JPS63263084A - ヒトインスリン様成長因子ｉの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ この発明は、ヒトイ゛ンスリン様成長因子工（以下、Ｉ
ＧＦ−Ｉという）の改良された製造法に関する。

［従来技術］ ＩＧＦ−１を遺伝子組み換え法で製造する方法として、
保護ペプチドとひ合したＩＧＦ−１をコードする遺伝子
を含有する発現プラスミドを用いて宿主微生物を形質転
換して得られる形質転換体を培地に培養し、得られる培
養液から保護ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉ（以下、融合ＩＧ
Ｆ−Ｉという）を回収し、該融合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプ
チドの脱離反応に付してＩＧＦ−■を分離採取する方法
がある。

［発明が解決しようとする問題点コ この発明は上記方法において、保護ペプチドを選択する
ことによって、融合ペプチドの発現効率を高めたところ
にある。

［問題点を解決するための手段］ この発明の発明者は、次の各工程を用いろことにより、
ＩＧＦ−Ｉを好収率で製造することに成功した： 工程１ 融合ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子（以下融合ＩＧＦ−
工遺伝子という）を製造する工程。

工程２ 適当なプラスミドに、該融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝ｒおよびプ
ロモーター遺伝子を、プロモーター遺伝子が融合ＩＧＦ
−Ｉ遺伝子の上流となるように、挿入することからなる
発現プラスミド製造工程。

工程３ 該発現プラスミドを用いて宿主微生物を形質転換するこ
とからなる形質転換体をＶ造する工程。

工程４ 該形質転換体を適当な培地中で培養するｒ程。

工程５ 工程４で得られる培養液から融合ＩＧＦ（を単准する工
程。

工程６ 融合ＩＧＦ−１を保護ペプチド脱離反応に付すことから
なるＩＧＦ−Ｉを製造する工程。

保護ペプチドは、形質転換体の細胞中のプロテアーゼに
よる分解からＩＧＦ−１を保護するために使用され、前
記融合ＬＧＦ−Ｉの保護ペプチド脱離反応によって除去
される。

ずなわち、融合ＩＧＦ−１は脱離反応によってＩＧＦ−
■を製造するための中間体である。

この目的のために用いられる保護ペプチドとしては、天
然または合成のペプチドから、あるいはそれらの断片か
ら誘導された任意の脱離可能なペプチドが挙げられるが
、この発明の発明者は、これらのうち、下記アミノ酸配
列を有するペプチドであるペプチドＣＬａを選択するこ
とによって、上記工程４における融合ペプチドの発現効
率が著しく高まることを見出し、この発明を完成した。

ペプチドＣＬａのアミノ酸配列は次の通りである。

１１゜ Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−５ｅ
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Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅ　ｔ−
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−！９ｅｒ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−工］、ｅ−８０９゜ Ｍａｔ−Ｇｉｎ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａｌ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ
ペプチドＣＬａと融合したＩＧＦ−Ｉ（以下、ＣＬａ融
合ＩＧＦ−１という）のアミノ酸配列は次の通りである
。

Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−９ｅ
ｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ
ｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇ　
１ｕ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　ｌｕ−Ｐｈｅ
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ｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ　１ａ−Ｇｌｙ−ＨＬ　ｓ−
５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−工
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ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ　−工
１ｓ−Ｍｅｔ−Ｇ　１ｎ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−工：Ｌｅ−
Ｖａ　ｌ−！ｌ；ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ　−Ｌｅ　ｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ　−Ｈｉ　
ｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
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Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＡＳｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、−Ｇｌｎ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙ　ｓ　−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙ　
ｓ　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−Ｇ　１ｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
９ｅｒ−６ｅｒ−８ｅｒ−Ａｗｇ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−
Ｐｒｏ−Ｇ　Ｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌｙ−工１ｅ−ｖａ　
１−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｃｙ　５−Ｃｙ　５−Ｐｈｅ　
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ｒ　ｑ−Ａｒｇ　−Ｌａｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−’ｒｙｒ
−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
八１ａ−Ｌｙｓ−９ｅｒ−１ａ ＣＬａ融合ＩＧＦ−１をフードする遺伝子（以下、ＣＬ
ａ融合ＩＧＦ−１遺伝子という）は次の通りである。

Ｍｅｔ　Ｐｈｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＴｙｒＡＴＧ−ＴＴＣ−ＴＡＣ
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ＡＴ−ＴＡＣ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−ＴＴ
Ｔ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−Ｇｌｙ　Ｓｅｒ
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Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ工１ｅ　ＶａｌＧＧＣ−ＴＣＣ
−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＧＣＡ−ＣＣＧ−
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ＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＣＧＴ−ＧＪ
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ｃｏＲＩ　　３０ Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｐ
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Ｃ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＣＣＡ−ＣＣＧ−ＣＴＡ−ＣＴＴ
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ｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ
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ｌｙ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ
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ＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＧ−ＡＡＴ−ＴＧＧ−＃彷
−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＭＧ−ＭＴ−ＣＣ
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Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇ
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ＧＧＴ−ＣＣＴ−ＧＡＡ、−ＡＣＴ−ＴＴＣ−ＧＭ−Ｃ
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ＧＣ−ＡＣＡ−ＣＣＡＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＡＡＧ
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彷Ｇ−ＣＣＡ−ＧＣＡ、−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＡＣ−Ｃ
ＴＴ−ＴＡＣ−ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡ
Ｃ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧＧ−Ａｈａ ＣＣＧ ＧＣ 前記ＣＬａ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子はＩＧＦ−Ｉをコード
する遺伝子（以下、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子という）の上流に
ベブデドＣＬａをコードする遺伝子（以下、ＣＬａＬａ
遺伝−う）が結合したものである。

ＣＬａ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子は、常法により合成法で製
造することもできるが、公知のプラスミドから適当な制
限酵素で切り出したフラグメントをライゲージ５ンする
ことによっても得ることができる。

すなわち、特開昭６２−６６８９号公報で公知のプラス
ミドｐｃＬａＨｔｒｐｓｄｔ　）ＩｉｎｄｌＩＩおよび
ＢａｍＨＩで開裂して得られる大きい方のフラグメント
と、特開昭６１−１３９６号公報で公知のプラスミドｐ
Ｌ）ＩＳｄＭｍｔｒｐからＨｉｎｄｌ［［およびＢａｍ
ＨＩで切り出した）」１さい方のフラグメントをライゲ
ーションして得られるプラスミドｐＣＬＳＭＳｔｒｐ中
に得ることができる。プラスミドｐＣＬＳＭ６ｔｒｐは
それ自体、発現プラスミドであるので、そのまま適当な
宿主微生物を形質転換して形質転換体を得、ＣＬａ融合
ＩＧＦ−１の生産に用いてもよいし、あるいは適当な制
限酵素、例えばＣ１ａＩおよびＢａｍＨＩで切り出して
、別の発現プラスミドに導いてもよい。

かくして得られるＣＬａ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の一例と
して、プラスミドｐＣＬＳＭ６ｔｒｐをＣ１ａＩおよび
ＢａｍＨＩで切り出した遺伝子のＤＮＡ配列は次の通り
である。

Ｃ１ａ工　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　
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Ｇ−ＴＭ−ＡＡＣ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−
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ＣＧＴ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＣＴＴ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−Ａ
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Ｌｙｓ　ＳｅｒＣＴＧ−ＧＭ−ＡＴＧ−ＴＡＣ−ＴＧＴ
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ＡＭ−ＴＣＣ−ＧＡＣ−ＣＴＴ−ＴＡＣ−ＡＴＧ−ＡＣ
Ａ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ
−ＴＴＴ−ＡＧＧ−１６７５ｔｏｐ　５ｔｏｐ　Ｂａｍ
Ｈ工１ａ ＧＣＧ−ＴＧＡ−ＴＡＧ−３’ ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’前記の工程２
において、用いられるプロモーター遺伝子とは、詳しく
はブロモ−クー・オペレーター領域をもつ遺伝子であっ
て、プロモーター、オペレーターおよび例えばＡＡＧＧ
、　ＡＧＧＡ、　ＧＡＧ、ＡＧＧＡ、　ＧＡＧＧなどの
シャイン・外ルガノ配列（以下、ＳＤ配列という）を含
有する。ＣＬａ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子は５′　−側には
、例えばＡＴＧである開示コドン、３′　−側には、例
えば丁ＧＡ、丁ＡＧなどの終示コドンをもつことが必須
である。開示コドンのＡＩＧはそれ自体保護ペプチドの
先頭のアミノ酸であるメチオニンをコードする。

この目的に用いろるプロモーター遺伝子としては、ＣＬ
ａ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を発現させ得るものであれば何
でもよいが、その好適な例としては、例えば合成ｊｒｐ
プロモーターＩ、合成しｒｐプロモーターｍおよびそれ
らが１〜３運となったものなどが挙げられる。

合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝予および合成ｔｒｐプロ
モーター■遺伝子のＤＮＡ配列は次の通りである。

合成ｔｒｐプロモーター！遺伝予： ｃｏＲＩ Ｈｐａ工 ＡＣＭＣＴＧＴＴＭＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＣＭＴ
ＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡ、ＧＴＧＣＡＴＴＴ−
ＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＴＡＡ 合成しｒｐプロモーター■遺伝子： ＥｃｏＲ工 ｐａｌ ことにより、形質転換体を得ることができる。

■遺伝子の製法は特開昭６２−６６８９号公報に開示さ
れている６発現プラスミドの製造に用いるプラスミドと
してはＣｏ１Ｅ１プラスミド、例えばｐＢＲ３２２など
が挙げられる。

適当な宿主微生物としては、大腸菌（Ｅｓｃｈａｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）（以下、Ｅ、　ｃｏｌｉという）、例
えばＥ、　ｃｏｌｉＨＢＬＯＬ　（ＡＴＣＣ３３６９４
）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）な
どが挙げられる。

プロモーター遺伝子およびＣＬａ融合Ｔ、ＧＦ−Ｉ遺伝
子を適当なプラスミドと、所望により適当なりＮＡ断片
（たとえばリンカ−１他の制限部位など）を用いて、常
法（たとえば制限酵素による消化、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いてのホスホリル化、Ｔ　４　ＤＮＡリ
ガーゼを用いてのライゲーションなど）により順次、環
状に連結することにより発現プラスミドを樽ることがで
きる。

次いで発現プラスミドを常法（たとえば形質転換、顕微
注射など）により宿主微生物に挿入するするには、この
ようにして得た形質転換体を栄養培地中で陪賓する。

栄養培地は炭素源（たとえばグルコース、グリセリン、
マンニトール、フルクトース、ラクトースなど）および
無機または有機の窒素源（硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキス、ポリペプ
トン、バタトトリプトン、牛肉エキスなど）を含有する
。所望により、他の栄養源［たとえば無機塩類（たとえ
ばリン酸−ナトリウムまたはカリウム、リン酸水素二カ
リウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシラノ１、塩化
カルシウムなど）、ビタミン類（たとえばビタミン８１
など）、抗生物質（たきえばアンピシリンなど）など］
を培地に加えてもよい。

形質転換体の培養は一般に、ｐＨ５，５〜８．５（好ま
しくはｐＨ７〜７．５）、１８〜４０℃（好ましくは２
５〜３８℃）で、５〜５０時間にわたって行えばよい。

こうして生産されたＣＬａ融合ＩＧＦ−１は培養された
形質転換体の細胞中に存在するのが普通であるので、細
胞を濾過または遠心分離によって集め、それらの細胞壁
および／または細胞膜を常法（たとえば超音波処理およ
び／またはリソチーム処理など）により破壊して、デブ
リスを得る。このデブリスから、天然または合成の蛋白
を単離、精製するのに一般に採用される常法［たとえば
適当な溶媒（たとえば８Ｍ尿素水溶液、６Ｍ塩酸グアニ
ジンなど）を用いての蛋白の溶解、透析、ゲル濾過、カ
ラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
などコにより、ペプチドＣＬａ融合ＩＧＦ−工を単離、
精製できる。

本発明における保護ペプチド脱離反応は、この反応に悪
彰響を及ぼさない慣用の溶媒中で、緩和な条件下に実施
することができる。

この明細書において、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味し、５′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味し、３′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 ［発明の効果］ ペプチドＣＬａを保護ペプチドとして用いることにより
、上記工程４における融合ペプチドの発現効率が著しく
高まり、従来法に比べて、単位培養法量から最終的に得
られるＩＧＦ−Ｉの量を高めることができる。

［実施例コ 以下、実施例により、この発明をより詳細に説明する。

実施Ｌ　プラスミドｐＣＬＳＭ６ｔｒｐの構築プラスミ
ドｐｃＬａＨｔｒｐｓｄ（１（ｌｓｇ　）　（特開昭６
２−６６８９号公報に記載されているＥ、　ｃｏｌｉ　
ＨＬを用いて、常法によりプラスミドｐｃＬａＨｔｒｐ
ｓｄを得た。なお、Ｅ、　ｃｏｌｉ　８１を得るための
原料となるプラスミドｐｙｔｒｐを含有するＥ、　ｃｏ
ｌｉ　Ｆ−９はＦＥＲＭ　ＢＰ−９０５として微生物工
業技術研究所に寄託されている）をＨｉｎｄ　ｍおよび
ＢａｍＨＩで切断した。０．８％アガロースゲル電気泳
動で精製して、大きい方のフラグメント（約ａ、５ｋｂ
ｐ、　５．０＜）を得た。

一方、プラスミドｐＬＨ５ｄＭｍｔｒｐ　（特開昭６１
−１３９６号公報に記載されているＥ、　ｃｏｌｉ　Ｆ
−６を用いて、常法によりプラスミドｐＬＨ５ｄＭｍｔ
ｒｐを得た。なお、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｆ−６はＦＥＲ１
’ｌ　ＢＰ−７２９よして微生物工業技４ｔｌ研究所に
寄託されている）　（Ｌｏｇ　）をＨｉｎｄｌ［［およ
びＢａｍＨｌで切断して、２４２　ｂｐのＩＧＦ−Ｉ遺
伝子を含むフラグメント（３００ｎｇ　）を得た。この
フラグメントを先に得た約４．５ｋｂｐのフラグメント
（２００ｎｇ）と合わせてライゲーション緩衝液［５０
ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．２０ｍＭジチ才スレイトール、１　ｍＭ　ＡＹ
Ｐ、１ｍＭスベルミンンおよび５０（牛血清アルブミン
からなるライゲーンヨン緩衝液、２０ρ］に移し、Ｔ４
リガーゼ（宝酒造製造、３５０単位）を加えて、１５℃
で３０分インキュベイトした。

得られたライゲーシゴン混合物で、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｄ
Ｉ〜１を形質転換した。アンピシリン耐性おマーカーと
して目的とする形質転換体 （Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ−１−ｐＣＬＳＭ６ｔｒｐ）を
選び出し、さらに選はれた形質転換体から、プラスミド
を抽出し、制限酵素分析により、そのプラスミドが目的
とするプラスミド（ｐＣＬＳＭ６ｔｒｐ　）であること
を確ご、２した。

制限酵素分析：　Ｈｐａｌ　−Ｂａｍ）ＩＩ　１０７ｂ
ｐ、　５４６ｂｐ：Ｃ１ａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　５１４
ｂｐ；　ＥｃｏＲＩ−Ｂａｍｌ（Ｉ　１９８ｂｐ；２２
４ｂｐ；　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　−ＢａｍＨＩ　２４２ｂｐ
；　Ａａｔｎ　−Ｃ１ａ　Ｉ　　２６４ｂｐ 発現プラスミドｐｃＬｓ６ｔｒｐの構築の模式図を第１
図に示す。

大Ｊ言江主　プラスミドｐＣＬＳＭ６ｔｒｐを含有ｒる
Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯｌの形質転換体（Ｅ、　ｃｏｌｉＨ
ＢＩＯＩ　−ｐＣＬＳＭ６ｔｒｐ　）によるペプチドＣ
Ｌａ融合ＩＧＦ−Ｉの発現 実施例１で得た形質転換体Ｅ、　　ｃｏｌｉ　ＤＨ−１
−ｐＣＬＳＭ６ｔｒｐから抽出したプラスミドｐＣＬＳ
Ｍ６ｔｒｐでＥ、　ｃｏｌｉ　）ＩＢＬＯＩを形質転換
し、得られた形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ−
ｐＣＬＳＭ６ｔｒｐをアンピシリン５０５ｇ／ｍＱを含
有するしプロス［バクト・トリプトン（ｏｘＦｃｏｌ　
）　１０　ｇ　、バクト・酵母エキスＤＩＦＣＯ製）５
　　ｇ、ＮａＣ１５ｇｓ　　水１　ｆｆｉ　、ｐＨ７，
２〜７．４コ　５ｍＱに移し、３７℃で８時間培養した
。得られた培養液の全量をさらにアンピシリン５ｏ＜／
ｍＱを含有するしブロス１００ｍＱに移し、３７℃で終
夜培養した。得られた培養液のうち２０戚をＭ９ＣＡブ
ロス（カザミノ！ｖ２ｏ、ｓ％、グルコース０．２％、
チアミン５０ｐｇ／ｍｕ、アンピシリン２５に／ｍｌｆ
　；４００ｍＱ　）に移し、３７℃て培養した。　２．
５〜３．０時間後、０Ｄ６ｏ、）　（６００ｎｍにおけ
る吸光度）が０．４〜０．６となったとき、β−インド
ールアクリル酸（２ｍｇ／ｍＱ　；　２ｍｍ）を添加し
た。

約３時間後　０Ｄ６ｏｏ　　は、１．６〜２．０となり
増殖は′Ｖ−衡に達した。培養液を遠心（４°Ｃ１８，
００Ｏｒｐｍ、１０分）し、得られる湿菌体を１０ｍＭ
　’）ン酸緩衝液−ＥＤＴＡ　［ＮａＣ１（８，０ｇ　
）、ＫＣＩ（０，２ｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２０
（２，９ｇ　）、ＫＨ２ＰＯ４（０，２ｇ　）およびＥ
ＤＴＡ＜３．７３＆）を水に溶解し、ＮａＯＨでｐ）１
８．０とし、全量を１２とする］ＢｍＱに懸濁した。懸
濁液を０℃で超音波処理し、遠心（４℃、１５．　ＯＯ
Ｏｒｐｍ、２０分）して、上清を除いた。

残渣をＧｎ−）ＩＣＩ緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩、
１０ｍＭ・ル酷緩衝ン夜−ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカ
プトエタノール）ＢｍＱに懸濁した。再び、０°Ｃで超
音波処理し、その処理液を遠心して得た上清液を脱イオ
ン水（２０に）に対して透析した。

透析液にβ−メルカプトエタノール（４００４）を加え
て、０°Ｃで３０分放置後、遠心して沈殿を集めた。得
られた沈殿物をアセトンで洗浄した後、減圧乾燥してペ
プチドＣＬａ融合ＩＧＦ−Ｉの粗製物（７０ｍｇ）を得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は発現プラスミドｐＣＬＳＭ６ｔｒｐの構築の模
式図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペプチドＣＬａと融合したヒトインスリン様成長
   因子Ｉをコードする遺伝子を含有する発現プラスミド。
2. （２）プラスミドｐＣＬＳＭ６ｔｒｐである特許請求の
   範囲第１項に記載の発現プラスミド。
3. （３）ペプチドＣＬａと融合したヒトインスリン様成長
   因子Ｉをコードする遺伝子を含有する発現プラスミドを
   用いて宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体を
   培地に培養し、得られる培養液からペプチドＣＬａと融
   合したヒトインスリン様成長因子Ｉを分離採取し、次い
   で、該融合ペプチドを保護ペプチド脱離反応に付し、ヒ
   トインスリン様成長因子Ｉを得ることを特徴とするヒト
   インスリン様成長因子Ｉの製造法。
4. （４）発現プラスミドがｐＣＬＳＭ６ｔｒｐであり、宿
   主微生物が大腸菌である特許請求の範囲第３項に記載の
   ヒトインスリン様成長因子Ｉの製造法。
5. （５）下記アミノ酸配列を有するペプチドＣＬａと融合
   したヒトインスリン様成長因子Ｉ。 【アミノ酸配列があります】