JPH0516835B2 - - Google Patents
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- JPH0516835B2 JPH0516835B2 JP61141900A JP14190086A JPH0516835B2 JP H0516835 B2 JPH0516835 B2 JP H0516835B2 JP 61141900 A JP61141900 A JP 61141900A JP 14190086 A JP14190086 A JP 14190086A JP H0516835 B2 JPH0516835 B2 JP H0516835B2
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明はα−ヒト心房由来ナトリウム排泄性
ポリペプチド（α−human atrial natriuretic
polypeptide、以下“α−hANP”と略称する）
の新規な融合蛋白に関する。さらに詳細には、Ｃ
末端がリジンである保護ペプチドと該リジンを介
して融合したα−hANPおよび、それからα−
hANNPを製造する方法に関するものである。 従来の技術およびこの発明が解決しようとする問
題点 α−hANPは、利尿作用、ナトリウム排泄増加
作用、および降圧作用を有する公知のポリペプチ
ドであり、利尿降圧剤として有用であり、 なる構造を有する（バイオケミカル・アンド・バ
イオフイジカル・リサーチ・コミニユケーシヨン
ズ第118巻、第131ページ（1984年）参照）。 そして、このα−hANPを収率よく製造する方
法が望まれていた。 発明の構成および効果 この発明者等はＣ末端がリジンである保護ペプ
チドと該リジンを介して融合したα−hANPをコ
ードする遺伝子を含有する発現ベクターを用いる
組換えDNA技術によるα−hANPの製造法を新
たに創出した。この方法によると、α−hANPを
高収率で得ることができる。 この発明では、(1)Ｃ末端がリジンである保護ペ
プチドと該リジンを介して融合したα−hANPの
アミノ酸配列をコードする遺伝子を含有する発現
ベクターにより形質転換された微生物を培地に培
養し、(2)得られる培養物より該保護ペプチド融合
α−hANPを採取し、(3)該保護ペプチド融合α−
hANPの保護ペプチド部分をアクロモバクター・
プロテアーゼ（API）の存在下に除去すること
によりα−hANPが製造される。 以下に、上記製造法における詳細をさらに詳し
く説明する。 形質転換される微生物は宿主細胞のことであ
り、細胞、真菌、ヒトおよび動物培養細胞および
植物培養細胞を挙げることができる。微生物の好
ましい例としては、細菌、特に例えばE.
coliHB101（ATCC33694）、E.coli294
（ATCC31446）、E.colix1776（ATCC31537）等の
エシエリヒア属に属する菌株を挙げることができ
る。 発現ベクターは、通常少くともプロモーター・
オペレーター領域、開始コドン、合成保護ペプチ
ド遺伝子、合成α−hANP遺伝子、終止コドンお
よび複製可能なユニツトを有するDNAより成る。 プロモーター・オペレーター領域は、プロモー
ター、オペレーターおよび例えばAAGG等のシ
ヤイン−ダルガーノ（SD）配列を含有する。SD
配列−開始コドン間の距離は、好ましくは８〜12
塩基対（b.p.）であり、後記実施例に示されるよ
うな最も好ましい例においては、SD配列−開始
コドン間の距離は11b.p.である。プロモーター・
オペレーター領域の例としては、合成プロモータ
ー・オペレーター領域の他に、例えばラクトー
ス・オペロン、PL−プロモーター、trp−プロモ
ーター等の通常用いられるプロモーター・オペレ
ーター領域を挙げることができる。プロモータ
ー・オペレーター領域の好ましい例は、この発明
者等が新らたに合成した合成trpプロモーター、
、およびがあり、そのDNA配列を各々第１
図、第２図および第３図に示す。この発明の製造
法においては、各発現ベクター毎に１〜３連のプ
ロモーター・オペレーター領域を使用してもよ
い。 好ましい開始コドンとしてはメチオニンコドン
（ATG）を挙げることができる。 保護ペプチド遺伝子としては、α−hANPとの
融合蛋白を形成することができ、且つ宿主細胞ま
たは培養物中の融合蛋白の望ましくない分解を抑
制するペプチドまたは蛋白のアミノ酸配列に対応
するDNA配列を有する遺伝子が挙げられる。 その好ましい例は「LH蛋白遺伝子」に連結さ
れた「ペプチドCd遺伝子」（以下、「LH蛋白遺伝
子を連結したペプチドCd遺伝子」を「ペプチド
CLa遺伝子」と呼ぶ）であり、そのDNA配列を
第４図に示す。 α−hANP遺伝子のDNA配列は、α−hANP
のアミノ酸配列から、多数の項目の非自明な基準
に従つてデザインされる。α−hANP遺伝子の好
ましいDNA配列の例を第５図に示す。後記実施
例においては、α−hANP遺伝子と保護ペプチド
遺伝子との間に、アミノ酸リジンをコードする
DNA配列を挿入した。 このようにすると、融合蛋白の接合部をアクロ
モバクター・プロテアーゼで切断することがで
きる。 終止コドンとしては、例えばTAG、TGA等の
通常に用いられる終止コドンを挙げることができ
る。 複製可能なユニツトとは、宿主細胞中で、それ
に属するDNA配列全体を複製することができる
DNA配列のことであり、天然プラスミド、例え
ば天然プラスミドより調製したDNA断片等の人
工修飾プラスミドおよび合成プラスミドを挙げる
ことができる。さらにプラスミドの好ましい例と
しては、プラスミドpBR322またはその人工修飾
体（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られ
るDNA断片）を挙げることができる。複製可能
なユニツトは天然または合成ターミネーター（例
えば合成fdフアージ・ターミネーター等）を包含
してもよい。 プロモーター・オペレーター領域、開始コド
ン、Ｃ末端がリジンである保護ペプチド遺伝子、
α−hANP遺伝子、終止コドン、ターミネーター
等を合成する場合には、その合成法はポリヌクレ
オチドの製造に通常用いられる公知の方法で行う
ことができる。 プロモーター・オペレーター遺伝子、開始コド
ン、Ｃ末端がリジンである保護ペプチド遺伝子、
α−hANP遺伝子および終止コドンは、所望であ
れば適当なDNA断片（例えばリンカー、その他
の制限酵素作用部位等）を用いて、常法（例えば
制限酵素による消化、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いるホスホリル化、T4DNAリガーゼを
用いるライゲーシヨン等）により、適当な複製可
能なユニツト（プラスミド）と連続且つ環状に連
結して、発現ベクターを得ることができる。 発現ベクターは常法により微生物（宿主細胞）
に挿入することができる。挿入は、例えば形質転
換、マイクロ・インジエクシヨン等の常法によつ
て行えば、形質転換体を得ることができる。 この発明の製法においてα−hANPを製造する
には、このようにして得た発現ベクターを含有す
る形質転換体を培地に培養することにより行なわ
れる。 培地としては、形質転換体が増殖するものであ
ればよく例えばグルコース、グリセリン、マンニ
トール、フルクトース、ラクトース等の炭素源お
よび例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、カゼインの加水分解物、酵母エキス、ポリペ
プトン、バクトトリプトン、ビーフエキス等の窒
素源を含有するのが通例であり、所望により、例
えばリン酸二水素ナトリウムまたはカリウム、リ
ン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウム、塩化カルシウム等の無機塩、例えば
ビタミンB1等のビタミン、例えばアンピシリン
等の抗生物質等の他の成分も培地に加えてよい。 形質転換体の培養は、通常、PH5.5〜8.5（好ま
しくはPH７〜7.5）、18〜40℃（好ましくは25〜38
℃）で５〜50時間行われる。 このように製造されたＣ末端がリジンである保
護ペプチドと該リジンを介して融合したα−
hANPは通常培養された形質転換体の細胞中に存
在するので、細胞を濾過あるいは遠心分離によつ
て集め、その細胞壁および／または細胞膜を常法
（例えば超音波および／まははリゾチームによる
処理等）により破壊し、破壊細胞を得る。この破
壊物より、天然または合成蛋白の精製および単離
に通常用いられる常法（例えば8M尿素水溶液、
6Mグアニジン等の適当な溶媒による蛋白の溶解、
透析、ゲル濾過、カラムクロマトグラフイー、高
速液体クロマトグラフイー等）でＣ末端がリジン
である保護ペプチドと該リジンを介して融合した
α−hANPを精製および単離することができる。 α−hANPは、保護ペプチド融合α−hANP
を、アクロモバクター・プロテアーゼ（API）
による処理により切断して調製することができ
る。APIは既知の酵素である［ビオキミカ・エ
ト・ビオフイジカ・アクタ、660、51（1981）］が、
組換えDNA技術により調製された融合蛋白を
API処理により好ましく切断することができるこ
とは知られていない。この方法は保護ペプチドと
その分子内にリジンを有しない目的ペプチドとの
間にリジンを有するペプチドよりなる融合蛋白の
切断に好適に用いることができる。 融合蛋白の切断は、PH５〜10、20〜40℃（好ま
しくは35〜40℃）で、例えば緩衝液、尿素水溶液
等の水溶液中で２〜15時間行えばよい。 後記実施例において、融合蛋白は、先ず8M尿
素を含有するPH５の緩衝液中、次いで4M尿素を
含有するPH９の緩衝液中でAPIにより処理され
る。この条件下では融合蛋白はリジン部位におい
て切断され、産生したα−hANPは自然に再構成
される。 このように産生されたα−hANPは、得られた
培養物より、上記の常法で精製、単離される。 以下に、この明細書に添付した図について説明
する。 図中の若干のものにおいては、オリゴヌクレオ
チドは――、〓〓または〓〓の記号（記号中、・
はT4ポリヌクレオチドキナーゼによりホスホリ
ル化された5′−末端を意味する）で示され、ブロ
ツクされたオリゴヌクレオチドは――、〓〓、〓
〓、〓〓、〓〓または〓〓の記号（記号中、△は
ライゲートされた位置を意味する）で示される。 特に断わり書きのない限り、この明細書におい
てDNA配列のＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式： 【式】および 【式】 を意味し、5′−末端Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式： および を意味し、3′−末端Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式： および を意味する。 以下の実施例において、Ap、Gp、Cp、Tpは
各々式： および を意味し、3′−末端AOH、GOH、COH、TOH
は各々式： および を意味し、5′末端HOAp、HOGp、HOCp、
HOTpは各々式： および を意味し、ABzpo、GiBpo、CBzpo、Tpo、TOは
各々式： および を意味する。DMTrはジメトキシトリチルであ
り、CEはシアノエチルである。 オリゴヌクレオチドのモノ（またはジまたはト
リ）マーは、常法例えば広瀬らの方法［蛋白質・
核酸・酵素25、225（1980）］により調製すること
ができ、カツプリングは、例えばセルロースまた
はポリスチレン・ポリマー上でホスホトリエステ
ル法［ニユークレイツク・アシツド・リサーチ、
９、1691（1981）、ニユークレイツク・アシツド・
リサーチ、10、1755（1982）］により行うことがで
きる。 以下の実施例はこの発明を説明するためのもの
でありこれにより制限されるものではない。 実施例において、使用した酵素（例えば制限酵
素）は市販品で入手可能なものであり、酵素の使
用条件は当業者にとつては、例えば市販の酵素に
添付の用法を参照すれば、自明のことである。 さらに、実施例において「ポリスチレンポリマ
ー」とはアミノメチル化ポリスチレン・HCl、ジ
ビニルベンゼン含量１％、100〜200メツシユ（販
売元ペプチド・インステイテユート・インク）を
意味する。 実施例 １
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTO
Ｈ（AH7）の合成： (1) DMTrOTpoCBzpoTO−スクシニルポリスチ
レンポリマーの合成 (i) HOTO−スクシニルポリスチレンポリマ
ーの調製： 反応用シリンジ中のDMTrO−TO−スク
シニルポリスチレンポリマー（51.8mg、
10.37μモル）［ニユークレイツク・アシツ
ド・リサーチ10、1755（1982）に記載の方法
により調製］に、ジクロロメタン（２ml）中
の５％ジクロロ酢酸（DCA）溶液を加える。
１分間放置した後、混合物を窒素気流でガラ
スフイルターを通し濾過する。DCA処理を
２回以上繰り返す。ポリマーをジクロロメタ
ン（２ml×３）、メタノール（２ml×３）お
よびピリジン（２ml×３）で順次洗浄し、窒
素気流で乾燥して、ポリマー付加物を得
る。 (ii) DMTrOTpoCBzpo−の調製： 蛋白質・核酸・酸素25、225（1980）に記載
の方法で調製したDMTrOTpoCBzpo−CE
（32.4mg、8.12μモル）を、室温で30分間トリ
エチルアミン−アセトニトリル混液（１：
1v／ｖ、５ml）で処理する。このようにし
て得たホスホジエステルダイマー
（DMTrOTpoCBzpo−）を乾燥し、水はピリ
ジンとの共沸混合物（２ml×２）として分離
する。 (iii) カツプリング： ダイマー（DMTrOtpoCBzpo−）とメシチ
レンスルホニルニトロチアゾリド（MSTN）
（80mg）をピリジン（0.5ml）に溶解する。溶
液をポリマー付加物とともに反応用シリン
ジに加え混合物を室温で１時間振盪する。反
応混合物を窒素気流でガラスフイルターを通
して濾過し、ピリジン（２ml×３）で洗浄
し、ポリマー付加物を得る。 (iv) 反応していない5′−ヒドロキシ基のアセチ
ル化： 上記で得られたポリマー付加物に、ピリ
ジン（0.9ml）および無水酢酸（0.1ml）を加
え、混合物を15分間振盪する。反応液をガラ
スフイルターを通して濾過し、得られたポリ
マーをピリジン（２ml×３）、メタノール
（２ml×３）およびジクロロメタン（２ml×
３）で順次洗浄し、窒素気流で乾燥する。こ
のポリマー付加物（DMTrOTpoCBzpoTO−
スクシニルポリスチレンポリマー）は次のカ
ツプリング工程に使用した。 (2) DMTrOTpoCBzpoCBzpotTpoCBzpoTO−ス
クシニルポリスチレンポリマーの合成： 上記(1)と同様の条件で、DMTrOTPoCBz
poTO−スクシニルポリスチレンポリマーの
DMTrOTpoCBzpoCBzpoCE（44.9mg）より
DMTrOTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−スクシ
ニルポリスチレンポリマーを合成する。 (3) DMTrOABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoCBz
poTpoCBzpoTO−スクシニルポリスチレンポ
リマーの合成： 上記(1)と同様の条件で、DMTrOTpoCBz
poCBzpoTpoCBzpoTO−スクシニルポリスチレ
ンポリマーとDMTrOABzpoGiBpoABzpoCE
（48.5mg）より、DMTrOABzpoGiBpoABz
poTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−スクシニル
ポリスチレンポリマーを合成する。 (4) DMTrOCBzpoGiBpoTpoABzpoGiBpoABz
poTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−スクシニル
ポリスチレンポリマーの合成： 上記(1)と同様の条件で、DMTrOABzpoGiB
poABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−スクシ
ニルポリスチレンポリマーとDMTrOCBzpoGiB
poTpoCE（45.1mg）より、DMTrOCBzpoGiB
poTpoABzpoGBzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBz
poTO−スクシニルポリスチレンポリマーを合
成する。 (5) DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABz
poGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−
スクシニルポリマーの合成： 上記(1)と同様の条件で、DMTrOCBzpoGiB
poTpoABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoTpoCBz
poTO−スクシニルポリスチレンポリマーと
DMTrOCBzpoTpoGiBpoCE（45.1mg）より、
DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABz
poGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−
スクシニルポリスチレンポリマー（60mg）を合
成する。この最終工程で、反応していない5′−
ヒドロキシ基は、アセチル基で保護する必要は
ない。 (6)
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpT
ＯＨの合成： DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABz
poGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−
スクシニルポリスチレンポリマー（60mg）を、
封管中、37℃で、1M、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テト
ラメチレングアニジウム・ピリジン−２−アル
ドキシメート［ジオキサン−水（１：1v／ｖ、
１ml）中］で20時間処理する。反応混合物に28
％（ｗ／ｗ）アンモニア水（12ml）を加え、混
合物を60℃で５時間加熱する。固体ポリマーを
濾別し、水（10ml）で洗浄する。濾液と洗液を
蒸発乾固し、残渣を室温で80％酢酸水溶液（25
ml）で15分間処理する。溶媒を除去した後、残
渣を0.1M炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液
（PH7.5、25ml）に溶解し、ジエチルエーテル
（３×25ml）で洗浄する。水層を蒸発乾固し、
残渣を0.1M炭酸トリエチルアンモニウム緩衝
液（PH7.5、２ml）に溶解すると、溶液中に粗
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpT
ＯＨが得られる。 (7)
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpT
ＯＨの精製 (i) 粗生成物の最初の精製はバイオゲルP2（バ
イオラツド）（24×2.6cmID）カラムクロマト
グラフイにより行う。最初の溶出ピークに相
当する画分（0.1ｍMEDTAを含有する50ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム、流速：１ml／分）を集
め、凍結乾燥して最初の精製物を得る。 (ii) 最初の精製物の２回目の精製はCDR−10
（三菱化成）（25cm×4.6mmID）を用いた高速
液体クロマトグラフイ（HPLC）により1M
酢酸アンモニウム−10％（ｖ／ｖ）含水エタ
ノールから4.5M酢酸アンモニウム−10％
（ｖ／ｖ）含水エタノールまでの直線勾配
（80分間、流速：１ml／分、60℃）を用いて
行い、２回目の精製物を得る。 (iii) ２回目の精製物の第３回目の精製は逆相
HPLC［Rp−18−5μ（×77）（メルク）、15cm
×４mmID］により、0.1M酢酸アンモニウム
から0.1M酢酸アンモニウム−15％（ｖ／ｖ）
アセトニトリル水溶液までの直線勾配（40分
間、1.5ml／分、室温）を用いて行い、最終
精製物を得る。 （
HOCpTPGpCpGpTpApGpApTpCpCPTpCpTO
Ｈ (8) オリゴヌクレオチド
（
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpT
ＯＨ）の分析 (i) ホスホジエステラーゼによる消化
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpC
ｐＴＯＨ（10μｇ、5.1μ）、0.2M MgCl2（20μ
）、0.2M Tris−HCl（PH8.5）（20μ）およ
び0.1ｍＭ EDTA（144.9μ）の混合物をホ
スホジエステラーゼ（10単位、10μ）で37
℃で20分間処理し、次いで100℃で２時間加
熱する。 (ii) HPLC分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドは
HPLC［CDR−10（三菱化成）、25cm×4.6mm
ID］により水〜2.0M酢酸アンモニウム（PH
3.4）の直線勾配（40分間、流速：1.5ml／
分、60℃）を用いて分析する。標準品の面積
と比較することにより、各ピーク面積からそ
のヌクレオチド組成を決定する。 計算値：pCOH4.000、pAOH2.000、
pTOH5.000、 pGOH3.000 実測値：pCHO3.770、pAOH2.026、
pTOH5.237、 pGOH2.968 実施例 ２ オリゴヌクレオチドの合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方
法と同様にして製造する。 【表】 実施例 ３ オリゴヌクレオチドの合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方
法と同様に製造する。 【表】 【表】 実施例 ４ オリゴヌクレオチドの合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方
法と同様にして製造する。 【表】 実施例 ５ 合成trpプロモータ遺伝子の構築およびクロ
ーニング（第６，７図に示す）： trpプロモーター遺伝子を実施例７に記載の
方法と同様の方法（第６図に示す）で構築する。
合成遺伝子はpBR322（宝酒造、NEB等より市販
品として入手できる）のEcoRI−BamHI断片と
ライゲートし、続いてE.coli HB101
（ATCC33694）をライゲーシヨン生成物で形質転
換する。RAmpでかつSTetの形質転換体から得た
プラスミドをHpaIで消化してポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（PAGE）でバンド（4.1kpP）
を確認し、続いてBamHIで消化し、PAGEで
90b.p.のバンドを確認した。さらに、EcoRI−
BamHI消化による56b.p.の断片はPAGEでサイ
ズマーカーと比較することにより確認した。この
プラスミドをpTrpEB7と命名し、発現ベクター
の構築に使用した。 実施例 ６ trpプロモーターベクター（pBR322trp）の構
築およびクローニング（第８図に示す）： プラスミドpBR322（9μｇ）をEcoRIおよび
BamHI制限エンドヌクレアーゼで消化する。65
℃で５分間加熱して反応を停止させ、0.8％アガ
ロースゲル電気泳動により断片を分離し、375b.
p.の小さい断片（500nｇ）を得る。一方、プラス
ミドpTrpEB7（10μｇ）をEcoRIおよびBamHIで
消化し、続いて調製ゲル電気泳動を行い、4094b.
p.の大きな断片（5μｇ）を得る。pTrpEB7の
EcoRI−BamHI断片（4094b.p.、200μｇ）を、
pBR322のEcoRI−BamHI断片（375b.p.、100n
ｇ）と、T4リガーゼ（宝酒造、360単位）を含有
するライゲーシヨンバツフアー［50ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）、10ｍＭ MgCl2、20ｍＭ DTT、
１ｍＭ ATP、１ｍＭスペルミジン、50μｇ／ml
BSA］（20μ）中、15℃で、一晩、ライゲート
する。このライゲーシヨン混合物でE.coliHB101
をKushinerの方法［T.Maniatisら、モルキユラ
ー・クローニング、p252（1982）、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー］により形質
転換し、テトラサイクリン（25μｇ／ml）を含有
するプレート上にテトラサイクリンに耐性の形質
転換体を得る。形質転換体より単離されたプラス
ミドpBR322trpをEcoRI−BamHI（375b.p.、
4094b.p.）およびHpaI（4469b.p.）で消化し、7.5
％PAGEおよび0.8％アガロースゲル電気泳動に
よりtrpプロモーター遺伝子を確認した。 実施例 ７ 合成trpプロモーター遺伝子の構築（第９図
に示す）： ブロツク′、″および′の各オリゴヌクレ
オチド（Ｂ−M′）（各2.0nモル）を、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ（BRL、2.5単位）を用い、ラ
イゲシヨンバツフアー（70μ）中、37℃で、１
時間ホスホリル化する。各ブロツクの反応混合物
にT4DNAリガーゼ（300単位）および20ｍ
MATP（2μ）を加え、混合物を15℃で30分間イ
ンキユベートした後、65℃で10分間加熱して反応
を停止させる。これらの各ブロツク（′、′お
よび′）の反応混合物を合わせ、T4DNAリガ
ーゼ（360単位）および20ｍＭ ATP（2μ）の
存在下にホスホリル化していないオリゴヌクロレ
オチド（Ａ、N′）と混合する。混合物を15℃で
１時間インキユベートした後、最終ライゲーシヨ
ン生成物を２〜16％の勾配のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（PAGE）により精製し、106b.p.
の合成trpプロモーター遺伝子を得る。 実施例 ８ ダブルtrpプロモーターベクター（p322dtrpS）
の構築およびクローニング（第１０図に示す）： プラスミドpBR322trpをEcoRIおよびClaIで消
化し、続いて調製アガロースゲル電気泳動を行い
4446b.p.の大きな断片を得る。この断片（4446b.
p.）を実施例７で得たtrpプロモーター遺伝子
（106b.p.）とT4DNAの存在下にライゲートする。
このライゲーシヨン混合物でE.coliHB101を形質
転換し、アンピシリンおよびテトラサイクリンに
耐性の形質転換体を得る。この形質転換体より得
られたプラスミドp322dtrpSを、制限エンドヌク
レアーゼ分析によつて確認した。ClaI−BamHI
（325b.p.）、HpaI（107b.p.）およびAat−ClaI
（287b.p.）。 実施例 ９ 合成trpプロモーターのDNA断片の一部を持
つペプチドCd遺伝子の構築（第１１図および第
１２図に示す）： ブロツク″、″および″の各オリゴヌクレ
オチド（0.2nモル）（Np1−Cd8、実施例４に示
す）を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（2.5単
位）を用い、ライゲーシヨンバツフアー（60μ
）中、37℃で、１時間ホスホリル化する。各ブ
ロツクの反応混合物にT4DNAリガーゼ（360単
位）および20ｍMATP（2μ）を加え、混合物を
15℃で１時間インキユベートする。この各ブロツ
クの反応混合物を合わせ、T4DNAリガーゼ
（360単位）および20ｍMATP（2μ）と共に、15
℃で、一晩、インキユベートし、続いて80℃で10
分間加熱する。混合物に500ｍＭ塩化ナトリウム
水溶液（20μ）およびEcoRI（20単位）を加え
る。37℃で２時間インキユベートした後、最終ラ
イゲーシヨン生成物を15％のPAGEで精製し、合
成trpプロモーターのDNA断片の一部を持つペ
プチドCd遺伝子を得る。このDNA配列を第１２
図に示す。 実施例 10 プラスミドpCdγの構築およびクローニング
（第１３図に示す）： プラスミドpγtrp（4544b.p.）（このプラスミド
を含有するE.coli Ｆ−９がFERM BP−905とし
て微工研に寄託されている。英国特許出願公開番
号第2164650号参照）をHpaIおよびEcoRIで消化
し大きな断片（4510b.p.）を得る。これを実施例
９で得た合成trpプロモーターのDNA断片の一
部も持つペプチドCd遺伝子とT4DNAリガーゼ
の存在下にライゲートする。このライゲーシヨン
混合物を用いてE.coliHB101を形質転換させる。R
Ampの形質転換体より得られるプラスミド
（pCdγ）を制限エンドヌクレアーゼ分析席により
確認した。ClaI−BamHI（543b.p.）、ClaI−Hind
（273b.p.）、ClaI−EcoRI（93b.p.）およびAat
−ClaI（180b.p.）。 実施例 11 プラスミドpCdγtrpSdの構築およびクローンニ
ング（第１４図に示す）： プラスミドpCdγをClaIおよびBamHIで消化し
た小さな断片（543b.p.）を得、これをp322dtrpS
（実施例７）のClaI−BamHI断片（4223b.p.）と
T4DNAリガーゼの存在下にライゲートする。こ
のライゲーシヨン混合物でE.coliHB101を形質転
換する。RAmpの形質転換体より得られるプラス
ミド（pCdγtrpSd）を制限エンドヌクレアーゼ分
析により確認した。HpaI−BamHI（1075、575b.
p.）、ClaI−BamHI（543b.p.）、PstI−EcoRI
（1057b.p.）、EcoRI−BamHI（450b.p.）、Hind
−BamHI（270b.p.）およびClaI−Hiand）
273b.p.）。 実施例 12 リンカーDNAを持つα−hANP遺伝子の調製
（第１５図に示す）： ブロツクおよびの各オリゴヌクレオチ
ド（AH2−AH17）（各0.2モル）を、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ（2.5単位）を用い、ライゲー
シヨンバツフアー（70μ）中、37℃で、１時
間、ホスホリル化する。各ブロツクの反応混合物
にT4DNAリガーゼ（300単位）および20ｍＭ
ATP（2μ）を加え、混合物を15℃で30分間イン
キユベートする。65℃で10分間加熱して反応を停
止させる。二つのブロツク（および）の
反応混合物を合わせ、T4DNAリガーゼ（300単
位）および20ｍＭ ATP（2μ）の存在下に、ホ
スホリル化してないオリゴヌクレオチド（AH1、
AH18）と混合する。混合物を15℃で１時間イン
キユベートした後、最終ラインゲーシヨン生成物
を２〜16％の勾配のPAGEにより精製し、リンカ
ーDNAを持つ134b.p.のα−hANP遺伝子を得る
（第５図に示す）。 実施例 13 α−hANP発現ベクターpCLaHtrpSdの構築お
よびクローニング（第１６図に示す）： プラスミドpCdγtrSdをHindおよびBamHI
で消化し大きな断片（4743b.p.）を得、これをリ
ンカーDNAを持つα−hANP遺伝子（134b.p.）
とT4DNAリガーゼの存在下にライゲートする。
このライゲーシヨン混合物を用いてE.coliHB101
を形質転換し、形質転換体Ｅ、coliH1を得る。R
Amp（E.coliH1）の形質転換体より得られるプラ
スミド（pCLaHtrpSd）［CLa蛋白（ペプチド
CLa融合α−hANP蛋白）遺伝子を含有してお
り、そのDNA配列は第１７図に示す］を制限エ
ンドヌクレアーゼ分析によつて確認した。Aat
−ClaI（287b.p.）、ClaI−BamHI（407b.p.）、ClaI
−EcoRI（93、198b.p.）、EcoRI−BamHI（116、
198b.p.）、Hind−BamHI（134b.p.）および
HpaI−BamHI（107、439b.p.）。 実施例 14 ペプチドCLa融合α−hNAP（CLaH蛋白）を
コードする遺伝子の発現： アンピシリン50μｇ／ml含有Ｌブロス（20ml）
中で一晩培養した、発現ベクター（プラスミド
pCLaHtrpSd）含有のE.coliH1の培養物を、0.2
％グルコース、0.5％カザミノ酸（カゼイン加水
分解物）、50μｇ／mlビタミンB1および25μｇ／ml
アンピシリン含有Ｍ−９培地（400ml）で希釈し、
このE.coliを37℃で培養する。培養液のA600
（600nｍの吸光度）が0.5となつた時にβ−インド
ールアクリル酸（２mg／mlエタノール、２ml）を
加え、細胞を３時間インキユベートする（最終Ａ
＝600＝1.85）。次に菌体を遠心分離（6000rpm、
４℃、５分間）により集める。 実施例 15 α−hANPの分離および精製： (1) ペプチドCLa融合α−hANP（CLaH蛋白）
の分離および精製： 実施例14で調製した培養液（600ml）より得
られる湿潤菌体ペーストを10ｍＭ PBS−
EDTA（PH7.4）［１リツトル中NaCl（8.0ｇ）、
KCl（0.2ｇ）、Na2HPO4・12H2O（2.9ｇ）、
KH2PO4（0.2ｇ）、EDTA（3.73ｇ）］８mlに懸濁
し、細胞を０℃で超音波処理して破壊する。
15000rpmで20分間（４℃）遠心分離してペレ
ツトを集め、これを6Mグアニジン−HCl、10
ｍＭ PBS−EDTAおよび２ｍMβ−メルカプ
トエタノールの混合物８mlに懸濁し、懸濁液を
０℃で超音波処理する。この懸濁液を
15000rpmで20分間（４℃）遠心分離し、上清
をフツ化ｐ−ニトロフエニルメチルスルホニル
（PMSF）含有10ｍＭ PBS−EDTA溶液に対
し４℃で一晩透析する。透析画分を遠心分離
（15000rpm、４℃、20分間）した後、ペレツト
を6Mグアニジン−HCl、10ｍＭ EDTAおよ
び10ｍＭジチオスレイトール含有の100ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH8.0）（８ml）に溶かし、
溶液を一晩放置する。この溶液を10ｍM2−メ
ルカプトエタノール含有1M酢酸（0.5リツト
ル）を用い２回透析し、トリスアミノメタンで
PH8.0に調整する。得られる沈殿（融合蛋白；
15.2mg）を遠心分離（3000rpm、10分間）によ
り集め、10ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（PH5.0）
で洗浄する。 (2) アクロモバクター・プロテアーゼ（AP）
によるペプチドCLa融合α−hANPからのペプ
チドCLaの脱離： 前記で得た融合蛋白を8M尿素を含有する10
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（PH5.0）（30ml）に
懸濁し、懸濁液をアクロモバクター・プロテア
ーゼ（AP）（0.25単位）（和光純薬）と共
に、37℃で、２時間、インキユベートする。反
応混合物を蒸留水（30mlで希釈し、トリスアミ
ノメタンでPH9.0に調整し、次いでAP（0.25
単位）をさらに加え、37℃で２時間インキユベ
ートする。反応液を10ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（PH7.0）（120ml）で希釈し、酢酸でPH７
に調整する。この溶液を10ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（PH7.0）で平衡化したSp−セフアデ
ツクスＣ−25カラム（15ml）にかける。カラム
は同じ緩衝液で洗浄し、0.5M塩化ナトリウム
水溶液を含有する10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（PH8.0）で溶出し、部分精製されたα−
hANP（0.4mg）含有画分を集める。 (3) 高速液体クロマトグラフイ（HPLC）： 前記(2)と同様にして得られプールしておいた
画分を減圧濃縮し、水（300ml）に対し透析し、
逆相HPLCで精製して、純粋なα−hANP（0.3
mg）を得る。 HPLC条件 （調製） カラム：半調製用ベツクマンウルトラポア
（φ10×250mm） 流速：2.5ml／分 溶出：0.01Mトリフルオロ酢酸中10％から60％
までのアセトニトリルの直線勾配；50分間 検出：214nｍにおける吸光度 （分析） カラム：ベツクマンウルトラポア（RPSC
（φ1.6×75mm） 流速：１ml／分 溶出：調製と同条件 保持時間：11.9分 この実施例により得られたα−hANPの
HPLC上での保持時間はα−hANP標準品（販
売：船越）のそれと一致した。 (4) α−hANPのアミノ酸分析 試料を還元、カルボキシメチル化し、次いで
6N塩酸で、110℃で、24時間加水分解する。α
−hANPのアミノ酸組成はウオーターズ社製ア
ミノ酸分析システムを用いて求めた。 α−hANPのアミノ酸組成（１モル当りの残
留物）は計算値と一致した。 (5) α−hANPのアミノ酸配列分析 α−hANPのＮ末端アミノ酸配列をエドマン
法（DABITC法）［FEBSレターズ、93、205
（1978）に記載］により決定し、Ｎ−末端Ser
およびLeu配列を確認した。Ｃ末端アミノ酸
（Ser−Phe−Arg−Tyr）はカルボキシペプチ
ダーゼにより消化しそれに続いてウオーターズ
社製アミノ酸分析システムを用いるアミノ酸分
析を行つて決定した。次いで、実施例で得られ
たα−hANPの全アミノ酸配列は両方の方法を
用いて決定され、α−hANPが得られているこ
とが確認された。 実施例 16 プラスミドpBR322trpSsの構築およびクロー
ニング（第１８図に示す）： プラスミドpBR322をEcoRIおよびClaIで消化
する。大きな断片（4340b.p.）を0.8％アガロース
ゲル電気泳動により精製し、T4DNAリガーゼお
よび１ｍＭ ATPの存在下に合成trpプロモータ
ー遺伝子とライゲートする。このライゲーシヨ
ン混合物を用いてE.coli HB101を形質転換する。
プラスミドDNA（pBR322trpSs）を形質転換した
クローンより分離し、制限エンドヌクレアーゼ分
析により定性解析する。 分析データ：Hpa ；4445bp、ClaI−Pst
；834bp 実施例 17 プラスミドpCLaHtrp−２の構築およびクロー
ニング（第１９図に示す）： プラスミドpCLaHtrpSdをClaIおよびBamHI
で消化する。小さな断片（407b.p.）を単離する。
一方、pBR322trpSsをClaIおよびBamHIで消化
する。大きい断片（4093b.p.）を分離し、前記
DNA（407b.p.）とライゲートする。このライゲ
ーシヨン混合物によりE.coliHB101を形質転換さ
せた後、所望のプラスミド（pCLaHtrp−２）を
形質転換したクローンより単離し、制限エンドヌ
クレアーゼ分析により確認した。ClaI−PstI
（834b.p.）、ClaI−BamHI（407b.p.）。 実施例 18 オリゴヌクレチドの合成： 実施例１の方法に準じて、下記のオリゴクレオ
チドを調製する。 (1)
HOGpApTpCpCpTpCpGpApGpApTpCpApAO
Ｈ （T1） (2)
HOGpCpCpTpTpTpApApTpTpGpAptpCpTp
ＣｐＧｐＡｐＧＯＨ （T2） (3)
HOTPTpApApApGpGpCpTpCpCpTpTpTpTp
ＧｐＧｐＡＯＨ （T3） (4)
HOApApApApApGpGpCpTpCpCpApApApAp
ＧｐＧｐＡＯＨ （T4） (5)
HOGpCpCpTpTpTpTpTpTpTpTpTpTpGOH
（T5） (6) HOTpCpGpApCpApApApApAOH （T6） 実施例 19 合成fdフアージ・ターミネーターの構築および
クローニング（第２０図および第２１図に示
す）： 実施例７に記載の方法と同様にして合成fdフア
ージ・ターミネーターを構築する（第２０図に示
す）。 即ち、DNAオリゴマーT2、T3、T4およびT5
（各0.4nモル）を混合し、１ｍＭ ATPの存在下
にT4ポリヌクレオチドキナーゼでホスホリル化
する。反応混合物を65℃で10分間加熱して酵素を
不活性化する。得られた混合物にDNAオリゴマ
ーT1およびT6（各0.8nモル）とT4DNAリガーゼ
を加える。混合物を15℃で30分間インキユベート
し、２〜16％の勾配のポリアクリルアミドゲル電
気泳動に付し、所望のDAN断片（47b.p.）を電
気溶出により回収し、BamHIおよびSalIで消化
したpBR322の大きい断片（4088b.p.）に挿入と
ライゲートする。このライゲーシヨン混合物によ
りE.coliHB101を形質転換させた後、所望のプラ
スミド（pter21）形質転換したクローンより単離
した。制限酵素分析：BamHI−SalI（47b.p.）、
AvaI（817b.p.）。 実施例 20 α−hANP発現ベクタープラスミド
pCLaHtrp3tの構築およびクローニング（第２２
図に示す）： プラスミドpCLaHtrp−２をPstIおよび
BamHIで消化する。この消化混合物より小さい
断片（1241b.p.）を単離し、pter21をPstIおよび
BamHIで消化して得られたpter21の大きな断片
（3005b.p.）にライゲートする。 このライゲーシヨン混合物でE.coliHB101を形
質転換して形質転換体E.coliH2を得る。RAmpの
形質転換体（E.coli H2）より得られたプラスミ
ドCLaHtrp3t（CLaH蛋白遺伝子を含有する）を
制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。
ClaI−EcoRI（93b.p.、198b.p.）、Hind−
BamHI（134b.p.）およびPstI−ClaI−Xho
（834b.p.、411b.p.）。 実施例 21 E.coli H2を用いたα−hANPの製造： E.coli H1の代りにE.coli H2を用いて実施例
14および15と同じ方法でα−hANPを得る。 このようにして得たα−hANPのアミノ酸配列
はアミノ酸配列分析の結果既知のα−hANPのそ
れと一致していることが確認された。
ポリペプチド（α−human atrial natriuretic
polypeptide、以下“α−hANP”と略称する）
の新規な融合蛋白に関する。さらに詳細には、Ｃ
末端がリジンである保護ペプチドと該リジンを介
して融合したα−hANPおよび、それからα−
hANNPを製造する方法に関するものである。 従来の技術およびこの発明が解決しようとする問
題点 α−hANPは、利尿作用、ナトリウム排泄増加
作用、および降圧作用を有する公知のポリペプチ
ドであり、利尿降圧剤として有用であり、 なる構造を有する（バイオケミカル・アンド・バ
イオフイジカル・リサーチ・コミニユケーシヨン
ズ第118巻、第131ページ（1984年）参照）。 そして、このα−hANPを収率よく製造する方
法が望まれていた。 発明の構成および効果 この発明者等はＣ末端がリジンである保護ペプ
チドと該リジンを介して融合したα−hANPをコ
ードする遺伝子を含有する発現ベクターを用いる
組換えDNA技術によるα−hANPの製造法を新
たに創出した。この方法によると、α−hANPを
高収率で得ることができる。 この発明では、(1)Ｃ末端がリジンである保護ペ
プチドと該リジンを介して融合したα−hANPの
アミノ酸配列をコードする遺伝子を含有する発現
ベクターにより形質転換された微生物を培地に培
養し、(2)得られる培養物より該保護ペプチド融合
α−hANPを採取し、(3)該保護ペプチド融合α−
hANPの保護ペプチド部分をアクロモバクター・
プロテアーゼ（API）の存在下に除去すること
によりα−hANPが製造される。 以下に、上記製造法における詳細をさらに詳し
く説明する。 形質転換される微生物は宿主細胞のことであ
り、細胞、真菌、ヒトおよび動物培養細胞および
植物培養細胞を挙げることができる。微生物の好
ましい例としては、細菌、特に例えばE.
coliHB101（ATCC33694）、E.coli294
（ATCC31446）、E.colix1776（ATCC31537）等の
エシエリヒア属に属する菌株を挙げることができ
る。 発現ベクターは、通常少くともプロモーター・
オペレーター領域、開始コドン、合成保護ペプチ
ド遺伝子、合成α−hANP遺伝子、終止コドンお
よび複製可能なユニツトを有するDNAより成る。 プロモーター・オペレーター領域は、プロモー
ター、オペレーターおよび例えばAAGG等のシ
ヤイン−ダルガーノ（SD）配列を含有する。SD
配列−開始コドン間の距離は、好ましくは８〜12
塩基対（b.p.）であり、後記実施例に示されるよ
うな最も好ましい例においては、SD配列−開始
コドン間の距離は11b.p.である。プロモーター・
オペレーター領域の例としては、合成プロモータ
ー・オペレーター領域の他に、例えばラクトー
ス・オペロン、PL−プロモーター、trp−プロモ
ーター等の通常用いられるプロモーター・オペレ
ーター領域を挙げることができる。プロモータ
ー・オペレーター領域の好ましい例は、この発明
者等が新らたに合成した合成trpプロモーター、
、およびがあり、そのDNA配列を各々第１
図、第２図および第３図に示す。この発明の製造
法においては、各発現ベクター毎に１〜３連のプ
ロモーター・オペレーター領域を使用してもよ
い。 好ましい開始コドンとしてはメチオニンコドン
（ATG）を挙げることができる。 保護ペプチド遺伝子としては、α−hANPとの
融合蛋白を形成することができ、且つ宿主細胞ま
たは培養物中の融合蛋白の望ましくない分解を抑
制するペプチドまたは蛋白のアミノ酸配列に対応
するDNA配列を有する遺伝子が挙げられる。 その好ましい例は「LH蛋白遺伝子」に連結さ
れた「ペプチドCd遺伝子」（以下、「LH蛋白遺伝
子を連結したペプチドCd遺伝子」を「ペプチド
CLa遺伝子」と呼ぶ）であり、そのDNA配列を
第４図に示す。 α−hANP遺伝子のDNA配列は、α−hANP
のアミノ酸配列から、多数の項目の非自明な基準
に従つてデザインされる。α−hANP遺伝子の好
ましいDNA配列の例を第５図に示す。後記実施
例においては、α−hANP遺伝子と保護ペプチド
遺伝子との間に、アミノ酸リジンをコードする
DNA配列を挿入した。 このようにすると、融合蛋白の接合部をアクロ
モバクター・プロテアーゼで切断することがで
きる。 終止コドンとしては、例えばTAG、TGA等の
通常に用いられる終止コドンを挙げることができ
る。 複製可能なユニツトとは、宿主細胞中で、それ
に属するDNA配列全体を複製することができる
DNA配列のことであり、天然プラスミド、例え
ば天然プラスミドより調製したDNA断片等の人
工修飾プラスミドおよび合成プラスミドを挙げる
ことができる。さらにプラスミドの好ましい例と
しては、プラスミドpBR322またはその人工修飾
体（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られ
るDNA断片）を挙げることができる。複製可能
なユニツトは天然または合成ターミネーター（例
えば合成fdフアージ・ターミネーター等）を包含
してもよい。 プロモーター・オペレーター領域、開始コド
ン、Ｃ末端がリジンである保護ペプチド遺伝子、
α−hANP遺伝子、終止コドン、ターミネーター
等を合成する場合には、その合成法はポリヌクレ
オチドの製造に通常用いられる公知の方法で行う
ことができる。 プロモーター・オペレーター遺伝子、開始コド
ン、Ｃ末端がリジンである保護ペプチド遺伝子、
α−hANP遺伝子および終止コドンは、所望であ
れば適当なDNA断片（例えばリンカー、その他
の制限酵素作用部位等）を用いて、常法（例えば
制限酵素による消化、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いるホスホリル化、T4DNAリガーゼを
用いるライゲーシヨン等）により、適当な複製可
能なユニツト（プラスミド）と連続且つ環状に連
結して、発現ベクターを得ることができる。 発現ベクターは常法により微生物（宿主細胞）
に挿入することができる。挿入は、例えば形質転
換、マイクロ・インジエクシヨン等の常法によつ
て行えば、形質転換体を得ることができる。 この発明の製法においてα−hANPを製造する
には、このようにして得た発現ベクターを含有す
る形質転換体を培地に培養することにより行なわ
れる。 培地としては、形質転換体が増殖するものであ
ればよく例えばグルコース、グリセリン、マンニ
トール、フルクトース、ラクトース等の炭素源お
よび例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、カゼインの加水分解物、酵母エキス、ポリペ
プトン、バクトトリプトン、ビーフエキス等の窒
素源を含有するのが通例であり、所望により、例
えばリン酸二水素ナトリウムまたはカリウム、リ
ン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウム、塩化カルシウム等の無機塩、例えば
ビタミンB1等のビタミン、例えばアンピシリン
等の抗生物質等の他の成分も培地に加えてよい。 形質転換体の培養は、通常、PH5.5〜8.5（好ま
しくはPH７〜7.5）、18〜40℃（好ましくは25〜38
℃）で５〜50時間行われる。 このように製造されたＣ末端がリジンである保
護ペプチドと該リジンを介して融合したα−
hANPは通常培養された形質転換体の細胞中に存
在するので、細胞を濾過あるいは遠心分離によつ
て集め、その細胞壁および／または細胞膜を常法
（例えば超音波および／まははリゾチームによる
処理等）により破壊し、破壊細胞を得る。この破
壊物より、天然または合成蛋白の精製および単離
に通常用いられる常法（例えば8M尿素水溶液、
6Mグアニジン等の適当な溶媒による蛋白の溶解、
透析、ゲル濾過、カラムクロマトグラフイー、高
速液体クロマトグラフイー等）でＣ末端がリジン
である保護ペプチドと該リジンを介して融合した
α−hANPを精製および単離することができる。 α−hANPは、保護ペプチド融合α−hANP
を、アクロモバクター・プロテアーゼ（API）
による処理により切断して調製することができ
る。APIは既知の酵素である［ビオキミカ・エ
ト・ビオフイジカ・アクタ、660、51（1981）］が、
組換えDNA技術により調製された融合蛋白を
API処理により好ましく切断することができるこ
とは知られていない。この方法は保護ペプチドと
その分子内にリジンを有しない目的ペプチドとの
間にリジンを有するペプチドよりなる融合蛋白の
切断に好適に用いることができる。 融合蛋白の切断は、PH５〜10、20〜40℃（好ま
しくは35〜40℃）で、例えば緩衝液、尿素水溶液
等の水溶液中で２〜15時間行えばよい。 後記実施例において、融合蛋白は、先ず8M尿
素を含有するPH５の緩衝液中、次いで4M尿素を
含有するPH９の緩衝液中でAPIにより処理され
る。この条件下では融合蛋白はリジン部位におい
て切断され、産生したα−hANPは自然に再構成
される。 このように産生されたα−hANPは、得られた
培養物より、上記の常法で精製、単離される。 以下に、この明細書に添付した図について説明
する。 図中の若干のものにおいては、オリゴヌクレオ
チドは――、〓〓または〓〓の記号（記号中、・
はT4ポリヌクレオチドキナーゼによりホスホリ
ル化された5′−末端を意味する）で示され、ブロ
ツクされたオリゴヌクレオチドは――、〓〓、〓
〓、〓〓、〓〓または〓〓の記号（記号中、△は
ライゲートされた位置を意味する）で示される。 特に断わり書きのない限り、この明細書におい
てDNA配列のＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式： 【式】および 【式】 を意味し、5′−末端Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式： および を意味し、3′−末端Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式： および を意味する。 以下の実施例において、Ap、Gp、Cp、Tpは
各々式： および を意味し、3′−末端AOH、GOH、COH、TOH
は各々式： および を意味し、5′末端HOAp、HOGp、HOCp、
HOTpは各々式： および を意味し、ABzpo、GiBpo、CBzpo、Tpo、TOは
各々式： および を意味する。DMTrはジメトキシトリチルであ
り、CEはシアノエチルである。 オリゴヌクレオチドのモノ（またはジまたはト
リ）マーは、常法例えば広瀬らの方法［蛋白質・
核酸・酵素25、225（1980）］により調製すること
ができ、カツプリングは、例えばセルロースまた
はポリスチレン・ポリマー上でホスホトリエステ
ル法［ニユークレイツク・アシツド・リサーチ、
９、1691（1981）、ニユークレイツク・アシツド・
リサーチ、10、1755（1982）］により行うことがで
きる。 以下の実施例はこの発明を説明するためのもの
でありこれにより制限されるものではない。 実施例において、使用した酵素（例えば制限酵
素）は市販品で入手可能なものであり、酵素の使
用条件は当業者にとつては、例えば市販の酵素に
添付の用法を参照すれば、自明のことである。 さらに、実施例において「ポリスチレンポリマ
ー」とはアミノメチル化ポリスチレン・HCl、ジ
ビニルベンゼン含量１％、100〜200メツシユ（販
売元ペプチド・インステイテユート・インク）を
意味する。 実施例 １
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTO
Ｈ（AH7）の合成： (1) DMTrOTpoCBzpoTO−スクシニルポリスチ
レンポリマーの合成 (i) HOTO−スクシニルポリスチレンポリマ
ーの調製： 反応用シリンジ中のDMTrO−TO−スク
シニルポリスチレンポリマー（51.8mg、
10.37μモル）［ニユークレイツク・アシツ
ド・リサーチ10、1755（1982）に記載の方法
により調製］に、ジクロロメタン（２ml）中
の５％ジクロロ酢酸（DCA）溶液を加える。
１分間放置した後、混合物を窒素気流でガラ
スフイルターを通し濾過する。DCA処理を
２回以上繰り返す。ポリマーをジクロロメタ
ン（２ml×３）、メタノール（２ml×３）お
よびピリジン（２ml×３）で順次洗浄し、窒
素気流で乾燥して、ポリマー付加物を得
る。 (ii) DMTrOTpoCBzpo−の調製： 蛋白質・核酸・酸素25、225（1980）に記載
の方法で調製したDMTrOTpoCBzpo−CE
（32.4mg、8.12μモル）を、室温で30分間トリ
エチルアミン−アセトニトリル混液（１：
1v／ｖ、５ml）で処理する。このようにし
て得たホスホジエステルダイマー
（DMTrOTpoCBzpo−）を乾燥し、水はピリ
ジンとの共沸混合物（２ml×２）として分離
する。 (iii) カツプリング： ダイマー（DMTrOtpoCBzpo−）とメシチ
レンスルホニルニトロチアゾリド（MSTN）
（80mg）をピリジン（0.5ml）に溶解する。溶
液をポリマー付加物とともに反応用シリン
ジに加え混合物を室温で１時間振盪する。反
応混合物を窒素気流でガラスフイルターを通
して濾過し、ピリジン（２ml×３）で洗浄
し、ポリマー付加物を得る。 (iv) 反応していない5′−ヒドロキシ基のアセチ
ル化： 上記で得られたポリマー付加物に、ピリ
ジン（0.9ml）および無水酢酸（0.1ml）を加
え、混合物を15分間振盪する。反応液をガラ
スフイルターを通して濾過し、得られたポリ
マーをピリジン（２ml×３）、メタノール
（２ml×３）およびジクロロメタン（２ml×
３）で順次洗浄し、窒素気流で乾燥する。こ
のポリマー付加物（DMTrOTpoCBzpoTO−
スクシニルポリスチレンポリマー）は次のカ
ツプリング工程に使用した。 (2) DMTrOTpoCBzpoCBzpotTpoCBzpoTO−ス
クシニルポリスチレンポリマーの合成： 上記(1)と同様の条件で、DMTrOTPoCBz
poTO−スクシニルポリスチレンポリマーの
DMTrOTpoCBzpoCBzpoCE（44.9mg）より
DMTrOTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−スクシ
ニルポリスチレンポリマーを合成する。 (3) DMTrOABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoCBz
poTpoCBzpoTO−スクシニルポリスチレンポ
リマーの合成： 上記(1)と同様の条件で、DMTrOTpoCBz
poCBzpoTpoCBzpoTO−スクシニルポリスチレ
ンポリマーとDMTrOABzpoGiBpoABzpoCE
（48.5mg）より、DMTrOABzpoGiBpoABz
poTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−スクシニル
ポリスチレンポリマーを合成する。 (4) DMTrOCBzpoGiBpoTpoABzpoGiBpoABz
poTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−スクシニル
ポリスチレンポリマーの合成： 上記(1)と同様の条件で、DMTrOABzpoGiB
poABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−スクシ
ニルポリスチレンポリマーとDMTrOCBzpoGiB
poTpoCE（45.1mg）より、DMTrOCBzpoGiB
poTpoABzpoGBzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBz
poTO−スクシニルポリスチレンポリマーを合
成する。 (5) DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABz
poGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−
スクシニルポリマーの合成： 上記(1)と同様の条件で、DMTrOCBzpoGiB
poTpoABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoTpoCBz
poTO−スクシニルポリスチレンポリマーと
DMTrOCBzpoTpoGiBpoCE（45.1mg）より、
DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABz
poGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−
スクシニルポリスチレンポリマー（60mg）を合
成する。この最終工程で、反応していない5′−
ヒドロキシ基は、アセチル基で保護する必要は
ない。 (6)
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpT
ＯＨの合成： DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABz
poGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO−
スクシニルポリスチレンポリマー（60mg）を、
封管中、37℃で、1M、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テト
ラメチレングアニジウム・ピリジン−２−アル
ドキシメート［ジオキサン−水（１：1v／ｖ、
１ml）中］で20時間処理する。反応混合物に28
％（ｗ／ｗ）アンモニア水（12ml）を加え、混
合物を60℃で５時間加熱する。固体ポリマーを
濾別し、水（10ml）で洗浄する。濾液と洗液を
蒸発乾固し、残渣を室温で80％酢酸水溶液（25
ml）で15分間処理する。溶媒を除去した後、残
渣を0.1M炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液
（PH7.5、25ml）に溶解し、ジエチルエーテル
（３×25ml）で洗浄する。水層を蒸発乾固し、
残渣を0.1M炭酸トリエチルアンモニウム緩衝
液（PH7.5、２ml）に溶解すると、溶液中に粗
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpT
ＯＨが得られる。 (7)
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpT
ＯＨの精製 (i) 粗生成物の最初の精製はバイオゲルP2（バ
イオラツド）（24×2.6cmID）カラムクロマト
グラフイにより行う。最初の溶出ピークに相
当する画分（0.1ｍMEDTAを含有する50ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム、流速：１ml／分）を集
め、凍結乾燥して最初の精製物を得る。 (ii) 最初の精製物の２回目の精製はCDR−10
（三菱化成）（25cm×4.6mmID）を用いた高速
液体クロマトグラフイ（HPLC）により1M
酢酸アンモニウム−10％（ｖ／ｖ）含水エタ
ノールから4.5M酢酸アンモニウム−10％
（ｖ／ｖ）含水エタノールまでの直線勾配
（80分間、流速：１ml／分、60℃）を用いて
行い、２回目の精製物を得る。 (iii) ２回目の精製物の第３回目の精製は逆相
HPLC［Rp−18−5μ（×77）（メルク）、15cm
×４mmID］により、0.1M酢酸アンモニウム
から0.1M酢酸アンモニウム−15％（ｖ／ｖ）
アセトニトリル水溶液までの直線勾配（40分
間、1.5ml／分、室温）を用いて行い、最終
精製物を得る。 （
HOCpTPGpCpGpTpApGpApTpCpCPTpCpTO
Ｈ (8) オリゴヌクレオチド
（
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpT
ＯＨ）の分析 (i) ホスホジエステラーゼによる消化
HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpC
ｐＴＯＨ（10μｇ、5.1μ）、0.2M MgCl2（20μ
）、0.2M Tris−HCl（PH8.5）（20μ）およ
び0.1ｍＭ EDTA（144.9μ）の混合物をホ
スホジエステラーゼ（10単位、10μ）で37
℃で20分間処理し、次いで100℃で２時間加
熱する。 (ii) HPLC分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドは
HPLC［CDR−10（三菱化成）、25cm×4.6mm
ID］により水〜2.0M酢酸アンモニウム（PH
3.4）の直線勾配（40分間、流速：1.5ml／
分、60℃）を用いて分析する。標準品の面積
と比較することにより、各ピーク面積からそ
のヌクレオチド組成を決定する。 計算値：pCOH4.000、pAOH2.000、
pTOH5.000、 pGOH3.000 実測値：pCHO3.770、pAOH2.026、
pTOH5.237、 pGOH2.968 実施例 ２ オリゴヌクレオチドの合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方
法と同様にして製造する。 【表】 実施例 ３ オリゴヌクレオチドの合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方
法と同様に製造する。 【表】 【表】 実施例 ４ オリゴヌクレオチドの合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方
法と同様にして製造する。 【表】 実施例 ５ 合成trpプロモータ遺伝子の構築およびクロ
ーニング（第６，７図に示す）： trpプロモーター遺伝子を実施例７に記載の
方法と同様の方法（第６図に示す）で構築する。
合成遺伝子はpBR322（宝酒造、NEB等より市販
品として入手できる）のEcoRI−BamHI断片と
ライゲートし、続いてE.coli HB101
（ATCC33694）をライゲーシヨン生成物で形質転
換する。RAmpでかつSTetの形質転換体から得た
プラスミドをHpaIで消化してポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（PAGE）でバンド（4.1kpP）
を確認し、続いてBamHIで消化し、PAGEで
90b.p.のバンドを確認した。さらに、EcoRI−
BamHI消化による56b.p.の断片はPAGEでサイ
ズマーカーと比較することにより確認した。この
プラスミドをpTrpEB7と命名し、発現ベクター
の構築に使用した。 実施例 ６ trpプロモーターベクター（pBR322trp）の構
築およびクローニング（第８図に示す）： プラスミドpBR322（9μｇ）をEcoRIおよび
BamHI制限エンドヌクレアーゼで消化する。65
℃で５分間加熱して反応を停止させ、0.8％アガ
ロースゲル電気泳動により断片を分離し、375b.
p.の小さい断片（500nｇ）を得る。一方、プラス
ミドpTrpEB7（10μｇ）をEcoRIおよびBamHIで
消化し、続いて調製ゲル電気泳動を行い、4094b.
p.の大きな断片（5μｇ）を得る。pTrpEB7の
EcoRI−BamHI断片（4094b.p.、200μｇ）を、
pBR322のEcoRI−BamHI断片（375b.p.、100n
ｇ）と、T4リガーゼ（宝酒造、360単位）を含有
するライゲーシヨンバツフアー［50ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）、10ｍＭ MgCl2、20ｍＭ DTT、
１ｍＭ ATP、１ｍＭスペルミジン、50μｇ／ml
BSA］（20μ）中、15℃で、一晩、ライゲート
する。このライゲーシヨン混合物でE.coliHB101
をKushinerの方法［T.Maniatisら、モルキユラ
ー・クローニング、p252（1982）、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー］により形質
転換し、テトラサイクリン（25μｇ／ml）を含有
するプレート上にテトラサイクリンに耐性の形質
転換体を得る。形質転換体より単離されたプラス
ミドpBR322trpをEcoRI−BamHI（375b.p.、
4094b.p.）およびHpaI（4469b.p.）で消化し、7.5
％PAGEおよび0.8％アガロースゲル電気泳動に
よりtrpプロモーター遺伝子を確認した。 実施例 ７ 合成trpプロモーター遺伝子の構築（第９図
に示す）： ブロツク′、″および′の各オリゴヌクレ
オチド（Ｂ−M′）（各2.0nモル）を、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ（BRL、2.5単位）を用い、ラ
イゲシヨンバツフアー（70μ）中、37℃で、１
時間ホスホリル化する。各ブロツクの反応混合物
にT4DNAリガーゼ（300単位）および20ｍ
MATP（2μ）を加え、混合物を15℃で30分間イ
ンキユベートした後、65℃で10分間加熱して反応
を停止させる。これらの各ブロツク（′、′お
よび′）の反応混合物を合わせ、T4DNAリガ
ーゼ（360単位）および20ｍＭ ATP（2μ）の
存在下にホスホリル化していないオリゴヌクロレ
オチド（Ａ、N′）と混合する。混合物を15℃で
１時間インキユベートした後、最終ライゲーシヨ
ン生成物を２〜16％の勾配のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（PAGE）により精製し、106b.p.
の合成trpプロモーター遺伝子を得る。 実施例 ８ ダブルtrpプロモーターベクター（p322dtrpS）
の構築およびクローニング（第１０図に示す）： プラスミドpBR322trpをEcoRIおよびClaIで消
化し、続いて調製アガロースゲル電気泳動を行い
4446b.p.の大きな断片を得る。この断片（4446b.
p.）を実施例７で得たtrpプロモーター遺伝子
（106b.p.）とT4DNAの存在下にライゲートする。
このライゲーシヨン混合物でE.coliHB101を形質
転換し、アンピシリンおよびテトラサイクリンに
耐性の形質転換体を得る。この形質転換体より得
られたプラスミドp322dtrpSを、制限エンドヌク
レアーゼ分析によつて確認した。ClaI−BamHI
（325b.p.）、HpaI（107b.p.）およびAat−ClaI
（287b.p.）。 実施例 ９ 合成trpプロモーターのDNA断片の一部を持
つペプチドCd遺伝子の構築（第１１図および第
１２図に示す）： ブロツク″、″および″の各オリゴヌクレ
オチド（0.2nモル）（Np1−Cd8、実施例４に示
す）を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（2.5単
位）を用い、ライゲーシヨンバツフアー（60μ
）中、37℃で、１時間ホスホリル化する。各ブ
ロツクの反応混合物にT4DNAリガーゼ（360単
位）および20ｍMATP（2μ）を加え、混合物を
15℃で１時間インキユベートする。この各ブロツ
クの反応混合物を合わせ、T4DNAリガーゼ
（360単位）および20ｍMATP（2μ）と共に、15
℃で、一晩、インキユベートし、続いて80℃で10
分間加熱する。混合物に500ｍＭ塩化ナトリウム
水溶液（20μ）およびEcoRI（20単位）を加え
る。37℃で２時間インキユベートした後、最終ラ
イゲーシヨン生成物を15％のPAGEで精製し、合
成trpプロモーターのDNA断片の一部を持つペ
プチドCd遺伝子を得る。このDNA配列を第１２
図に示す。 実施例 10 プラスミドpCdγの構築およびクローニング
（第１３図に示す）： プラスミドpγtrp（4544b.p.）（このプラスミド
を含有するE.coli Ｆ−９がFERM BP−905とし
て微工研に寄託されている。英国特許出願公開番
号第2164650号参照）をHpaIおよびEcoRIで消化
し大きな断片（4510b.p.）を得る。これを実施例
９で得た合成trpプロモーターのDNA断片の一
部も持つペプチドCd遺伝子とT4DNAリガーゼ
の存在下にライゲートする。このライゲーシヨン
混合物を用いてE.coliHB101を形質転換させる。R
Ampの形質転換体より得られるプラスミド
（pCdγ）を制限エンドヌクレアーゼ分析席により
確認した。ClaI−BamHI（543b.p.）、ClaI−Hind
（273b.p.）、ClaI−EcoRI（93b.p.）およびAat
−ClaI（180b.p.）。 実施例 11 プラスミドpCdγtrpSdの構築およびクローンニ
ング（第１４図に示す）： プラスミドpCdγをClaIおよびBamHIで消化し
た小さな断片（543b.p.）を得、これをp322dtrpS
（実施例７）のClaI−BamHI断片（4223b.p.）と
T4DNAリガーゼの存在下にライゲートする。こ
のライゲーシヨン混合物でE.coliHB101を形質転
換する。RAmpの形質転換体より得られるプラス
ミド（pCdγtrpSd）を制限エンドヌクレアーゼ分
析により確認した。HpaI−BamHI（1075、575b.
p.）、ClaI−BamHI（543b.p.）、PstI−EcoRI
（1057b.p.）、EcoRI−BamHI（450b.p.）、Hind
−BamHI（270b.p.）およびClaI−Hiand）
273b.p.）。 実施例 12 リンカーDNAを持つα−hANP遺伝子の調製
（第１５図に示す）： ブロツクおよびの各オリゴヌクレオチ
ド（AH2−AH17）（各0.2モル）を、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ（2.5単位）を用い、ライゲー
シヨンバツフアー（70μ）中、37℃で、１時
間、ホスホリル化する。各ブロツクの反応混合物
にT4DNAリガーゼ（300単位）および20ｍＭ
ATP（2μ）を加え、混合物を15℃で30分間イン
キユベートする。65℃で10分間加熱して反応を停
止させる。二つのブロツク（および）の
反応混合物を合わせ、T4DNAリガーゼ（300単
位）および20ｍＭ ATP（2μ）の存在下に、ホ
スホリル化してないオリゴヌクレオチド（AH1、
AH18）と混合する。混合物を15℃で１時間イン
キユベートした後、最終ラインゲーシヨン生成物
を２〜16％の勾配のPAGEにより精製し、リンカ
ーDNAを持つ134b.p.のα−hANP遺伝子を得る
（第５図に示す）。 実施例 13 α−hANP発現ベクターpCLaHtrpSdの構築お
よびクローニング（第１６図に示す）： プラスミドpCdγtrSdをHindおよびBamHI
で消化し大きな断片（4743b.p.）を得、これをリ
ンカーDNAを持つα−hANP遺伝子（134b.p.）
とT4DNAリガーゼの存在下にライゲートする。
このライゲーシヨン混合物を用いてE.coliHB101
を形質転換し、形質転換体Ｅ、coliH1を得る。R
Amp（E.coliH1）の形質転換体より得られるプラ
スミド（pCLaHtrpSd）［CLa蛋白（ペプチド
CLa融合α−hANP蛋白）遺伝子を含有してお
り、そのDNA配列は第１７図に示す］を制限エ
ンドヌクレアーゼ分析によつて確認した。Aat
−ClaI（287b.p.）、ClaI−BamHI（407b.p.）、ClaI
−EcoRI（93、198b.p.）、EcoRI−BamHI（116、
198b.p.）、Hind−BamHI（134b.p.）および
HpaI−BamHI（107、439b.p.）。 実施例 14 ペプチドCLa融合α−hNAP（CLaH蛋白）を
コードする遺伝子の発現： アンピシリン50μｇ／ml含有Ｌブロス（20ml）
中で一晩培養した、発現ベクター（プラスミド
pCLaHtrpSd）含有のE.coliH1の培養物を、0.2
％グルコース、0.5％カザミノ酸（カゼイン加水
分解物）、50μｇ／mlビタミンB1および25μｇ／ml
アンピシリン含有Ｍ−９培地（400ml）で希釈し、
このE.coliを37℃で培養する。培養液のA600
（600nｍの吸光度）が0.5となつた時にβ−インド
ールアクリル酸（２mg／mlエタノール、２ml）を
加え、細胞を３時間インキユベートする（最終Ａ
＝600＝1.85）。次に菌体を遠心分離（6000rpm、
４℃、５分間）により集める。 実施例 15 α−hANPの分離および精製： (1) ペプチドCLa融合α−hANP（CLaH蛋白）
の分離および精製： 実施例14で調製した培養液（600ml）より得
られる湿潤菌体ペーストを10ｍＭ PBS−
EDTA（PH7.4）［１リツトル中NaCl（8.0ｇ）、
KCl（0.2ｇ）、Na2HPO4・12H2O（2.9ｇ）、
KH2PO4（0.2ｇ）、EDTA（3.73ｇ）］８mlに懸濁
し、細胞を０℃で超音波処理して破壊する。
15000rpmで20分間（４℃）遠心分離してペレ
ツトを集め、これを6Mグアニジン−HCl、10
ｍＭ PBS−EDTAおよび２ｍMβ−メルカプ
トエタノールの混合物８mlに懸濁し、懸濁液を
０℃で超音波処理する。この懸濁液を
15000rpmで20分間（４℃）遠心分離し、上清
をフツ化ｐ−ニトロフエニルメチルスルホニル
（PMSF）含有10ｍＭ PBS−EDTA溶液に対
し４℃で一晩透析する。透析画分を遠心分離
（15000rpm、４℃、20分間）した後、ペレツト
を6Mグアニジン−HCl、10ｍＭ EDTAおよ
び10ｍＭジチオスレイトール含有の100ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH8.0）（８ml）に溶かし、
溶液を一晩放置する。この溶液を10ｍM2−メ
ルカプトエタノール含有1M酢酸（0.5リツト
ル）を用い２回透析し、トリスアミノメタンで
PH8.0に調整する。得られる沈殿（融合蛋白；
15.2mg）を遠心分離（3000rpm、10分間）によ
り集め、10ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（PH5.0）
で洗浄する。 (2) アクロモバクター・プロテアーゼ（AP）
によるペプチドCLa融合α−hANPからのペプ
チドCLaの脱離： 前記で得た融合蛋白を8M尿素を含有する10
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（PH5.0）（30ml）に
懸濁し、懸濁液をアクロモバクター・プロテア
ーゼ（AP）（0.25単位）（和光純薬）と共
に、37℃で、２時間、インキユベートする。反
応混合物を蒸留水（30mlで希釈し、トリスアミ
ノメタンでPH9.0に調整し、次いでAP（0.25
単位）をさらに加え、37℃で２時間インキユベ
ートする。反応液を10ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（PH7.0）（120ml）で希釈し、酢酸でPH７
に調整する。この溶液を10ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（PH7.0）で平衡化したSp−セフアデ
ツクスＣ−25カラム（15ml）にかける。カラム
は同じ緩衝液で洗浄し、0.5M塩化ナトリウム
水溶液を含有する10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（PH8.0）で溶出し、部分精製されたα−
hANP（0.4mg）含有画分を集める。 (3) 高速液体クロマトグラフイ（HPLC）： 前記(2)と同様にして得られプールしておいた
画分を減圧濃縮し、水（300ml）に対し透析し、
逆相HPLCで精製して、純粋なα−hANP（0.3
mg）を得る。 HPLC条件 （調製） カラム：半調製用ベツクマンウルトラポア
（φ10×250mm） 流速：2.5ml／分 溶出：0.01Mトリフルオロ酢酸中10％から60％
までのアセトニトリルの直線勾配；50分間 検出：214nｍにおける吸光度 （分析） カラム：ベツクマンウルトラポア（RPSC
（φ1.6×75mm） 流速：１ml／分 溶出：調製と同条件 保持時間：11.9分 この実施例により得られたα−hANPの
HPLC上での保持時間はα−hANP標準品（販
売：船越）のそれと一致した。 (4) α−hANPのアミノ酸分析 試料を還元、カルボキシメチル化し、次いで
6N塩酸で、110℃で、24時間加水分解する。α
−hANPのアミノ酸組成はウオーターズ社製ア
ミノ酸分析システムを用いて求めた。 α−hANPのアミノ酸組成（１モル当りの残
留物）は計算値と一致した。 (5) α−hANPのアミノ酸配列分析 α−hANPのＮ末端アミノ酸配列をエドマン
法（DABITC法）［FEBSレターズ、93、205
（1978）に記載］により決定し、Ｎ−末端Ser
およびLeu配列を確認した。Ｃ末端アミノ酸
（Ser−Phe−Arg−Tyr）はカルボキシペプチ
ダーゼにより消化しそれに続いてウオーターズ
社製アミノ酸分析システムを用いるアミノ酸分
析を行つて決定した。次いで、実施例で得られ
たα−hANPの全アミノ酸配列は両方の方法を
用いて決定され、α−hANPが得られているこ
とが確認された。 実施例 16 プラスミドpBR322trpSsの構築およびクロー
ニング（第１８図に示す）： プラスミドpBR322をEcoRIおよびClaIで消化
する。大きな断片（4340b.p.）を0.8％アガロース
ゲル電気泳動により精製し、T4DNAリガーゼお
よび１ｍＭ ATPの存在下に合成trpプロモータ
ー遺伝子とライゲートする。このライゲーシヨ
ン混合物を用いてE.coli HB101を形質転換する。
プラスミドDNA（pBR322trpSs）を形質転換した
クローンより分離し、制限エンドヌクレアーゼ分
析により定性解析する。 分析データ：Hpa ；4445bp、ClaI−Pst
；834bp 実施例 17 プラスミドpCLaHtrp−２の構築およびクロー
ニング（第１９図に示す）： プラスミドpCLaHtrpSdをClaIおよびBamHI
で消化する。小さな断片（407b.p.）を単離する。
一方、pBR322trpSsをClaIおよびBamHIで消化
する。大きい断片（4093b.p.）を分離し、前記
DNA（407b.p.）とライゲートする。このライゲ
ーシヨン混合物によりE.coliHB101を形質転換さ
せた後、所望のプラスミド（pCLaHtrp−２）を
形質転換したクローンより単離し、制限エンドヌ
クレアーゼ分析により確認した。ClaI−PstI
（834b.p.）、ClaI−BamHI（407b.p.）。 実施例 18 オリゴヌクレチドの合成： 実施例１の方法に準じて、下記のオリゴクレオ
チドを調製する。 (1)
HOGpApTpCpCpTpCpGpApGpApTpCpApAO
Ｈ （T1） (2)
HOGpCpCpTpTpTpApApTpTpGpAptpCpTp
ＣｐＧｐＡｐＧＯＨ （T2） (3)
HOTPTpApApApGpGpCpTpCpCpTpTpTpTp
ＧｐＧｐＡＯＨ （T3） (4)
HOApApApApApGpGpCpTpCpCpApApApAp
ＧｐＧｐＡＯＨ （T4） (5)
HOGpCpCpTpTpTpTpTpTpTpTpTpTpGOH
（T5） (6) HOTpCpGpApCpApApApApAOH （T6） 実施例 19 合成fdフアージ・ターミネーターの構築および
クローニング（第２０図および第２１図に示
す）： 実施例７に記載の方法と同様にして合成fdフア
ージ・ターミネーターを構築する（第２０図に示
す）。 即ち、DNAオリゴマーT2、T3、T4およびT5
（各0.4nモル）を混合し、１ｍＭ ATPの存在下
にT4ポリヌクレオチドキナーゼでホスホリル化
する。反応混合物を65℃で10分間加熱して酵素を
不活性化する。得られた混合物にDNAオリゴマ
ーT1およびT6（各0.8nモル）とT4DNAリガーゼ
を加える。混合物を15℃で30分間インキユベート
し、２〜16％の勾配のポリアクリルアミドゲル電
気泳動に付し、所望のDAN断片（47b.p.）を電
気溶出により回収し、BamHIおよびSalIで消化
したpBR322の大きい断片（4088b.p.）に挿入と
ライゲートする。このライゲーシヨン混合物によ
りE.coliHB101を形質転換させた後、所望のプラ
スミド（pter21）形質転換したクローンより単離
した。制限酵素分析：BamHI−SalI（47b.p.）、
AvaI（817b.p.）。 実施例 20 α−hANP発現ベクタープラスミド
pCLaHtrp3tの構築およびクローニング（第２２
図に示す）： プラスミドpCLaHtrp−２をPstIおよび
BamHIで消化する。この消化混合物より小さい
断片（1241b.p.）を単離し、pter21をPstIおよび
BamHIで消化して得られたpter21の大きな断片
（3005b.p.）にライゲートする。 このライゲーシヨン混合物でE.coliHB101を形
質転換して形質転換体E.coliH2を得る。RAmpの
形質転換体（E.coli H2）より得られたプラスミ
ドCLaHtrp3t（CLaH蛋白遺伝子を含有する）を
制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。
ClaI−EcoRI（93b.p.、198b.p.）、Hind−
BamHI（134b.p.）およびPstI−ClaI−Xho
（834b.p.、411b.p.）。 実施例 21 E.coli H2を用いたα−hANPの製造： E.coli H1の代りにE.coli H2を用いて実施例
14および15と同じ方法でα−hANPを得る。 このようにして得たα−hANPのアミノ酸配列
はアミノ酸配列分析の結果既知のα−hANPのそ
れと一致していることが確認された。
第１〜３図は合成trpプロモーター遺伝子、
合成trpプロモータ遺伝子および合成trpプロモ
ータ遺伝子のDNA配列をそれぞれ示す。第４
図および第５図はペプチドCLa遺伝子およびリン
カーDNAを持つα−hANP遺伝子のDNA配列お
よびそれに対応するアミノ酸配列をそれぞれ示
す。第６図は合成trpプロモータ遺伝子の構築
を、第７図は合成trpプロモータ遺伝子の分子
クローニングをそれぞれ示す。第８図はtrpプロ
モータ・ベクター（pBR322trp）と構築とクロー
ニングを示す。第９図は合成trpプロモータ遺
伝子の構築を示す。第１０図はダブルtrpプロモ
ータ・ベクター（p322dtrpS）の構築とクローニ
ングを示す。第１１図および第１２図は合成trp
プロモータのDAN断片の一部を持つペプチド
Cd遺伝子の構築およびそのDNA配列をそれぞれ
示す。第１３図はプラスミドpCdγの構築および
クローニングを示す。第１４図はプラスミド
pCdγtrpSdの構築およびクローニングを示す。第
１５図はリンカーDNAを持つα−hANP遺伝子
の構築を示す。第１６図はα−hANP発現ベクタ
ーpCLaHtrpSdの構築とクローニングを示す。第
１７はCLaH蛋白遺伝子のDNA配列を示す。第
１８図はプラスミドpBR322trpSsの構築とクロ
ーニングを示す。第１９図はプラスミド
pCLaHtrp−２の構築とクローニングを示す。第
２０図および第２１図は合成fdフアージ・ターミ
ネーターの構築とクローニングをそれぞれ示す。
第２２図はプラスミドpCLaHtrp3tの構築とクロ
ーニングを示す。
合成trpプロモータ遺伝子および合成trpプロモ
ータ遺伝子のDNA配列をそれぞれ示す。第４
図および第５図はペプチドCLa遺伝子およびリン
カーDNAを持つα−hANP遺伝子のDNA配列お
よびそれに対応するアミノ酸配列をそれぞれ示
す。第６図は合成trpプロモータ遺伝子の構築
を、第７図は合成trpプロモータ遺伝子の分子
クローニングをそれぞれ示す。第８図はtrpプロ
モータ・ベクター（pBR322trp）と構築とクロー
ニングを示す。第９図は合成trpプロモータ遺
伝子の構築を示す。第１０図はダブルtrpプロモ
ータ・ベクター（p322dtrpS）の構築とクローニ
ングを示す。第１１図および第１２図は合成trp
プロモータのDAN断片の一部を持つペプチド
Cd遺伝子の構築およびそのDNA配列をそれぞれ
示す。第１３図はプラスミドpCdγの構築および
クローニングを示す。第１４図はプラスミド
pCdγtrpSdの構築およびクローニングを示す。第
１５図はリンカーDNAを持つα−hANP遺伝子
の構築を示す。第１６図はα−hANP発現ベクタ
ーpCLaHtrpSdの構築とクローニングを示す。第
１７はCLaH蛋白遺伝子のDNA配列を示す。第
１８図はプラスミドpBR322trpSsの構築とクロ
ーニングを示す。第１９図はプラスミド
pCLaHtrp−２の構築とクローニングを示す。第
２０図および第２１図は合成fdフアージ・ターミ
ネーターの構築とクローニングをそれぞれ示す。
第２２図はプラスミドpCLaHtrp3tの構築とクロ
ーニングを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｃ末端がリジンである保護ペプチドと該リジ
ンを介して融合したα−hANPをアクロモバクタ
ー・プロテアーゼの存在下に切断することを特
徴とするα−hANPの製造法。 ２ Ｃ末端がリジンである保護ペプチドと該リジ
ンを介して融合したα−hANPをコードする遺伝
子を含有する発現ベクターにより形質転換された
微生物を培地に培養し、得られる培養物より該融
合蛋白を採取し、保護ペプチドをアクロモバクタ
ー・プロテアーゼの存在下に除去することを特
徴とする請求項１記載のα−hANPの製造法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB858515686A GB8515686D0 (en) | 1985-06-20 | 1985-06-20 | Production of-human atrial natriuretic polypeptide |
| GB8515686 | 1985-06-20 | ||
| GB8600754 | 1986-01-14 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4278583A Division JPH0633316B2 (ja) | 1985-06-20 | 1992-10-16 | 保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS626689A JPS626689A (ja) | 1987-01-13 |
| JPH0516835B2 true JPH0516835B2 (ja) | 1993-03-05 |
Family
ID=10581084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61141900A Granted JPS626689A (ja) | 1985-06-20 | 1986-06-18 | 合成遺伝子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS626689A (ja) |
| GB (1) | GB8515686D0 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK175535B1 (da) | 1987-03-04 | 2004-11-29 | Daiichi Suntory Pharma Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt peptid |
| JPH0227993A (ja) * | 1988-07-15 | 1990-01-30 | Nippon Shinyaku Co Ltd | ｈＥＧＦの製法 |
| JP4861927B2 (ja) * | 2007-08-02 | 2012-01-25 | 日立アプライアンス株式会社 | 冷蔵庫 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2008123B (en) * | 1977-11-08 | 1982-09-08 | Genentech Inc | Method of means for microbial polypeptide expression |
| IE53166B1 (en) * | 1980-08-05 | 1988-08-03 | Searle & Co | Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression |
| JPS62135500A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-06-18 | モンサント コンパニ− | ポリペプチドからのペプチドの放出 |
-
1985
- 1985-06-20 GB GB858515686A patent/GB8515686D0/en active Pending
-
1986
- 1986-06-18 JP JP61141900A patent/JPS626689A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS626689A (ja) | 1987-01-13 |
| GB8515686D0 (en) | 1985-07-24 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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