JPS63258899A - ヒト胎盤由来レクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト胎盤抽出液より得られうる、新規なレク
チンに関する。

（従来技術〕 レクチンとは植物、動物、微生物等に存在する蛋白質ま
たは糖蛋白質のうち、糖に対する特異的結合活性を持っ
た物質の総称として用いられ、■免疫反応の産物以外の
、糖結合性の蛋白質または糖蛋白質で、細胞または複合
糖質を凝集するもの、■２つ以上の結合部位を持ち、動
・植物細胞を凝集することができるもの、■ａ集は、単
糖またはオリゴ糖により特異的に阻害されるもの、とし
て定義されている。レクチン、特に植物由来のレクチン
は、古くからよく知られ、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ
）やインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）の様に末梢血リン
パ球に働いて芽球化を誘起するもの、また糖結合特異性
の明確なレクチンを用いて細胞表面１！ｉｎの検索を行
ったり、不溶化レクチンを用いて糖蛋白の特異的精製を
行うなど、免疫学的、細胞生物学的応用が広がっている
。一方、動物由来のレクチンは、現在２種類、その存在
が知られている。１つは、主に肝臓実質細胞に存在する
レクチンである。これは高分子（ラット由来のもので（
分子１１９０ＫＤ）で、糖との結合にはＣａ　”が必要
で、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンに特異性を示し、血流中でアサイアログリコプロテ
インに結合し消失させる作用を有することが考えられて
いる。他の１つは、電気ウナギの発電器官や種々のラッ
トＭｉ織、ニワトリの筋原細胞、マウスの株化細胞等に
存在するβ−ガラクトシド結合性の低分子（分子！！２
５〜３５Ｋ（１）レクチンで筋原細胞の特異的吸着と融
合に関与しているかもしれないと考えられている。しか
し、生理的な役割はまだ明らかにされていない。そのう
ち、電気ウナギの発電器官より分離されたエレクトロレ
クチンは、上記動物由来のレクチンのうち、低分子のβ
−ガラクトシド結合レクチンの一種であり、ウサギ実験
的自己免疫疾患筋無力症モデルで、予防・治療効果を有
することが報告されている。また、これと共通の抗原性
を有するレクチンがヒト組織より分離された種々の報告
がみられる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

今回、ヒト胎盤抽出液から、上記の生理活性を有する新
規な蛋白Ｍ（すなわち、レクチン、以下ＨＰ　Ａと省略
）を単離・精製し、本発明を完成した。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の要旨は特許請求の範囲に記載した通りである。

本発明のヒト胎盤抽出液より得られたレクチンは以下の
ような性質を有する。

＋１１分子分 子用濾過（還元下）による分子量は、３００００±３０
００程度である。

また、５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、還元下）による分子
量は、ｌ５ｏｏｏ±１５００程度である。

！２１ｐｌ＋安定性 本発明ＨＰ　Ａは、ｐＨ９以上では安定であるが、ｐＨ
７以下では不安定である。

（３）熱安定性 本発明ＨＰ　Ａは、５６℃以下（例えば５６℃、３０分
）では安定であるが、１００℃では不安定である。

（４）酵素安定性 本発明ＨＰ　Ａは、トリプシンに対して不安定である。

＋５１ＣｏｎＡ結合性 本発明ＩＩ　Ｐ　Ａは、ＣｏｎＡをリガンドを有する担
体（例えばＣｏｎ＾−セファロース）に結合しない。

（６）糖結合特異性 本発明ＨＰＡは、ガラクトースに対して結合特異性を有
するが、フコース、グルコース、マンノース、サン力ロ
ースおよびＮ−アセチルグルコサミンには結合特異性を
示さない。

（７）生理活性 本発明ＨＰ　Ａは、赤血球凝集活性を有するが、リンパ
球分化促進活性、免疫抑制活性、１元ウィルス活性〔イ
ンターフェロン活性（ＩＦＮ活性）〕、ＫＢ細胞増殖抑
制活性、Ｌ９２９細胞障害活性、分化Ｌｔｄ　ｍ活性〔
ニトロブルーテトラゾリウム還元活性（ＮＢＴ還元活性
）〕およびＣ３Ｆ活性を有さない。

（８）アミノ酸組成 本発明ＨＰＡは、ウォーターズＰＴＣＯ・ＴＡＧ＠アミ
ノ酸分析酸分上法ば、第１表に示したようなアミノ酸組
成を有する。

〔以下余白〕

第１表　ＨＰＡのアミノ酸組成 本発明ＨＰ　Ａの製造・単離・精製は、自体公知の手段
を適宜組み合わせてることによって行われる。具体的に
は以下のような手順が挙げられる。

＋１１出発原料 本発明ＨＰ　Ａの出発原料はヒト胎盤であり、その抽出
液はヒト胎盤ミンチを適当な緩衝液を用いてホモジネー
トすることにより得られる。緩衝液中には、ラクトース
を０．１〜ＩＭ程度添加しておくことが好ましい。

（２）ゲル濾過 抽出液をゲル濾過で処理して精製する。

抽出液は、ゲル濾過の前に、等量程度のエチレングリコ
ールを添加して攪拌しておき、その上清を回収しておく
。

ゲル濾適用の担体としては、架橋デキストラン（商品名
セファデックス）、多孔性ポリアクリルアミド（商品名
バイオゲル）などが挙げられる。

平衡溶媒・展開溶媒としては、０．１〜２％（Ｗ／Ｖ）
程度の塩化ナトリウムを含む緩衝液が挙げられる。また
、当該溶媒中には、２−メルカプトエタノール、ＥＤＴ
Ａ−ナトリウムなどを添加しておくことが好ましい。

ゲル濾過に際しては、通常の方法で展開を行い、目的画
分を回収すればよい。

（３）固定化ラクトースによる処理 （２）の回収画分を固定化ラクトースと接触処理して、
本発明ＨＰＡを精製する。

固定化ラクトースは、ラクトースを水不溶性担体に化学
結合させたものである。この担体としては（２）で挙げ
た担体等が挙げられる。固定化方法自体は公知であるが
、市販品を入手することもできる。

平衡溶媒・吸着用溶媒としては、たとえば０．１〜２ｗ
、’ｖ％程度の塩化ナトリウムを含む緩衝液が挙げられ
る。また、当該溶媒中には、２−メルカプトエタノール
、ＥＤＴＡ−ナトリウムなどを添加しておくことが好ま
しい。

溶出溶媒としては、平衡溶媒の組成にさらにラクトース
（０，１〜０．５Ｍ程度）を添加した緩衝液を用いる。

本工程では、吸着したＨ　Ｐ　Ａを溶出することにより
、目的画分として回収される。

１４）ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による
ゲル濾過 （３）の回収画分をＨＰＬＣによるゲルｉＩ！過で処理
し、ＨＰＡを精製する。

担体としては、親水性シリカゲルビーズ（商品名ＴＳＫ
ゲルＧ３０００ＳＷ、同Ｇ２０００ＳＷ）などが挙げら
れる。

平衡溶媒・展開溶媒としては、０．０１〜０．５Ｍ程度
のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）を用いる。当該溶媒中に
は、塩化ナトリウム（０，１〜０．２Ｍ程度）を含むこ
とが好ましく、また、より好ましくは、２−メルカプト
エタノール、ＥＤＴＡ−ナトリウムを添加しておく。

なお、各々の工程後に、回収ＨＰ　Ａ画分の精製度をよ
り高めるため、あるいは、次の工程への導入をより容易
にするため、必要に応じて、限外濾過、透析、遠心分離
など自体公知の手段を施すことができる。

また、目的とするＨＰＡを検出するためにＡ２９０によ
る蛋白吸収、赤血球凝集反応などを利用することができ
る。

〔作用・効果〕

かくして得られた本発明ＨＰＡは、以下に示す特性から
新規物質であり、生化学用、薬理学用の試薬として用い
てもよく、また、医薬品として用いる場合には医薬品製
造の通例技術にしたがって、要すれば滅菌、除菌処理、
製剤化を行えばよい。

かくして新規な）ＩＰＡを含有する医薬が提供される。

〔実験例〕

ＨＰＡの活性測定法は、トリプシン処理ウサギ赤血球凝
集反応により行った。即ち、ウサギ血液（日本バイオテ
スト研究新製）１０ｍｌに等容量のリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ　（−））を添加・懸濁し、これにトリプシンを最終
濃度が０１１％（Ｗ／ｖ）となる様に加えた。その後、
３７℃で１時間反応させ、次に生理食塩液で５回洗浄し
て、最後に１０％（Ｖ／Ｖ）血球となる様に生理食塩液
で懸濁した。被検サンプルは丸底９６六マイクロプレー
トを用いてウェル内で２倍段階希釈（５０ｐｊ／ｗｅｌ
ｌ）し、これに生理食塩液で２％（Ｖ／Ｖ）に調製した
上記血球を加え（５０ＰＪ／ｗｅｌｌ、最終血球濃度１
％）、攪拌後室温で９０分間静置して、その時の血球凝
集の有無を観察した。なお、サンプル希釈液には、１４
ｍＭ２−メルカプトエタノール含有０．９％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム溶液を使用し、また対照陽性コントロー
ルとして大豆レクチン（ＳＢＡ）およびＣｏｎＡを用い
た。ＨＰＡの活性としては、血球凝集がみられたサンプ
ルの最大希釈倍数でもって（Ｕ／ａ＋１）表記した。

ｉ１１分子量 （ｉ）ゲル濾過 本発明ＨＰＡを１４ｍＭ２−メルカプトエタノール、４
ｍＭＥＤＴＡ３Ｎａ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０
．１　Ｍリン酸バッファー（ｐ　Ｈ７，０）に溶解した
ものを同じ緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３００
０−２０００ＳＷカラム（７，５ｍｍ　Ｘ　６０　ａｓ
。

２本、東洋ソーダ製）に注入した。溶出は、流速１ｍｌ
／＋＊＋ｎ、で行い、各フラクションは１ｍ１分取とし
た。溶出液は、Ａ　ｎｏによる蛋白吸収と活性によりモ
ニターした。また、同カラムは、グルタメートデヒドロ
ゲナーゼ（２９０ＫＤ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ
（１４２ＫＤ）、エノラーゼ（６７ＫＤ）、アデニレー
トキナーゼ（３２ＫＤ）、およびチトクロームＣ（１２
，４ＫＤ）によりキャリブレーションした。

その結果、本発明ＨＰＡの分子量は約３００００であっ
た（第１図参照）。

（ｉｉ）（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 本発明ＨＰＡサンプル（約１μｇ）　を２％（Ｗ／ｖ）
ＳＤＳ、、２％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノール、
０．３Ｍシェークロース含有０．０６２５Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌバフファー（ｐＨ６，８）を４０μ添加し、溶解し
て、室温で約３０分間放置後、その２０μ（０，５μｇ
相当）を５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動は、０．１％
（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ含を１５％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルア
ミドゲル厚スラブゲル）を用い、Ｌａｅｍｍｌｉ　の方
法（Ｎａｔｕｒｅ。

Ｈ互６８０　（１９７０）　）に準じて行った．泳動後
、蛋白バンドは、銀染色（銀染色キット、和光純薬社製
）により検出するとともに、マイクロデンシトメーター
によりスキャンを行った０分子量マーカーとして、ホス
ホリラーゼＢ（９４ＫＤ）生血端アルブミン（６７ＫＤ
）、オバアルプミン（４３ＫＤ）、カルボニックアンヒ
ドラーゼ（３０ＫＤ）、トリプシンインヒビター（２０
，１ＫＤ）、そしてα−ラクトアルブミン（１４，４Ｋ
Ｄ）を用いた。

その結果、本発明レクチンの分子量は約１５０００であ
った。

（２）その他の性状 ■ｐｌ＋安定性 ＨＰＡサンプルを希釈してＨＰＡ活性が８Ｕ／ｍｌとな
る様に調製し、この２００μをｐＨ２，４，７，９，１
１のバッファー（各１００ｍ１）に対して４℃で一夜透
析した。各透析外液は、１４ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール、４ｍＭＥＤＴＡ含有０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣ１
溶液であり、各ｐＨには、ＩＮ−ＨＣｌまたはｌＮ−Ｎ
ａＯＨを用いて調整した。透析終了後、ｐＨを中性に戻
すためにｐｉ（７，４の同透析バッファーに対して、再
び４℃で４時間透析を行った。そして各ｐＨ処理済サン
プルのＨＰＡ活性を測定した。その結果は第２表に示す
通りである。

第２表 ■熱安定性 ＨＰＡサンプルを希釈してＨＰＡ活性が８Ｕ／ｍｌとな
る様に調製し、この１５０−を熱（４℃、室温、３７℃
、５６℃、１００℃）処理した。処理時間は、４℃、室
温、３７℃は一夜、５６℃は３０分、そして１００℃は
５分間とした。なお、サンプルの溶媒は、１４ｍＭ２−
メルカプトエタノール、４ｍＭＥＤＴＡ含有０．９％（
Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、ｐＨ７，４で行った。そして
、各熱処理済サンプルのＨＰ　Ａ活性を測定した。その
結果は第３表に示す通りである。

第３表 ■トリプシン感受性試験 ＨＰ　Ａサンプルを希釈して活性が１６Ｕ／ｍｌとなる
様に調製し、この１００Ｐｌｔに５ＰＪの２．５％（ｗ
／ｖ））リプシン溶液またぼＰＢＳ　（−）を加えて３
７℃で３時間反応させた。その後、トリプシンインヒビ
ター（大豆）３０■／ｍｌ溶液を１０μ添加して反応を
止め、トリプシン処理および未処理サンプルのＨＰＡ活
性を測定した。その結果は第４表に示す通りである。

第４表 ■ＣｏｎＡセファロース結合性試験 ＨＰＡサンプルを希釈して活性が１６Ｕ／＋ａｌとなる
様に調製し、この４５０μ（ＨＰＡｏ、７μｇ）に０．
２５％（Ｗ／Ｖ）ヒト血清アルブミン５０Ｐ１を添加し
て５ＱＯＰｊとした。そして、これを予め１４ｍＭ２−
メルカプトエタノール、４ｍＭＥＤＴＡ含有０．９％（
Ｗ／Ｖ＞塩化ナトリウム、ｐ）（７，４で平衡化したａ
　Ｃａｎ＾セフブロースカラム（０，７５Ｘ　１．２ｃ
ｍ）　０．５ｍｌに供し、続いてカラムの２倍量（１ｍ
ｌ）の同平衡化バッファーで洗浄後、溶出は、カラムの
３倍！　（１，５ｍｌ）の０．２　Ｍ　α−メチルＤ−
マンノシド（α−ＭＭ）含有同平衡化バッファーで行っ
た。各フラクションは０．５１分取とし、各々同平衡化
バッファーに対して一夜透析した。

そして各フラクションのＨＰ　Ａ活性をモニターした。

その結果は第５表に示す通りである。

第５表 ＨＰ八をＣｏｎＡセファロースカラムにロードした結果
、そのＨＰＡ活性は、全て通過画分に検出され、α−Ｍ
Ｍによる溶出画分には検出されなかった。即ち、ＨＰＡ
は、ＣｏｎＡセファロースには結合しなかった。

■糖結合特異性 ＨＰＡサンプルを希釈して活性が１６０／ｍｌとなる様
に調製し、これに等容量の１００ｍＭの単糖または２単
糖を添加して、トリプシン処理ウサギ血球の凝集が阻害
されるか否かを調べた。その結果は第６表に示す通りで
ある。糖として、ガラクトース、フコース、グルコース
、マンノース、サッカロース、及びＮ−アセチルグルコ
サミンを用いた。

〔以下余白〕

第６表 ＨＰ　Ａの血球ａ集活性は、ガラクトースにより阻害さ
れ、その他の糖（フコース、グルコース、マンノース、
サッカロース及びＮ−アセチルグルコサミン）では阻害
されなかった。即ち、ＨＰＡはガラクトース結合特異性
を示した。

■ＩＩ　Ｐ　Ａのアミノ酸組成分析 ［（Ｐ　Ａサンプルを逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ＲＰ−３０４
）にかけ、得られたＨＰＡ蛋白ピーク（６，５μｇ、約
４００ｐｍｏｌ）を減圧乾固した０次にこれを５０Ｐ１
の蒸溜水に溶解し、全量をＰＩＣＯ−ＴＡＪ’４＋ンブ
ルチューブに移した。そしてＰｉｃｏ−ＴＡＧ”ワーク
ステーションを用い減圧乾固後、ＰＩＣＯ−ＴＡＧ法に
従い加水分解（１００℃、２０時間、６Ｎ−ＨＣｌ処理
）、誘導化（ＰＴＨ化）を行った。

得られたＰＴＨ−アミノ酸の分析は、Ｐ［Ｃ０−ＴＡＧ
アミノ酸分析用カラム（逆相ＨＰＬＣカラム）を使って
実施した。

加水分解条件（１１０℃、２０時間、６Ｎ−ＭＣＩ）で
は　Ｔｒｐ、は分解し、またＣｙｓ、は回収率が非常に
不安定であるので、この２つのアミノ酸を除外し、１６
種のアミノ酸について、その合計１　（ｐ＋ｍｏｌ）か
ら百分率（％）を求めた。その結果は第７表に示す通り
である。

〔以下余白〕

第７表　ＨＰＡのアミノ酸組成り ■ＨＰ　Ａの各種生物活性の検索 ＩＩ　Ｐ　ＡサンプルをＰＢＳ（−）に対して透析し、
溶媒中の２−メルカプトエタノール及びＥＤＴＡを十分
に除去した後、得られた透析済サンプル（ＨＰＡ活性８
［Ｊ／ｍｌ）について、各種生物活性測定系にかけ、そ
の反応性を調べた。調べた活性としては、■リンパ球分
裂促進活性（リンパ球のグルコース消費充進活性）、■
免疫抑制活性（ＰＨＡ−刺激リンパ球のグルコース消費
抑制活性）、■抗ウィルス活性Ｎ　ＦＮ活性）、■ＫＢ
細胞増殖抑制活性、■マウスＬ９２９細胞障害活性（Ｔ
ＮＦ活性）、■分化誘導活性（ＮＢＴ還元活性）、■Ｃ
３Ｆ活性の合計７種類である。

■リンパ球分裂促進活性 リンパ球を含む培地（２０％とＬＡＢ型血漿加ＲＰＭＩ
７１６４０）にＨＰＡサンプルを混和してインキュベー
ションした後に培地中のグルコース消費量を測定した。

■免疫抑制活性 ＰＨＡ−Ｐ（２０μｓ　／ｍｌ）刺激リンパ球（２×１
０Ｂ個／清ｌ）を含む培地（２０％ヒトＡＢ型証漿加Ｒ
ＰＭＩ−１６４０）にＨＰＡを混和してインキュベーシ
ョンした後に培地中のグルコース消費量を測定した。

■抗ウィルス活性 ヒト羊膜由来のＦＬ細胞を単層培養し、本物質あるいは
標準インターフェロン（ＩＦＮ）存在下、シンドビスウ
イルスを感染させ、培養後に細胞を固定・染色した。５
０％細胞破壊抑制法により力価を測定した。

■ＫＢ細胞増殖抑制活性 ２倍段階希釈した（　５０　ｐＪ／ｗｅｌｌ）本発明サ
ンプル１０　Ｘ　１０　’　　Ｃｅ１ｌｓ／ｍｌ）のＫ
Ｂ細胞（ヒト鼻咽喉癌由来、５０　ｐｇ／ｗｅ１１）を
加え３７℃５％ＧＯ２以下で７日間培養した。培１！後
、０．５％クリスタルウアイオレフト染色液で残存細胞
を染色し生細胞にとり込まれた色素量を、マルチスキャ
ン（タイターチック製）を用いて５９０ｎｍでの吸光度
により測定した。

■マウスＬ９２９細胞障害活性 アクチノマイシンＤ存在下に、マウス結合組織由来Ｌ−
９２９細胞をｔ（ＰＡあるいは標準リンホトキシンと共
に１晩培養し、培養後に細胞を固定・染色した。５０％
細胞破壊抑制法により力値を測定した。

■分化誘導活性 ０．１％ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、３０
ｎｇ１２−０−テトラデカノイルフォルボール−１３−
アセテート（ＴＰＡ）および本物質を被検細胞懸濁液０
．２１に加え、３７℃、２０分間インキュベート後水冷
下に反応を止め、検鏡下で細胞内で０２−で還元され濃
青色に認められるフォルマザンデポジットを含有する細
胞を陽性とした。細胞２００個以上を数え陽性率を算定
した。

■Ｃ３Ｆ活性 マウス（Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／　６　）骨髄細胞（８〜１
２週例）を大腿骨より取り出し、マツコイ　（ＭｃＣｏ
ｙ’ｓ　）５Ａ培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌ
ａｎｄ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）イーグル（１！ａｇｌｅ
’ｓ　）アミノ酸ビタミン培地（日永製薬）、牛胎児血
清を加えて骨髄細胞浮遊液をつくリ、プラスティック皿
あたりｌＸ１０５細胞となる様に調製し、さらに検体を
加えた。３７℃、５％ｃｏ２下にて１週間培養後、倒立
顕微鏡にて観察し、細胞数が４０個以上より成る細胞塊
をコロニーとし、プラスチック皿１枚あたりに形成され
たコロニー数を計測した。

ＨＰＡは、調べた７種の生物活性測定基金てにおいて、
有意な活性を示さなかった。

〔実施例〕

■ラクトース抽出 胎盤ミンチ２．１　ｋｇに等！（２，１１）の抽出バッ
ファー（７５ｍＭリン酸２−ナトリウム、７５ｍＭＮａ
ｃｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、１４ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール、３００ｍＭラクトーラクトース抽出液４　）を加
え、氷水中でバイオトロンホモジナイザー（１分間、３
回）によりホモジナイズした。遠心（７０００ｒｐｍ　
、　１５分間）後、上清を回収し、その沈査に対してさ
らに、同抽出バッファー１．４００＋ｓｌ　と共に上記
同様の操作を行い、遠心して上清を回収した。この２回
の操作で得られた遠心上清をプール（４，５００ｍｌ）
　Ｌ、ペリコンカセットシステム（限外ｄツ過膜システ
ム、分画分子量１万カツト）を用いて１，８５０　ｍｌ
に濃縮しくＡ２ｒｏ９３）　、１４ｍＭ２−メルカプト
エタノール、４ｍＭＥＤＴＡ３Ｎａ含存０．９％（ｗ／
■）塩化ナトリウム溶液に対して透析した。透析終了後
、遠心（７０００ｒｐｍ、６０分間）により沈査を除去
し、その上清２．０００ｍ１　（Ａ２ｒｏ　’７３．０
　）を得た。この両分をラクトース抽出液とし、４℃保
存した。

■セファデックスＧ−２５ゲル濾過 ラクトース抽出液２２．５ｍｌに等容量のエチレングリ
コールを加えて最終５０％（Ｗ／Ｖ）エチレングリコー
ル濃度とし、４℃で約１時間撹拌した。

その後、予め１４ｍＭ２−メルカプトエタノール、４ｍ
ＭＥＤＴＡ３Ｎａ含有０．９％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウ
ム溶液で平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍカラム（
５Ｘ１０Ω）に全量（４５ｍｌ）を添加し、さらに同平
衡化バッファーを流して、通過してくる液のうち、最初
の７０ｍ１は廃棄し、次の８０−１を回収した。

■Ｌａｃｔｏｓｅ　Ｕアフィニティークロマトセファデ
ックスＧ−２５ゲル濾過ステツプから得られた両分（８
０ｍｌ）を予め１４ｍＭ２−メルカプトエタノール、４
ｍＭＥＤＴＡ３Ｎａ含有０．９％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリ
ウムバッファーで平衡化したＬａｃｔｏｓｅ　ＩＩ　（
ラクトースをアガロースゲルに固定化した樹脂、Ｐｉｅ
ｒｃｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ製）カラム（１，２Ｘ８．５
ＣＩ＋）に流速５０ｍ１／ｈでロードした。

続いて、カラム体積の約１０倍量の同平衡化バッファー
で洗浄後、溶出は０．３　Ｍラクトース含有平衡化バッ
ファーで行った０分取は、５ｍｌ／ｈで行い、各フラク
ションは、平衡化バッファーで透析後、ＨＰＡ活性を測
定した。

■Ｔ　Ｓ　Ｋｇｅｌ　Ｇ３０００−２０００　Ｓ　Ｗゲ
ル濾過ＨＰＬＣＬａｃｔｏｓｅ　Ｕ　　アフィニティー
クロマトから得られた活性フラクションプール液（１０
ｍｌ）をＹＭ−１０ｍｅｍｂｒａｎｃｅ　　（分子量１
万カツト）による限外濾過で７０μにまで′ａ縮し、こ
れを予め１４ｍＭ２−メルカプトエタノール、４ｍＭＥ
ＤＴＡ３Ｎａ。

０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸バッファ
ー、ＰＩＩ７．０で平衡化したＴ　Ｓ　Ｋｇｅｌ　Ｇ３
０００−２０００ＳＷカラム（７，５ｎ＋ｎＸ　６０ｃ
ａｓ　２本、東洋ソーダ製）に注入した。溶出は流速１
　ｍｌ／分で行い、各フラクションは１１分取とした。

溶出液はＡ’ｈｔＯによる蛋白吸収と活性によりモニタ
ーした。得られたＨ　Ｐ　ＡはＲＰ−３０４による逆相
ＨＰＬＣ（ｔ＆述）および５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（実験例
参照）により単一ピークであることを確認した。

■Ｒ）’−３０４逆相ＨＰＬＣ ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００−２０００　ＳＷゲル濾過Ｈ
ＰＬＣステップから得られた活性フラクションプール液
２ｍｌを自動グラジェントコントローラーを備えたＨ　
Ｐ　Ｌ　Ｃシステム（ウォーターズ製）に装着したＲＰ
−３０４カラム（４，６ａｖ＋Ｘ　’ｌ　５ｃｍ、バイ
オランド！！りに注入した。溶出は０〜８０％アセトニ
トリル含有０．１％トリフルオロ酢酸、ｐＨ２を用いた
６０分の直線型濃度勾配で行い、流速１ｍｌ／分で１ｍ
１分取とした。溶出液はＡｔｔｏによる蛋白吸収でモニ
ターした。その結果は第８表の通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明ＨＰ　ＡのＴＳＫ−ゲルＧ　３０００
−２０００　ＳＷゲル１ｌｔａＨＰＬｃ＋７）溶出パタ
ーンを示す。 第２図は、本発明ＨＰＡの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる電気
泳動パターンを示す。 第３図は、本発明ＨＰ　ＡのＲＰ−３０４逆相ＨＰＬＣ
による溶出パターンを示す。 特許出願人　株式会社　ミドリ十字 ＋７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ヒト胎盤抽出液より得られ、以下の性質を有するレクチ
   ン 分子量：３００００±３０００（ゲル濾過による）１５
   ０００±１５００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）ｐＨ安定
   性：ｐＨ９以上で安定 熱安定性：５６℃、３０分で安定 酵素安定性：トリプシンに対して不安定 コンカナバリンＡ結合性：なし 糖結合特異性：ガラクトースに対して結合特異性あり 生理活性：赤血球凝集活性を有する アミノ酸組成：次表の通り： ￥アミノ酸￥　￥量（ｐｍｏｌ）￥　￥ｍｏｌ％￥ 　Ａｓｐ　　　　１４５．７３　　　　１１．５３ 　Ｇｌｕ　　　　　９１．４６　　　　　７．２３ 　Ｓｅｒ　　　　　４４．６８　　　　　３．５３ 　Ｇｌｙ　　　　　６２．００　　　　　４．９０ 　Ｈｉｓ　　　　　２３．９８　　　　　１．９０ 　Ａｒｇ　　　　　６２．２６　　　　　４．９３ 　Ｔｈｒ　　　　　３６．１７　　　　　２．８６ 　Ａｌａ　　　　１５６．３３　　　　１２．３７ 　Ｐｒｏ　　　　　９１．３１　　　　　７．２２ 　Ｔｙｒ　　　　　２７．７１　　　　　２．１９ 　Ｖａｌ　　　　１１０．０２　　　　　８．７０ 　Ｍｅｔ　　　　　　７．３８　　　　　０．５８ 　Ｃｙｓ　　　　　Ｎｏｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ 　Ｉｌｅ　　　　　４８．４８　　　　　３．８３ 　Ｌｅｕ　　　　１６０．７１　　　　１２．７１ 　Ｐｈｅ　　　　１１８．０４　　　　　９．３４ 　Ｔｒｐ　　　　　Ｎｏｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ 　Ｌｙｓ　　　　　７７．９０　　　　　６．１６