む各種動物由来（細胞培養
によるものを含む）のもの、微生物由来のもの、植物由
来のもの、遺伝子工学産物、合成品のいずれでもよい。
例えば、サイトカイン｛例、インターフェロン−β、イ
ンターフェロン−γ、インターロイキン２等｝、ホルモ
ン｛例、成長ホルモン、インスリン｝、酵素｛例、アス
パラギナーゼ、各種プロテアーゼ、各種ペプチダーゼ
等｝、免疫グロブリン、プロテアーゼインヒビター、各
種チトクローム等が挙げられる。とりわけ好ましい生理
活性蛋白質としては、ヒトを含む各種動物由来、微生物
由来、植物由来または遺伝子組換え技術で生産されたＳ
ＯＤ（ヒトＣｕ、Ｚｎ型−ＳＯＤ、Ｍｎ型−ＳＯＤ、Ｆ
ｅ型−ＳＯＤ等）等が挙げられる。

【００１８】

【実施例】以下、本発明の具体的実施例を説明するが、
本発明は、これに限定されるものではない。なお、実施
例において、ガラクト−ス糖鎖はヒドラジン分解法（続
生化学実験講座，第４巻，１４２頁）により分析した。
また、糖修飾率はＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼン
スルホン酸）法（A.F.S.A.HABEEB.,Anal.Biochem.,14,3
28(1966)）により測定した。

【００１９】参考例：ラクト−スラクトンの製造 （１）ラクタネートの製造 ラクトース２６ｇを水４５０ｍｌに溶解し、メタノール
３５ｍｌを加え、さらにヨウ素３７．４５ｇを含むメタ
ノール６００ｍｌを４０℃で加え、次いで４％水酸化カ
リウム溶液（３５．２ｇ／８７５ｍｌ）を加えて４０℃
で６０分反応させた。ヨウ素の色が消失したら氷冷し、
メタノール１０００ｍｌを加え、沈澱を濾取し、冷メタ
ノールとエーテルで洗浄し、水１５０ｍｌに溶解してメ
タノールを添加し、沈澱を濾取してラクトースのグルコ
ースが開環し、その１位がカルボキシル基のカリウム塩
である化合物（ラクタネート）１８ｇを得た。 （２）ラクトースラクトンの製造 （１）で製造したラクタネート１０ｇを水２００ｍｌに
溶解し、ダウエックス(Dowex) ５０(H⁺)カラムに通過
させて、遊離型とし、これを濃縮し、メタノールを加え
て濃縮した。メタノールを溜去し、生成した沈澱にエタ
ノールを加え、沈澱を濾取してラクトースラクトンを得
た。

【００２０】実施例１：ＳＯＤのラクト−スラクトンに
よる修飾 （製造）牛の赤血球由来のＳＯＤ（分子量32000；アミ
ノ基２２個；3000 units/mg 蛋白質）5mg（0.156μmol;
第１級アミノ基として3.44μmol）を水1mlに溶解し、ラ
クト−スラクトンを6mg(16.76μmol)、15mg(41.9μmol)
および30mg(83.8μmol)ずつ加えて室温で48時間反応し
た。反応液を水に対して透析し、凍結乾燥した。

【００２１】それぞれ上記ラクト−スラクトンの使用量
の順番に生成した糖修飾ＳＯＤの各ロットをLL-SOD-1、
2および3とした。収量、糖修飾率（糖で修飾された第１
級アミノ基の個数はそれぞれ４個、８個及び１２個）、
活性、イオン交換樹脂を用いた高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）（DEAE 5PW）による溶出時間を表１
に、アセチルセルロ−ス電気泳動｛溶媒：0.1M ピリジ
ン／ギ酸（pH3.0）、泳動：30分（0.5mA/cm）、クーマ
シ−ブル−染色｝を図１に示した。

【００２２】

【表１】

【００２３】（体内動態）ロットLL-SOD-3及びSODを
［2,3-³H］スクシンイミジルプロピオネート（succinim
idyl propionate ）で標識し、2500kBq/mgの³H-LL-SOD-
3及び2500kBq/mgの³H-SODを調製した。雄性C₃H/HeN 6
週齢マウス尾静脈から10μg 蛋白質相当を投与し、投与
後経時的に動物を屠殺し、血液及び各臓器の放射活性を
測定して体内動態を調べた。その結果を表２に示した。

【００２４】

【表２】

【００２５】

【発明の効果】本発明の糖修飾蛋白質は、未修飾の蛋白
質に比べて肝臓への集積性が極めて高く、生体内での半
減期が延長されている。このため、肝癌、肝硬変、肝炎
等の肝疾患の治療または予防に該蛋白質を使用すると、
未修飾の蛋白質を使用した場合に比べて極めて高い治療
効果または予防効果をあげることができる。

【００２６】本発明の糖修飾蛋白質の製造法は、蛋白質
が過酷な反応条件に晒されないために、化学的修飾によ
る生理活性の低下を防ぐことができ、高い生理活性を有
する糖修飾蛋白質を得ることができる極めて優れた方法
である。また、本発明は、種々の機能を有する蛋白質を
種々の糖修飾率の糖修飾蛋白質とすることができるの
で、目的に応じて種々の機能性蛋白質を製造できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による糖修飾ＳＯＤと未処理のＳＯＤの
アセチルセルロ−ス電気泳動による泳動図を示すもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/44

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトースラクトンと蛋白質とを水性溶
   媒中、０〜４５℃で反応させることを特徴とする請求項
   １記載の糖修飾蛋白質の製造法。
2. 【請求項２】 ラクトースラクトンと蛋白質（インター
   フェロン−αを除く）との結合反応生成物であることを
   特徴とする糖修飾蛋白質。