JPS6356501A - アフイニテイークロマトグラフイー用カラム充填剤及びその製造方法 - Google Patents
アフイニテイークロマトグラフイー用カラム充填剤及びその製造方法Info
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- JPS6356501A JPS6356501A JP61199569A JP19956986A JPS6356501A JP S6356501 A JPS6356501 A JP S6356501A JP 61199569 A JP61199569 A JP 61199569A JP 19956986 A JP19956986 A JP 19956986A JP S6356501 A JPS6356501 A JP S6356501A
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- epsilon
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- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
らに詳しくは球状セルロースゲルに８−ポリリジンを結
合させた不溶性担体に関するものである。
合させた不溶性担体に関するものである。
近年、バイオテクノロジーの進歩に伴って細胞培養、遺
伝子操作などによって生産される微量の生理活性物質の
分離、精製技術の重要性が増してきている。分離、精製
方法として、ゲル濾過、イオン交換、遠心分離などの組
合せが利用されてきた。これらの操作は長時間を要した
シ、目的物質のロスなどが生じて問題点があった。これ
に対して最近、生物学的親和性を利用して分離するアフ
イニテイクロマトが盛んに利用されるようになった。
伝子操作などによって生産される微量の生理活性物質の
分離、精製技術の重要性が増してきている。分離、精製
方法として、ゲル濾過、イオン交換、遠心分離などの組
合せが利用されてきた。これらの操作は長時間を要した
シ、目的物質のロスなどが生じて問題点があった。これ
に対して最近、生物学的親和性を利用して分離するアフ
イニテイクロマトが盛んに利用されるようになった。
従来のアフイニテイクロマト剤はほとんどが多糖類のア
ガロースをペースとして、ブロムシアンで活性化後リガ
ンドを結合させる方法で製造されていた。リガンドとし
ては抗体、抗原、酵素、アミノ酸、ペプチド、ホルモン
、核酸などが使用されている。しかしアガロースをベー
スとしているために、従来のアフイニテイゲルは軟く、
機械的強度が弱くカラムに充填してクロマトを実施する
場合に流速がでなく、工業的利用に難点があった。他方
リガンドの中で近年、プラスミノーゲンの精製などに使
用される塩基性アミノ酸であるリジンあるいはポリリジ
ンが注目され、これらをアガロースに結合させたアフイ
ニテイゲルが開発されている。しかし、これらのゲルは
ブロムシアン法で結合されているので、リガンドの脱離
があったり、流速がでない、精製効率が悪い等の欠点が
あった。
ガロースをペースとして、ブロムシアンで活性化後リガ
ンドを結合させる方法で製造されていた。リガンドとし
ては抗体、抗原、酵素、アミノ酸、ペプチド、ホルモン
、核酸などが使用されている。しかしアガロースをベー
スとしているために、従来のアフイニテイゲルは軟く、
機械的強度が弱くカラムに充填してクロマトを実施する
場合に流速がでなく、工業的利用に難点があった。他方
リガンドの中で近年、プラスミノーゲンの精製などに使
用される塩基性アミノ酸であるリジンあるいはポリリジ
ンが注目され、これらをアガロースに結合させたアフイ
ニテイゲルが開発されている。しかし、これらのゲルは
ブロムシアン法で結合されているので、リガンドの脱離
があったり、流速がでない、精製効率が悪い等の欠点が
あった。
本発明の目的は硬くて機械的強度が強く、クロマトを実
施する場合には流速が大きく、リガ〔問題点を解決する
ための手段〕 本発明Ｉｄｅ−ポリリジンをリガンドとして、球状セル
ロースゲルに官能基を介して結合させた新しいゲルに関
するものである。
施する場合には流速が大きく、リガ〔問題点を解決する
ための手段〕 本発明Ｉｄｅ−ポリリジンをリガンドとして、球状セル
ロースゲルに官能基を介して結合させた新しいゲルに関
するものである。
アミノ酸であるリジンが重合したポリリジンは従来はリ
ジンのα−位のアミノ基がカルボキシル基と縮合したα
−ポリリジンで合成品であったが、本発明に使用するボ
ＩＪ Ｉ７ジンとしては微生物のストレプトマイセスア
ルブラス（５ｔｒｅｐｔｏ −ｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌ
ｕｓ ）が産生ずるｅ−アミノ基が縮合しているｅ−ポ
リリジンを使用することができる。その構造式を次に示
す。
ジンのα−位のアミノ基がカルボキシル基と縮合したα
−ポリリジンで合成品であったが、本発明に使用するボ
ＩＪ Ｉ７ジンとしては微生物のストレプトマイセスア
ルブラス（５ｔｒｅｐｔｏ −ｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌ
ｕｓ ）が産生ずるｅ−アミノ基が縮合しているｅ−ポ
リリジンを使用することができる。その構造式を次に示
す。
その製造法は特公昭５９−２０３５９号に記述されてい
る。即ち、ストレプトマイセスアルブラスをグリセロー
ル、硫酸アンモニウム、酵母エキス等を含む培養液で培
養後、分離精製してポリリジンが得られる。このポリリ
ジンの重合度は２０〜３０である。又、同じ発明者らの
別の文献によると（醗酵と工業４３巻９０２頁、Ａｇｒ
。
る。即ち、ストレプトマイセスアルブラスをグリセロー
ル、硫酸アンモニウム、酵母エキス等を含む培養液で培
養後、分離精製してポリリジンが得られる。このポリリ
ジンの重合度は２０〜３０である。又、同じ発明者らの
別の文献によると（醗酵と工業４３巻９０２頁、Ａｇｒ
。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ４５巻２５０３頁）このポリリ
ジンは一従来のものと異なってリジンのｅ−位のアミノ
基がα位のカルボキシル基と縮合しているいわゆるｅ−
ポリリジンであることも明らかにされている。
ジンは一従来のものと異なってリジンのｅ−位のアミノ
基がα位のカルボキシル基と縮合しているいわゆるｅ−
ポリリジンであることも明らかにされている。
ｅ−ボＩＪ ＩＪジンを結合させるセルロースは真球状
の球状粒子であυ、その製造方法としては次の様な例が
ある。
の球状粒子であυ、その製造方法としては次の様な例が
ある。
（１） 特開昭５３−８６７４９号に記載の方法で、
セルロース酢酸エステルを有機溶媒中に溶解し、この溶
液を水性媒体中にけんだくさせて、球状化し、有機溶媒
を蒸発させてセルロースエステル粒子を得、これをケン
化後セルロース粒子とする方法。
セルロース酢酸エステルを有機溶媒中に溶解し、この溶
液を水性媒体中にけんだくさせて、球状化し、有機溶媒
を蒸発させてセルロースエステル粒子を得、これをケン
化後セルロース粒子とする方法。
（２１（１１の方法の応用でセルロース酢酸エステルの
溶液に脂肪族高級アルコール等を加えて、多孔性を調節
する特開昭５６−２４４２９号の方法。
溶液に脂肪族高級アルコール等を加えて、多孔性を調節
する特開昭５６−２４４２９号の方法。
（３） セルロースをパラホルムアルデヒドとジメチ
ルスルホキシドの混合溶媒にとかして造粒する特開昭５
７−１５９８０１号、特公昭５７−１５９８０２号の方
法。
ルスルホキシドの混合溶媒にとかして造粒する特開昭５
７−１５９８０１号、特公昭５７−１５９８０２号の方
法。
（４）セルロースを水酸化第２銅、塩化第１銅の濃アン
モニア水に溶解して造粒する特開昭５２−１１２３７号
の方法。
モニア水に溶解して造粒する特開昭５２−１１２３７号
の方法。
（５） ビスコースを変圧器油中に分散させて造粒す
る特開昭５１−５３６１号の方法。
る特開昭５１−５３６１号の方法。
（６） セルロースをチオシアン酸カルシウム塩溶液
に溶解させて造粒する特開昭５５−４４３１２号の方法
。
に溶解させて造粒する特開昭５５−４４３１２号の方法
。
（７）精製リンターを銅アンモニア溶液に溶解させて造
粒する特開昭４８−６０７５４号の方法。
粒する特開昭４８−６０７５４号の方法。
次にこれら球状セルロース粒子とｅ−ポリリジンを結合
させるにはセルロースに反応性のある官能基を導入し、
その後ｅ−ポリリジンと反応させる。その方法について
は次のような方法がある。
させるにはセルロースに反応性のある官能基を導入し、
その後ｅ−ポリリジンと反応させる。その方法について
は次のような方法がある。
（１） セルロースにホルミル基を導入し、次いでこ
れと８−ポリリジンと反応させてシック塩基を形成させ
、還元する方法。この場合セルロースにホルミル基を導
入するＫは例えば次のような方法がある。
れと８−ポリリジンと反応させてシック塩基を形成させ
、還元する方法。この場合セルロースにホルミル基を導
入するＫは例えば次のような方法がある。
■ セルロース＋（ＪＣＨ，ＣＨ−ＣＨ，→ゝ。′
（セルロース）−０−ＣＨ，−ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ。
Ｈ
（→ツレロース）−０−ＣＨ，−ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ−
ＣＨ，−（Ｃ）Ｉ、）、−ＣＨ０Ｈ Ｈ （２）セルロースをビスオキシランと反応させてエポキ
シ基を導入し、このエポキシ基とε−ポリリジンを反応
させる方法。
ＣＨ，−（Ｃ）Ｉ、）、−ＣＨ０Ｈ Ｈ （２）セルロースをビスオキシランと反応させてエポキ
シ基を導入し、このエポキシ基とε−ポリリジンを反応
させる方法。
（３） セルロースをω−アミノアルキルアミンと反
応させてアミノ基を導入し、この末端アミノ基とｅ−ポ
リリジンのカルボキシル基と縮合させる方法。
応させてアミノ基を導入し、この末端アミノ基とｅ−ポ
リリジンのカルボキシル基と縮合させる方法。
（４） セルロースをエピクロルヒドリンでエポキシ
化後、アミン化して無水コハク酸と反応させてカルボキ
シル基を導入し、この末端カルボキシル基とｅ−ポリリ
ジンのアミノ基を縮合させる方法。
化後、アミン化して無水コハク酸と反応させてカルボキ
シル基を導入し、この末端カルボキシル基とｅ−ポリリ
ジンのアミノ基を縮合させる方法。
（５）’ （４）の方法で得られたカルボキシル基と
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて活性りその
他（６）ジアゾニウム誘導体による結合方法、（７）ヒ
ドラジド誘導体による結合方法などがある。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて活性りその
他（６）ジアゾニウム誘導体による結合方法、（７）ヒ
ドラジド誘導体による結合方法などがある。
最近、セルロースの球状粒子でアフイニテイ用ゲルでア
ミン化−七ルロファイン（セルロファインは商標である
。以下同じ。）、ホルミルーセルロファインがあシ、こ
れらを使用すると便利である。
ミン化−七ルロファイン（セルロファインは商標である
。以下同じ。）、ホルミルーセルロファインがあシ、こ
れらを使用すると便利である。
これらの結合方法を反応式に表わすと例えば次の様にな
る。
る。
（ｌ）（セルロース）−ＣＨＯ＋ＮＨ２−（ポリリジン
）−（セルロース）−ＣＮ＝Ｎ−（ポリリジン）１１東
軌（セルロース） ＣＨｔ ＮＨ（ポリリジン）（
２）（セルロース）−０−ＣＨ，−ＣＨ−ＣＨ，−０−
（ＣＨ，）４−０−ＣＨ，−普 ＣＨ −ＣＨ−ＣＨｚ ＋ ＮＨｔ−（ポリリジン）→ （
→ツレロース）−０−ＣＨｔ−ＣＨ−ＣＨｔ−０−（Ｃ
）Ｉｔ）４−０−ＣＨｔ−暑 −ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ−（ポリリジン）ＣＨ （３）（→ツレロース’）−ＮＨ−（ＣＨ，）−ＮＨ，
＋ ＨＯＯＣ−（ポリリジン）→ （→ツレロース）
−き■（−（ＣＨ，）−ＮＨＣＯ−（ポリリジン）（４
）（七ｖト嘱） −〇 −ＣＨ，−ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ
−ＣＯ−ＣＨ，−ＣＨ，−ＣＨ −ＣＯＯＨ＋ ＮＨ２−（ポリリジン）→（七ｒｗ−
ｘ）−０−ＣＨ，−ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ−Ｃｏ−ＣＨ，
−ＣＨ，−寥 ＣＨ −ＣＯＮＨ−（ポリリジン） ＣＨ （セルロース）−０−ＣＩ（、−ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ−
ＣＯ−ＣＨ，−ＣＨ，−ＣＨ −ｃｏ−ＮＨ−（ポリリジン） 〔発明の効果〕 この様な本発明のｅ−ポリリジンが結合したセルロース
は今までにない特異的な分離精製剤として利用できる。
）−（セルロース）−ＣＮ＝Ｎ−（ポリリジン）１１東
軌（セルロース） ＣＨｔ ＮＨ（ポリリジン）（
２）（セルロース）−０−ＣＨ，−ＣＨ−ＣＨ，−０−
（ＣＨ，）４−０−ＣＨ，−普 ＣＨ −ＣＨ−ＣＨｚ ＋ ＮＨｔ−（ポリリジン）→ （
→ツレロース）−０−ＣＨｔ−ＣＨ−ＣＨｔ−０−（Ｃ
）Ｉｔ）４−０−ＣＨｔ−暑 −ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ−（ポリリジン）ＣＨ （３）（→ツレロース’）−ＮＨ−（ＣＨ，）−ＮＨ，
＋ ＨＯＯＣ−（ポリリジン）→ （→ツレロース）
−き■（−（ＣＨ，）−ＮＨＣＯ−（ポリリジン）（４
）（七ｖト嘱） −〇 −ＣＨ，−ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ
−ＣＯ−ＣＨ，−ＣＨ，−ＣＨ −ＣＯＯＨ＋ ＮＨ２−（ポリリジン）→（七ｒｗ−
ｘ）−０−ＣＨ，−ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ−Ｃｏ−ＣＨ，
−ＣＨ，−寥 ＣＨ −ＣＯＮＨ−（ポリリジン） ＣＨ （セルロース）−０−ＣＩ（、−ＣＨ−ＣＨ，−ＮＨ−
ＣＯ−ＣＨ，−ＣＨ，−ＣＨ −ｃｏ−ＮＨ−（ポリリジン） 〔発明の効果〕 この様な本発明のｅ−ポリリジンが結合したセルロース
は今までにない特異的な分離精製剤として利用できる。
類似の素材としてα−ポリリジンが結合したアガロース
ゲル（シグマ製）があるが、ポリリジンがα−ポリリジ
ンであシ、α位−アミノ基が縮合しているのでフリーの
アミノ基はｅ−位である。ｅ−ポリリジンはε−位のア
ミノ基が縮合しているので、α−位のアミノ基がフリー
であり、ｅ−ポリリジン−セルロースでもフリーのアミ
ノ基が多くあり、α−ボリリジンーアガロースとは異な
った特異な性質を有し新しい分離精製剤として非常に有
用である。ポリリジンが従来のα−ポリリジンと異なる
ばかりでなく、担体ゲルがセルロースであることも大き
な特徴である。アガロースは多糖類であるが、その構造
のため軟く、機械的強度が弱いという欠点がある。この
ためこの様なゲルをクロマト剤としてスケールアップし
て工業的スケールで使用する場合、高流速がとれない等
の欠点がある。本発明のε−ポリリジン−セルロースは
機械的強度がち）、高流速が得られ、工業的スケールで
の使用もでき、新しい分離システムとしての用途が期待
できる。
ゲル（シグマ製）があるが、ポリリジンがα−ポリリジ
ンであシ、α位−アミノ基が縮合しているのでフリーの
アミノ基はｅ−位である。ｅ−ポリリジンはε−位のア
ミノ基が縮合しているので、α−位のアミノ基がフリー
であり、ｅ−ポリリジン−セルロースでもフリーのアミ
ノ基が多くあり、α−ボリリジンーアガロースとは異な
った特異な性質を有し新しい分離精製剤として非常に有
用である。ポリリジンが従来のα−ポリリジンと異なる
ばかりでなく、担体ゲルがセルロースであることも大き
な特徴である。アガロースは多糖類であるが、その構造
のため軟く、機械的強度が弱いという欠点がある。この
ためこの様なゲルをクロマト剤としてスケールアップし
て工業的スケールで使用する場合、高流速がとれない等
の欠点がある。本発明のε−ポリリジン−セルロースは
機械的強度がち）、高流速が得られ、工業的スケールで
の使用もでき、新しい分離システムとしての用途が期待
できる。
本発明のε−ポリリジン−セルロースではフリーのα−
位のアミノ基が多く存在するのでアフイニテイクロマト
剤として用いたとき酵素のｆｆｇ、プラスミノーゲンの
単離、７アージの分離、精製、核酸の分離、多糖類の分
離などが今までの分離材と異なって効率良く、しかも−
度に多量に可能である。
位のアミノ基が多く存在するのでアフイニテイクロマト
剤として用いたとき酵素のｆｆｇ、プラスミノーゲンの
単離、７アージの分離、精製、核酸の分離、多糖類の分
離などが今までの分離材と異なって効率良く、しかも−
度に多量に可能である。
以下に実施例としてｅ−ポリリジンのセルロース球状粒
子への結合方法と得られた担体の使用例を示すが本発明
はかかる実施例のみに限定されるものではない。
子への結合方法と得られた担体の使用例を示すが本発明
はかかる実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
アフイニテイ用担体として市販されているセルロースを
ホルミル化したホルミルーセルロファイン（チッソ■製
）サクンヨラドライ品（プフナーロート上で吸引濾過し
たもの） ５０Ｆ （約７０１１Ｌｔ）と０．５９のｅ
−ポリリジンを含む０．２Ｍ Ｎａｔ ＨＰ Ｏａ −
Ｎａ ＯＨバッファー（１）Ｈｌｌ、０）１００ゴを加
え３０℃、１時間撹拌した。この後水素化シアノホウ素
ナトリウム（５ＣＢＨ）４００■を加え、−晩撹拌した
。さらにＬ−リジン１４，６Ｎ１ＳＣＢＨ４００１ｎ９
を加え、２時間撹拌した。
ホルミル化したホルミルーセルロファイン（チッソ■製
）サクンヨラドライ品（プフナーロート上で吸引濾過し
たもの） ５０Ｆ （約７０１１Ｌｔ）と０．５９のｅ
−ポリリジンを含む０．２Ｍ Ｎａｔ ＨＰ Ｏａ −
Ｎａ ＯＨバッファー（１）Ｈｌｌ、０）１００ゴを加
え３０℃、１時間撹拌した。この後水素化シアノホウ素
ナトリウム（５ＣＢＨ）４００■を加え、−晩撹拌した
。さらにＬ−リジン１４，６Ｎ１ＳＣＢＨ４００１ｎ９
を加え、２時間撹拌した。
濾過後蒸留水洗浄をくり返し、ｅ−ポリリジン−セルロ
ースゲルを得た。固定化されたｅ−ポリリジンはメチル
オレンジによる結合方法を利用する比色法（Ｊ、 Ｐｏ
ｌｙｍ、 Ｓｃｉ、 Ｐｏｌｙｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｅｄ
、 ２２巻、１２８１ページ、１９８４年参照）で定量
されゲル１ゴ当９５■であった。
ースゲルを得た。固定化されたｅ−ポリリジンはメチル
オレンジによる結合方法を利用する比色法（Ｊ、 Ｐｏ
ｌｙｍ、 Ｓｃｉ、 Ｐｏｌｙｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｅｄ
、 ２２巻、１２８１ページ、１９８４年参照）で定量
されゲル１ゴ当９５■であった。
実施例２
特開昭５５−４４３１２号の実施例１の方法で造粒した
セルロースゲルのサクションドライ品１００ＩをｌＮ−
ＮａＯＨ溶液８０ゴにけんだくさせさらにＮａ Ｂ Ｈ
４５ＪＦと１２Ｗｌｌの１，４−ビス−（２，３−エポ
キシビロキシ）−ブタンを加え、２５℃で５時間反応さ
せた。反応終了後、濾過して水でよく洗滌した。この様
にして得られたエポキシ活性化−セルロースゲルのサク
ションドライ品１００．Ｆを０．２ Ｍ Ｎａ、 ＣＯ
３溶液１３０ｄにけんだくさせε−ポリリジン１．２ｙ
を加え、４℃で１５時間反応させた。反応終了後１．０
ＭＮａ Ｃ１で洗滌した。過剰のエポキシ基を除くた
めに中性条件で５Ｍ−塩酸ヒドロキシアミンを１００ｄ
加えて撹拌後濾過した。固定化されたＢ−ポリリジンは
ゲ／ｌ／ １ ｘｒｌ当シ４■であった。
セルロースゲルのサクションドライ品１００ＩをｌＮ−
ＮａＯＨ溶液８０ゴにけんだくさせさらにＮａ Ｂ Ｈ
４５ＪＦと１２Ｗｌｌの１，４−ビス−（２，３−エポ
キシビロキシ）−ブタンを加え、２５℃で５時間反応さ
せた。反応終了後、濾過して水でよく洗滌した。この様
にして得られたエポキシ活性化−セルロースゲルのサク
ションドライ品１００．Ｆを０．２ Ｍ Ｎａ、 ＣＯ
３溶液１３０ｄにけんだくさせε−ポリリジン１．２ｙ
を加え、４℃で１５時間反応させた。反応終了後１．０
ＭＮａ Ｃ１で洗滌した。過剰のエポキシ基を除くた
めに中性条件で５Ｍ−塩酸ヒドロキシアミンを１００ｄ
加えて撹拌後濾過した。固定化されたＢ−ポリリジンは
ゲ／ｌ／ １ ｘｒｌ当シ４■であった。
実施例３
特開昭５６−２４４２９号の実施例１の方法で造粒した
セルロースゲルのサクションドライ品１ｏｏｔＩを０，
４ＭのＫ Ｉ Ｏ４溶液１３０ｒ！Ｌｔを加え１時間室
温で撹拌した。水でよく洗滌後、１．０Ｍのへキサメチ
レンシアミン１５０ゴを加え６時間撹拌した。反応終了
後水洗した。このようにして得られたアミン化−セルロ
ースゲル１００Ｉにｅ−ボリリジ７３．０．９”ｉ含む
０．１ Ｍ炭酸ナトリウム１５０肩！と１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１．
０９を加え室温で３時間撹拌した。反応終了後濾過し、
水洗後、０．１Ｍ炭酸ナトリウム１５０ｍ／とＬ−リジ
ン２．０．９を加え、１時間反応後水洗した。固定化さ
れたｅ−ポリリジンはゲル１１Ｒ１当９１０■であった
。
セルロースゲルのサクションドライ品１ｏｏｔＩを０，
４ＭのＫ Ｉ Ｏ４溶液１３０ｒ！Ｌｔを加え１時間室
温で撹拌した。水でよく洗滌後、１．０Ｍのへキサメチ
レンシアミン１５０ゴを加え６時間撹拌した。反応終了
後水洗した。このようにして得られたアミン化−セルロ
ースゲル１００Ｉにｅ−ボリリジ７３．０．９”ｉ含む
０．１ Ｍ炭酸ナトリウム１５０肩！と１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１．
０９を加え室温で３時間撹拌した。反応終了後濾過し、
水洗後、０．１Ｍ炭酸ナトリウム１５０ｍ／とＬ−リジ
ン２．０．９を加え、１時間反応後水洗した。固定化さ
れたｅ−ポリリジンはゲル１１Ｒ１当９１０■であった
。
実施例４
アフイニテイ用担体として市販されているセルロースを
アミン化したアミン化−七ルロファイン（チッソ■製）
のサクションドライ品１００Ｉを０．１ Ｍ ＮａＣ１
で洗滌後、１５０ｄの０．１ Ｍ Ｎａｃｌにけんだく
させた。これに１２Ｎの無水コハク酸を少量づつ加えた
。その間２０％ＮａＯＨを加えｐＨを６．０に保ちなが
ら３０℃で６時間撹拌した。濾過してゲルを０．１ Ｍ
−ＮａＯＨ中にけんだくさせ室温で３０分間撹拌した
。その後このゲルを水洗してスクシニルアミノセルロー
スゲルを得た。このゲル１００１に１．５１のε−ポリ
リジンを含む０．２ Ｍ Ｎａ２ＨＰ０４−ＮａＯＨバ
フ７アー（ｐＨ１１，０） ２００ゴと１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩１．５１を加え、室温で８時間撹拌した。
アミン化したアミン化−七ルロファイン（チッソ■製）
のサクションドライ品１００Ｉを０．１ Ｍ ＮａＣ１
で洗滌後、１５０ｄの０．１ Ｍ Ｎａｃｌにけんだく
させた。これに１２Ｎの無水コハク酸を少量づつ加えた
。その間２０％ＮａＯＨを加えｐＨを６．０に保ちなが
ら３０℃で６時間撹拌した。濾過してゲルを０．１ Ｍ
−ＮａＯＨ中にけんだくさせ室温で３０分間撹拌した
。その後このゲルを水洗してスクシニルアミノセルロー
スゲルを得た。このゲル１００１に１．５１のε−ポリ
リジンを含む０．２ Ｍ Ｎａ２ＨＰ０４−ＮａＯＨバ
フ７アー（ｐＨ１１，０） ２００ゴと１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩１．５１を加え、室温で８時間撹拌した。
さらにＬ−リジン５．０ｇを加え、２時間撹拌した。反
応終了後は水洗を十分おこなった。固定化されたε−ポ
リリジンはゲル１−当り４．０１ｎ９であった。
応終了後は水洗を十分おこなった。固定化されたε−ポ
リリジンはゲル１−当り４．０１ｎ９であった。
実施例５
実施例４で得たスクシニルアミノセルロースゲルをジオ
キサン中で充分に洗滌して脱水後、３００ ｙｔｌのジ
オキサンにけんだくさせた。最終濃度が各々０．１Ｍに
なる様にＮ−ヒドロキシスクシンイミドとジシクロへキ
シルカルボジイミドを加えた。６０分間撹拌した。７０
０ ｍｌのジオキサン、５００ｍのメタノール、４００
ｒｔｔｌのジオキサンで洗滌した。この様にしてＮ−ヒ
ドロキシスキシンイミドエステル化セルロースゲルを得
た。このゲル１０．９（サクションドライ品）に１％Ｎ
ａＣ１を含む０．０１ Ｍ ＮａＨＣＯｓ （ｐＨ７，
５）を５Ｑｍ加えけんだくさせε−ポリリジンｏ、ｓｙ
を加え室温で２０時間撹拌した。残存活性基をブロック
するためＫ Ｏ，Ｉ Ｍ −）リス塩酸（ｐＨ９，０）
で室温で１時間撹拌した。次いで０、５ Ｍ −ＮａＣ
１含有の０．０５ Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ４，０）にて
洗滌した。このようにしてε−ポリリジンを官能基を介
して結合したセルロースゲルが得られた。ｅ−ボＩＪ
ＩＪレジン結合量はゲル１ゴ当シロｒｎ９であった。
キサン中で充分に洗滌して脱水後、３００ ｙｔｌのジ
オキサンにけんだくさせた。最終濃度が各々０．１Ｍに
なる様にＮ−ヒドロキシスクシンイミドとジシクロへキ
シルカルボジイミドを加えた。６０分間撹拌した。７０
０ ｍｌのジオキサン、５００ｍのメタノール、４００
ｒｔｔｌのジオキサンで洗滌した。この様にしてＮ−ヒ
ドロキシスキシンイミドエステル化セルロースゲルを得
た。このゲル１０．９（サクションドライ品）に１％Ｎ
ａＣ１を含む０．０１ Ｍ ＮａＨＣＯｓ （ｐＨ７，
５）を５Ｑｍ加えけんだくさせε−ポリリジンｏ、ｓｙ
を加え室温で２０時間撹拌した。残存活性基をブロック
するためＫ Ｏ，Ｉ Ｍ −）リス塩酸（ｐＨ９，０）
で室温で１時間撹拌した。次いで０、５ Ｍ −ＮａＣ
１含有の０．０５ Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ４，０）にて
洗滌した。このようにしてε−ポリリジンを官能基を介
して結合したセルロースゲルが得られた。ｅ−ボＩＪ
ＩＪレジン結合量はゲル１ゴ当シロｒｎ９であった。
実施例６ （プラスミノーゲンの精製）実施例１で調整
したε−ポリリジンーセルロ始バッファー」という。）
で平衡化した。このカラムに人血清２００ｄを流速２２
ｍｌ／ｂｒで添加し、溶出液の吸光度（２８０１ｍ）
が０，０５以下になるまで開始バッファーで洗滌した。
したε−ポリリジンーセルロ始バッファー」という。）
で平衡化した。このカラムに人血清２００ｄを流速２２
ｍｌ／ｂｒで添加し、溶出液の吸光度（２８０１ｍ）
が０，０５以下になるまで開始バッファーで洗滌した。
弱い非特異的吸着物質を除くために更に０．５Ｍの食塩
を含む開始バッファー５９ｍでカラムを洗滌した。
を含む開始バッファー５９ｍでカラムを洗滌した。
ついで０．２ Ｍの８−アミノカブ四ン酸溶液７０ｄを
流しプラスミノーゲンを溶出した。以上の操作で１２１
ｎ９のプラスミノーゲンが回収された。
流しプラスミノーゲンを溶出した。以上の操作で１２１
ｎ９のプラスミノーゲンが回収された。
これはＳＤＳポリアクリルアミドグラジエンド電気泳動
で純品と確認された。ゲルの単位容量当りの回収率は１
．２１Ｒ９／ｍであった。
で純品と確認された。ゲルの単位容量当りの回収率は１
．２１Ｒ９／ｍであった。
比較例１
実施例６においてｅ−ポリリジン−セルロースゲルに代
えてα−ポリリジン−アガロースを使用し、他を全く同
様な条件でおこない６Ｒ９のプラスミノーゲンが回収さ
れた。ゲルの単位溶積当シの回収率は０．６Ｉｎ９／ゴ
であった。
えてα−ポリリジン−アガロースを使用し、他を全く同
様な条件でおこない６Ｒ９のプラスミノーゲンが回収さ
れた。ゲルの単位溶積当シの回収率は０．６Ｉｎ９／ゴ
であった。
実施例６と比較例１の比較から本発明のゲルの精製効率
は従来のものよりもはるかくすぐれていることが明らか
である。
は従来のものよりもはるかくすぐれていることが明らか
である。
実施例７ （Ｔ４ファージの分離、精製）実施例２で調
整したｅ−ポＩＪ ＩＪレジンセルロースゲル１ ｍｌ
をガラス製カラム（径０．８ ａｎ Ｘ ２ｃＩＬ）に
充填し、０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む０．０２Ｍリン
酸バッファー（ｐＨ７，４）（以下「開始バッファー」
という。）１０ｍｌで平衡化した。これにＴ４ファージ
１．５Ｘ１０”個／１ｔｌを含む開始バッファー１ｄを
添加し、２ｒｕｌ／ｈｒの流速で流した。さらに開始バ
ッファーＩＱ＋ａ／で洗滌した。
整したｅ−ポＩＪ ＩＪレジンセルロースゲル１ ｍｌ
をガラス製カラム（径０．８ ａｎ Ｘ ２ｃＩＬ）に
充填し、０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む０．０２Ｍリン
酸バッファー（ｐＨ７，４）（以下「開始バッファー」
という。）１０ｍｌで平衡化した。これにＴ４ファージ
１．５Ｘ１０”個／１ｔｌを含む開始バッファー１ｄを
添加し、２ｒｕｌ／ｈｒの流速で流した。さらに開始バ
ッファーＩＱ＋ａ／で洗滌した。
この時カラムより溶出して来た液を集め全体を１２−と
した。これを素通り液とした。次ＫＯ，５Ｍ −ＮａＣ
１を含む０．０５Ｍ−グリシン塩酸バフ７アー（ｐＨ３
，０）５ｍ／で流速４ｄ／ｈｒで溶出した。これを溶出
液とした。対照としてｅ−ボＩＪ １７ジンが結合して
いない特開昭５５−４４３１２号の実施例１の方法で造
粒したセルロースゲルを用いて同じ実験を行ない、各々
素通シ液、溶出液を回収した。以上のサンプル中のファ
ージ数を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏ１１
）を用いた寒天二重層で検定した。結果は次の第１表の
とおシであシ、ｅ−ポリリジン−セルロースゲルはＴ４
ファージを吸着するととが明らかとなシ、ファージの分
離、精製に有用である。
した。これを素通り液とした。次ＫＯ，５Ｍ −ＮａＣ
１を含む０．０５Ｍ−グリシン塩酸バフ７アー（ｐＨ３
，０）５ｍ／で流速４ｄ／ｈｒで溶出した。これを溶出
液とした。対照としてｅ−ボＩＪ １７ジンが結合して
いない特開昭５５−４４３１２号の実施例１の方法で造
粒したセルロースゲルを用いて同じ実験を行ない、各々
素通シ液、溶出液を回収した。以上のサンプル中のファ
ージ数を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏ１１
）を用いた寒天二重層で検定した。結果は次の第１表の
とおシであシ、ｅ−ポリリジン−セルロースゲルはＴ４
ファージを吸着するととが明らかとなシ、ファージの分
離、精製に有用である。
第１表
実施例８ （ヒアルロン酸の精製）
ス）Ｌ／７’）コツカスズーエビテミヵス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ）
Ｆ ＥＲＭ ＢＰ −８７８菌をペプトン１．５％、
酵母エキス０．５％、牛血溝０．５係、リン酸１カリウ
ム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、ブドウ糖２％
、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、亜硫酸す） ＩＪウ
ム０．００２％及び硫酸マグネシウム０．０１％を含む
水溶液（ｐＨ７，０）で培養した。（醗酵方法について
は６１年度農芸化学会講演要旨集Ｐ、 ５１０参照。）
培養液は１１で３２℃で３０時間、醗酵をおこなった。
ｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ）
Ｆ ＥＲＭ ＢＰ −８７８菌をペプトン１．５％、
酵母エキス０．５％、牛血溝０．５係、リン酸１カリウ
ム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、ブドウ糖２％
、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、亜硫酸す） ＩＪウ
ム０．００２％及び硫酸マグネシウム０．０１％を含む
水溶液（ｐＨ７，０）で培養した。（醗酵方法について
は６１年度農芸化学会講演要旨集Ｐ、 ５１０参照。）
培養液は１１で３２℃で３０時間、醗酵をおこなった。
終了後加熱処理して菌体を分離した。戸液にエタノール
約５０９ｍＡ！を加え、結晶を析出させた。
約５０９ｍＡ！を加え、結晶を析出させた。
析出した結晶を戸数し５００ｍの０．０５ Ｍ ） リ
スバッファー（ｐＨ７，５）に溶解させて、実施例３で
製造したｅ−ポリリジン−セルロースゲ２し２１（径８
ｃＩｒＬ×４０ｃ！ＩＬ）を詰めたカラムに加え２、０
Ｍ ＮａＣ１を加えるグラジェント法で溶出させた。
スバッファー（ｐＨ７，５）に溶解させて、実施例３で
製造したｅ−ポリリジン−セルロースゲ２し２１（径８
ｃＩｒＬ×４０ｃ！ＩＬ）を詰めたカラムに加え２、０
Ｍ ＮａＣ１を加えるグラジェント法で溶出させた。
流量（６００ｍｌ／ｈｒ ）溶出液を２５ｍ１ずつ分取
し、ヒアルロン酸の定量はＢｉｔｔｅｒ （Ａｎａｌ。
し、ヒアルロン酸の定量はＢｉｔｔｅｒ （Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ ４３３０ （１９６２））のウロン酸
を測定する方法でおこなった。その結果を第１図に示す
。
を測定する方法でおこなった。その結果を第１図に示す
。
ウロン酸の分析値が高いフラクション／１６２０〜／ｆ
６４０までを集めて透析で脱塩後、濃縮、凍結乾燥して
ヒアルロン酸の製品３．Ｏｌを得た。ここに得られたヒ
アルロン酸は次の様な性質を有し、高品質であった。
６４０までを集めて透析で脱塩後、濃縮、凍結乾燥して
ヒアルロン酸の製品３．Ｏｌを得た。ここに得られたヒ
アルロン酸は次の様な性質を有し、高品質であった。
分子量：９６万（粘度法）
ヒアルロン酸二８９％
水 分 ： １０係
蛋 白 質 ： （０，１係
核 酸 ：（０，５％
ゲルコサミノグルカン硫酸塩 ：（０，０１％実施例９
（ゲルの流速の測定） 次の様な条件で実施例４で製造した本発明のゲルと市販
のα−ポリリジン−アガロース（シグマ製）の流速を測
定した。
（ゲルの流速の測定） 次の様な条件で実施例４で製造した本発明のゲルと市販
のα−ポリリジン−アガロース（シグマ製）の流速を測
定した。
カ ラ ム ：１．６Ｘ２０ｃｍ溶 出
液： ５５−リン酸バッファー（ｐＨ７，０）この結果
を第２図に示す。この図より本発明のゲルは従来品のア
ガロース系ゲルと比較して問題なく流速が大であること
が明らかであり、工業的に大量に使用する場合に非常に
有利である。
液： ５５−リン酸バッファー（ｐＨ７，０）この結果
を第２図に示す。この図より本発明のゲルは従来品のア
ガロース系ゲルと比較して問題なく流速が大であること
が明らかであり、工業的に大量に使用する場合に非常に
有利である。
第１図は実施例８で行なったヒアルロン酸のアフイニテ
イクロマトグラフイーによる溶出曲線を示す図、第２図
はカラムのみ囚、本発明グルを詰めだカラム（Ｂ）及び
市販のα−ボＩＪ ＩＪリジンアガロースを詰め九カラ
ム（Ｃ）Ｋ ５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７，０
）を流したときの流速を示す図である。 以上
イクロマトグラフイーによる溶出曲線を示す図、第２図
はカラムのみ囚、本発明グルを詰めだカラム（Ｂ）及び
市販のα−ボＩＪ ＩＪリジンアガロースを詰め九カラ
ム（Ｃ）Ｋ ５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７，０
）を流したときの流速を示す図である。 以上
Claims (9)
- （１）球状セルロース粒子に官能基を介してε−ポリリ
ジンが結合した生物化学的親和性を有するゲル。 - （２）前記ε−ポリリジンがストレプトマイセスアルブ
ラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）の
醗酵より得られる重合度２０〜３０のものであることを
特徴とする第（１）項記載のゲル。 - （３）ε−ポリリジンと反応する官能基を導入した球状
セルロース粒子とε−ポリリジンとを反応させ必要に応
じて後処理することを特徴とする球状セルロース粒子に
官能基を介してε−ポリリジンが結合した生物化学的親
和性を有するゲルの製造方法。 - （４）前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入した
球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子にホルミル
基を導入したものであり、前記後処理が還元であること
を特徴とする第（３）記載のゲルの製造方法。 - （５）前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入した
球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子にエポキシ
基を導入したものであることを特徴とする第（３）項記
載のゲルの製造方法。 - （６）前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入した
球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子とω−アル
キルアミンの末端アミンとの反応生成物であることを特
徴とする第（３）項記載のゲルの製造方法。 - （７）前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入した
球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子にカルボキ
シル基を導入したものであることを特徴とする第（３）
項記載のゲルの製造方法。 - （８）前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入した
球状セルロール粒子が、球状セルロース粒子にカルボキ
シル基を導入し、このカルボキシル基をＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドでエステル化したものであることを特徴
とする第（３）項記載のゲルの製造方法。 - （９）前記ε−ポリリジンがストレプトマイセスアルブ
ラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ａｌｂｕｌｕｓ）の
醗酵より得られる重合度２０〜３０のものであることを
特徴とする第（３）項ないし第（８）項のいずれかに記
載のゲルの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61199569A JPS6356501A (ja) | 1986-08-26 | 1986-08-26 | アフイニテイークロマトグラフイー用カラム充填剤及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61199569A JPS6356501A (ja) | 1986-08-26 | 1986-08-26 | アフイニテイークロマトグラフイー用カラム充填剤及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6356501A true JPS6356501A (ja) | 1988-03-11 |
| JPH0427504B2 JPH0427504B2 (ja) | 1992-05-12 |
Family
ID=16410010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61199569A Granted JPS6356501A (ja) | 1986-08-26 | 1986-08-26 | アフイニテイークロマトグラフイー用カラム充填剤及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6356501A (ja) |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5328603A (en) * | 1990-03-20 | 1994-07-12 | The Center For Innovative Technology | Lignocellulosic and cellulosic beads for use in affinity and immunoaffinity chromatography of high molecular weight proteins |
| EP1120428A3 (en) * | 2000-01-24 | 2001-08-22 | Kuraray Co., Ltd. | Water-swellable polymer gel and process for preparing the same |
| JP2002263486A (ja) * | 2001-03-14 | 2002-09-17 | Chisso Corp | エンドトキシン吸着体、及びそれを用いたエンドトキシンの除去方法 |
| JP2003503363A (ja) * | 1999-06-29 | 2003-01-28 | セゴェー，ペーテル | 体内への各種活性物質輸送に好適なポリカチオンベース生物接合体を選好する方法 |
| US7888412B2 (en) | 2004-03-26 | 2011-02-15 | Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Polymer dissolution and blend formation in ionic liquids |
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| US8232265B2 (en) | 2005-10-07 | 2012-07-31 | Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Multi-functional ionic liquid compositions for overcoming polymorphism and imparting improved properties for active pharmaceutical, biological, nutritional, and energetic ingredients |
| US8668807B2 (en) | 2008-02-19 | 2014-03-11 | Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Ionic liquid systems for the processing of biomass, their components and/or derivatives, and mixtures thereof |
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| US9278134B2 (en) | 2008-12-29 | 2016-03-08 | The Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Dual functioning ionic liquids and salts thereof |
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| US10100131B2 (en) | 2014-08-27 | 2018-10-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Chemical pulping of chitinous biomass for chitin |
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| US10927191B2 (en) | 2017-01-06 | 2021-02-23 | The Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Coagulation of chitin from ionic liquid solutions using kosmotropic salts |
| US10941258B2 (en) | 2017-03-24 | 2021-03-09 | The Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Metal particle-chitin composite materials and methods of making thereof |
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| JPS6115900A (ja) * | 1984-06-30 | 1986-01-23 | Agency Of Ind Science & Technol | 変性セルロ−ス系多孔質膜 |
-
1986
- 1986-08-26 JP JP61199569A patent/JPS6356501A/ja active Granted
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| US10927191B2 (en) | 2017-01-06 | 2021-02-23 | The Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Coagulation of chitin from ionic liquid solutions using kosmotropic salts |
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| CN109206538A (zh) * | 2018-08-29 | 2019-01-15 | 武汉汇研生物科技股份有限公司 | 一种环氧氨基层析介质及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0427504B2 (ja) | 1992-05-12 |
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